时间：2023-05-29 17:45:35
开篇：写作不仅是一种记录，更是一种创造，它让我们能够捕捉那些稍纵即逝的灵感，将它们永久地定格在纸上。下面是小编精心整理的12篇热休克蛋白，希望这些内容能成为您创作过程中的良师益友，陪伴您不断探索和进步。
关键词:热休克蛋白;结构;功能;针灸;中药
中图分类号:R456 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)04-0718-03
Comparison of Different Heat Shock Proteins and Their Relationship with the Chinese Medicine
HUANG Yun,Advisor:LING Yaping
(Department of Acu-moxibustion and Massage,Hunan College of Chinese Medicine,Changsha 410208,Hunan,China)
Abstract:Heat shock protein is a group of highly conserved protein molecules family who has important physiological functions. Physiology, pathology and environmental factors can be induced by heat shock protein production, it is also known as stress proteins. According to molecular size and degree of homology, HSPs can be divided into HSP110, HSP90, HSP70, HSP60, small molecular HSP family of five major. Current,We studied HSP90, HSP70 most, but few on the HSP110. HSPs have much in common, but each HSP family has a unique structure and function. HSPs can protect the body , so try to find a no toxic side effects of HSPs induction agent or method has become an active area of research at home and abroad. Acupuncture and Chinese medicine of Traditional Chinese Medicine can affect the expression of HSPs.We make a review aboutthe structure、function of the HSPs and the relationship with Chinese medicine.
Key words:heat shock protein ; structure; function ; acupuncture Chinese medicine
收稿日期:2009-11-11
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30772707 )国家教育部博士点科研基金资助项目(20070541003)
作者简介:黄芸(1984-),女,湖南耒阳人,硕士研究生,研究方向:经脉脏腑相关机理研究。
通讯作者:林亚平(1956-),女,湖南长沙人,教授,硕士研究生导师,研究方向:经脉脏腑相关机理研究。
热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是Ritossa在1962年首先发现的,当时在研究果蝇唾液腺染色体时发现一种在细胞高温应激时能产生对细胞有保护作用而且高度保守的蛋白质[1]。HSPs每个家族针对不同的亚细胞结构都有组成性和诱导性表达,如HSP60和HSP90在哺乳动物中为组成性表达,而HSP70和HSP27在受到高热、氧化应激或抗癌药物刺激时的高表达为诱导性表达。
HSPs的功能[2]主要有 :①维持细胞蛋白自稳。②“分子伴侣”作用。③提高细胞对应激原的耐受性。④参与免疫调节,增强免疫功能。⑤既有直接的神经元保护作用,又可诱导其他保护性机制的产生,直接或间接参与神经元的自身保护。⑥参与细胞周期的调节。
HSPs的分子生物学特性[3]:①生物界的普遍性。自然界所有的原核和真核生物都有HSP。②高度保守性。不同物种有同源性很高的HSP,其中氨基酸序列有50%～90%的一致性, 但不同家族HSPs之间则无明显序列同源性。③非特异性。除热环境以外,其他的物理、化学及生物应激原,如缺血、缺氧、感染、创伤、重金属离子、氧自由基等均可诱导HSPs的产生。④交叉耐受性。是指一种应激刺激诱导细胞产生HSPs后,不仅使细胞对该刺激的耐受性增加,也增加了细胞对其他应激原刺激的耐受性。⑤模拟性。指能以分子模拟宿主自身抗原,兼具迷惑宿主与致病的两重性。⑥双重性。指有自身抗原和特异抗原,能引起抗感染免疫及肿瘤防护,又能诱导多种自身免疫病及感染炎症。
除了上述的共同特点外,各个热休克蛋白家族又有独特的结构、功能及生物学特性。
HSP90:HSP90家族成员主要有HSP90α、HSP90β和gp96(Grp94)。HSP90 在胞浆内主要以同源二聚体的形式存在,每个同源二聚体又由2 个单体构成。HSP90 单体包括3 个主要的结构域:由1个保守的25×103的N 末端结构域和1个55×103的C末端结构域和1个中间结构域[4]。其N端结构域是结合底物蛋白结构域,类似蛋白酶结合底物口袋,C端为寡聚化结构域[5]。HSP90是胞浆蛋白,它通过与靶蛋白的活集团的结合,使其维持所谓“无活性稳态”。HSP90通常可逆性地结合并稳定胞浆中受体分子的活性结合位点,从而避免这些结构与胞浆中的其它生物分子形成聚合体而失活[6]。在抑制细胞凋亡、促进细胞存活上,HSP90主要作用于抑制IκB降解的各个通路上。HSP90能直接与Akt相互作用,抑制它的去磷酸化。磷酸化的Akt能使Bcl-2家族的Bad和caspase-9磷酸化,使它们的活性受到抑制,促进细胞存活。
HSP90作为HSPs 重要成员之一,在肿瘤中研究和应用最多。HSP90在肿瘤细胞中主要处于活化态,而在正常细胞中则主要处于静默态。pp60v2src 是第一个被发现能与HSP90 作用的原癌基因,它能够与HSP90 形成HSP902pp60v2src复合体。P53基因突变是至今已知的与人类癌症相关的最普遍的基因异常, HSP90 也能够和突变型p53 特异性结合,导致突变型p53 复合体的积聚和半衰期的延长[7]。HSP90 还参与肿瘤血管的生长、侵袭及转移。研究表明抑制HSP90 的功能可对肿瘤达到“多点攻击”,达到抑制肿瘤的生长和转移。HSP90抑制剂可以通过特异性抑制HSP90 阻断肿瘤生长转移信号网络通路中的多个靶点,还能逆转肿瘤的耐药性,使肿瘤对化疗药物敏感性增加。HSP90及其抑制剂是目前抗肿瘤研究的热点和前沿[8]。
HSP70:HSP70家族包括GRP75,GRP78,BIP,HSP68,HSP72,HSC70等。根据表达形式的不同可分为结构型和诱导型两种:HSC70固定表达存在于胞液与细胞核中,被称为结构型HSP70;诱导型HSP70(又称为HSP72或HSP70)为高度应激所诱导。通常所指的HSP70即诱导型HSP70[9]。HSP70蛋白由两部分组成,即ATP酶区(AT-Pase domain)和底物识别区或叫多肽结合区(pep-tide-binding domain)[10]。HSP70是膜结构相关蛋白,其生物学作用主要是结合靶蛋白的疏水片断而防止肽链的错误盘绕。在细胞受到环境变化和有害刺激时,细胞的一部分结构和功能蛋白发生变性,在正常状态下处于分子内部的疏水片断暴露“外化”,而形成不稳定的空间结构。HSP70则通过与这些疏水片断的结合而稳定其结构,并通过复杂的分子间相互作用,利用水解ATP的能量,协助变性蛋白的复性[11]。在控制细胞凋亡中,HSP70高表达能抑制caspase的激活、线粒体的损伤和核断裂。可以通过直接或间接地抑制MEK激酶抑制JNK的磷酸化,还可作为天然的抑制蛋白结合到JNK,抑制其活性,从而抑制JNK细胞凋亡通路。
HSP70是HSPs中反应最为敏感研究最多最深入的。在临床上,HSP70与癫痫、心脑缺血、多发性硬化、感染、肿瘤等多种疾病关系密切。在脑血管病和心血管病中对心肌细胞和脑细胞有显著的保护作用,减少细胞缺血坏死范围,修复损伤蛋白质,提高细胞对缺血的耐受性[9,12]。急性脑创伤后在易受损伤区域的神经元HSP70的转录表达,能减少神经细胞凋亡,有助于延迟神经细胞的死亡,与神经保护关系最为密切[13-14]。HSP70可与突变型P53形成稳定复合物,从而使核内P53转移到胞浆中,丧失了控制细胞增殖的能力。HSP70可以激发抗肿瘤细胞的特异性反应,结合细胞内的全部异常肽库,因此HSP70 - 肽疫苗可以是多价的,这有利于防止免疫逃逸从而增强免疫效果,为肿瘤疫苗开发提供了新的思路。
HSP60:真核生物的HSP60主要位于线粒体内(约70～80%),另有小部分位于胞浆。此外, HSP60存在于某些细胞的分泌颗粒中,例如胰岛的β细胞。HSP60是线粒体内最主要的分子伴侣蛋白之一,它与HSP10组成的高分子量聚合物被形容为“巨型呼吸器”,是线粒体基质蛋白折叠和修复系统的关键组成部分。人类HSP60与其分子伴侣HSP10的基因头对头位于2号染色体上,两个基因之间有双向启动子,启动子中则含有热休克元件,接受热休克转录因子的调控[15]。正常条件下,HSP60以稳定状态存在于细胞质和线粒体基质中,维护抗凋亡因子的正常构象和功能;应激条件下,HSP60迅速从胞质中转移到线粒体基质以修复线粒体基质中的变性蛋白,对促凋亡因子产生保护和协同作用[16]。因此,HSP60有抗凋亡和促凋亡的双向调整作用。它的这种抑制或者促进作用可能与细胞种类、所受刺激类型、细胞状态、HSP60含量和活性等多种因素有关。HSP60 是一种T细胞信号,压抑或禁止化学反应,其中Peptide (p277) 是它的一个24个氨基酸片段,首先在非肥胖型糖尿病大鼠体内发现的一种抗原,p277能阻止先天的或适应性T细胞受体对B 细胞的损害,从而对1型糖尿病有治疗作用[17]。
sHSP:小热休克蛋白(small heat shock protein,sHSP)几乎存在于所有生物体中,其主要结构是由N端域和C端域2个部分组成,C端域含有一个相当保守的α晶体蛋白(α-crystallin)结构域,由约90个氨基酸残基组成,与其相邻的是可变的N端域。小热休克蛋白家族成员的共同特点是特殊丝氨酸残基上的磷酸化,磷酸化作用会导致sHSP低聚体状态发生改变,从而使sHSP的生物学功能得以发挥[18]。目前研究最多的sHSP有HSP47和HSP27。 HSP47是内质网内唯一的一种热休克蛋白,它是一种能与多种类型胶原和前胶原特异性结合的内质网驻留蛋白。在胶原合成及纤维化病理过程中发挥重要作用。国外有多项研究证实,抑制HSP47的表达,可抑制胶原合成,减弱纤维化程度[19-20]。HSP27为ATP非依赖性分子伴侣,其功能主要是防止蛋白质聚集. HSP27既可以维持细胞氧化还原稳态又可以维持线粒体的稳定性,结合和稳定肌动蛋白维持肌动蛋白网状系统的完整性,防止凋亡因子如激活的Bid进入线粒体膜。
HSPs与针灸、中药。HSPs对机体具有保护作用,故设法寻找一种没有毒副反应的HSPs诱导剂或方法,诱导HSPs合成,增加机体对细胞的保护过程,已成为国内外研究的活跃领域。中医中的针灸和中药能影响HSPs的表达。在机体受到疾病损伤时,用对机体没有损伤的针灸和中药诱导HSPs的表达,对机体产生保护作用。
祖国医学认为针刺作为一种刺激,作用于腧穴,通过经络系统的传导,调节机体脏腑功能,具有温通经络,消瘀散结,祛散阴寒,益气升陷,回阳救逆及保健强身,预防疾病等作用,已得到国内外医学界的公认[21]。临床上,刺血疗法治疗类风湿性关节炎具有镇痛和泻热作用显著的特点,用三棱针在大鼠患侧“昆仑”穴刺血,这种物理性刺激可以直接刺激机体促进HSP70的产生,增强HSP70表达。HSP70的增高又抑制炎症细胞因子如IL-1、PGE2的转录,使之减少分泌并降低循环中的含量[22]。对心脏手术者取双侧内关、列缺、云门穴位针刺,发现针刺对心肌细胞HSPmRNA基因表达有一定的增强作用,表明针刺对心脏手术者的心肌缺血有一定保护作用。刘志彬等对慢性脊髓损伤大鼠模型使用电针治疗后,通过增加HSP70的表达能量显著降低iNOS的活性,保护脊髓神细胞并减轻继发性脊髓损伤[23]。
艾灸是将艾叶点燃后放置在腧穴或病变部位进行烧灼和熏熨,借其温热刺激及药物作用以防治疾病的一种外治方法。艾灸具有镇痛、改善血循环、调整代谢紊乱、调节免疫功能和调整脏腑功能等作用。《医学入门》说:“虚者灸之使火气以助元气也,实者灸之使实部随火气发散也,寒者灸之使其气复温也,热者灸之引郁热外发”。易受乡等[24-26]对应激性胃溃疡大鼠艾灸“足三里”“梁门”穴。研究结果显示,与艾灸非穴对照点组比较,艾灸足三里、梁门穴组大鼠胃黏膜的HSP70家族的表达均明显增强、MDA含量明显减少胃黏膜损伤程度明显减轻,显著降低了应激性溃疡指数和溃疡面积比,并使应激模型大鼠的死亡率降低。
中药复方或单味药物的提取物能提高HSPs在机体的表达。于泽等[27]用三七五参汤作用与心肌缺血损伤的试验中,Western和免疫组化结果显示三七五参汤组大鼠心肌组织中HSP70的表达较正常组和模型组明显为高,心肌损伤程度明显减轻,说明三七五参汤对缺血心肌的保护作用可能与其诱发HSP70表达有关。涂胜豪等[28]观察雷公藤甲素对胶原诱导的关节炎大鼠的作用。结果发现,雷公藤甲素可以有效地下调模型大鼠关节滑膜和软骨细胞异常表达的HSP60、HSP70和MHC-Ⅰ类分子。在脑缺血再灌注中,分别用补阳还五汤、黄芪、川芎嗪、葛根素、丹参、复方阿魏酸来诱导HSP70,结果显示,虽然这些药物的作用机理不同,但是都使HSP70mRNA及蛋白表达明显增强,对脑缺血损伤有保护作用。补阳还五汤可明显抑制HSP70的转录,而黄芪则除了可明显抑制其转录外,还可轻度降低HSP70的翻译[29]。
参考文献
[1] 王运满,李长生,杨晓妮.热休克蛋白70与脑缺血的中医药干预研究现状[J].中西医结合心脑血管病杂志,2008,6(1):67-68.
[2] ParcellierA, GurbuxaniS,SchmittE, et al. Heat shock proteins,cellular chaperones that modulate mitochontial cell death pathways[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 304(3): 505-512.
[3] 刘玲玉,孟强,杨学冬.热休克蛋白生物学作用的研究进展[J].阴山学刊, 2007,21(1):61-64.
[4] 蔡志华,卢辉山.热休克蛋白90在防治肿瘤方面的研究进展[J].医学综述,2008,14(4):559-562.
[5] 范云霞.热休克蛋白与免疫应答[J].国外医学•免疫学分册,2001,24(2):62-64.
[6] Galea Lauri JAU, Latchman DSAU, Katz DR. The role of 90-kDa heat shock protein in cell cycle control and differentiation of the monoblastoid cell line U937.Exp Cell Res,1996,226:243-254.
[7] 蒲力群,王逢会,霍满鹏.热休克蛋白的研究进展[J].延安大学学报,2008,27(1):72-75.
[8] Hataji O ,Yamakado K,Nakatsuka A ,et al.Radiological and pathological correlation of lung m alignant tumors treated with percutaneous radiofrequency ablation[J].Intern Med ,2005,44(8):865-869.
[9] 陈秀莲,孙林,于培兰,等.热休克蛋白70与缺血性脑损伤[J].中国临床康复,2006,10(24):137-139.
[10] 陈兰英,朱泮民,李冰冰,等. HSP70的结构、特性和功能研究进展[J].平顶山工学院学报,2004,13(2):41-43.
[11] 刁力,李成文,盛志勇,等.大鼠烫伤早期肠黏膜组织热休克蛋白HSP70和HSP90的表达[J].中华烧伤杂志,2000,16(5):279-282.
[12] 许丽丽,石武祥,邬堂春.热休克蛋白70与心肌炎的关系研究进展[J].现代预防医学,2008,35(3):406-408.
[13] 马旭,吕刚.HSP-70与细胞保护的研究进展[J].大连医科大学学报,2007,29(2):194-196.
[14] 卿国平,段宣初,蒋幼芹,等.热休克蛋白72在急性高眼压模型大鼠视网膜神经节细胞中的表达[J].眼视光学杂志,2006,8(4):221-223.
[15] 曹智,马骏,袁文俊,等.热休克蛋白60与细胞凋亡[J].生理科学进展,2008,39(3):267-270.
[16] 方利,王浩,胡波,等.结直肠癌患者血清及粪便中热休克蛋白60检测的意义[J].重庆医学,2008,37(3):254-255.
[17] 朱爱华,鲁勇,金亮,等.P277多肽融合热休克蛋白65提高抗1型糖尿病的作用[J].生物工程学报,2008,24(4):640-645.
[18] 夏佳音,张耀洲.小热休克蛋白的结构和功能[J].中国生物化学与分子生物学报,2007,23(11):911-915.
[19] 邓剑波,袁发焕.热休克蛋白47与肾脏纤维化[J].国外医学•泌尿系统分册, 2004,24(5):667-670.
[20] 荣芳,侯恒.热休克蛋白与胃黏膜保护的研究[J].医学综述,2008,14(1):9-10.
[21] 刘志彬,孔抗美.针刺与热休克蛋白[J].汕头大学医学院学报,2004,17(4):223-224.
