时间：2023-05-29 17:47:12
开篇：写作不仅是一种记录，更是一种创造，它让我们能够捕捉那些稍纵即逝的灵感，将它们永久地定格在纸上。下面是小编精心整理的12篇基因编辑技术，希望这些内容能成为您创作过程中的良师益友，陪伴您不断探索和进步。
[关键词] 基因靶向修饰技术；Cas9；CRISPR/Cas；基因组编辑；基因治疗
[中图分类号] Q78 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）08（a）-0154-04
Review about CRISPR/Cas system as a new targeted genome editing technology
JIA Liangjie
College of Life Sciences， Shaanxi Normal University， Shaanxi Province， Xi′an 710119， China
[Abstract] CRISPR （clustered， regularly interspaced， short， palindromic repeats）/Cas （CRISPR-associated） systems are a unique prokaryotic defense against foreign genetic elements. It also be considered as a targeted genome editing tool in molecular biology research. Because of its simplicity， high success rate and high efficiency in genome targeting， Cas system became the best genome targeting tools compared with ZFNs （Zinc-finger nucleases） and TALENs （Transcription activator-like effector nucleases）. According to the recent researches， Cas system could be used as an efficient system for site-specific transcriptional repression or activation. Additionally， a specific Cas9 protein has been observed to target an RNA substrate， suggesting that Cas9 may have the same ability as RNAi technology to be programmed to target RNA as well. Overall， the targeted genome editing technology via CRISPR/Cas system has been Widely promoted and applied in many field such as the research on gene functions， the the disease model of gene knock-out animal construction and the gene therapy. So it will have significant impact on future advancements in genome engineering.
[Key words] Gene targeting； Cas9； CRISPR/Cas； Genome editing； Gene therapy
CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas（CRISPR-associated）系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质免疫系统，通过序列特异的RNA介导，切割降解外源性DNA，这些外源性遗传物质包括噬菌体或者外源性质粒[1]。CRISPR/Cas系统可分为三种类型，其中类型Ⅱ CRISPR/Cas系统由于其组成简单，被改造成为基因组靶向编辑的工具。在类型Ⅱ CRISPR/Cas系统中，CRISPR能够转录产生前体crRNA（Pre-CRISPR RNA，Pre-crRNA），Pre-crRNA经过Cas9-tracrRNA复合物加工后产生成熟的crRNA（CRISPR RNA），crRNA的5′端区域能够与靶位点互补配对，而其3′端能够与tracrRNA（trans-activating crRNA）及Cas9蛋白形成复合物，从而引导Cas9蛋白结合于靶位点进行特异性地切割。CRISPR/Cas系统与其他外源核酸防御系统（如限制修饰系统）最重要的区别在于：CRISPR/Cas系统具有记忆性，细菌会记忆首次入侵外源核酸的信息，在其再次入侵时，特异性的识别并切割这些外源核酸酶使其降解，保护自身遗传物质的完整准确[1]。特异的Cas蛋白会识别外源性的遗传物质中具有原型间隔序列毗邻区（protospacer adjacent motifs，PAM）的DN段，通过Cas蛋白将PAM5′端的DNA（即原型间隔序列）加工成短的DN段，插入到其CRISPR序列的重复序列之间，最终使得细菌通过spacer序列识别并且随后靶向这些外来原件进行切除[2]。
类型Ⅱ CRISPR/Cas系统组成最为简单，只需要Cas9蛋白、tracrRNA、crRNA、RNase Ⅲ四种成分即可发挥作用[3]。在这一系统中，Cas9蛋白在crRNA的加工以及对外源DNA的特异性切割中都发挥着重要的作用[4]。因此本综述也主要介绍针对类型ⅡCRISPR/Cas改造而来的相关技术。
1 CRISPR/Cas系统可以作为一种位点特异性基因编辑平台
CRISPR/Cas系统作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点在于操作简单，这是因为其识别的特异性是有crRNA序列决定的。有报道称，可以通过人工合成crRNA序列使得Cas9系统识别并结合到与该crRNA互补的DNA序列上，最终介导Cas9蛋白特异性的切割该杂交区域[5]。与crRNA互补的靶位点序列称为原型间隔序列，除了与crRNA存在互补序列外，在互补序列的毗邻区还必须存在原型间隔序列毗邻区（proto-spacer adjacent motif，PAM）。PAM序列对于Cas9系统能够有效稳定的发挥作用有着重要的意义，其使得双链RNA复合体与靶序列精准的结合，并有效地避免了自身结合现象的发生。
在Cas9系统发挥识别剪切过程中，tracrRNA首先与crRNA形成crRNA：tracrRNA复合体，Cas9蛋白识别并与crRNA：tracrRNA复合体结合，在crRNA的引导下识别并切割靶位点。为了进一步简化操作过程，研究人员依据crRNA：tracrRNA复合体的结构特征设计了sgRNA（single guide RNA），sgRNA具备crRNA：tracrRNA复合体的功能，能够被Cas9蛋白识别并引导Cas9蛋白结合于靶位点[5]。
上述Cas9所具有的这些优点使得其能够成为一种跨平台的基因编辑工具在多种实验模型中发挥价值。最新的研究结果显示，Cas9作为一种基因组编辑工具已经成功的应用在细菌、酵母、植物、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠和人的细胞模型之中（既包括传代细胞系和干细胞中）[5-7]{Cong，2013#427}{Cong，2013#427}{Mali，2013#409}{Mali，2013#409}{Cong，2013#425}{Cong，2013#425}{Cong，2013#425}。这说明了它是一种多物种适应性的，位点特异性的有效基因组编辑工具。Cas9-sgRNA在靶位点切割产生双链DNA断裂（Double strand break，DSB）后，细胞可以通过两种方式对DNA进行修复，非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）修复方式和同源重组方式（homology-directed repair，HDR）。非同源末端连接往往使得核酸链被剪切的区域发生基因突变，导致编码的基因会丧失功能[8-9]。而同源重组往往通过供体DNA与基因组DNA之间的同源重组造成靶位点的纠正或者靶向插入外源基因[8-9]。
由于sgRNA对靶序列识别的长度只有20个碱基，且Cas9蛋白对sgRNA 5′端序列与靶位点的错配不敏感，这使得Cas9-sgRNA技术的脱靶率比较高。为了提高该技术打靶的特异性，一种突变型的Cas9蛋白（Cas9 D10A）被构建出来[8-9]。这种突变型的Cas9核酸内切酶是将Cas9蛋白的两个核酸内切酶结构域之中的一个（RuvC-Ⅰ）经过点突变的从而失活，另一个切割结构域被保留，从而使得目标序列形成单链断裂（nicked DNA）[5]。这样需要有结合于两条互补的DNA链上相邻位置的一对sgRNA同时引导Cas9 D10A识别并切割靶位点才能造成DSB，从而加大了识别的长度，有效的提高了Cas9-sgRNA技术的特异性[8-9]。
2 利用Cas9系统在转录水平对基因表达的调节
Cas9-sgRNA作为一种能够与靶位点特异性识别并切割的技术，其用途不仅限于对靶位点的靶向编辑。通过点突变使Cas9蛋白的两个核酸内切酶结构域活性全部丧失获得dCas9，但是dCas9仍保留了与靶位点特异性结合的能力，这样将dCas9-sgRNA作为与DNA特异性识别的平台，同样具有很大的应用价值[5，10]。dCas9-sgRNA结合与DNA上，阻断该位点上基因的转录，可以起到转录抑制的效果。如果在dCas9的C端融合转录抑制结构域KRAB（Krüppel associated box），获得的dCas9-KRAB-sgRNA具有更强的转录抑制效果，将可以替代脱靶效应明显的siRNA技术。如果在dCas9的C端融合转录激活结构域p65AD，则可获得能激活特定基因转录的转录因子[10]。通过以上这两个方面的改造可以使Cas9-sgRNA成为对基因表达的调控工具。由于原核表达系统中，需要依赖于诱导与阻遏调控机制，相反，真核生物中，调控的方式是散在的协同调控方法。所以当我们设计在原核生物中表达一个真核生物的基因或是在真核生物中表达一个原核生物的基因时，这就需要在基因序列前附加一个新的启动子和具有调控作用的小分子进行转录水平的调控，甚至需要对于特定的基因序列设计相应的增强子来对于目标基因的表达进行调控，而利用dCas9-激活或抑制系统就可以绕过这些繁琐的步骤[11-13]。
3 利用Cas9系统对目标RNA序列进行操纵
最近，相关研究证明了病原体Francisella novicida基因组中编码的Cas9核酸内切酶能够引起一个位点特异性的转录抑制作用[14]。该文章报道了通过tracrRNA和一种新型的小RNA（small CRISPR/Cas-associated RNA，scaRNA）所介导，F.novicida Cas9（FnCas9）能够与靶向的mRNA相结合，从而进一步发生反应的过程。随后，这种Cas9-scaRNA-tracrRNA-mRNA复合结构的各组分之间互作导致了mRNA稳定性衰减从而将靶序列的表达量降低。以此可以推测FnCas9或可能其他的Cas9系统将可以很容易的被介导靶向RNA。事实上，实验还为研究Cas9系统优先靶向RNA或DNA的机制方面提供了启发，也就是FnCas9系统作为Cas9系统的一个个例，具有较强的结构特异性和序列需求性。