[22] 刘雨星,梁繁荣,付弋,等.刺血疗法对AA大鼠炎症局部热休克蛋白的影响[J].辽宁中医杂志,2004,31(1):74-75.
[23] 刘志彬,孔抗美,齐伟力.电针对大鼠慢性脊髓损伤热休克蛋白70及诱导型一氧化氮合酶表达的影响[J].中国临床康复,2004,8(26):5608-5609.
[24] 常小荣,彭娜,易受乡,等.艾灸足三里和梁门穴诱导热休克蛋白7O抗大鼠胃黏膜氧化损伤作用[J].世界华人消化杂志,2006,14(35):3405-3408.
[25] 易受乡,彭 艳,常小荣,等.艾灸对应激性胃溃疡大鼠胃粘膜细胞增殖和凋亡的影响及其与热休克蛋白表达关系的研究[J].针刺研究,2006,31(5):259-263.
[26] 易受乡,彭艳,常小荣,等.艾灸预处理对应激性溃疡大鼠胃黏膜增殖修复的影响[J].世界中西医结合杂志,2007,2(l):21-24.
[27] 于泽,崔金涛.三七五参汤抗心肌缺血损伤及HSP70表达关系的研究中西医结合[J].心脑血管病杂志,2003,1(1):12-13.
[关键词]热休克蛋白90(HSP90);糖尿病;难愈创面;创面愈合
[中图分类号]R622 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)05-0691-04
Heat shock protein 90 promotes wound healing in the diabetic rats
REN Jing,ZENG Hai-feng,XIA Wei,LIU Bei,LI Yong
(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army,Xijing Hospitol,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China)
Abstract:ObjectiveHeat shock protein 90 (HSP90) could promote human epidermal cell migration in hypoxia which is the essential processes for skin wound healing. These processes are often disrupted in diabetic chronic wounds, causing patients morbidity and fatality. So we want to find out whether HSP90 could promote the epidermal cell migeration in the diabetic wound. Methods A d=2cm-sized stented wound were created in 80 streptozotocin-induced rats. A total of 100 diabetic wounds were studied in 5 groups (n = 20). The group B is blank Vaseline, the group C is 1μg/ml HSP90 plus Vaseline, the group D is 30μg/ml insulin plus Vaseline, the group E is 1μg/ml HSP90 and 30ug/ml insulin plus Vaseline. And we set group A as control group that is normal rats without treatment. We rubbed these kinds of Vaseline into the diabetic rat's wounds for 2 days. We used a group of normal rats without therapy as controls. The state of the wound healing was observed, and the percent of wound healing determined by measuring its size and by performing a histopathologic study. The statistical analyses were performed by t-test, using SPSS 14.0 software. On the 3th, 5th,7th, 10th, 14th and 21th, we tested the wound tissues by immunohistochemical staining and calculated integrated optical density (IOD) and density mean(DM)by image pro plus 6.0 software. Results On the 21th day, the wound closure rates of the group C(85.9%),D (86.8%)and E(96.8%) is significantly higher than group B(79.7%) (P
Key words: heat shock protein90(HSP90);diabetic wound;wound healing;diabetes
糖尿病造成的难愈创面已成为目前临床治疗的一大难题,研究表明,高糖会抑制人表皮细胞的迁移,从而导致创面上皮化延迟[1-2]。近来,Li.W的研究发现热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)能够有效促进人表皮细胞的迁移[3],而关于其是否能够有效促进糖尿病性难愈创面的研究并未见报道。本实验旨在将HSP90应用于糖尿病性难愈创面,并辅以胰岛素作为参照,以观察不同时期各组创面的愈合程度及创面中HSP90的表达含量。
1材料和方法
1.1动物及分组:选用健康清洁级雄性SD大鼠100只,由第四军医大学动物试验中心提供,体重(200±3)g,分为A、B、C、D、E五组,每组20只。A组为正常创面但不予以任何治疗,即对照组;B组为糖尿病大鼠难愈创面给予空白凡士林药膏治疗组,即空白组;C组为糖尿病大鼠难愈创面给予含有HSP90的凡士林药膏治疗组,即HSP90组(HSP90浓度:1μg/ml);D组为糖尿病大鼠难愈创面给予含有胰岛素的凡士林药膏治疗组(胰岛素浓度:30μg/ml)E组为糖尿病大鼠难愈创面给予含有HSP90及胰岛素的凡士林药膏治疗组,即联合用药组(E组,HSP90浓度:1μg/ml,胰岛素浓度:30μg/ml)。每组n=(5n1+n2)=20只,共100只大鼠,
1.1.1 构建2型糖尿病难愈创面模型:采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)法诱导2型糖尿病造模。各组提前4周高脂高糖饮食,饥饿12h后以40mg/kg腹腔注射STZ并维持高脂高糖饮食,并于注射后48h用强生稳步血糖仪检测空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),FBG值>16.7mmol/L,体重明显下降(>50g)为造模成功[4]。三天后补注STZ(以10～20mg/kg体重剂量腹腔注射),并测量FBG值。切取全层皮肤暴露肉膜为准后以d=2cm的金属环间断缝合固定于创缘,防止创面挛缩。
1.1.2 给药及分组:A组不涂抹任何药物;B组为空白药膏;C组为含有浓度1μg/ml HSP90的药膏;D组为含有浓度30μg/ml胰岛素的药膏;E组为含有1μg/ml HSP90及30μg/ml胰岛素的药膏。各给药组均以外用涂抹局部给药,药膏均匀覆盖整个创面(约1g/次)为准(含有药物的药膏均委托金花生物制药集团有限公司完成)。HSP90的浓度为我们参考了Li.W试验中用于正常创面的治疗浓度后[3],并以15只糖尿病大鼠给予1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml进行了简单的预实验,发现三种浓度的效果并无显著差异,所以取最小浓度。
6941,
2实验过程及观察设计
在创面形成后即时给予难愈创面药物治疗持续2天,A组则不治疗,动物创面予以暴露。创面的固定环会于创面形成后的第10天予以摘除,因为此时皮肤挛缩力量较大,会导致缝合线断裂,为统一标准予以摘除。并创面形成后第3天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天进行大体观察及活体取材做常规病理学观察,在第3天、第5天、第7天、第10天及第14天5个时间点各取n1=3个标本,而在第21天取n2=5个标本,各标本取材时取全层厚皮肤,保留创缘约1～2mm的正常皮肤。
2.1 大体观察指标:分别于用药后第3、5、7、10、14、21 进行大体拍照观察并采用ADOBE photoshop cs4 计算各时期的创面愈合率;
2.2 镜下观察指标:并于3、5、7、10、14、21天取创面标本,3、5、7、10、14天每组各时间点3只,21天时每组5只。皮肤标本剪成横断面,标本均用1%中尔马林固定,石蜡包埋,连续切片,分别进行HE染色、并使用ABC法进行HSP90的免疫组化染色。并采用image pro plus 6.0彩色图像分析系统, 每张切片选取5个有代表性的200倍视野,测量每个标本HSP90阳性表达密度及积分光密度IOD值的均值并记录。
2.3 数据统计:所得试验数据均采用SPSS11。文中数据以均数和标准差(x±s) 表示,并且对创面愈合率采用两个独立样本t检验进行比较。
3实验结果
3.1 大鼠创面愈合率差异比较:各组大鼠在各时间点创面愈合率比较见表1。由表可见,单独使用HSP90(C组)及单独使用胰岛素(D组)均能够提高创面的愈合率(与同期B组相比,P
3.2 各组创面第10天时HSP90的免疫组化对比:见图1～5。由图可见,联合用药组及正常创面对照组创面中,HSP90的阳性表达较为强烈。
3.3 HSP90阳性表达的比较:为更加客观的反应HSP90在创面中的阳性表达状况我们选取平均阳性率及积分光密度作为指标[5-6]。各组大鼠各时间点HSP90平均阳性率(Density Mean,DM)值的比较见图6。各组大鼠各时间点创面中HSP90的平均积分光密度(Identical Optical density,IOD)的比较见图7。
由图6、图7我们发现:①在糖尿病大鼠创面中,HSP90的表达明显下调(同期对照组相比,P
4讨论
美国创面愈合协会的资料显示大约有66%的难愈性创面即使经过6个月的治疗护理仍无法治愈[7],仅处理创面的材料每年就花费90亿美元[8]。糖尿病创面的治疗一直是难题,表皮细胞迁移迟缓也是其发生机制的一个重要特点。 在糖尿病创面的临床治疗中,胰岛素的局部应用的疗效及作用机制均得到了验证,这一方法也成为了临床治疗糖尿病创面的经典方法。而其作用机制主要在于降低创面组织血糖浓度,加快糖尿病创面的新生毛细血管形成,促进上皮细胞的增殖与迁移[9-10]。
2007年DR. Woodley等发现人表皮细胞受到缺氧刺激后,会大量分泌HSP90α,在胞外的HSP90α能够有效促进人表皮细胞的迁移,并将其应用于正常创面,发现HSP90α能够加速创面的再上皮化过程[3,11]。在此之前,人们对于HSP90的关注了解更多的集中在癌症领域,作为重要的分子伴侣,它介导了多条调控细胞增殖、凋亡、迁移的信号通路[12],并保护细胞产生应激反应,抵抗各类损伤带给机体的不可逆性伤害[13]
在本实验中我们主要为了研究HSP90是否能够促进糖尿病性难愈创面的愈合,并观察HSP90在糖尿病性难愈创面中的表达,探索HSP90在创面中的表达是否与创面的愈合速率有关联。我们的研究发现:在大体观察下,①外源性给予糖尿病性难愈创面HSP90,同期的创面愈合率有所提高(与同期空白组相比,P0.05)。仅从大体实验的观察结果我们认为,创面中HSP90的表达与糖尿病难愈创面的愈合是存在相关性的。在镜下观察,我们发现:①糖尿病性难愈创面的高糖微环境明显抑制了HSP90的表达(空白组与同期对照组相比,P
分析结果我们认为,高糖环境会降低HSP90在创面中的表达,减弱HSP90对细胞的保护作用。并且创面中HSP90的表达高低与创面的愈合速率具有相关性。虽然无论是局部给予胰岛素改善高糖微环境,还是局部应用HSP90提高创面中HSP90的表达,均能够提高糖尿病性难愈创面的愈合率,但是我们发现联合应用后糖尿病性难愈创面的愈合效果最好。据此我们认为,胰岛素改善了糖尿病性难愈创面的局部微环境,有利于创面中HSP90的表达提高,进一步局部给予HSP90,提高创面中HSP90的含量,从而激活部分HSP90参与调控的信号通路,提高创面中各类生长因子的表达,促进了糖尿病性难愈创面的愈合。
然而,我们的研究尚属浅显,对于HSP90在糖尿病创面愈合过程中的作用机制也未进行研究。但是,依然为我们寻找糖尿病创面的治疗方向提供了一个具有临床应用意义的思路。下一步,我们会对HSP90在糖尿病性难愈创面的作用机制进行进一步的研究,探索HSP90在糖尿病性难愈创面中所调控的与创面愈合密切相关的生长因子与细胞外基质的变化。并且HSP90的提取目前还很昂贵,所以进一步寻找到其稳定的上游信号分子或寻找一种能够有效且廉价的提取HSP90的方法会成为我们今后的研究方向。
[参考文献]
[1]Lan CC,Wu CS,Kuo HY,et al.Hyperglycaemic conditions hamper keratinocyte locomotion via sequential inhibition of distinct pathways: new insights on poor wound closure in patients with diabetes[J]. Br J Dermatol,2009,160(6):1206-1214. Epub 2009 Mar 9.
[2]林源,王润秀,农庆文,等.糖尿病创面愈合过程的动态组织学特征[J].中国临床康复,9(3):118-120.
[3]Li W,Li Y,Guan S,et al.Extracellular heat shock protein-90alpha: linking hypoxia to skin cell motility and wound healing[J]. EMBO J,2007,26(5):1221-1233.
[4]方厚华. 医学实验模型动物[M]. 北京:军事医学科学出版社,2002:57-58.
[5]Wang CJ,Zhou ZG,Holmqvist A,et al. Survivin expression quantified by Image Pro-Plus compared with visual assessment[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol,2009,17(6):530-535.
[6]吕宏升,朱庆生,王军,等.全自动显微镜及图像分析系统处理免疫组化图像[J].中国体视学与图像分析,2004,9(1):37-39.
[7]Takahashi PY,Kiemele LJ,Chandra A,et al. A retrospective cohort study of factors that affect healing in long-term care residents with chronic wounds[J].Ostomy Wound Manage,2009,55(1):32-37.
[8]Wadman M. Scar prevention: the healing touch[J]. Nature,2005,25,436(7054):1079-1080.
[9]Lo bmann R,Ambrosch A,Schultz G, et a1.Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in the wounds of diabetic and non-diabetic patients[J].Diabetologia,2002,45(7):1011-1016.
[10]Apikoglu-Rabus S,Izzettin FV,Turan P,et al. Effect of topical insulin on cutaneous wound healing in rats with or without acute diabetes[J]. Clin Exp Dermatol, 2009,6 Epub ahead of print.
[11]Woodley DT,Fan J,Cheng CF, et al. Participation of the lipoprotein receptor LRP1 in hypoxia-HSP90 alpha autocrine signaling to promote keratinocyte migration[J]. J Cell Sci,2009,15,122(Pt 10):1495-1498.
[12]Hahn JS. The HSP90 chaperone machinery: from structure to drug development[J]. BMB Rep,2009,31,42(10):623-630.
[13]Whitesell L, Lindquist SL. HSP90 and the chaperoning of cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2005,5(10):761-772.
【关键词】 子宫内膜
关键词: 子宫内膜;热休克蛋白;免疫组织化学;图像分析
摘 要:目的 探讨不同子宫内膜中热休克蛋白（HSP）70和90表达与ER表达的关系. 方法 用免疫组化Envision法和图像分析仪检测了30例正常子宫内膜、30例增生过长子宫内膜和53例子宫内膜癌中HSP70、HSP90和雌激素受体（ER）的表达. 结果 增生期内膜中HSP90和ER的表达（62.1±6.0）%和（67.80±4.2）%，明显强于分泌期内膜（42.0±5.2）%和（40.2±7.8）%，P
Keywords:endometrial carcinoma;heat shock protein;im-munohistochemistry;imaging analysis system
Abstract:AIM To investigate the expression of heat shock protein70，90in different endometrium and the correlation between HSP70，90and ER status.METHODS Thirty sam-ples of normal endometrium，30samples of endometrial hy-perplasia and53samples of endometrial carcinoma taken from Xijing Hospital were examined for HSP70，90and ER expres-sion by using Envision immunohistochemical analysis and computerized imaging analysis system.RESULTS Expres-sion of HSP90and ER in proliferative phase（62.1±6.0）%，and（67.8±4.2）%is stronger than in secretory phase of normal endometrium（42.0±5.3）%and（40.2±7.8）%，P
0 引言
子宫内膜增生过长和子宫内膜癌常见，但其分子病理学改变却知之甚少.热休克蛋白（HSP）是一组高度保守的伴侣蛋白，HSP70，HSP90在人类子宫内膜中均有表达，受甾体激素调节，与甾体激素受体如雌激素受体（ER）及孕激素受体（PR）表达有关.我们采用免疫组化法和图像分析法探讨不同子宫内膜中HSP70，90表达与ER表达的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 1999-01/2001-12西京医院病理科子宫切除和内膜刮除正常内膜30例（增生、分泌期各15例），增生过长内膜30例（简单型20例，复杂型10例），子宫内膜样癌53例（病理分级:Ⅰ级30例，Ⅱ级14例，Ⅲ级9例;组织学类型:内膜样腺癌39例，非内膜样腺癌14例;临床分期:Ⅰ/Ⅱ期42例，Ⅲ/Ⅳ期11例），所有标本诊断均经组织病理学证实.标本蜡块，连续切片，厚5μm.兔抗人HSP70，HSP90多克隆抗体为美国Maxin Biotech Inc产品，小鼠抗人ER单克隆抗体为美国Antibody Diagnostica Inc产品，山羊抗兔Envision二抗为美国Dako公司产品.
1.2 方法 石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇致水，磷酸盐缓冲生理盐水（PBS，pH=7.2）冲洗.微波炉0.01mol・L-1 枸橼酸钠缓冲液（pH=6.0）行抗原修复（5min×2次），自然冷却.30g・L-1 过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，室温，30min.正常山羊血清封闭非特异性抗原，室温，10min，滤纸吸去封闭血清.兔抗人HSP70，90抗体，小鼠抗人ER抗体，37℃，120min.山羊抗兔Envision二抗，37℃，30min，DAB显色，苏木精复染、脱水、透明、树胶封片.阳性对照采用已知阳性结果的肝癌切片，阴性对照用PBS代替一抗.用Leica Q500Mc图像分析仪测阳性结果的相对染色强度，每张片子选5个高倍视野（×200），以颜色为标准作图像分割，测阳性结果的相对不透光度（%）.结果用SPSS统计软件处理.