FnCas9系统靶向特定的RNA序列原理做出第一种推测是， FnCas9系统自身结构的特殊性决定了功能。在目前已知的蛋白结构中没有一个是可以通过保守残基与靶向mRNA结合的[14]。相反，在FnCas9系统中存在一个精氨酸富集基元（arginine-rich motif，ARM）结构域，并被证明是在其结合mRNA的过程中发挥了重要的作用[12]。FnCas9系统可能在tracrRNA和mRNA中间形成了一个简单的脚手架结构，这个结构促使了靶向的核酸内切酶对目标区域RNA的降解[15]。另一种推测是介导RNA和靶向RNA之间的非同源性互作下进行识别并结合。实验证实，这个现象在病原体F. novicida中出现，tracrRNA上与mRNA反向互补的同源序列和非同源序列相互交错结合，从而形成tracrRNA-mRNA复合物。
这项新的技术一经提出，预示着FnCas9将会代替shRNA（short hairpin RNA）/siRNA等传统RNAi（small interfering RNA）技术成为一种新型的RNA干扰物而对于不同种类的细胞及动物模型定的基因的下游产物进行RNA干扰[16]。在目前的研究成果看来，并不能确定此系统能否稳定地在真核生物的细胞之中都能发挥降解RNA的作用[23]。当然，FnCas9系统也并不是唯一一个能够与mRNA结合产生干扰作用的Cas9系统一种存在于Pyrococcus furiosus 的CRISPR/Cas蛋白亚型（Ⅲ型）被证明可以靶向消化RNA底物[16]。研究发现，与先前提到的FnCas9相比，这一系统所能够识别并干扰的RNA序列更长，也就表明，这一系统与基于Cas9系统的FnCas9干扰物相比有更高的特异性，这一平台的发现将极大促进RNAi技术的进步。
4 展望及结语
到目前为止对CRISPR/Cas9技术的开发尚属初步。首先，虽然Cas9系统会被sgRNA引导从而识别出靶序列，但脱靶效应依然存在[11]。为了减少脱靶效应，研究人员得出了很多方法改变现状，如通过改变sgRNA的二级结构、改变sgRNA的长度、或是通过互补的切口酶预先制造双链DNA断裂，这都能有效地减少脱靶效应[11，17-19]。另外，PAM区域与靶片段的同源序列的长短也在近期被报道，在对于Neisseria meningitidis中的Cas9系统（NmCas9）的PAM序列的特异性分析的报道中我们就可以发现，NmCas9系统的PAM区域（5′-NNNNGATT-3′）与Streptococcus thermophilus中的Cas9系统的PAM区域（5′-NNAGAAW-3′）比Streptococcus pyogenes Cas9（5′-NGG-3′）对PAM区域配对的要求严格的多[5，8，20]。
从最开始认识到CRISPR作为细菌和古细菌的一种免疫系统，到之后通过观察到这种获得性的免疫能力的细菌或是古细菌也能够生存下来并能将免疫能力传递给下一代，认识到 CRISPR/Cas9是一种能够遗传的免疫系统，这完美地验证了拉马克的获得性遗传理论[21]。通过这种在原核生物中发现的遗传物质靶向操作系统，现在能够很快速地对遗传物质进行操作或修饰，无论是在细胞系中还是在模式动物的胚胎中[22]。CRISPR/Cas9系统在基因治疗方面能够发挥较大的作用。通过导入Cas9系统和相应的靶向致病基因的sgRNA载体，来对遗传缺陷进行纠正或删除，这种技术将在未来几十年之内将会逐步成为一种可靠地治疗手段。当然，与成熟的ZFN 和 TALEN等遗传物质靶向编辑系统相比，CRISPR/Cas9核酸内切酶系统具有得天独厚的优越性，其优越性体现在如构建简单方便快捷、安全性高、毒性小等方面。CRISPR/Cas9系统在临床治疗、基础理论研究和农牧渔业等领域必将会发挥巨大的作用，并且将会对分子生物学研究和基因治疗领域产生深远的影响。
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永久性治疗乳腺癌
现在，对于癌症的治疗有多种方法，例如，对于女性的乳腺癌可以在发现后进行手术、化疗、放疗和生物疗法。但是，从预防的角度看，与其患病后治疗，不如早期预防更有效。而早期的预防是通过健康的生活方式来实现的，如注重饮食均衡、不熬夜、不抽烟、不酗酒等。不过，对于携带有乳腺癌致癌基因的人来说，现在又有了一种新的防治癌症的选择，即提前切除可能患癌的靶器官，如和卵巢等。美国影视明星朱莉就是这么做的。
2011年，朱莉进行基因检测发现，她的体内携带有致癌基因BRCA1，医生认为，她患上乳腺癌的概率大约是87%，患卵巢癌的概率是50%。于是，2013年2月，朱莉决定将发病的可能性减到最小，进行了乳腺切除手术，并在切除乳腺后重塑。
切除乳腺后刚两年，朱莉又做出惊人之举。2015年3月24日，朱莉宣布，由于担心罹患卵巢癌，她再次接受手术，切除了卵巢和输卵管。在两年的时间内，这位只有39岁的女性为了防癌，先后切除了3种器官（、卵巢和输卵管）。这一治疗方式自然引发了专业人员和公众的热议和争论，在未出现症状和影响身体正常生理功能之前就切除部分器官，是否操之过急，是否值得？
当然，各执己见的人都不能说服对方，这实际上也成为今天癌症治疗的一种选择，提前进行治疗。不过，现在还有一种更有远见，也能从根本上去除致病基因的防治乳腺癌和卵巢癌的方法，即对胚胎或生殖细胞的致癌基因进行清除。显而易见，这样的方式更容易引发争议。