2 结果
2.1 子宫内膜HSP，ER的表达 HSPs阳性信号为上皮和基质细胞的胞质和/或胞核内出现棕黄色颗粒，ER阳性信号为上皮和/或基质细胞的胞核内出现棕黄色颗粒，阳性细胞呈局灶性或弥漫性分布（Fig1）.增生期内膜中HSP90，ER表达（62.1±6.0）%和（67.80±4.2）%，明显强于分泌期内膜（42.0±5.2）%和（40.2±7.8）%，P
2.2 子宫内膜癌中HSPs表达与临床病理学指标的关系 内膜癌中HSP70表达随病理分级升高而表达增强（48.2±5.0）%，（62.7±4.3）%和（75.2±2.8）%，P
3 讨论
HSPs是一组具有重要生理功能高度保守的糖蛋白超基因家族，生理、病理及环境因素均可诱导HSPs的产生，对细胞的生存起保护作用［1-4］ .研究表明，HSPs与细胞的增生、分化、瘤变及凋亡等生长过程有关［5-9］ .有关子宫内膜中HSPs与ER表达关系的研究国内外报道不多.有报道指出:HSP90可促进子宫内膜上皮细胞增生，子宫内膜癌中HSP70，90表达与内膜癌组织学类型和性激素受体表达显著相关［10］ .我们的研究表明，HSP70，90在增生期、分泌期子宫内膜中都有表达，增生期子宫内膜中HSP90表达强于分泌期内膜，增生过长内膜中表达进一步增强，分泌期内膜中HSP70表达强于增生期内膜.说明HSP70，90在子宫内膜的增生分泌中均起一定作用，HSP90可能促进子宫内膜增生，HSP70主要与子宫内膜的分泌活动有关.
图1 略
内膜癌中HSP70，90表达有明显变化，内膜癌中HSP90表达较正常内膜和增生过长内膜减弱，HSP70表达反而增强，说明HSP70可能对内膜癌变有促进作用，而HSP90对内膜癌变有一定的保护作用.内膜癌中HSP90随肿瘤分级升高而减弱，HSP70随肿瘤分级升高而增强，内膜样癌中HSP70表达较非内膜样癌中弱，而HSP90较非内膜样癌强.肿瘤细胞分级及组织学类型和患者的预后是密切相关的:子宫内膜癌患者5a存活率随肿瘤细胞分级升高而明显降低，腺鳞癌、透亮细胞癌和浆液性状腺癌等较内膜样癌预后差［11］ ，说明预后差的肿瘤中HSP70表达强，HSP90表达弱.预后差的肿瘤细胞生长速度快而凋亡少，细胞分化程度低，说明HSP70过表达对癌细胞分化和凋亡有抑制作用，HSP90作用可能相反.113例子宫内膜HSP70，90与ER表达的相关性分析表明，HSP90表达与ER表达成正相关，HSP70表达与ER表达成负相关.子宫内膜增生过长和内膜癌的发生及内分泌治疗效果与雌激素作用和ER表达有关.故研究子宫内膜中HSPs表达对探讨内膜生长规律及病变机制、改善治疗措施及治疗效果等方面将有很大的指导意义.
图2 － 图4 略
参考文献:
［1］Helmbrecht K，Zeise E，Rensing L.Chaperones in cell cycle regulation and mitogenic signal transduction ［review］［J］.Cell Prolif，2000;33（6）:341-346.
［2］Huang WJ，Jia KY，Zhnag P，Xiao HS，Han LF，Chen BF，Chen JZ，Ju G.HSP70Expression in hypothala-mus of rats exposed to infrasound ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（2）:162-163.
［3］Ye L，Liao WJ，Liu YF，Liu YF.The expression of heat shock proteins in the veroE6cells induced by Hantaan virus infection in vitro ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med U-niv），2000;21（4）:341-399.
［4］Zhang SZ，Wang XP，Liu YF，Yang SX，Sun YJ.Expression of heat shock protein70in human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7221［J］.Di-si Junyi DaxueXuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（9）:1164.
［5］Witkin SS.Heat shock protein expression and immunity:Rele-vance to gynec-ologic oncology ［J］.Eur J Gynaecol Oncol，2001;22（4）:249-256.
［6］Nylandsted J，Rohde M，Brand K，Bastholm L，Elling F，Jaat-tela M.Selective depletion of heat shock protein70（Hsp70）activates a tumor-specific death program that is independent of caspases and bypasses Bcl-2［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000;97（14）:7871-7876.
［7］Workman P，Maloney A.HSP90as a new therapeutic target for cancer therapy:The story unfolds ［J］.Expert Opin Biol Ther，2002;2（1）:3-24.
［8］Klein SD，Brune B.Heat-shock protein70attenuates nitric ox-ide-induced apoptosis in RAW macrophages by preventing cy-tochrome C release ［J］.Biochem J，2002;362（Pt3）:635-641.
［9］Hashiguchi N，Ogura H，Tanaka H，Koh T，Nakamori Y，No-borio M，Shiozaki T，Nishino M，Kuwagata Y，Shimazu T，Sugimoto H.Enhanced expression of heat shock proteins in ac-tivated polymorphonuclear leukocytes in patients with sepsis ［J］.J Trauma，2001;51（6）:1104-1109.
[主题词] 电针;心脏外科手术;热休克蛋白质类/代谢;RNA,信使/代谢
Effects of Electroacupuncture on Myocardial Cellular HSP70mRNA Gene Expression in Patients Undergoing Cardiac Surgery
Wang Xiangrui1,Zhang Tengfei2,Ma Shuliang1,et al(1. Renji Hospital Affiliated to Shanghai Second Medical University,Shanghai 200127;2. Teaching and Research Section of Biochemistry,Shanghai Second Medical University)
[Abstract] Purpose To observe the effect of electroacupuncture on myocardial cellular HSP70mRNA gene expression in patients undergoing cardiac surgery(ASD).Methods 28 ASD patients were randomly divided into 3 groups,i,e,acupuncture anesthesia group(groupⅠ,n=6),acupuncture combined with general anesthesia group(group Ⅱ,n=10) and general anesthesia group(groupⅢ,n=9).The sample from left atrium at 10 min before CPB,stopping CPB,30 min and 1 h after stopping CPB.Extration of total RNA from myocardial tissue using Reagent Kit.The concentration of mRNA was measured through RTPCR and CKMB was detected.Results After CPB CKMB in the three groups was significantly higher than the value of 10 min before CPB,and CKMB in the group Ⅲ was remarkedly higher than the group Ⅰ and Ⅱ;HSP70mRNA expression was found to be higher in the group Ⅰ than that of group Ⅲ at 30 min and 1 h after stopping CPB.Conclusion Electroacupuncture can induce the expression of HSP70mRNA in ischemic myocardial tissue of patients undergoing cardiac surgery.
[Key words] Electroacupuncture;Heart Surgery;RNA,Massenger/metab;HeatShock Proteins/metab;Myocardium/metab
体外循环心脏手术术后并发症的发生率与术中心肌缺血、缺氧的保护有明显关系[1]。除采用低温、不同成份灌注液的冠脉灌注等方法外,近年发现机体有自身的保护机制,心肌缺血、缺氧后诱导心肌内应激蛋白增加,从而增强机体抗御缺血的能力。笔者发现针刺麻醉病人术后恢复快,并发症少。为探讨针刺对心脏功能的调节作用[2],本文观察针刺对心脏手术病人心肌细胞热休克蛋白mRNA基因表达的影响,初步分析两者之间的相互关系。
1 资料和方法
1.1 一般资料
随机选择房间隔缺损修补术(ASD)28例,分针麻组(组 Ⅰ)6例,男 女各3例,年龄26.0±5.3岁;针刺加全麻组(组 Ⅱ)10例,男4例,女6例,年龄27.1±7.4 岁;全麻组(组 Ⅲ)9例,男5例,女4例,年龄26.8±5.4岁。各组病人术前心功能 Ⅰ ～Ⅱ级。
1.2 麻醉方法
针刺穴位取双侧内关、列缺、云门,进针后接G 6805针麻刺激仪,脉冲频率为3～4 Hz,电流量以病人舒适为度,诱导时间20～30 min,体外循环肝素化时,留针停止刺激,待鱼精蛋白中和肝素后恢复刺激。
全麻组病人术前用药为肌注苯巴比妥钠0.1 g,哌替啶50 mg,东莨菪碱0.3 mg,麻醉诱导安定0.1 mg/kg,维库溴铵0.25 mg/kg,依托咪酯0.2 mg/kg,芬太尼5 μg/kg,麻醉维持吸入异氟醚,间断静注芬太尼和维库溴铵。
1.3 标本采集
上腔静脉插管前(转流前10 min),停心肺转流机和停机后30 min,1 h分别自右心耳剪下1 mm×1 mm×1 mm标本。体外循环机最大转速4 L/min,最低温度针麻组26.02±0.12 ℃,针刺加全麻组23.41±1.52 ℃,全麻组 22.92±1.65 ℃。
1.4 HSP70mRNA的分离提取
应用Reagent抽取组织总RNA,通过匀浆化、分离、洗涤、溶解、沉淀分离总RNA,紫外分光光度仪测定RNA浓度,加入随机引物和探针,经RTPCR扩增后,溴芬兰染色在0.8%胶走电泳,以123 Mark标记分子量。显色后斑点杂交膜用密度扫描仪(岛津CS920型)对HSP70mRNA进行定量。
1.5 心肌酶谱CKMB测定
自右颈内静脉导管抽取近右心房处血标本,采用日立7150全自动分析仪测定肌酸磷酸激酶同功酶(CKMB)。
1.6 术后并发症发生率
术后低血压、循环功能不稳定者所应用血管活性药物发生率和每人平均用量;神经系统并发症,包括脑栓塞、脑出血、意识功能障碍;肾功能不全监测、少尿、无尿及术中知晓发生率。
1.7 统计学处理
各时点数据用均数±标准差表示。各数值输入SAS软件进行统计学处理。组内各数据采用配对t检验,组间各数据采用方差分析。
2 结果
2.1 3组病人体外循环转流前后CKMB的变化
3组病人停转流和转流后1 h CKMB均较转流前明显增高(P
2.2 3组HSP70mRNA含量的比较
通过斑点切迹杂交显色,可见针刺组HSP70mRNA表达高于对照组,斑点切迹经薄层扫描仪定量,其密度值见表2。
2.3 CKMB与HSP70mRNA含量之间的关系
停转流1 h时,组ⅠHSP70mRNA增高39.7%, CKMB增高272.7%,组ⅢHSP70mRNA增高10.3%,CKMB增高696.6%,HSP70mRNA基因表达率增加与CKMB增加的幅度相关,HSP70mRNA明显增加,CKMB的增幅明显下降。
2.4 术后并发症发生率
组Ⅲ术后1天循环功能不稳定需用血管活性药物5例,占总数31.0%;神经意识障碍、脑栓塞2例,占14.4%;平均术后恢复天数5.41±0.82天,均明显高于组Ⅰ和组Ⅱ(P
3 讨论
当机体受到应激因子刺激,组织细胞可产生应激蛋白,对机体产生自身保护作用,热休克蛋白属一类应激蛋白,包括HSP90,HSP70,HSP60和HSP27等类型,参与组织蛋白质折叠和复合物的形成[3]。
近年对HSP70的研究较为详细,HSP70家族至少包括4种同分异构体,HSP75,78为葡萄糖调节蛋白,前者存在于线粒体,后者存在于肌浆网,HSP为存在于胞浆中的非应激蛋白,HSP72在非应激状态下不存在于细胞中,而在各种引起细胞蛋白损伤因素(缺血、热、缺氧、代谢抑制、乙醇、蛋白变性等)存在时迅速合成。减轻心肌缺血再灌注损伤,提高缺血后心脏的机械功能,有利于ATP的保存和保护线粒体功能[4],心功能的恢复与HSPmRNA表达和HSP70的含量有关[5]。
心肌缺血再灌注损伤的主要原因之一是氧自由基产生,损伤细胞膜,破坏细胞核和核糖蛋白,抑制细胞酶系统,影响细胞功能[6,7]。热休克蛋白能减少氧自由基释放,稳定细胞膜和溶酶体膜,防止蛋白质变性,减轻心肌的缺血再灌注损伤。
本研究结果表明针麻组和针刺加全麻组停心肺转流和停转流后1 h HSP70mRNA基因和HSP70含量高于单纯全麻组病人。因而针刺对心肌细胞热休克蛋白mRNA基因表达有一定的增强作用。分析3组病例热休克蛋白mRNA基因表达与反映心肌缺血酶指标之间的关系可见,针刺组和针刺加全麻组,转流后热休克蛋白mRNA表达高于全麻组,而CKMB指标的增高幅度则小于全麻组,表明针刺对心脏手术病人的心肌缺血有一定保护作用。其中增强术中热休克蛋白的基因表达,减少氧自由基生成可能是针刺增加心肌对缺血心肌的保护作用机制之一。在心脏外科领域,如能通过不同方法诱导心肌HSP70mRNA的表达,对于减轻心肌的缺血再灌注损伤,改善心脏手术的预后具有一定的临床意义。
术后并发症的统计表明,全麻组术后2天以内,由于循环功能不稳定者需用血管活性药物占31.0%,精神神经系统并发症占14.4%,全麻辅助针刺和针麻病人术后均未应用血管活性药物,未见神经系统并发症。虽然针麻体外循环病人转流中最低温度较其它两组要高,但术中心脏全部自动复跳,明显高于全麻组病人,表明针刺有助于减轻全麻药对循环系统的抑制作用,通过内在的调节机制增强心肌对缺血缺氧的耐受性。
4 参考文献
1 Robers AJ.Perioperative Myocardial Infarction:Changes in Left Ventricular Performance Related to Coronary Artery Bypass Graft Sugery.Ann Thorac Surg,1983;35:208
2 王祥瑞,杭燕南,孙大金,等.针刺下心脏手术患者血流动力学的变化.中国针灸,1999;19(10):628
3 Ang D,Liberek,K.Skowyral D,et al.Bioloigical Role and Regulation of the Universally Conserved Heat Shock Protein.J Biol Chem,1991;266:24233
4 Yellon DM,Pasini E,Cargnoni A,et al.The Protector Role of Heat Stress in the Ischemic and Reperfused Rabbit Myocardium.J Mol Cell Cardiol,1992;24:895
5 Hutter M,Sievers RF,Barbosa V,et al.Heatshock Protein Induction in Rat Heat.A Direct Correlation Between the Amonut of HeatShock Protein Induced and the Degree of Myocardial Protection.Circulation,1994;89:355
6 Lucchesi BR.Myocardial Ischemia,Reperfusion,and Free Radical Injury.Am J Cardiol,1990;65:141
【关键词】 心肌间质
Effects of heat shock protein 70 on immature myocardium and myocardial interstitium in rabbits
【Abstract】 AIM: To investigate the protective effects of heat shock protein 70 (HSP70) on immature myocardium and myocardial interstitium. METHODS: Isolated working rabbit heart model was used in this study. Twelve rabbits (aged 14-21 days) were randomly pided into 2 groups: Control group (C) undergoing 45 min ischemia followed by 45 min reperfusion after distilled water was injected by intraperitoneum 24 h later， and experimental group (E) undergoing 45 min ischemia followed by 45 min reperfusion after norepinephrine was injected by intraperitoneum 24 h later. The HSP70 content， lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase (CK) leakage， adenosine triphosphate (ATP) and malondialdehyde (MDA) content， superoxide dismutase (SOD) activity， hydroxyproline (HP) and endothelin (ET) content， myocardial cell Ca2+ content， Ca2+ATPase activity of mitothondia (［Ca2+ATPase］m) and its Ca2+ content (［Ca2+］m)， synthesizing ATP activity of mitochondria(［ATP］m) and myocardial ultrastructure were tested. RESULTS: The cardiac function recovery was better in E group than C group (P
【Keywords】 heat shock protein 70; immature myocardium; myocardial interstitium; cardioprotection
【摘要】 目的: 探讨热休克蛋白70(HSP70)对未成熟心肌和心肌间质的影响. 方法：健康新生长耳大白兔12只随机分为2组. 对照组(C组)：ip生理盐水0.4 mL，24 h后取离体心脏，常规建立Langendorff离体心脏灌注模型，灌注15 min转为工作心15 min后停灌45 min，恢复灌注15 min改为工作心30 min；实验组(E组)：ip去甲肾上腺素， 24 h后取离体心脏，方法同对照组. 测定心肌细胞中HSP70含量、血流动力学指标、心肌含水量（MWC）、心肌肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）漏出率、三磷酸腺苷(ATP)含量、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛(MDA)含量、心肌组织羟脯氨酸（HP）含量、内皮素(ET) 含量、心肌细胞内Ca2+含量、心肌线粒体Ca2+ATPase活性及其Ca2+含量、心肌线粒体合成ATP能力［ATP］m，心肌超微结构. 结果：E组HSP70含量明显高于C组(P
【关键词】 热休克蛋白70;未成熟心肌;心肌间质;心肌保护
0引言
1988年Currie等［1］证实在某些非致死性应激（如高温，缺血再灌注）条件下能诱导合成热休克蛋白（heat shock proteins， HSP）能提高对应激的耐受力，其中HSP70家族倍受重视. 在成熟心肌中，人们通过各种方式能诱导HSP70表达增强了心肌的抗损伤能力. 然而在未成熟中，人们对心肌HSP70表达及抗损伤能力并不清楚. 我们观察ip重酒石酸去甲肾上腺素诱导HSP70在未成熟心肌中的表达对缺血再灌注时心肌的影响.