现在，正在美国哈佛大学乔治・丘奇教授的实验室中从事博士后研究的中国留学生杨璐菡等人进行的一项研究就是修改人类卵细胞遗传基因，以便永久性地防治乳腺癌和卵巢癌。杨璐菡等人利用目前最好的基因编辑技术，在实验室中修补卵巢细胞中导致乳腺癌和卵巢癌的BRAC1致癌基因。当这一基因被修正或清除，随着卵巢细胞逐渐成长为卵细胞，其中的BRAC1基因也会被修改或清除。于是，以这样的卵子孕育后代，以后就不会患乳腺癌和卵巢癌。
这一相关研究结果尚未公开发表。即便如此，杨璐菡等人的研究情况披露后也引起了争论。因为，对于修改人类卵子、和胚胎的基因在许多国家都存在争议，反对者认为，这些研究违背道德准则，在技术上也充满不确定性，风险太大。
面对争议，哈佛大学的丘奇教授强调说，杨璐菡等人在实验室中所做的研究完全是尝试性的。其中用到的卵巢细胞是在实验室里培养的，根本没有打算让卵细胞受精，更别提将其移植到一位女性体内了。
显然，修改卵子、和胚胎的基因目前还只是一种尝试，但未来这种尝试是否会成真呢？
修改动物胚胎的尝试
同样是利用基因编辑技术修改胚胎基因的研究也在尝试之中，而且获得了比较明显的成功。这种研究体现在两个方面：一是对动物胚胎进行修改，一是对人的胚胎进行修改。
云南中科灵长类生物医学重点实验室季维智、牛昱宇研究小组与南京医科大学、南京大学、中科院动物研究所合作，利用基因编辑技术对猕猴的3个基因进行剪接：一个是调节代谢的基因Ppar-γ；一个是调节免疫功能的基因Rag1；另一个是调节干细胞和性别决定的基因。
研究人员是在180多个单细胞期猴胚胎中同时靶向编辑这3个基因。在对15个胚胎的基因组DNA进行测序后，发现其中有8个胚胎显示出两个靶基因（Ppar-γ和Rag1）同时突变的迹象。随后研究人员把经过基因编辑的胚胎移植到代孕母猴体内，其中一个生出了一对孪生猴。检测这对孪生猴的基因组后发现，猴子体内的两个靶基因（Ppar-γ和Rag1）已经发生改变。
调节代谢的基因Ppar-γ和调节免疫功能的基因Rag1如果变异，将会产生种种生理变化或疾病，但需要等这种在胚胎期就修改了基因的猴子长大（3年）后才能证实，如此就意味着可以在胚胎期进行基因修改以预防疾病，比如修改可能引发帕金森病和囊性纤维变性的基因，以根治这些疾病。但是，这也仅仅是一种方向。
与此同时，美国马萨诸塞州博德研究所的研究人员证实，可以利用基因编辑技术修改小鼠胚胎或卵子的基因，他们已经修改了小鼠胚胎干细胞中的5个基因，这同样为在胚胎期根治疾病奠定了基础。
由于这类研究是在动物身上进行的，因而伦理争议较少。
修改人的胚胎
地中海贫血是一种遗传病，同样可以通过胚胎期的基因清除或修改来根治这类疾病，但是，目前这也只是一种尝试，而且引发了巨大争议。
地中海贫血又称海洋性贫血和珠蛋白生成障碍性贫血，是一组遗传性溶血性贫血。由于遗传基因缺陷致使血红蛋白中一种或一种以上珠蛋白链合成缺如或不足，从而导致贫血。由于基因缺陷的复杂性与多样性，缺乏的珠蛋白链类型、数量及临床症状变异性较大，因此地中海贫血分为α型、β型、δβ型和δ型4种，其中以β和α地中海贫血较为常见。
β地中海贫血（β珠蛋白生成障碍性贫血）在中国南方人群中比较常见，已知有100种以上的β基因突变，主要是由于基因的点突变，少数为基因缺失。现在，中国中山大学的黄军就研究团队试图通过修改胚胎中的β珠蛋白基因来根治这种遗传病。
研究人员利用基因编辑技术对86个人的废弃胚胎进行了改造，48小时后，对71个存活胚胎的54个进行检测发现，有28个胚胎的基因被切割，但是，只有4个胚胎包含设计的基因序列。这也意味着，只有4个胚胎被切除了导致β地中海贫血的基因。尽管这一技术尚不成熟，但这一研究表明，这是未来极有可能根除遗传病的一种全新的方法。
然而，这种对人胚胎的修改引发了极大争议，首先是黄军就等人的研究论文被英国的《自然》和美国的《科学》杂志拒绝，理由是存在伦理争议。后来，他们的研究论文在中国的期刊《蛋白质与细胞》上发表。后这一研究甚至招来批评。
可否修改人类胚胎或生殖细胞基因
利用基因编辑技术对胚胎或生殖细胞的基因进行修改不仅可以治疗多种疾病，最主要的是治疗遗传病，同时，基因编辑技术也可以用在更多的基因修改上，例如，可以修改决定皮肤、肌肉、神经、骨骼和内脏等细胞的基因，以帮助研究和治疗疾病，同时还可以修改控制人的身高、体重、肤色，甚至决定智商的基因，把人改造成超人。另外，改变了的基因也是可以遗传的，这就必然会引发巨大的社会问题。
在黄军就等人的研究发表后，美国国立卫生研究院（NIH）于2015年4月29日发表声明，重申禁止开展涉及编辑人类胚胎基因的研究。该院院长弗朗西斯・柯林斯在声明中阐述了美国国立卫生研究院一直秉持的反对资助此类研究的长期政策以及反对的伦理和法律理由。
基因编辑技术存在着很大风险，现在只是试验性的技术，既不完全，也不完美，因此，这样的技术可能伤害生命，不符合伦理原则。
现在，防止父母将遗传性疾病传递给孩子并非只有基因编辑的方法，还可以采用更成熟的试管婴儿技术，在体外培育胚胎，然后筛选掉含有缺陷基因的胚胎。因此，基因编辑不是让生命变得美好和正常的唯一技术，也不是非用不可的技术。国际医学科学组织理事会与世界卫生组织（WHO）颁布的《涉及人的生物医学研究国际伦理准则》规定了涉及人的生物医学研究需要遵守的21项准则（上期《换头术可行吗？》一文已对21项准则进行了详细介绍，此处不再赘述）。
从这些伦理规定来看，目前的基因编辑技术用于修改生命还不算是非做不可和对病人唯一有利。因此，显然不太符合伦理要求。黄军就等人也认为，要对正常的胚胎进行编辑和修改，成功率必须接近100%。由于目前该方法还很不成熟，中山大学研究团队也暂停了后续研究。
在法律上，美国1996年颁布的《迪基-韦克修正案》特别规定，禁止政府资助破坏人类胚胎或者为了研究目的培育人类胚胎的试验。但是，后来的法律修正案允许开展胚胎干细胞的研究。而且，美国前总统布什在任期间一直禁止联邦资金用于胚胎干细胞研究，但奥巴马上台后于2009年3月9日签署行政命令，解除这一禁令。