1材料和方法
1.1材料
出生14~21 d的健康新生长耳大白兔12只，随机等分为2组：实验组(E组)和对照组（C组）. 对照组ip生理盐水0.4 mL后24 h取离体心脏，常规建立Langendorff模型，灌注15 min转为工作心15 min后停灌45 min，恢复灌注15 min改为工作心30 min；实验组，重酒石酸去甲肾上腺素(溶于生理盐水中)3.1 μmol/kg (0.53 mg/kg) ip后24 h取离体心脏，方法同对照组.
1.2方法
兔心脏跳动稳定后，记录心率(heart rate， HR)、主动脉流量(aortic flow， AF)、冠状动脉流量(coronary flow， CF)、心排出量(cardiac output， CO)、左心室收缩压(left ventricular systolic pressure， LVSP)、左心室舒张末压(left ventricular enddiastolic pressure， LVEDP)、左心室内压上升最大速率(+dp/dtmax)、左心室内压下降最大速率(-dp/dtmax)等，以持续停灌前工作心基础水平为100%，比较复灌末心功能恢复的百分率. 实验结束后取标本测心肌含水量(myocardial water content， MWC)、心肌肌酸激酶(creatine kinase， CK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase， LDH) 15 min漏出率、心肌组织三磷酸腺苷（ATP）含量(荧光素酶法)、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛(MDA)含量 (化学比色法，试剂盒购自南京聚力生物工程研究所)、心肌组织羟脯氨酸（hydroxyproline， HP）含量、内皮素(endothelin， ET) 含量、心肌线粒体Ca2+ATPase活性及其Ca2+含量、心肌线粒体合成ATP能力［ATP］m、心肌超微结构等. 采用Western blot法测定心肌细胞中HSP70含量. 用2×SDS样品缓冲液裂解细胞，收集细胞蛋白质，经SDSPAGE分离后迅速转移至尼龙膜，按文献［2］加入抗HSP70 mAb（1∶1000）及碱性磷酸酶偶联的抗小鼠IgG（1∶1000），用硝基蓝四氮唑/溴氯吲哚磷酸盐（NBT/BCIP）显色.
统计学处理：所有数据以x±s表示，采用t检验. P
2结果
2.1血流动力学指标E组与C组比较，HR，AF恢复率差异无显著性，CF，CO，LVSP，LVEDP，+dp/dtmax和-dp/dtmax差异有显著性(P
2.2生化指标E组MWC低于C组(P
表4心肌线粒体Ca2+ATPase活性、Ca2+含量及合成ATP能力（略）
转贴于
2.3心肌超微结构C组：线粒体肿胀明显，部分呈空泡状融合并溢出细胞外，线粒体嵴溶解明显；肌丝排列紊乱、溶解(Fig 2A). E组：线粒体轻度肿胀，偶有线粒体呈空泡状，线粒体嵴排列尚整齐、密度无增高；肌丝排列整齐(Fig 2B).
3讨论
HSPs有多个家族，其中HSP70家族（Mr 66 000~78 000）是最丰富的HSPs，HSP70家族是一类最保守和最重要的热休克蛋白家族，在心肌保护中起重要作用. HSP70参与蛋白质的折叠和伸展、多聚复合物的装配以及蛋白质在胞质与细胞器之间的移位等. 已有实验证实HSP70诱导总量（或表达）与心肌缺血、坏死的范围及程度呈负相关［3］. HSP70具有帮助蛋白质完成细胞内转移的功能(分子伴侣功能)［4］. 在应激状态下HSP稳定细胞内变性的蛋白质，有利于它们的消除和修复，从而在应激状态下起到保护和恢复细胞功能的作用，其解离过程需要ATP参与. HSP70也是一种类固醇激素受体结合蛋白［5］，类固醇激素受体可以与HSP70结合，结合后HSP70将此受体由胞质运送到细胞核中，发挥受体的作用.
在心肌组织，热休克处理后，无论成熟的或未成熟的心肌细胞都能合成HSP70 ［6］. 许多应激原如缺血、缺氧、压力或容量负荷、重金属、药物［7］等和热应激一样，在心肌细胞中都能诱导HSP70表达，对抗缺血后再灌注损伤. 在冠状动脉内皮细胞同样也可以诱导HSP70的表达［8］，发挥心肌抗缺血后再灌注损伤作用. 研究证实，5′核苷酸酶活性增强在心肌HSP70抗缺血后再灌注损伤中起重要作用［9］，经过热预处理或缺血预处理的心肌同样表达HSP70，与缺血预处理一样具有心肌保护作用［10］. 近来研究表明，HSP70的表达与蛋白激酶C(protein kinase C， PKC)激活密切有关［11］，心肌保护作用与HSP70减少线粒体损伤相关［12］. 我们的实验通过ip重酒石酸去甲肾上腺素诱导心肌HSP70表达. 结果显示，ip 24 h后HSP70蛋白表达明显增多. 离体心脏实验结果表明，与C组比较，E组在再灌注期间，左室的舒缩功能明显改善，LDH， CK和ET的漏出率及MDA含量减少，心肌水肿减轻，ATP， HP含量及SOD活性增高，E组心肌细胞内、线粒体内Ca2+明显含量减少，线粒体ATP合成能力和心肌线粒体Ca2+ATPase活性较C组明显增加，心肌超微结构损伤明显轻于C组，证实HSP70的表达对缺血再灌注未成熟心肌功能和形态具有明显的保护效应.
【参考文献】
［1］ Currie RW， Karmazyn M， Kloc M. Heat shock response is associated with enhanced postischemic ventricular recovery［J］. Circ Res，1988;63: 543-549.
［2］ Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual［M］. 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory， 1989: 1860-1874.
［3］ Hulter MM， Sievers RE， Vissern FLJ， et al. Heat shock protein induction in rat heartsA direct correlation between the amount of heat shock protein induced and the degree of myocardial protection［J］. Circulation，1994;89: 355-360.
［4］ Beckman BP，Mizzen LA，Welch WJ. Interaction of HSP70 with newly synthesized proteins: Implication for proteinfolding and assembly［J］. Science， 1990;240:850-854.
［5］ Knowlton AA. The role of heat shock proteins in the heart［J］. J Mol Cell Cardiol， 1995;27: 121-131.
［6］ Nomura F，Aoki M，Forbess JM，et al. Myocardial selfpreservative effect of heat shock protein 70 on an immature lamb heart［J］. Ann Thorac Surg， 1999;68:1736-1741.
［7］ Meng XM，Brown JM，Ao LH， et al. Norepinephrine induces heat shock protein 70 and delayed cardioprotection in the rat through α1 adrenoceptors［J］. Cardiovasc Res， 1996;32: 374-383.
［8］ Amrani M，Latif N，Morrison K， et al. Relation induction of heat shock protein in coronary endothelial cells and cardiomyocytes: Implication for myocardial protection［J］. J Thorac Cardiovasc Surg，1998;115:200-209.
［9］ Sakaguchi T，Sawa Y，Kitakaze M， et al. Ecto5nucleotidase plays a role in the cardioprotective effects of heat shock protein 72 in ischemiareperfusion injury in the rat hearts［J］. Cardiovasc Res， 2000; 47:74-80.
［10］ Chong KY，Lai CC，Lille S， et al. Stable overexpression of the constitutive form of heat shock protein 70 confers oxidative protection［J］. J Mol Cell Cardiol，1998;30:599-608.
［11］ Baek SH，Lee UY，Park EM， et al. Role of protein kinase Cδ in transmitting hypoxia signal to HSF and HIF1［J］. J Cell Physiol， 2001; 188:223-235.
方法 搜集2013年7月至2015年8月经病理证实为HCC的患者62例，所有病例术前行CT平扫及3期增强扫描，通过对比患者术前CT表现与术后癌组织GPC-3，HSP70的表达水平、病理分级，统计分析其是否存在相关关系。
结果 本研究62例HCC患者中肝癌的大小、动脉期血管强化及肝癌的供血类型与GPC-3表达水平存在相关性，不同供血类型的肝癌HSP70的表达水平存在差异；肝癌的大小、边缘、瘤内出血坏死与其病理分化程度相关；肝癌的病理分化程度越低GPC-3及HSP70的表达水平越高。
结论 肝癌的CT征象可在一定程度上反映癌组织GPC-3及HSP70的表达情况及肝癌的病理分化程度，GPC-3和HSP70表达水平与肝癌的病理分级相关。
【关键词】 肝细胞肝癌； 病理分级； 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3； 热休克蛋白70
中图分类号：R735.7 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.03.005
【Abstract】 Objective To investigate the correlation of preoperative CT findings between expressions and pathological grade of postoperative glypican-3（GPC-3） and heat shock proteins 70（HSP70） protein in hepatocellular carcinoma（HCC）.
Methods A total of 62 cases who were pathologically proved with HCC from July，2013 to August，2015 were enrolled in this study.All cases underwent CT plain scan and 3 phase enhanced scanning before operation.And by comparing preoperative CT findings and the expression levels of postoperative GPC-3，HSP70 and pathological grade，whether there was a correlation between them was counted and analyzed.
Results In this study，the size of liver cancer，arterial blood vessels and blood supply type of liver cancer were correlated with GPC-3 expression levels in 62 cases of HCC patients，and the expression level of HSP70 in HCC with different blood supply types was different.The size，margin，intratumoral hemorrhage and necrosis of HCC were correlated with the degree of pathological differentiation.In addition，the lower the degree of pathological differentiation，the higher the expression level of GPC-3 and HSP70.
Conclusion CT findings of HCC can reflect the expression of GPC-3，HSP70 and liver pathological differentiation in a certain extent，and the expression level of GPC-3 and HSP70 were correlated with HCC pathological grading.
【Key words】 HCC；pathological grade；GPC-3；HSP70
肝胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）在我国发病率较高，最新统计资料显示，肝癌发病率位于肺癌和胃癌后排第三位，而其所致的男性恶性肿瘤死亡率仅次于肺癌[1]。CT是目前肝癌诊断的重要影像学方法，不仅可以观察肝癌的形态、大小及其对周围邻近组织的关系，更能通过增强扫描的方法来观察肝癌的血供状况，对肝癌的检出、定性、分期及治疗后复查具有重要意义[2]。病理学检查是诊断肝癌的金标准，而免疫组织化学是诊断肝癌的重要辅助手段。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 （Glypican-3， GPC-3）及热休克蛋白70（Heat shock proteins 70， HSP70）是肝癌诊断的代表性免疫组织化学标志物之一，近些年来，多个研究结果都表明GPC-3及HSP70在肝癌的发生、发展中都扮演了重要的角色[3～5]。笔者拟通过研究HCC的CT表现与癌组织中GPC-3、HSP70表达及病理分级的关系，为肝癌的诊断、治疗及预后评估提供更多信息。
1 资料与方法
1.1 一般资料
搜集右江民族医学院附属医院2013年7月至2015年8月病理科确诊为HCC的患者62例，其中男性52例，女性10例，年龄22～76岁，平均年龄49.74岁。所有病例术前行CT平扫及3期增强扫描，未接受放化疗、肿瘤靶向治疗等非手术治疗，粒子植入、碘油栓塞等介入治疗。术后用免疫组织化学法分析癌组织GPC-3及HSP70表达情况。本研究所有病例均有完整的随访资料。
1.2 CT检查及征象判断方法
CT检查方法：采用GE Highspeed N x/I或西门子Definite AS 128层螺旋CT扫描仪。常规进行胃肠道准备，先平扫，增强扫描对比剂用优维显（300 mgI/ml）80～100 ml，注射速率3～3.5 ml/s，注射对比剂后分别行动脉期（30 s）、门静脉期（65 s）和平衡期扫描（120 s）。CT征象判断方法：参照陆玉敏等[6]的标准对肿瘤直径分为小肝癌组（≤3 cm）和大肝癌组（>3 cm）。肿瘤边缘分为清楚和模糊两组。根据肿瘤内是否有平扫低或高密度、增强或无强化改变分为有出血坏死和无出血坏死两组。肝内或肝外侵袭转移分为有侵袭转移组和无侵袭转移组。结合黄娟等人[7]的研究将其分为：肝动脉供血型、门静脉供血型、肝动脉及门静}双重供血型和少血供型。
1.3 病理检查及判断方法
将所有62例标本常规石蜡包埋，连续切片，切片厚度3 μm，行S-P法免疫组织化学染色，鼠抗人GPC-3及HSP70抗体即用型，所用试剂盒购自北京中衫金桥生物技术有限公司，染色步骤按说明书进行。阳性结果的判读：综合考虑免疫组化染色强度和细胞染色阳性率，每张染色切片随机选取 5 个染色均匀的高倍视野（×400），取平均数。判定标准：染色强度按无色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别计为0分、1分、2分、3分；阳性细胞按无阳性细胞、阳性细胞比例≤25%、26%～50%、51%～75%、>75% 分别计为0分、1分、2分、3分、4分。染色强度与阳性细胞百分比的乘积3且≤6者（+），>6且≤9者（++），>9且≤12者（+++）。HCC的病理分级采用国际上常用的Edmondson-Steiner分级法：I级：癌细胞形态似正常肝细胞，核圆而规则，核仁明显，核分裂象少，核浆比例接近正常；Ⅱ级：癌细胞略异型，胞质嗜酸性和颗粒性强，胞核较大，核着色深浅不一，核仁明显，核浆比例接近正常或略增大；Ⅲ级：癌细胞异形明显，胞质呈嗜碱性着色，核大而不规则，核染色质粗，着色不一致，核仁明显，核分裂象多；Ⅳ级：癌细胞形态变异大，可呈梭形或多形性巨细胞或小细胞，核大，核仁不规则，核浆比例明显增大。
1.4 统计学方法
应用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料组间比较用t检验，计数资料比较用卡方检验，等级资料比较用秩和检验，检验水准：α=0.05， 双侧检验。
2 结 果
2.1 肝癌CT表现及病理分级与GPC-3、HSP70表达的关系 本组62例HCC患者CT表现中，小肝癌组10例，大肝癌组52例；边缘清楚者32例，边缘模糊者（图1A）30例；有坏死者41例，无坏死者20例，肿瘤内出血者1例；有侵袭转移8例，无侵袭转移54例，有动脉期血管强化者（图1B）37例，无动脉期血管强化者25例。动脉供血型（图1A-D）52例，双重供血型及门静脉供血型10例。GPC-3阳性表达者30例占48.4%，HSP70阳性表达者45例占72.6%（图1E-F）。HCC>3 cm、动脉期有血管强化、供血类型为动脉型者GPC-3表达明显高于对照组，差异有统计学意义（P
2.2 肝癌的CT表现与病理分级的关系
本组62例HCC，Edmondson-Steiner分级Ⅰ～Ⅱ级39例，Ⅲ～Ⅳ级23例；肝癌的Edmondson-Steiner级别越高，肿瘤越大、边缘越不清楚、瘤内越容易出血坏死，差异有统计学意义（P
3 讨 论
肝癌在世界范围内是最常见的恶性肿瘤，HCC占原发性肝癌的80%以上。在2012年全世界估计有782 500例新发肝癌患者和745 500例肝癌死亡患者。而其中约一半的新发病例和死亡患者都发生在中国[8]，我国肝癌的诊疗形势严峻。对于术前肝癌的诊断临床常通过影像图像结合患者血清AFP升高水平和/或穿刺活检进行判定。临床上对不同时期肝癌的治疗方法差别很大，早期肝癌患者可以通过手术完全切除，患者能获得较长的无复发生存期，晚期肝癌患者常通过部分切除、射频消融、动脉化疗栓塞、放射性粒子植入再结合放化疗等姑息性治疗延长患者的生存时间。如果能通过CT图像对肝癌患者进行一个较为准确的初期评估，对患者的进一步检查、治疗及预后的判断都将有非常重要的意义。
通常认为，肝癌的病理分级越高，恶性程度越高；肝癌直径越大，其向恶性转变越明显。有研究显示，当肝癌直径生长至3 cm时，是其生物学行为由相对良性向高度恶性转变的重要时期，小于3 cm肝癌多表现为分化好，膨胀性生长、微血管浸润和卫星结节发生率低等相对温和的生物学行为，具有根治性治疗的病理学基础；大于3 cm肝癌发生微血管浸润、卫星结节及不良预后的风险明显增加，而且总的生存期及无复发生存期也明显低于小于3 cm肝癌患者[9]。早期肝癌向周围浸润少，常表现为边缘清楚，在HCC与癌旁组织之间没有或者有不完整的纤维性包膜。随着肝癌的进展，肿瘤逐渐由门静脉供血转变为肝动脉供血，门静脉供血不断下降，表现为增强扫描动脉期明显强化，门静脉及平衡期强化程度低于肝实质的“洗脱”样表现，这是诊断肝癌的最重要的影像学征象。由于进展期肝癌呈恶性克隆性增殖，需要大量血供提供细胞增殖所需的营养物质，肿瘤周围可出现迂曲增粗、增多的异常供血血管，在影像上表现为瘤周或瘤内迂曲走形的动脉期血管强化影。但是当肿瘤生长速度与肿瘤供血不匹配时，瘤内病灶可出现缺血性坏死。由于肿瘤血管结构的不完整性和/或肿瘤对血管的浸润破坏，也可表现为肿瘤内的出血。包膜是进展期肝癌的征象之一，其组织成分可以为富含纤维组织的真包膜，也可为纤维组织和扩张的肝血窦组成的假包膜[10]。完整的肿瘤包膜可以限制肝癌向外扩散转移，当进展期肝癌突破包膜向外生长时，表现为包膜不完整或者在影像上表现为肿瘤边缘不清楚。
GPC-3是分子量为60 kDa的硫酸乙酰肝素蛋白多糖，通过糖基化磷脂酰肌醇锚定在细胞膜表面，其在胎儿肝脏中表达丰富，在成人肝脏中不表达，当肝癌发生时，可被激活并通过整合素、胰岛素样生长因子-Ⅱ和Wnt信号通路等传导通路促进肝癌细胞的生长[3]。本研究显示当HCC直径大于3 cm时，其GPC-3表达率升高，在动脉期血管强化组和动脉供血型中，GPC-3的表达也高于对照组，这表明肝癌的CT表现能够在一定程度上反映GPC-3的表达水平。病理对照显示肝癌组织的病理分级越高GPC-3表达水平越高。本研究结果与Bin Yan等[11]的研究结果基本一致，其结果显示GPC-3过表达和HCC的病理分级、肝内转移明显相关，GPC-3阳性表达者HCC的肿瘤更大，而与是否有肿瘤包膜无关。本研究结果显示HCC中总的GPC-3表达率为48.4%，低于Bin Yan等[11]的研究结果（65%），@可能与本研究所纳入的病例较少有关。
热休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）为高度保守的蛋白，在正常情况下低表达，在休克、缺血、遗传毒性药物、营养物质缺乏和肿瘤蛋白高表达等细胞应力条件下表达升高。热休克蛋白依据其分子量的大小，可分为HSP27， HSP70 和HSP90等，其都与恶性肿瘤密切相关，HSP70在细胞凋亡信号传导，HCC细胞移行和生成中扮演重要的角色[4～5]。本研究显示，肝癌动脉供血型中HSP70表达高于门静脉及双重供血型，但与肝癌的大小、边缘、瘤内出血坏死、动脉期血管强化无关；病理高级别的HCC中HSP70表达高于低级别。Shin E等[12]研究认为HSP70与肿瘤大小、Edmonson-Steiner分级及肿瘤是否有包膜相关，瘤体越大、病理分级越高，HSP70表达越明显，肿瘤有包膜者比无包膜者HSP70表达要低，HSP70还可以作为鉴别HCC是否转移的指标， HSP70表达水平和血管浸润有关。本研究中HSP70的表达率为72.6%，与其研究结果（71.9%）趋同。
仅通过肝癌CT表现能不能准确反映肝癌的病理分化级别？笔者检索国内文献发现该研究鲜有报道，而做病理对照的较多。黄娟等人[7]将肝癌的血供特点与其病理分化程度作了对比，认为HCC分化程度较好时（Edmondson Ⅰ～Ⅱ级）肿瘤可以接受肝动脉、门静脉或双重供血，随着HCC分化程度的降低（EdmondsonⅢ～Ⅳ级）病变则以肝动脉供血为主。本研究结果显示HCC的血供特点与其病理分化程度并无相关性，但是HCC的大小、边缘、瘤内出血坏死与其病理分级密切相关，即HCC直径较大、边缘不清、瘤内出血坏死者Edmondson-Steiner分级较高，提示肝癌的CT表现对肝癌病理分化的评估有一定意义。
总之，我们认为HCC的CT征象能在一定程度上反映肝癌的病理分化程度和GPC3、HSP70表达水平，可以丰富肝癌的临床诊断信息，增加临床医生的诊断信心。但是本研究纳入的病例数较少，其结果可能存在一定的偏倚，需要更大样本的研究结果加以确认和补充。
参 考 文 献
[1] 陈万青，郑荣寿，张思维，等.2012年中国恶性肿瘤发病和死亡分析[J].中国肿瘤，2016，25（1）：1-8.
[2] 中华人民共和国卫生部.原发性肝癌诊疗规范（2011年版）[J].临床肝胆病杂志，2011，27（11）：1141-1159.
[3] Ozkan H，Erdal H，Koc，ak E，et al.Diagnostic and prognostic role of serum glypican 3 in patients with hepatocellular carcinoma[J].Journal of Clinical Laboratory Analysis，2011，25（5）：350-353.
[4] Wang C，Zhang Y，Guo K，et al.Heat shock proteins in hepatocellular carcinoma：Molecular mechanism and therapeutic potential[J].International Journal of Cancer，2016，138（8）：1824.
[5] Liu CC，Jan YJ，Ko BS，et al.14-3-3σ induces heat shock protein 70 expression in hepatocellular carcinoma[J].BMC Cancer，2014，14（1）：425.
[6] 陆玉敏，吴英宁，李振宇，等.肝细胞癌CT表现、肝外转移与病理分级和P53蛋白表达的关系[J].临床放射学杂志，2014，33（11）：1680-1683.
[7] 黄 娟，周翔平，刘荣波，等.原发性肝癌血供特点的螺旋CT表现及其与病理学特性的相关性研究[J].中华放射学杂志，2000，34（11）：753.
[8] Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012[J].Ca A Cancer Journal for Clinicians，2015，65（2）：87-108.
[9] 中国抗癌协会肝癌专业委员会，中华医学会肝病学分会肝癌学组，中国抗癌协会病理专业委员会等.原发性肝癌规范化病理诊断指南（2015年版）[J].中华肝胆外科杂志，2015，21（3）：145-151.
[10] Grazioli L，Olivetti L，Fugazzola C，et al.The pseudocapsule in hepatocellular carcinoma：correlation between dynamic MR imaging and pathology[J].European Radiology，1999，9（1）：62-67.
[11] Yan B，Wei JJ，Qian YM，et al.Expression and clinicopathologic significance of glypican 3 in hepatocellular carcinoma[J].Annals of Diagnostic Pathology，2011，15（3）：162-169.
作者单位：241000 皖南医学院弋矶山医院
通讯作者：徐祝军
【摘要】 目的 通过对损伤的大鼠脊髓早期不同时机减压后测定脊髓组织中热休克蛋白（HSP）70的表达及其与神经细胞凋亡的相关性研究，评价早期减压的疗效。方法 采用环扎法建立大鼠脊髓损伤模型，随机将大鼠分为4组，对照组、8 h脊髓减压组（实验B组）、72 h脊髓减压组（实验C组）和不减压组（实验D组），并分别在1 d、3 d、7 d、14 d和21 d处死后取各组大鼠受损脊髓进行HE染色，免疫组化法、光密度测量法观察脊髓细胞HSP70的表达，TUNEL法观察神经细胞的凋亡。应用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析。结果 实验组HSP70、TUNEL阳性细胞数及HSP70积分光密度各组组间比较差异均有统计学意义（P
【关键词】 脊髓损伤； 减压时机； 光密度； 热休克蛋白70； 细胞凋亡
The research of relationship between HSP70 and neuronal apoptosis measured by optical density in rats treated with Cerclage spinal cord injury and decompression at different early time GU Wen-hao,HU Lan-xiang,XU Zhu-jun,et al.Yijishan Hospital of Wannan Medical College，Wuhu 24100，China
【Abstract】 Objective To investigate relationship between HSP70 and neuronal apoptosis measured by optical density in rats treated with cerclage spinal cord injury and decompression at different early time,and to evaluate the efficacy of early decompression.Methods Cerclage rat model of spinal cord injury, rats were randomly divided into four groups,divided into control group,eight hours of spinal cord decompression group,72 hours spinal decompression group and non-decompression group,in 1 d,3 d,7 d,14 d and 21 d of each group were killed after spinal cord damage in rats with HE staining, immunohistochemistry,optical density measurement of spinal cord cells, the expression of HSP70,TUNEL apoptosis of nerve cells was observed. SPSS 17.0 statistical software for data analysis.Results Experimental group HSP70,TUNEL-positive cells and HSP70 integrated optical density were significantly different, each group P
【Key words】 Spinal cord injury; Decompression time; Optical density; Heat shock protein70; Cell apoptosis
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.02.005
脊髓损伤（SCI）的发病率随着现代交通业的发展而升高，手术减压治疗急性SCI是一种切实可行的治疗方法，但是在对SCI选择伤后干预性手术治疗时间点上，各临床治疗中心尚没有达成共识[1]。为探讨早期不同时机减压疗效，本实验采用环扎法建立大鼠脊髓损伤模型，对损伤的脊髓早期减压，应用免疫组化法观察HSP70的表达及TUNEL阳性细胞数，光密度测量脊髓细胞的HSP70表达阳性面积，观察HSP70表达与神经细胞凋亡的关系，观察早期减压疗效。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 84只雄性、13周龄、清洁级Sprague-Dawley大鼠，体重270～320 g，平均290.5 g。由浙江省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(浙)20080033。使用随机数字表、安全随机法，分为4组。对照组即A组：仅行椎板切除，n=12，实验组分为B组：8 h脊髓减压，n=24；C组：72 h脊髓减压，n=24；D组：环扎术后不行脊髓减压术，n=24。分别于手术后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d处死后取出脊髓标本。
1.2 主要试剂 （1）Rabbit Anti-Hsp70；（2）即用型SABC试剂盒；（3）细胞凋亡检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；（4）0.01PBS(PH7.2-7.4)；（5）0.01枸橼酸缓冲液（PH6.0）；（6）DAB显色试剂盒；（7）胃蛋白酶消化液(北京中杉金桥生物有限公司)；（8）4%甲醛(皖医弋矶山医院实验外科)。
1.3 动物模型建立 采用环扎法建立大鼠脊髓损伤模型[2]。以5-0普通白色丝线环扎大鼠胸腰段硬脊膜囊建立大鼠急性脊髓损伤压迫模型。1%戊巴比妥钠，30～40 mg/kg，大鼠腹腔内给药麻醉，以T13棘突为中心，取后入路，咬除T13椎板。10倍显微镜下，用测量线环形测量硬脊膜囊周长，测出硬脊膜囊周长(C1)，经代数运算(C2=C1×0.7)获得将硬脊膜囊截面压缩至原截面积70%的周长(C2)，将原测量平面将硬脊膜囊环扎至原截面积的70%。结扎后依层缝合。B组8 h脊髓减压，取出环扎线；C组72 h脊髓减压，取出环扎线。D组保留环扎线。术后常规护理。
1.4 标本采集、制备与HE染色 大鼠模型分别在手术减压后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d五个时间，将对照组和脊髓损伤组的大鼠经心脏灌注取材，灌注后脊髓已被多聚甲醛固定变硬，以环扎损伤部位为中心、取出其上下段共1.5 cm脊髓组织，浸泡于相同甲醛溶液中后固定72 h。损伤下端0.5 cm以4 μm厚度切片，脊髓取冠状面，捞片于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，标签晾干玻片分别行HE染色。
1.5 免疫组织化学染色 分别取脊髓损伤下端组织切片用Rabbit Anti-Hsp70抗体进行SABC免疫组织化学染色，使用DAB显色试剂盒，TUNEL法观察神经细胞的凋亡水平，使用DAB显色试剂盒染色检测，所有实验步骤严格按照该试剂的标准和流程进行。使用数码相机（NIKON-4300日本)对显色的图片摄像。
1.6 光密度测量 在普通光学显微镜（日本Olympus公司）下观察每组不同时间下染色特点。每一染色切片随机取5个高倍视野(10×40)进行显微摄影(Nikon Eclipse 80i显微成像系统)获取图像，调试完成后，维持采集的各项设置不变，一次性采集出所有样本的图像，每张切片至少随机采集5个视野。使用图像分析软件（Image－Pro Plus 6.0美国）对每张切片进行光密度测定。积分光密度(IOD)可反映所测结构的光密度与面积的综合变化，IOD与物质的质量成正比，其数值反映物质的相对含量 [3，4]。
1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行数据分析，各组数据采用均数±标准差（x±s）表示，四组数据均呈正态分布，方差齐性检验采用比较均值单因素方差同性检验，组内组间比较采用一般线性模型单变量方差检验，HSP70阳性细胞数与神经细胞凋亡细胞数相关性采用直线相关分析。以P
2 结果
2.1 HSP70积分光密度 使用图像分析软件（Image－Pro Plus 6.0美国）对每张切片进行光密度测定，在400倍每张切片至少随机采集5个视野。A组偶见阳性面积，各时间点无显著差异。阳性面积D组高于C组，C组高于B组，实验组术后1 d阳性面积增加，术后3 d到达高峰，术后7 d有所降，术后21 d仍然有所表达。实验组组间比较差异有统计学意义（P
2.2 HSP70免疫组化阳性细胞数结果 光镜下分别观察各组各时间点脊髓损伤下端的组织变化，以细胞浆和（或）核棕黄色着色为阳性细胞，在400倍视野下每张切片于灰质取5个视野，分别计数每个视野的阳性细胞数。A组偶见免疫阳性细胞，各时间点无显著差异（见图1：A）。阳性细胞数，D组高于C组，C组高于B组，实验组术后1 d免疫阳性细胞增加，术后3 d到达高峰，术后7 d有所降，术后21 d仍然有所表达。实验组图片见图1:B、C、D、E、F。实验组组间比较差异有统计学意义（P
2.3 Tunel凋亡细胞 凋亡细胞呈棕褐色和棕黄色，胞核固缩颗粒深染，形态不规则，为散在和弥散性分布于损伤区域及周围。在400倍视野下每张切片于灰质取5个视野，分别计数每个视野的阳性细胞数。对照组少见凋亡细胞。凋亡细胞数，D组高于C组，C组高于B组，实验各组术后1 d出现大量凋亡细胞，术后3 d达到高峰，术后7 d、14 d、21 d凋亡细胞逐日减少。各组组间比较差异有统计学意义（P
2.4 HSP70阳性细胞与Tunel细胞凋亡的相关性分析 实验组不同时间点热休克蛋白70阳性细胞、tunel阳性细胞数比较差异均具有统计学意义，两者线性相关系数r=0.685～0.971，对r值进行t检验的假设检验，P
3 讨论
目前治疗脊柱脊髓损伤的主要方法是及时彻底地减压和恢复脊柱稳定性，减少继发性损伤[1]。目前认为细胞凋亡是继发性脊髓损伤的重要组成部分，继发性脊髓损伤中出现的神经元和神经胶质细胞死亡都是继发细胞凋亡的结果[5]。
注：A：空白对照组；B：8 h减压术后3 d；C：8 h减压术后21 d；D：72 h减压术后3 d；E：72 h减压术后21 d；F：未减压术后3 d
当发生脊髓损伤后局部热休克蛋白（HSPs）的表达增加，可对抗脊髓继发性损伤神经细胞凋亡是脊髓继发性损伤的主要机制之一，HSPs可通过以下机制抑制神经细胞凋亡：抑制内源性（线粒体内caspase依赖的）凋亡途径，抑制外源性（受体介导的）凋亡途径，调节Bcl-2家族成员的活性促进核转录因子的活化，抑制一氧化氮(NO)的大量产生减少自由基的毒性作用[6]。其中HSP70属于诱导型HSP70，其在正常细胞中不表达或表达量很少，但在应激源刺激下，表达量显著增加[7]。实验证实HSP70对细胞保护作用，其诱导的数量与保护作用的强弱呈正相关[8]。邵将等[9]实验显示，HSP70表达随时间的延长逐渐增强，损伤后24～48 h达到顶峰，在此期间组织内所有细胞均可见HSP70的阳性表达，这种表达一直持续到损伤后72 h。与本次实验HSP70表达的高峰期较为接近。由于HSP70属于诱导型HSP，其诱导的机制尚不完全清楚，所以单纯手术干预不能诱导其表达增加。因此在今后的研究中，对损伤的脊髓早期减压的同时，短时间诱导出大量HSPs，达到更好地抗脊髓继发性损伤神经细胞凋亡，将是未来治疗脊髓损伤的新路径。
参 考 文 献
［1］ 杨民,徐祝军,党耕町.外科干预性手术治疗时间的选择对急性脊髓损伤预后影响的研究进展［J］.中国脊柱脊髓杂志,2009,19(4):310-313.
［2］ 徐祝军,王兵,杨民.环扎法致大鼠脊髓损伤后早期不同时段减压疗效的评价［J］.中华实验外科杂志,2011,28(7):1191-1192.
［3］ 李涛,范好,刘芳.免疫组织化学图像光密度分析的标准化方法［J］.解剖学杂志,2008,31(5):727-728.
［4］ 李枫.图像分析中光密度参数物理意义的正确理解和使用［J］.解剖学杂志，2009,32(2):271-273.
［5］ 范留欣，马龙，孙长山.大鼠脊髓损伤后MMP一9表达和细胞凋亡的研究［J］.中国医学创新,2010,7（25）:175-176.
［6］ 李健辉,冯世庆.热休克蛋白与脊髓损伤的相关性研究［J］.天津医药,2009,37(6):521-523.
［7］ 朱林波,傅庆国.HSP70-PCs的抗肿瘤作用［J］.中华全科医学,2011,9(8):1281-1282.
［8］ Sale hi AH,Morris SJ,Ho WC,et al.AEG3482 is an antiapoptotic compound that inhibits Jun kinase activity and cell deathth rough induced expression of heat shock protein70［J］.ChemBio,2006,13(2):213-223.