即便法律修正案解除禁止政府资助人类胚胎研究的禁令，美国的法律措辞也是指，对无法存活的人类胚胎进行研究也在禁止资助之列，因为胚胎的定义是任何源自“受精、单性生殖、克隆或任何其他方式”的产物。所以，在法律上，美国对于研究人类胚胎存在模棱两可的情况。
但是，英国对利用基因编辑技术修改人类胚胎或生殖细胞采取绝对禁止的态度，因为，管理者认为，这一技术用于治疗可能产生伦理影响之外，还涉及其他因素，比如，只是为了让孩子拥有某些优良的属性可能会带来严重后果。基因编辑技术只需对胚胎DNA进行较小的变动，就可以改变婴儿眼睛的颜色，或使孩子变得更强壮等等，这就有可能产生不止是治疗疾病的行动，而是让人趋之若鹜地改变自己后代的基因，以求后代生长得比别人更为强大和聪明，这无疑是天才论在遗传学中的实践。
但是，丘奇教授不认为基因编辑技术不成熟，因为研究人员没有使用最新的基因编辑技术，如果采用新的技术，黄军就等人的基因修改会更为准确，他们遇到的严重脱靶问题将可避免。而且，丘奇教授认为，杨璐菡和黄军就等人的研究目前虽然还不被人们广泛接受，但他们的论文的某些方面内容最终会被人们接受。
关键词：CRISPR/Cas9；基因敲除；Mindin
中图分类号：Q7 文献标识码：A
CRISPR/Cas9是近年来从古细菌免疫系统中发展起来的一种新型高效的基因组编辑技术，利用人工设计的sgRNA介导外源表达的Cas9核酸酶与基因组靶点特异性结合从而实现对靶序列的特异性切割，进而诱导细胞通过非同源末端连接或同源重组方式来修复断裂的DNA双链[1-2]。非同源末端连接的修复效率高于同源重组的修复效率，但易形成错配修复，从而在切割位点引入序列的缺失或插入，引发靶点基因编码的蛋白发生移码突变从而实现对靶点基因的敲除。当存在同源片段时，断裂的DNA链可能发生同源重组修复，将外源片段整合到基因组中，从而实现基因的敲除、敲入及突变等[2-3]。
Mindin是一种高度保守的分泌性细胞外基质蛋白[4]，我们研究发现，Mindin是肠癌发病过程中重要的抑癌基因。由于前期对其功能研究的主要手段为RNA干扰技术，是在转录后水平降低蛋白的表达，其瞬时性和不彻底性会影响对其功能的深入研究。因此，我们迫切需要利用CRISPR/Cas9技术在基因水平上完全敲除Mindin基因并筛选出可稳定遗传的细胞株，为进一步深入研究Mindin在肠癌发生与发展过程中的作用提供有力的细胞模型支持。
1 资料与方法
1.1一般资料 L929细胞株（小鼠成纤维细胞株）由厦门大学李勤喜教授实验室馈赠；pUC57-sgRNA质粒载体（Addgene 51132）以及pST1374-Cas9-NLS表达质粒由上海科技大学黄行许教授馈赠；pBKS质粒由厦门大学林圣彩教授实验室馈赠。sgRNA寡聚核苷酸链引物由厦门安特奥生物有限公司合成；单克隆引物由上海生工生物有限公司合成；质粒测序及单克隆菌液测序由厦门闽博生物有限公司完成。
1.2方法
1.2.1质粒构建 针对Mindin基因编码序列设计三个sgRNA作用靶点，合成寡聚核苷酸链，序列如下：
F1：5’-TAGGactgtgcagggggccggaac-3’& R1：5’-AAACgttccggccccctgcacagt-3’
F2：5’-TAGGcctgccatccctagcggtac-3’& R2：5’-AAACgtaccgctagggatggcagg-3’
F3：5’-TAGGaagtctgcccggtaccgcta-3’& R3：5’-AAACtagcggtaccgggcagactt-3’
寡聚核苷酸序列5’端TAGG和AAAC碱基为pUC57-sgRNA质粒载体通用粘性末端。合成的寡聚核苷酸链利用PCR仪退火后连接入经Bsa I酶切的pUC57-sgRNA载体，构建sgRNA表达质粒。所得质粒通过测序检验连入片段的正确性。
1.2.2细胞的转染与筛选 将测序正确的pUC57-sgRNA质粒载体连同pST1374-Cas9-NLS质粒载体利用电转仪电转入消化好的L929细胞中，待细胞贴壁生长后换液并加入杀稻瘟菌素（Blasticidin）进行筛选，即可获得细胞库。从细胞库中提取基因组DNA，测序鉴定突变情况。
1.2.3单克隆的挑选与扩增 待对照组细胞全部死亡后，将实验组细胞利用DMEM培养液进行梯度稀释，分装至96孔板中培养，10 d后，于显微镜下观测各孔细胞生长情况，确定真正的单克隆细胞，进行后续培养分析。
1.2.4细胞基因组提取与鉴定 将待鉴定的细胞加入含蛋白酶K的DNA Digestion Buffer（Jackson Lab）中56℃消化过夜，利用酚氯仿抽提法提取细胞基因组DNA。利用单克隆引物TA-F1：5’-tgagtcttgccctgggcaga-3’&TA-R1：5’-agctactgtgccctccaaca-3’和TA-F2： 5’-atgcagtcaggcctttgca-3’& TA-R2：5’-acaggtccagactgtcgat-3’进行PCR扩增，所得DN段通过连接酶非依赖的克隆构建方法（Ligase independent clone，LIC）将其连入利用BamH I和Xho I酶切好的pBKS质粒载体中，挑选单克隆菌落进行测序分析。
2 结果
2.1 sgRNA的设计和打靶载体的构建 针对Mindin基因组中蛋白编码序列，我们利用MIT张锋教授实验室提供的在线软件分析了所有的可能sgRNA位点（PAM序列为NGG），从中挑选出三个评分最高的sgRNA位点，设计并合成寡聚核苷酸链。合成的寡聚核苷酸链利用PCR仪退火后连接入经Bsa I酶切的pUC57-sgRNA载体，构建sgRNA表达质粒。通过测序证实插入片段正确。
2.2 sgRNA效率的检测 实验组和对照组转染完24 h后加入杀稻瘟菌素处理，待对照组细胞全部死亡后，将实验组剩下的细胞继续培养至24孔板中。利用酚氯仿抽提法提取细胞基因组进行PCR扩增并测序。三个sgRNA位点的突变情况，见表1，所有测序的克隆均发生不同程度的突变。
2.3 Mindin基因敲除单克隆细胞的获得 根据细胞库敲除的情况，我们挑选了sgRNA位点3的细胞库进行单克隆分选。用培养基稀释的细胞培养14天后，于显微镜下挑选正确的单克隆提取基因组DNA，利用单克隆测序引物TA1或TA2进行测序。其中所获得的第23号单克隆缺少了10bp，是一株Mindin基因敲除并可稳定遗传的细胞。而所获得的第12号单克隆缺失了3bp，是一种不会改变后续阅读框的突变，可以用于当作对照组细胞株，见图1。
图1 Mindin敲除的单克隆细胞基因组测序结果
3 讨论
基因组编辑是研究基因功能以及进行基因治疗的重要手段，人工核酸酶技术的出现为基因组编辑提供了强有力的工具。CRISPR/Cas9作为新一代的基因组编辑核酸酶技术，其对靶位点的识别依赖于sgRNA 5’端与靶位点DNA序列间的互补配对，针对不同靶点序列的sgRNA仅需替换识别位点处20bp的序列即可，应用时简单易行，具有显著的优势，成为目前生命医学领域的研究热点。
真核生物基因组DNA具有复杂的高级结构，并且组蛋白上经常会发生各种修饰，故而寻找高效的sgRNA位点是确保CRISPR/Cas9系统有效工作的重要前提。为了探究如何获得高效的sgRNA，在本研究工作中，我们挑选了肠癌抑制基因Mindin作为靶基因，利用已有的设计软件，构建了针对Mindin基因的三条sgRNA，并将其导入鼠源L929细胞中，检测sgRNA的效率。结果表明，所挑选的三条sgRNA都能高效的介导基因组编辑，细胞库内测序的所有克隆都发生了突变，并且突变位点都位于sgRNA后NGG序列附近，证明了这三条sgRNA都可以介导Cas9蛋白高效切割Mindin基因靶序列。从细胞库中分离得到的不同单克隆细胞株进一步证实了这种基因组编辑可以稳定遗传的。由此，我们得到了一个稳定敲除Mindin基因的L929细胞株，为后续研究Mindin基因在肠癌发生与发展过程中的作用提供了必要的研究素材。此外，我们设计出的高效sgRNA位点也可用于Mindin基因敲除动物的制备，为其动物模型的建立打下坚实的基础。
参考文献：
[1]Barrangou R，Fremaux C，Deveau H，et al.CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.Science 2007；315（5819）1709-12
[2]Cong L，Ran FA，Cox D，et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science，2013，339（6121）：819-823.
关键词：反义RNA；RNA干扰；ZFN；TALEN；CRISPR-Cas系统
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）08-1405-08
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.08.002
Research Progress on Loss of Gene Function Technologies
NING Hui-yua，b，LIU Caia，b，ZOU Hua-wena，b
（a.College of Agriculture；b.Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）
Abstract： Loss of gene function technology is one of the most important and efficient methods to study gene function at present. Now main widely used loss of gene function technologies are anti-sense RNA， RNA interference，ZFN，TALEN，CRISPR-Cas nucleases technology and so on. Those technologies aim to inhibiting or turning off the expression of the target gene， researching the change of the biological phenotype， and thus their related functions were speculated. In the practical studies， loss of gene function is always along with gene overexpression， providing the most direct evidence for gene function research， which was widely used in biology， medicine， agriculture and other fields. This paper systematically introduces the developing history， technological principles and application of some common loss of gene function technologies， and the protest of their future research and application is introduced.