一、心肌预缺血现象
心肌预缺血保护是指预先使心肌经历数次短暂缺血(不至造成不可逆的损伤)，可使其对随后较长时间的缺血和再灌注造成的损伤产生抵抗作用。这一适应性的保护反应首先由Murry等［3］发现并报道。实验犬心肌局部经历数次短暂重复的缺血，预想将造成累积性的ATP消耗。但结果发现，经历首次缺血后，心肌ATP含量并没有随着后面数次缺血进一步减少，7条犬中6条没发生心肌梗死。这一结果与当时普遍接受的观点相矛盾，即重复缺血可造成心肌梗死。进一步实验发现，阻塞犬冠状动脉分支5分钟，接着开放5分钟，重复4次，然后经历40分钟缺血，结果心肌梗死面积只有对照组(没有经历4次预缺血)的25%。在实验动物上引发预缺血保护，理想的预缺血时间是2～5分钟，间隔同样或长一倍的时间，如此重复2～5次，可达到最佳保护效果，又不会造成心肌梗死和室颤［4］。预缺血使心肌在几分钟之内产生保护作用，但持续时间很短，2～4小时后大部分丧失，这一快速适应性保护称早期预缺血保护［5］。随后的研究发现另外存在一种缓慢产生的保护，称延迟预缺血保护，在预缺血24小时后效果明显，持续到72小时以后［4］。随着研究的深入，预缺血的含义被扩大了，引发预缺血保护的方法包括：离体心脏低氧灌注，快速心脏起搏，热刺激，内毒素和基因转移。预缺血保护不但在许多动物如大鼠、兔、犬、猪，而且在人类心脏上也被证实。
二、心肌预缺血保护的机制
近年来学者们对心肌预缺血保护的机制做了大量研究，认为早期预缺血通过受体激活细胞内信息传递链，激活蛋白激酶，而后使ATP依赖性钾通道(KATP)开放产生保护作用［6］。延迟预缺血保护的机制尚不清楚。但许多作者认为与细胞内信息传递链激活和蛋白合成有关［7］。
1.早期心肌预缺血的保护机制有证据表明缺血时神经内分泌应激激素如腺苷、去甲肾上腺素、缓激肽、内皮素、血管紧张素Ⅱ、乙酰胆碱的释放与早期预缺血保护有关，而蛋白质的合成则与此保护无关［8］。有实验表明使用腺苷可使心肌产生预缺血样保护，而在预缺血期或后缺血期使用腺苷受体拮抗剂或腺苷脱氢酶则可消除保护作用［9］。腺苷受体与G蛋白结合，腺苷与受体结合后，G蛋白从结合体中传递信息给效应酶和离子通道［10］。预缺血也可以增加G蛋白的活性。其他应激激素受体如α1肾上腺素能受体、血管紧张素受体、缓激肽受体、内皮素受体、乙酰胆碱能受体均与G蛋白结合并通过其传递信息［11］。G蛋白传递信息给与它结合的磷脂酶C(phospholipaseC)使其激活，后者使细胞膜磷酸肌醇水解，产生两种细胞内第二信使，一种是三磷酸肌醇，可引起细胞内非线粒体钙释放；另一种是二环甘油(diacylglycerol,DAG)。DAG可使本来处于细胞浆内非激活状态的蛋白激酶C(proteinKinaseC,PKC)移到细胞的双层脂膜上，等待后缺血期激活［12］。蛋白激酶C有几种异构体，预缺血时诱导的是新型的钙非依赖型酶。该酶在后缺血和再灌注期通过上述腺苷激活链被激活，它可激活KATP［13］，另外后缺血期心肌细胞内ATP含量降低也可开放KATP。KATP激活后，钾离子外流，心肌动作电位平台期缩短，钙离子内流减少，在亚细胞水平维持钙离子循环所需的高能磷酸键减少，心肌收缩功能减弱，能量需要减少，从而保护了心肌。钾通道开放后亦可显著减轻由白细胞释放氧自由基引起的心肌损伤［14］。
2.延迟预缺血保护机制目前对延迟预缺血的保护机制研究处于初期阶段，有学者认为这一保护的激发因子和信息传导链与早期保护相同。延迟预缺血与蛋白质的基因转录、合成和降解在时间上相吻合，且使用蛋白合成抑制剂可消除延迟保护，故蛋白合成被认为与这一保护机制有关。热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)和抗氧化酶在许多实验中被证实能产生延迟保护作用。预缺血后心肌延迟产生的抗氧化酶可清除后缺血和再灌注期产生的氧自由基。
热休克蛋白是心肌遇热刺激后产生的一种反应性蛋白，正常心肌组织中含量较低，它可防止新合成的多肽链误折和误聚，使其穿过生物膜，并作为补体作用于新合成的多肽链使其有机地折迭和组合。预缺血2小时后，免疫组化测定显示HSP70mRNA含量增高，于24小时后回到正常水平，与此同时HSP明显升高［4］，于72小时后开始下降，其含量与心肌保护作用的程度成正相关，被认为是哺乳动物中作用最强的心肌保护蛋白。它可使损伤的蛋白质多肽链解聚，以便重新折迭和组合，恢复活性。有作者［16］认为热休克蛋白可维持抗氧化酶的活性，增强其清除氧自由基作用。另外，有实验证明热休克蛋白含量与心肌细胞凋亡(apoptosis)数量成反比，而与细胞核转录因子(NF-kB)活性成反比，故提出热休克蛋白通过抑制NF-kB的活性减少心肌细胞的凋亡［17］。
三、心肌预缺血保护的临床价值
预缺血保护在临床上也已得到证实和应用。在心肌梗塞前有数次心绞痛发作(预缺血)的冠心病人与无心绞痛发作的病人相比，其梗死面积小，心源性休克及充血性心衰发生率低。心内直视术中引进预缺血，心肌保护明显优于单用冷晶体停跳液或氧合血停跳液者［18］。低温亦可增强预缺血保护效果。对高危心脏手术病人引入这一内源性的保护机制，可望达到理想效果。
四、研究展望
1.机制方面虽然腺苷-蛋白激酶C-KATP这一预缺血保护的激活途径得到大多数学者认可，但也有作者观察到预缺血并不改变后缺血和再灌注对动作电位的影响；KATP作为最终作用因子亦受到有些学者怀疑。在延迟保护方面，信息传递链与热休克蛋白和抗氧化酶合成的关系尚不明确。有实验提出在延迟保护实验中，热休克蛋白和抗氧化酶并不升高。以上方面均需进一步探讨。
Proteomic analysis of human bone marrowderived mesenchymal stem cells induced to differentiate into osteoblasts
【Abstract】 AIM: To analyze the difference of protein profiles between human bone marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) and osteogenic differentiated MSCs by proteomic approach. METHODS: The MSCs were isolated primarily from bone marrow of adults and detected in cell purity by flow cytometry analyzing cell phenotypes and in cell function by multilineage potential test. The undifferentiated MSCs and osteogenic differentiated MSCs over a period of 14 d were collected and cell total proteins were extracted for finding out the differential expression by proteomic analysis including 2D gel electrophoresis and Peptide Mass Fingerprinting technology. RESULTS: Twentythree differentially expressed proteins were identified by MALDITOFMS analysis. CONCLUSION: Proteomic approach is a high throughput method to screen the key proteins which play important roles in MSCs osteogenic differentiation.
【Keywords】 proteomics; mesenchymal stem cells; protein expression
【摘要】 目的: 探讨用蛋白质组学方法分析人骨髓间充质干细胞（MSCs）定向成骨细胞诱导分化中细胞蛋白表达谱的改变. 方法: 从人骨髓细胞中分离获得MSCs，经细胞表型及多向分化能力测定鉴定MSCs的纯度和功能后，采用定向成骨细胞分化诱导培养体系，于分化后14 d分别提取未分化细胞及分化后细胞的总蛋白，双向电泳分析，确定蛋白差异点，经酶切后行蛋白肽质量指纹谱鉴定差异蛋白表达. 结果: 双向电泳找到38个蛋白差异点，质谱分析鉴定出23个差异蛋白分子表达. 结论: 用蛋白质组学方法可高通量筛选与MSCs定向诱导成骨细胞分化相关的重要蛋白.
【关键词】 蛋白质组学；间质干细胞；蛋白表达
0引言
间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)是一群具有向成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞分化能力的干细胞，存在于成体的骨髓、骨、脂肪和肌肉等组织中. MSCs体外贴壁性使之易于分离纯化，且体外培养的MSCs增殖能力强，是一种具有重要应用价值的种子细胞［1］. 但有关MSCs定向分化的分子机制尚不清楚. 为探讨MSCs定向成骨分化过程中细胞内可能具有调控作用的蛋白分子的变化，我们首先从人骨髓单个核细胞中分离获得MSCs，对所获得的MSCs进行了细胞表型及多向分化能力测定，在鉴定MSCs的纯度和功能后，采用定向成骨分化诱导培养体系诱导MSCs定向成骨细胞分化，对未分化MSCs及分化后细胞总蛋白进行提取，经双向电泳比较蛋白差异点，选择差异点蛋白，酶切后进行蛋白点肽质量指纹谱鉴定分析.
1材料和方法
1.1材料
骨髓取自食道癌手术患者，年龄56～67岁. 主要试剂Dulbeccos modified Eagles medium（DMEM）培养基为Gibco产品，胎牛血清为Stem cell产品，Percoll为Amersham Pharmacia产品，CD34，CD45，CD73，CD105，CD166单克隆抗体为BD公司产品，胰酶、地塞米松、β－甘油磷酸钠、抗坏血酸、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)染色试剂盒、CHAPS为Sigma产品，IPG干胶条(pH310，18 cm)为Amersham Pharmacia产品，碘乙酰胺为Fluka产品，标准蛋白BSA为Pierce产品，其他试剂由本室提供.
1.2方法
1.2.1人骨髓MSCs的分离培养Percoll分离人骨髓单个核细胞，2×105细胞/cm2密度接种于塑料培养瓶中，培养体系为含100 mL/L经筛选胎牛血清的高糖DMEM，48 h后去除非贴壁细胞，每隔3 d换液，至贴壁细胞0.80融合时按3000细胞/cm2接种传代.
1.2.2人骨髓MSCs的鉴定收集3代以后的细胞，按1 μL/1×106细胞分别加入PE或FITC直接标记的抗CD34，CD45，CD73，CD105和CD166等单克隆抗体，室温反应20 min. PBS洗涤后，流式细胞仪检测，每个反应至少收集5000个点数据. 以加入相应同型抗体细胞作为阴性对照，应用相关软件分析［2-3］. 按照文献方法［4］诱导MSCs向成骨细胞分化，用ALP染色鉴定；诱导MSCs向脂肪细胞分化，用油红染色鉴定；诱导MSCs向成软骨细胞分化，阿尔辛蓝染色鉴定.
1.2.3双向电泳
1.2.3.1双向电泳蛋白质样品的制备收集3代以后的MSCs和向成骨诱导分化的细胞，用冷的PBS洗2遍后，加入细胞裂解液(8 mol/L尿素，40 g/L CHAPS，40 mmol/L Tris base)，混匀后用液氮反复冻融，再加入适量RNA酶和DNA酶，冰浴20 min. 4℃离心(14 000 g，30 min)，取上清，Bradford法定量，分装，-70℃保存.
1.2.3.2第一向固相PH梯度等电聚焦（IEF）100 μg（银染）或1 mg（考染）蛋白与重泡涨液（8 mol/L尿素，20 g/L CHAPS，5 μL/L IPG缓冲液，20 mmol/L DTT，痕量溴酚蓝）混合，行等电聚焦，重泡涨与等电聚焦在16℃，以设定程序进行，总电压时间为80 000 V・h.
1.2.3.3平衡等电聚焦结束后，每根IPG胶条用8 mL含SDS的平衡液（50 mmol/L Tris・Cl (pH 8.8)，6 mmol/L尿素，300 mL/L甘油，20 g/L SDS，痕量溴酚蓝）平衡两次，每次15 min，第一次为还原过程，平衡液内加20 mmol/L DTT；第二次平衡为烷基化过程，平衡液内加100 mmol/L的碘乙酰胺.
1.2.3.4第二向垂直平板电泳（SDSPAGE）将平衡好的IPG胶条转移至130 mL/L的丙烯酰胺胶上分离，碱性端旁置蛋白分子量Marker，行SDSPAGE.
1.2.3.5染色及凝胶图像采集分析SDSPAGE胶在硝酸银染色时须经过固定、增敏、显色三步；在考马斯亮蓝染色时，则须染色3 h，然后脱色. 染色后的双向电泳凝胶用凝胶图像扫描仪透射扫描，数字化图象文件采用Amersham Pharmacia公司的二维电泳处理软件（ImageMasterTM 2D Elite 3.01）分析，结合目视，从分子量、等电点等方面比对蛋白分子差异点.
1.2.4蛋白点肽质量指纹谱鉴定
1.2.4.1切胶、脱色、干燥将电泳后凝胶中蛋白质点切出，用干净的解剖刀将胶块切成约1～2 mm3大小，去离子水冲洗，除尽残留的SDS. 用含500 mL/L乙腈、25 mmol/L NH3HCO3的溶液100～200 μL，涡旋混合器震荡约30 min，重复此操作直至胶块中的蓝色完全褪尽. 将胶块在真空干燥器内干燥约20 min.
1.2.4.2酶切及肽段提取在干燥好的胶块上加入3～7 μL胰蛋白酶液（0.01 g/L，配于25 mmol/L NH4HCO3溶液内），4℃放置15 min使酶液完全被吸收，补加5 μL 25 mmol/L的NH4HCO3溶液保湿，37℃温育18～20 h. 收集酶切后的上清，在胶块内加50～100 μL 50 g/L三氟乙酸于40℃放置1 h，收集上清；再加入25 g/L三氟乙酸、500 mL/L乙腈50～100 μL于30℃放置1 h，收集上清；合并上清液离心干燥.
1.2.4.3肽混合物的PMF分析在干燥后的肽混合物内加入3～7 μL 50 g/L三氟乙酸，混匀后，取0.5～1 μL溶液和等体积饱和基质溶液混合，然后加至不锈钢靶上，室温干燥，装靶测定：20 kV，阳离子模式下在Bruker REFLEX Ⅲ型MALDITOFMS(BrukerFranzen， Bremen， Germany)质谱仪上获取数据，用Mascot(matrixscience.cn)软件在NCBInr数据库内进行检索.
2结果
2.1人骨髓MSCs形态骨髓单个核细胞于3 d左右开始伸出突起，2～6 d时细胞增殖较缓慢，逐渐长为梭形，7 d开始细胞增殖迅速，细胞呈旋涡状生长，14 d左右逐渐达到完全融合(图1).
2.2流式细胞学分析MSCs表型研究表明，MSCs具有多种标志分子，有造血干细胞生长因子及间质细胞、基质细胞抗原和细胞外基质受体的表达， 但并不表达CD45，CD34等造血干祖细胞的表面标志. 通过流式细胞学分析，培养的MSCs表达CD73，CD105，CD166，不表达CD34，CD45(图2).
2.3MSCs功能鉴定ALP染色鉴定MSCs向成骨诱导分化，ALP染色MSCs阴性，成骨细胞阳性；油红染色鉴定MSCs向成脂肪诱导分化，油红染色MSCs阴性，成脂肪细胞阳性，可见脂滴堆积；阿尔辛蓝染色鉴定MSCs向成软骨诱导分化，成软骨细胞阳性，存在大量蛋白聚糖基质. 通过MSCs表型和MSCs功能鉴定证实，我们获得了从人骨髓单个核细胞分离培养的MSCs细胞(图3).
2.4双向电泳显示蛋白质差异点的变化MSCs与成骨细胞凝胶图像存在多个蛋白差异点，选取38个差异点，切胶作质谱分析. 经过鉴定，共有23个差异点鉴定出差异蛋白(图4).
2.5质谱分析鉴定差异蛋白鉴定结果表明，大多数蛋白点的出峰情况较好［部分蛋白分子差异点的肽质量指纹谱（PMF），图5］. 用MALDITOF/MS结果进行检索就可以得到比较确定的鉴定结果. 质谱鉴定MSCs和向成骨诱导细胞蛋白差异点的详细情况见表1.表1质谱鉴定的差异蛋白（略）
3讨论
骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，研究证实MSCs可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞，MSCs还可分化为神经元细胞、神经胶质细胞、心肌细胞、内皮细胞. 这些研究结果表明，间充质干细胞已超越了传统意义上只能分化为间质组织的概念. 细胞分化的实质是细胞内基因的选择性表达，导致细胞新的特异性的蛋白质的合成，从而在生化、结构及功能上发生变化. 对细胞内基因的结构与功能的研究最终需定位于细胞内蛋白质的结构与功能的研究. 因此我们应用蛋白质组学实验技术检测MSCs定向诱导分化为成骨细胞后蛋白表达的差异，期望发现对MSCs的诱导分化起作用的调控蛋白，从功能蛋白质组学的高度阐述MSCs分化过程中其相关蛋白质的含量与修饰的变化，以便更深入地阐明MSCs定向分化的分子机制. 我们经过筛选，从38个蛋白差异点中鉴定出23个差异蛋白. 在这些差异蛋白中，微管蛋白和骨架蛋白占相当大的比例，如Moesin，β微管蛋白、cofilin 1，平滑肌蛋白、SM22alpha. 由于MSCs诱导分化成成骨细胞，微管蛋白和骨架蛋白的表达必然增加. 我们也找到了2个感兴趣的差异蛋白：热休克蛋白27和KIAA0120. 热休克蛋白27是热休克蛋白家族中的一员，作为一种分子伴侣，它参与一系列细胞活动，包括细胞内蛋白聚集的抑制、细胞骨架蛋白的动力学、细胞生长与细胞分化等. 热休克蛋白27的诱导和表达与肌动蛋白和微管蛋白的结构建造紧密相连，通过磷酸化作用稳定细胞肌丝，从而在细胞保护方面发挥作用［5-6］. 近年来的研究证实，热休克蛋白27通过几种不同的机制参与细胞凋亡，有关热休克蛋白27参与细胞凋亡的信号传导通路已经成为这一领域研究的热点之一. 热休克蛋白27能维持细胞内氧化还原的动态平衡和线粒体的稳定，通过与细胞色素C的相互作用，调节细胞行使细胞凋亡功能［7］. 在以后的实验中，我们会围绕热休克蛋白27基因和蛋白作一些相关研究. 我们另一个感兴趣的差异蛋白是KIAA0120. KIAA0120是KIAA家族中的一员. 目前对KIAA的研究主要集中于基因水平，对KIAA蛋白的结构与功能所知不多［8-9］. 我们应用反转录PCR（RTPCR）方法观察到MSCs定向诱导分化为成骨细胞后，KIAA1077基因的表达上调（资料未显示）. 对KIAA基因和蛋白的研究也是我们以后研究的重点之一.
参考文献
［1］Deans RJ， Moseley AB. Mesenchymal stem cells: Biology and potential clinical uses ［J］. Exp Hematol， 2000，28:875-884.
［2］Barry FP， Boynton RE， Haynesworth S， et al. The monoclonal antibody SH22， raised against human mesenchymal stem cells， recognizes an epitope on endoglin(CD105) ［J］. Biochem Biophys Res Commun， 1999，265(1):134-139.
［3］Barry F， Boynton R， Murphy M， et al. The SH23 and SH24 antibodies recognize distinct epitopes on CD73 from human mesenchymal stem cells［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2001，289 (2):519-524.
［4］Pittenger MF， Mackay AM， Beck SC， et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells ［J］. Science， 1999，284(5411):143-147.
［5］Bruder SP， Jaiswal N， Haynesworth SE. Growth kinetics， selfrenewal，and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation［J］. J Cell Biochem， 1997，64:278-294.
［6］Kamiya H， Zhangm W， Sima AAF. Apoptotic stress is counterbalanced by survival elements preventing programmed cell death of dorsal root ganglions in subacute Type 1 diabetic BB/Wor rats ［J］. Diabetes， 2005，54:3288-3295.
［7］Lee1 JS， Zhang MH，Yun1 EK， et al. Heat shock protein 27 interacts with vimentin and prevents insolubilization of vimentin subunits induced by cadmium［J］. Exp Mol Med， 2005，37(5): 427-435.
调节体温 让孩子适度出点汗，可帮助体内排出多余的热量，维持体温的恒定，有效减少热对酶和结构蛋白质的伤害，增强免疫力，维护孩子的健康。
防范中暑 儿童是中暑的高发人群，这与有些孩子体内的热休克蛋白数量过低有关。热休克蛋白是指细胞在应激原特别是环境高温诱导下所生成的一组蛋白质。如果长期享受空调，怕热怕流汗，不进行耐热锻炼，体内的热休克蛋白数量就少。
抵御病菌 汗液中的乳酸与皮脂腺分泌的脂肪酸，是杀灭病原微生物的化学武器，可杀死皮肤表面大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和白色念珠菌等致病菌，维持皮肤的生态平衡，防范疖痈等皮肤病。
帮助排毒 皮肤是最大的排泄器官，人体内每天会产生大量的代谢废物，并随着汗水排泄出去，从而使人体内环境保持洁净，各脏器发挥正常的生理功能。
增进食欲 孩子活动出汗后，促进了身体的气血运行，胃肠道的蠕动和消化液的分泌正常，有利于对食物的消化吸收，胃口好，吃饭香。
出汗是夏天孩子保健的法宝，因此我们要注意维护好孩子的汗腺健康――
防止汗腺疲劳
汗腺分泌的汗液中99％是水分，其余是氯化钠、氯化钾、水溶性维生素及尿素等。夏季天气炎热，出汗过多会丢失众多物质，影响机体的健康。比如，钠离子丢失太多就无力统帅“水兵”，汗腺会不停地分泌汗液，如不及时补充盐分，时间一长，汗腺就会发生疲劳，影响排汗功能。体内缺少盐分，水分丢失过多，水和电解质的平衡失调，体温调节中枢失灵而导致中暑，严重者危及生命。
因此，夏天要注意孩子的饮食营养，合理调配膳食，平时常吃些新鲜蔬菜瓜果，补充维生素及矿物质。孩子在外面跑跳玩耍时常会汗水淋漓，妈妈可让孩子多次少量喝些淡盐开水、绿豆汤或防暑的清热饮料；西瓜是消暑佳品，享有“天然白虎汤”之美称，每天吃点西瓜大有裨益。同时要给孩子创造一个温湿度适宜、空气清新的室内环境，既避免了孩子出汗过多，又防止汗腺发生疲劳。
保持皮肤清洁
夏天孩子出汗多，如不注意卫生，皮肤极易变脏，灰尘污垢会堵塞汗孔，影响汗液排泄，容易引起汗孔角质层的炎症，还会导致汗管破裂，形成痱子，如继发细菌感染，会变成痱毒或疖痈，严重者引起毒血症或败血症。
因此，夏天要天天给孩子沐浴洗澡，保持皮肤清洁，有利于汗腺导管通畅。但洗澡要讲究科学，当孩子在剧烈活动后一身大汗时，千万不能带孩子到池塘或河水中洗澡，更不可对着自来水猛冲身体，以免热身子受到冷水的剌激后，皮下血管急剧收缩，汗孔闭塞，引发感冒、急性关节痛等病，严重者可导致肢体瘫痪。所以，运动后要休息半小时，等汗干后再去洗澡。洗后及时擦干身体，穿好衣服。
芍药苷（paeoniflorin，PF）是中药芍药的主要有效单体成分。芍药Paeonia lactiflora Pall具有清热凉血、散淤止痛、活血化淤、调节免疫之功能。既往研究证明芍药苷有抗自由基损伤，抑制细胞内钙超载和抗神经毒性等活性，体内实验证明其有降低血液黏度、抗血小板聚集、扩张血管、改善微循环、抗氧化、抗惊厥等作用。现经国内外进一步研究，发现其具有神经保护作用。以下对芍药苷的神经保护作用的研究进展作一综述，为进一步开发提供依据。
1 对脑缺血-再灌注损伤的保护作用
脑缺血-再灌注损伤后由于脑缺血后脑细胞缺血缺氧，脑细胞膜上Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶失活，ATP含量迅速下降、功能衰竭，造成脑组织能量代谢障碍及自由基连锁反应，使生物膜的运输功能发生障碍，引起水和电解质代谢紊乱，而导致脑细胞损伤、水肿。在动物脑缺血-再灌注损伤模型上观察到芍药苷有保护作用。
孙蓉等［1］观察芍药苷对大鼠脑缺血后再灌注期间血脑屏障及脑缺血神经病理改变症状、脑血流量的影响，采用大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤实验模型，以神经行为学、脑组织含水量、病理组织学检查、血脑屏障通透性、脑血流量为指标，结果发现与模型对照组比较，局灶性脑缺血1 h再复灌3 d后，应用芍药苷的各组动物的神经行为学、脑组织含水量、组织病理学改变和血脑屏障通透性均得到改善，大脑局部血流量显著增加，说明芍药苷对脑缺血后脑水肿、血脑屏障、大脑局部血流量等具有保护作用；另外［2］，用沙土鼠双侧颈总动脉夹闭脑缺血再灌注模型，于再灌注后48 h取脑皮质测定Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、乳酸、NO和NOS水平，结果发现与假手术对照组比较，缺血再灌注后48 h脑组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性均降低，NO含量和NOS活性降低，而乳酸含量无明显变化；与模型对照组比较，芍药苷高、中、低剂量均可不同程度地防止缺血再灌注48 h后Na+-K+-ATP酶活性的降低，增加Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性，增加NO含量，提高NOS活性，结论认为芍药苷通过调节脑内能量代谢和NO的生成而发挥抗脑缺血作用。
Chen DM等［3］在大脑中动脉闭塞再灌注模型上研究芍药苷预处理诱导延缓神经蛋白的作用机制，在鼠大脑中动脉闭塞后再灌注24 h的实验前48 h分别应用20，40 mg/kg芍药苷预处理能明显降低死亡率，减少大脑梗塞面积，减少神经细胞丢失。在大脑中动脉闭塞再灌注后24，48 h， 5 d予20 mg/kg芍药苷也有相似作用；应用比较蛋白组学鉴定芍药苷预处理诱导的蛋白表达，发现芍药苷预处理后相关蛋白表达水平改变，20种升高，另22种降低；一系列相关蛋白、分子包括NO系统、神经损害标记物、促分裂素蛋白酶等参与了芍药苷预处理的作用机制。
Liu DZ等［4］在大鼠短暂性局部脑缺血模型（结扎大脑中动脉1.5 h）及持久局部脑缺血模型上，皮下注射芍药苷2.5 mg·kg-1 及5mg·kg-1均能减少神经细胞缺失及减少脑梗塞面积，且呈量-效关系；这种神经保护作用能被腺苷A1受体拮抗剂DPCPX所抑制。
2 对慢性动脉性脑缺血的保护作用
Xiao L等［5］在大脑中动脉闭塞模型上观察芍药苷的作用，应用大脑中动脉闭塞造成慢性（4周）一过性脑缺血大鼠模型，观察脑梗塞面积、神经系统症状、伸舌动作、水迷宫移动等指标；结果发现1 d（10 mg/kg，2次/d）或7 d（2.5～10 mg/kg，2次/d）皮下注射芍药苷法均能起减少脑梗塞面积、改善神经系统症状等保护作用。
3 保护神经细胞作用
3.1 抑制细胞凋亡 研究证实［6］脑缺血-再灌注损伤后4h出现凋亡细胞，24 h达高峰，并持续到96 h。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株PC12细胞广泛应用于神经生理和神经药理学研究。孙蓉等［7］探讨一氧化氮诱导PC12细胞凋亡及芍药苷的保护作用的机制，应用MTT和乳酸脱氢酶活性测定细胞存活率，DNA凝胶电泳观察DNA的断裂情况，流式细胞仪测定细胞凋亡率、检测线粒体跨膜电位，结果发现硝普钠(SNP)可诱导PC12细胞凋亡，细胞线粒体跨膜电位明显下降，预先经过芍药苷处理后，SNP诱导的PC12细胞凋亡明显减少，同时明显减弱一氧化氮对线粒体跨膜电位的影响，说明芍药苷可抑制一氧化氮诱导PC12细胞凋亡，其作用机制可能与其稳定细胞线粒体跨膜电位有关。
3.2 活化腺苷A1受体，保护神经细胞已知的腺苷受体有4种亚型(A1、A2a、A2b及A3 受体)，均属于与G蛋白耦联的受体家族，可与相应的G蛋白耦联，介导广泛的生物学效应，进而调节腺苷酸环化酶、鸟苷酸环化酶、离子通道及磷脂酶的活性［8］。腺苷作用于A1受体，可抑制神经元的兴奋性，从而降低能量的消耗；另一方面，腺苷可以扩张局部脑血管，增加受损脑区的血流量，从而增加细胞的能量供应［9］。Liu HQ等［10］研究发现芍药苷有对帕金森病小鼠模型的神经保护作用；皮下注射芍药苷2.5及5 mg·kg-111 d，在注射第8天时开始注射MPTP 20 mg·kg-1，1次/d，共4次，观察到芍药苷能防止黑质及纹状体神经纤维运动徐缓或死亡；另一实验方法是先注射4次MPTP，在最后1次注射1 h后皮下注射芍药苷2.5及5 mg·kg-13 d，1次/d，观察到芍药苷能减轻多巴胺能神经变性的作用，且呈量-效关系；用5 mg·kg-1芍药苷处理能明显减少MPTP诱发的促炎症反应因子增量调节及抑制小神经胶质细胞及星形细胞的激活；每次注射芍药苷前15 min应用腺苷A1受体拮抗剂预处理，能拮抗芍药苷的神经保护作用；据此推测芍药苷能活化腺苷A1受体，起神经细胞保护作用。
3.3 对抗兴奋性氨基酸海人藻酸所致的神经细胞损伤 吴玉梅等［11］探讨芍药苷是否促进培养皮层神经细胞的存活，并对抗兴奋性氨基酸海人藻酸(KA)所致的神经损伤，解剖分离15 d胚胎小鼠皮层神经细胞，接种于24孔板中加药培养，台盼蓝染色细胞，相差显微镜及免疫组织细胞化学方法进行形态学观察，结果发现:①加入芍药苷20.8和41.6 mg·L-1培养4 d增加神经细胞存活数量，降低死亡率；②加入KA 50 μmol·L-1 作用30 min，神经元肿胀，失去折光性，核偏位，死亡率增高，预先加入芍药苷20.8和41.6 mg·L-1 培养4 d，可对抗KA所致的神经损伤，结果证明芍药苷可增加神经细胞存活数量，降低死亡率，对抗KA所致的兴奋性神经损伤，但其机理有待进一步研究。
3.4 与脑星形胶质细胞的关系Liu J等［12］研究芍药苷对大鼠慢性脑供血不足的保护作用，持续结扎颈动脉7周后，处死大鼠，应用免疫组化技术标记脑海马神经细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞，结果发现慢性供血不足可致大鼠脑星形胶质细胞、小胶质细胞增多，而应用芍药苷后这些细胞没有增多；大鼠慢性供血不足后星形胶质细胞中NF-Kβ表达增加，而芍药苷能减少NF-Kβ表达。结果表明芍药苷能减轻慢性脑供血不足引起的认知障碍，可能机制是芍药苷诱导相关脑神经蛋白生成。我们知道星形胶质细胞的作用不仅仅是支持和营养神经元，还参与了神经元发育至神经损伤的各种复杂过程。芍药苷能抑制星形胶质细胞的活性似与芍药苷的神经细胞保护作用矛盾。但吴玉梅等［13］研究发现芍药苷对星形胶质细胞活性有明显的抑制作用，推测芍药苷促进神经细胞活性的作用是一种直接的作用，而不是通过胶质细胞间接影响神经细胞。
3.5 阻断钠通道，抑制钠内流，减轻脑缺氧损伤 钠通道失活，钠钙交换障碍，持续钠向内流是细胞缺氧损伤的主要机制。Zhang GQ等［14］应用膜片钳技术，研究芍药苷阻断小鼠海马CA1区神经元细胞钠通道，结果发现，以抑制频率依赖及浓度依赖钠通道方式，0.3 mmol/L芍药苷把最大激活电位从-40mV提高到-30mV，增大稳态激活曲线及失活曲线，钠通道从失活态恢复的时间从（4.2±0.7）ms延迟到（9.8±1.2） ms。说明芍药苷有阻断脑海马CA1区细胞钠通道的作用。这可能是芍药苷保护脑缺氧细胞损伤的机制之一。
3.6 对大脑海马CA1区损害的保护作用 Tsuda T等［15］在钴致大鼠癫痫模型上研究芍药提取物对大脑海马CA1区损害的保护作用，连续30 d给大鼠1 g/kg/d灌胃后，应用钴造成大鼠癫痫模型，可观察到大脑皮层频发棘波及大脑海马CA1区损害能被芍药提取物防护，单用芍药苷或天然鞣酸没发现类似作用，但联用两者有防护作用。
3.7 对细胞钙超载损伤的保护作用 杨军等［16］探讨芍药苷对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆株PC12细胞钙超载损伤模型的保护作用及其机制，采用组织培养法，制备氧化钾及N-甲基-D-门冬氨酸诱导的钙超载损伤模型，结果形态学检查发现芍药苷对两种不同类型的钙超载损伤模型中PC12细胞均具有明显保护作用，MTT法活细胞测定提示芍药苷可显著提高损伤模型中PC12细胞存活数，减少胞内乳酸脱氢酶渗漏，并显著减少细胞内钙离子浓度，说明芍药苷对钙超载所致PC12细胞损伤有显著的保护作用，其作用机制可能与抑制钙离子内流有关。另研究表明［17］，芍药苷对咖啡因型、氯化钾型、N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)型细胞内超载损伤均具有保护作用，且随着浓度的增加，芍药苷保护作用更加明显，强度依次为氯化钾、咖啡因型和NMDA型。芍药苷也能抑制藜芦碱诱导的大鼠心房收缩和心律失常。这些均显示它可能具有钙通道阻断作用［18］。
4 对小鼠学习记忆能力的改善作用
孙蓉等［19］观察芍药苷对东莨菪碱致小鼠记忆形成障碍、亚硝酸钠致记忆巩固障碍和乙醇致记忆再现障碍的影响。采用小鼠跳台法和Y一型迷宫法， 结果发现芍药苷对小鼠学习记忆功能有明显的促进作用，对东莨菪碱致小鼠记忆形成障碍、亚硝酸钠致记忆巩固障碍和乙醇致记忆再现障碍有明显的改善作用，且呈一定的量效关系，说明芍药苷对东莨菪碱、亚硝酸钠和乙醇致小鼠记忆获得、巩固及再现障碍均有不同程度的改善作用。
Tabata K［20］研究芍药苷对腺苷A1受体介导记忆障碍的作用，对小鼠训练实验后24 h应用选择性腺苷A1受体激动剂能引起记忆行为损害，腹膜注射芍药苷及腺苷A1受体拮抗剂DPCPX能减轻这种损害，体外实验显示腺苷能剂量依赖性地降低棘波振幅及减少大脑海马的长时程增强(LTP)的强直刺激，DPCPX能拮抗腺苷的这些作用，而单用DPCPX则对棘波振幅及LTP没有影响；芍药苷能拮抗腺苷的减少大脑海马的长时程增强(LTP)的强直刺激作用，而不能拮抗腺苷的降低棘波振幅作用；结果说明芍药苷能改善腺苷A1受体介导的认知、记忆障碍。
Tabata K等［21］还通过记录大鼠脑海马CA1区的群峰电位，M1、M2受体拮抗剂东莨菪碱和选择性M1受体拮抗剂哌吡卓酮均能抑制群峰电位的长时程增强，而M2受体拮抗剂AF-DX116则不能，单用芍药苷不能起抑制作用，但能对抗东莨菪碱和哌吡卓酮的抑制作用，结果说明芍药苷对抗M1受体拮抗剂的作用可能是芍药苷改善因胆碱能功能障碍引起的空间认知缺损的机制。
5 诱导热休克蛋白生成
热休克蛋白是一种分子伴侣，其功能由帮助蛋白质正确折叠、移位、维持和降解，具有调节蛋白功能及抗蛋白质毒性作用，有对细胞的结构维持、更新、修复、免疫等有重要作用。机体应激时诱生热休克蛋白，在分子水平上对机体保护作用。Yan D等［22］研究发现而芍药苷不但能加强诱导热休克蛋白，也可直接诱导热休克蛋白;应用芍药苷处理细胞能加强热休克基因转录因子磷酸化及结合脱氧核糖核苷酸的能力，提示芍药苷诱导热休克蛋白的机制是活化热休克基因转录因子，即使高剂量也未见产生毒性作用。
6 舒张动脉血管
Tsai HY等［23］发现单用芍药苷对离体大鼠大动脉没有作用，但能减轻藜芦碱的收缩动脉作用，尤其是对有内皮组织的大动脉，应用藜芦碱预处理能增强新福林和去甲肾上腺素的收缩动脉作用，去甲肾上腺素介导的藜芦碱收缩动脉作用的舒张与NO及cGMP的增加有关，藜芦碱收缩动脉作用是通过增加细胞内钙引起，而芍药苷可抑制细胞内钙的增加，因此有减轻藜芦碱的收缩动脉作用。
7 抗血栓形成作用
Ye J等［24］在光化学反应微血管血栓形成模型上观察到芍药苷有抗血栓形成作用，芍药苷能延长凝血时间；其机制可能与芍药苷抑制花生四烯酸代谢，增强组织型纤维蛋白溶煤原活化剂活性，以及对抗氧自由基的作用。
8 结语
综上所述，芍药苷是芍药的主要有效成分，在体内能通过血脑屏障， 对脑缺血-再灌注损伤有保护作用。通过抑制细胞凋亡、 活化腺苷A1受体、阻断钠通道，抑制钠内流、减轻细胞钙超载损伤等作用机制发挥保护神经细胞作用。还有抗血栓形成、诱导热休克蛋白生成、舒张动脉血管及镇痛作用。也能改善小鼠学习记忆能力。目前，有关芍药苷的神经保护作用研究仅限于动物实验，具体机理还不太清楚，有待进一步深入研究。
【参考文献】
［1］ 孙 蓉，吕丽莉，郭守东，等.芍药苷对局灶性脑缺血模型及血脑屏障的影响［J］.哈尔滨商业大学学报，2005，21（4）：406.