Key words： anti-sense RNA； RNA interference； ZFN； TALEN； CRISPR-Cas nucleases
20世o50年代DNA双螺旋结构的发现，标志着人们对生命科学的研究进入了分子生物学时代。随着后基因组时代的到来，基因组学的研究重心从揭示生命的所有遗传信息结构、组成等转移到对功能的研究上。除了传统的转基因（基因过量表达）外，定向抑制或完全消除特定基因的表达也是目前研究基因生物学功能的重要手段。因此，出现了反义RNA、RNA干扰等技术。随着研究技术手段的发展，近年来又兴起了ZFN技术、TALEN技术、CRISPR-Cas系统等基因功能修饰技术。这些技术不断被发现及应用，极大地促进了生物学研究的发展。本研究主要对基因功能缺失技术发展历程、技术原理及应用等方面进行概述。
1 反义RNA技术
反义RNA是指与靶RNA（多为mRNA）具有互补序列的RNA分子，它通过与靶RNA进行碱基互补配对的结合方式影响mRNA的后续翻译过程。反义RNA最早在原核生物E.coli的产肠杆菌素的Col E1质粒中发现[1]。随后发现在真核生物中也存在天然的反义RNA，特别是发现了人工构建的反义寡核苷酸在真核生物中具有生物学效应以来，反义RNA技术已成为一种直接有效的人为控制基因表达的方法，并且倍受生物学界关注。
1.1 反义RNA作用机理
反义RNA主要通过与靶RNA以碱基互补配对的方式结合，参与基因表达调控。其作用机理为：①在DNA复制水平上。反义RNA通过与DNA复制时的起始引物RNA结合，阻止RNA引物与模板DNA的结合，抑制DNA的复制。②在转录水平上。反义RNA可以直接与mRNA5′端互补，阻止转录。③在翻译水平上。反义RNA通过与mRNA上的特定序列互补配对而结合。结合位置包括起始密码子AUG、靶mRNA的非编码区、原核生物的SD序列以及真核生物的mRNA5′端，从而直接或间接地抑制mRNA的翻译[2]。
1.2 反义RNA技术的应用
目前，反义RNA技术作为一种重要的基因调控手段，在植物、病毒、细菌中得到广泛应用。在植物中最显著的应用是果实成熟的控制。科学家通过控制乙烯合成途径中的关键酶来限制乙烯的合成，从而达到控制果实成熟的目的[3]。Oeller等[4]利用反义RNA技术抑制ACC合成酶的活性，使果实内的乙烯含量被抑制了99.5%。这为果实的贮藏、加工、运输等提供了新方法。
反义RNA技术在植物抗病方面也得到了很好的应用。植物病毒是影响植物生长的重要因素之一。由于DNA病毒和RNA病毒在复制和表达的过程中都要经历RNA生物合成阶段，这为利用反义RNA技术进行抗病毒研究提供了理论依据。Nelson等[5]利用TMV 5′端的基因片段作为目的基因，成功构建了反义基因并获得了表达反义基因的转基因烟草植株。试验结果表明，病毒RNA和后代病毒的合成被抑制了25～50倍，病毒侵染症状大量减少甚至消失，并且该抗病毒性状可稳定遗传。
由于抗生素的滥用，细菌的耐药性越来越强。为了能够快速、简便获得新的抗菌药物，反义RNA技术被应用到药物筛选模型上。2006年科学家在金黄色葡萄球菌体内诱导表达出了针对单功能脂肪酸合成酶FabF的反义RNA，并构建了反义工程菌。研究发现，构建的反义工程菌对FabF（Fatty acidbiosynthesis geneF）的特异性抑制剂非常敏感，通过药物筛选获得了能够有效抑制MRSA（Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus）和VRE（Vancomycin-Resistant Enterococci）的新型抗生素平板霉素[6]。因此，可利用反义RNA技术寻找新型抗生素解决细菌耐药性的问题。
1.3 反义RNA技术的优缺点
随着研究的不断深入，人们对反义RNA技术也有了比较成熟的认识。与传统的基因敲除技术相比，反义RNA技术具有许多的优越性。①反义RNA技术操作较简单，适用范围广泛。通过靶mRNA的序列就可以合成所需的反义RNA，可用多个反义RNA同时阻断多个基因的表达。②特异性强[7]。反义RNA技术可以有选择性的迅速抑制目的基因的表达。该技术不会对蛋白质产生完全抑制，从而能避免致死突变，对细胞的正常生长影响较小。③安全性高[8]。导入细胞的反义RNA不能被翻译产生蛋白质，因此该技术在基因工程上的应用具有很大的安全性。
众多的因素限制了反义RNA的发展。主要包括：①成本较高。②靶基因定位困难。由于高等生物的基因组复杂，对特殊基因的靶向定位很困难。③使用效率问题。反义RNA的碱基序列、含量、靶序列结合部位和浓度等都会影响其使用效率[9]。
2 RNA干扰技术
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指与靶mRNA存在同源互补序列的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）在细胞内特异性地降解靶mRNA的一种基因转录后沉默现象[10]。这一现象在自然界中广泛存在，是生物体在进化过程中形成的一种进化上保守的用来抵御外来基因或外来病毒侵犯的防御机制。
1990年Napoli等[11]将查尔酮合成酶CHS基因转入到牵牛花中，试图获得开出深紫色花朵的牵牛花，结果却得到了白色和斑片状花朵，即转入的CHS基因和与该基因同源的色素基因的表达均受到抑制，将这种现象称为转录后基因沉默 （Post-transcriptional gene silencing）或者共抑制（Co-suppression）。1994年Cogoni等[12]分别将外源基因albino-1和albino-3转入粗糙脉孢菌（Neurospora）中，也出现了与植物共抑制相同的转录后基因沉默现象，将其称为基因压制（Gene quelling）现象。1995年Guo等[13]发现将秀丽新小杆线虫（Caenorhabditis elegans）par-1基因的正义链RNA和反义链RNA分别注射到线虫体内均会抑制par-1基因的表达，但当时的理论无法解释这一现象。直到1998年Fire等[10]才解释了这一现象，即RNAi是由于dsRNA引起的转录后序列特异性基因沉默，并将其命名为基因沉默（Gene silencing）。