［2］ 孙 蓉，吕丽莉，刘国卿. 芍药苷对沙土鼠不全性脑缺血后能量代谢、NO和NOS的影响［J］.中国中药杂志， 2006，31(10): 832.
［3］ Chen DM， Xiao L， Cai X， et al. Involvement of multitargets in paeoniflorin-induced preconditioning［J］. J Pharmacol Exp Ther， 2006，319(1):165.
［4］ Liu DZ， Xie KQ， Ji XQ，et al. Neuroprotective effect of paeoniflorin on cerebral ischemic rat by activating adenosine A1 receptor in a manner different from its classical agonists［J］.Br J Pharmacol， 2005，146(4):604.
［5］ Xiao L， Wang YZ， Liu J， et al.Effects of paeoniflorin on the cerebral infarction， behavioral and cognitive impairments at the chronic stage of transient middle cerebral artery occlusion in rats［J］. Life Sci，2005，12;78(4):413.
［6］ Renolleau S，Aggoun ZD，Ben-Are Y，et al.A model of transient unilateral focal ischemia with reperfusion in the P7 neonatal rat morphological change indicative of apoptosis［J］.Stroke，1998，29：1454.
［7］ 孙 蓉，武栋栋，刘国卿. 一氧化氮诱导PC12细胞凋亡及芍药苷的保护作用［J］.中国临床药理学与治疗学，2005， 10(11):1266.
［8］ Collis MG， Hourani SMO. Adenosine receptor subtypes［J］.Trends Pharmac Sci， 1993， 14:360.
［9］ Sweeney MI.Neuroprotective effects of adenosine in cerebral ischemia:window of opportunity［J］.Neurosci Biobehav Rew，1997，21(2):207.
［10］ Liu HQ，Zhang WY，Luo XT，et al. Paeoniflorin attenuates neuroinflammation and dopaminergic neurodegeneration in the MPTP model of Parkinson's disease by activation of adenosine A1 receptor［J］. Br J Pharmacol. 2006，148(3):314.
［11］ 吴玉梅，许汉鹏，王春婷，等. 芍药苷对培养小鼠皮层神经元的保护作用［J］.中国药理学与毒理学杂志， 2002，16(3):172.
［12］ Liu J， Jin DZ， Xiao L， et al. Paeoniflorin attenuates chronic cerebral hypoperfusion-induced learning dysfunction and brain damage in rats［J］. Brain Res， 2006，1089(1):162.
［13］ 吴玉梅，许汉鹏，王春婷，等. 芍药甙对体外培养大鼠星形胶质细胞活性的作用［J］.解剖学报，2002，33（4）：430.
［14］ Zhang GQ， Hao XM， Chen SZ， et al. lockade of paeoniflorin on sodium current in mouse hippocampal CA1 neurons［J］. Acta Pharmacol Sin， 2003，24(12):1248.
［15］ Tsuda T， Sugaya A， Ohguchi H，et al. Protective effects of peony root extract and its components on neuron damage in the hippocampus induced by the cobalt focus epilepsy model［J］. Exp Neurol. 1997，146(2):518.
［16］ 杨 军，何丽娜，何素冰. 芍药苷对氯化钾及N一甲基一D一门冬氨酶诱导诱导的PC12细胞钙超载损伤的保护作用［J］.中国新药杂志，2001，10(6):426.
［17］ 杨 军，何丽娜，何素冰，等．芍药甙对大鼠皮层神经细胞钙超载损伤的保护作用［J］.中国药理学与毒理学杂志，2001，16(3)：l64.
［18］ Tsai HY，Lin YT， Chen YF，et al．The interaction of Paconiflorin and veratrine on isolated rat atria［J］．J Ethnopharmacol，1997，57(3)：169.
［19］ 孙 蓉 ，吕丽莉 ，刘国卿. 芍药苷对小鼠学习记忆能力的影响［J］.中药药理与临床，2006，22(1):23.
［20］ Tabata K， Matsumoto K， Murakami Y， Ameliorative effects of paeoniflorin， a major constituent of peony root， on adenosine A1 receptor-mediated impairment of passive avoidance performance and long-term potentiation in the hippocampus［J］. Biol Pharm Bull，2001，24(5):496.
［21］ Tabata K， Matsumoto K， Watanabe H.Paeoniflorin， a major constituent of peony root， reverses muscarinic M1-receptor antagonist-induced suppression of long-term potentiation in the rat hippocampal slice［J］. Jpn J Pharmacol. 2000，83(1):25.
［22］ Yan D， Saito K， Ohmi Y，et al. Paeoniflorin， a novel heat shock protein-inducing compound. Cell Stress Chaperones［J］. 2004 ，9(4):378.
【摘要】 目的 探索结肠癌colo205细胞系对exosomes的分泌功能，并分析热休克作用对表面蛋白CD44v6表达量的影响。方法 采用超速离心法分离colo205细胞分泌的exosomes和热休克处理后colo205细胞分泌的exosomes(Heat shocked exosomes，HSExo)，经220 nm微孔滤膜过滤纯化后，在透射电镜下观察其形态，并用SDSPAGE方法分析细胞与exosomes的蛋白组成，Western Blot检测表面CD44v6的表达情况。结果 经透射电镜观察，正常exosomes与HSExo形态基本相似，均为圆形或椭圆形膜性囊泡，直径大多在30～100 nm之间，且经热休克处理的colo205细胞及其分泌的HSExo，在CD44v6表达量上较正常colo205细胞及exosomes显著上调(P
【关键词】 结肠癌;exosomes;CD44v6;肿瘤免疫
外脂体是由细胞多囊体形成的一种膜性小囊泡，其来源十分广泛，其特异功能与来源细胞密切相关：外脂体携带着许多种独特的蛋白，如黏附蛋白，热休克蛋白等，在信号传导中起重要作用。作为一种免疫治疗的新手段，外脂体可以应用于肿瘤治疗。CD44v6是CD44 的一种拼接变异体，其表达可改变肿瘤细胞表面细胞黏附分子的构成和功能，有助于肿瘤细胞获得转移潜能，起到介导细胞间黏附、参与信号传递等作用，并与肿瘤的预后密切相关。目前，结肠癌外脂体肿瘤疫苗的研究才刚刚起步，主要是从LoVo、LS174T等细胞系中分离外脂体〔1，2〕，对其肿瘤免疫功能有较多的研究，但对结肠癌细胞分泌的外脂体表面相关蛋白的研究相对较少，尤其对其表面CD44v6的检测至今在国内外未见报道。因此，本课题组拟采用超速离心法从结肠癌细胞系中分离外脂体，对其表面分子CD44v6的表达水平进行检测，并分析热休克作用对CD44v6表达量的影响，为结肠癌亚细胞疫苗的研究及应用提供一定的理论依据。
1 资料与方法
1.1 材料 RPMI1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司，胰蛋白酶、对钠十二烷基硫酸盐(SDS)均购自美国Sigma公司，丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、预染蛋白Marker、均购自北京鼎国生物技术有限责任公司，硝酸纤维素转印膜购自美国PALL公司，鼠抗人CD44v6单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HPR)标记山羊抗小鼠IgG均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、超敏化学发光(ECL)试剂盒购自碧云天生物技术研究所，人结肠癌colo205细胞株由吉林大学药学院生物工程实验中心提供。JEM2000EX透射电子显微镜购自日本电子公司、OptimaTM LE80K 低温超速离心机购自美国Beckman Coulter公司，Olympus IX70倒置显微镜购自日本Olympus公司。
1.2 结肠癌细胞的培养和热休克处理 实验选用结肠癌Colo205细胞株，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液于37℃、5% CO2条件下进行常规原代培养，待细胞长满培养瓶底80%后，拟提取exosomes，将培养细胞用不含小牛血清的RPMI1640洗涤2次，并继续培养48 h，台酚蓝染色检测细胞活力(细胞活力应大于97%)。此后，细胞于43℃孵育2 h，再于37℃恢复4 h〔3〕，倒置显微镜下观察细胞状态变化。
1.3 热休克源性exosomes(Heat shocked exosomes，HSExo)和非热休克源性exosomes的提取及纯化〔4，5〕 收集结肠癌细胞培养上清液，依次经300 r/min离心5 min、1 200 r/min离心20 min和6 000 r/min离心30 min，去除上清液中的细胞碎片等颗粒后，再以100 000 r/min离心60 min，收集沉淀，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗1次。弃上清液，加入20 μl PBS重悬沉淀即为exosomes。-80℃冻存备用，使用前用0.22 μm滤膜过滤纯化。
1.4 电镜观察分析 取5 μl exosomes和HSExo，滴于载样铜网上，滤纸吸干液体，在滴加2%磷钨酸染液，负染1 min，待白炽灯烤干后约10 min，用透射电镜观察并照相。
1.5 结肠癌细胞及exosomes表面蛋白的分离 取经热休克处理和未处理的结肠癌细胞和相应的exosomes，分别放入细胞裂解液中，与冰上放置1 h，制得溶解物〔1〕。于100℃处理10 min，进行蛋白质变性，用二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度。
1.6 Exosomes表面蛋白CD44v6的检测 设正常colo205细胞组、热休克处理的细胞组、正常外脂体组和热休克外脂体组，各组设3个复孔，经蛋白浓度检测后，各组以等量蛋白上样，进行8% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。电泳后将凝胶中的蛋白质通过湿法电转移方法，转移到硝酸纤维素膜上，并用含5%脱脂牛奶的Tris缓冲盐溶液(TBS)封闭硝酸纤维素膜，37℃作用3 h，将鼠抗人CD44v6单抗用含5%脱脂牛奶的TBS以1∶1 000稀释，膜与一抗置于封闭塑料袋内，4℃过夜。用TBS洗膜3次，再与辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG 37℃下结合1 h，用TBS充分洗膜3次，经ECL化学发光试剂作用显色后，于暗盒内曝光，X光片显影定影后分析实验结果。
1.7 统计学分析 用Quantity one v4.62图像分析软件进行分析，结果以x±s表示，组内采用t检验。
2 结 果
2.1 热休克colo205细胞的观察 未经热休克处理的colo205细胞大多处于贴壁生长状态，少量悬浮生长;热休克处理之后悬浮细胞明显增多，但镜下未见形态学改变，见图1。图1 正常和热休克处理的colo205细胞(×200)
2.2 结肠癌colo205细胞源exosomes和HSexo的电镜观察 透射电镜下可见exosomes和HSexo大小不一，直径基本在30～100 nm之间，个别较大，二者形态基本相似，无明显差别，均为圆形或椭圆形膜性囊泡，并且在局部有相互聚集的倾向，见图2。
2.3 SDSPAGE结果 从SDSPAGE结果可见，在220 kD与105 kD之间，各样品组均在一定位置出现条带，但两个细胞组与两个exosomes组的条带位置有较大差异，而针对细胞组和exosomes组的组内比较条带位置差异并不显著。CD44v6的分子量约为190 kD，电泳结果显示在此区域有蛋白条带存在(1组为正常colo205细胞，2组为热休克colo205细胞，3组为正常外脂体，4组为热休克外脂体)。见图3。图2 exosomes和HSExo阳性图片(×100 000)图3 SDSPAGE结果
2.4 Western印迹结果分析 正常colo205细胞、热休克处理的细胞、exosomes和HSexo 4组经显影定影后均可见清洗条带。见图4。用Quantity one v4.62图像分析软件对Western印迹结果进行分析，结果显示经热休克处理后，CD44v6在细胞及exosomes上均出现了表达上调的现象(P
3 讨 论
肿瘤来源的exosomes(Tumor Exosomes，TEX)，在形态学、密度以及一些膜标志物的表达上与抗原提成细胞(APCs)来源的exosomes相似〔5〕。TEX中存在肿瘤抗原运载系统以及与细胞靶向性有关的蛋白(CD9)，这表明exosomes是一种抗原传递系统，能将肿瘤抗原转移到APCs。另外，TEX中含有许多肿瘤细胞所共有的共同抗原，TEX能将其转移到DC，导致交叉性呈递的CTL反应〔6〕。热休克反应是机体受到高温、缺氧、重金属离子、紫外线照射等理化因素的作用后，所产生的一种保护机体免受损伤的应激反应。热休克蛋白是在热休克反应作用下，启动热休克蛋白基因选择性合成的一组高度保守的蛋白质分子家族。近年来研究发现，人类肿瘤细胞中存在热休克反应，与肿瘤的生长、增殖及凋亡密切相关，表明热休克处理结肠癌细胞的方法，使细胞某些蛋白的表达上调，TEX中相应的蛋白含量也随之增加〔1〕;另外，热休克处理可以在一定程度上提高TEX的产量〔7〕。在本实验中，CD44v6表达上调的现象与相关研究一致，但并未发现热休克作用可提高结肠癌源TEX的产量，所以认为：不同细胞系的热休克反应往往有所区别，作用方式的差异常导致作用结果不尽一致，热休克处理不一定提高每种细胞系exosomes的产量。热休克作用会对exosomes产生影响，但作用机制还需进一步探索与研究。
参考文献
1 Chen W，Wang J，Shao C，et al.Efficient induction of antitumor T cell immunity by exosomes derived from heatshocked lymphoma cells〔J〕.Eur J Immunol，2006;36(6):1598607.
2 Yang S，Wang HP，Wang XY，et al.Expression of CD44V6 in parotid pleomorphic adenoma and carcinoma expleomorphic adenoma〔J〕.Expert Opin Investig Drugs，2010;19(1):1018.
3 刘 婷，华 川.树突状细胞抗肿瘤免疫的研究进展〔J〕.重庆医学，2009;38(16):20902.
4 Li XB，Zhang ZR，Schluesener HJ，et al.Role of exosomes in immune regulation〔J〕.J Cell Mol Med，2006;10(2)：36475.
5 Hegmans JP，Bard MP，Hemmes A，et al.Proteomic analysis of exosomes secreted by human mesothelioma cells〔J〕.Am J Pathol，2004;164(5)：180715.