2.1 RNA干_作用机理
RNA干扰作用机理可分为3个过程：siRNA的形成、靶mRNA的降解、RNAi的形成。①siRNA的形成[14]。细胞质中的内源性或外源性的长dsRNA首先与Dicer酶结合，形成Dicer-dsRNA复合物，在Dicer酶的RNase的作用下，长dsRNA被特异性地裂解为21～23 nt siRNA。其5′端为磷酸基，3′端为羟基且含有2个突出的黏性末端。②靶mRNA的降解。siRNA在解旋酶的作用下解链，形成正义链和反义链，其中的反义链可指导形成RNA诱导的沉默复合体（RISC）[15]。在siRNA的引导下，RISC通过碱基互补配对的方式识别具有同源序列的靶mRNA并进行剪切，其剪切位点为与siRNA反义链互补的第1个核苷酸下游的11或12个核苷酸处，然后降解靶mRNA。③RNAi的形成。在RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）的作用下，以靶mRNA为模板，siRNA为引物，合成dsRNA。合成的dsRNA在Diser酶的作用下，又产生新的siRNA，如此循环多次，可以使RNAi的作用进一步放大。因此，少量的siRNA可以产生高效的基因沉默效应[16]。研究还发现siRNA除了能导致转录后基因沉默，还可指导DNA甲基化酶与DNA的特定部位结合，引发该特定部位DNA中的胞嘧啶甲基化，导致转录水平的基因沉默[17]。
2.2 RNA干扰技术的应用
虽然人们对RNA干扰的研究只有短短的十几年时间，但发展却极为迅速，在生物医学等领域得到广泛应用。①疾病治疗上的应用。RNA干扰作为一种基因敲除技术，在肿瘤、病毒感染、遗传病治疗方面得到了广泛应用。An等[18]利用RNA干扰技术构建了卵巢癌OVCAR3细胞IGF-IR基因的siRNA表达质粒，通过脂质体法转染到人的卵巢癌OVCAR3细胞中，研究发现IGF-IR基因的siRNA能显著抑制其mRNA及蛋白质的表达，并且还能抑制OVCAR3细胞的增殖。RNA干扰技术为疾病在基因领域的治疗提供了新方法。②作为基因研究的新工具。由于RNA干扰能特异性的抑制目的基因的表达，根据其表型等的改变可以分析基因的功能，因此是研究基因功能的一种有效的手段[19]。Yu等[20]通过构建cyclin D1基因的siRNA表达质粒，研究cyclin D1基因对疤痕疙瘩成纤维细胞的细胞增殖和细胞周期的变化。③RNA干扰技术还被广泛应用于信号传导通路的研究。通过和传统的缺失突变技术结合，RNA干扰技术可以很容易确定复杂信号传导途径中不同基因的上下游关系[21]。Jin等[22]利用RNAi技术发现argonaute-1在FMRP参与神经元发育和突触生长过程中起重要作用，证明FMRP能调节信号通路。④药物的开发与应用。RNA干扰可作为寻找和鉴定新药物靶标的工具。利用RNA干扰技术可以明显缩短从鉴定到认识药物靶基因功能的时间，有助于药物开发过程中对已知靶基因功能的高通量分析[23]。Duff等[24]利用RNA干扰技术能降低蛋白转移酶9（PCSK9）的表达量，研究发现PCSK9表达量的降低能明显降低小鼠血清胆固醇水平，说明沉默PCSK9可成为治疗高胆固醇的药物靶点。
2.3 RNA干扰技术的优缺点
RNA干扰技术具有以下特点：①高效性。RNAi存在级联放大效应。siRNA在Diser酶的作用下，以靶mRNA为模板可以产生新的siRNA，如此循环多次，可以使RNA干扰的作用进一步放大。因此，少量的siRNA可以产生高效的基因沉默效应。②特异性。siRNA与靶mRNA通过碱基互补配对原则进行结合，只特异性的诱导靶mRNA的降解。研究表明，即使是一个碱基的错配，也会影响靶mRNA沉默效率[25]。对mRNA前体几乎没有影响，以内含子或启动子构成的dsRNA也不产生RNA干扰现象。③可传播和可遗传性。RNA干扰效应可以在不同细胞间进行传递，并且可以传递到下一代。Fire等[10]通过将dsRNA注射到线虫体内，发现dsRNA可以扩散到其他细胞中，并且在下一代也表现出了RNA干扰现象。
目前，对RNA干扰的研究仍处于初级阶段，还有许多问题亟待解决。主要包括：①存在脱靶现象。siRNA可以引起一些非靶基因的非特异性沉默或表达上调，抑制细胞的正常生长。②稳定性差。siRNA导入受体细胞后RNA干扰效应持续数天后便会消失。③载体的安全性问题。在临床应用上，载体作为外来抗原可激活机体的免疫应答，使载体失活，甚至可能对机体造成严重的不良后果[26]。
3 锌指核酸酶（ZFN）技术
1983年，锌指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）首次在非洲蛙蟾转录因子IIIA中被发现。随着研究的不断深入，人们对ZFP有了进一步的了解。1996年Kim等[27]将锌指结构域与IIs型限制性核酸内切酶FokⅠ的切割结构域融合，获得了具有识别特性的人工合成的核酸内切酶。随后，Bibikova等[28]利用ZFN技术对爪蟾的卵母细胞开展外源DNA修复试验，并取得成功。Bibikova等[29]又利用ZFN技术成功敲除了果蝇的一个内源基因。ZFN技术的应用实现了对基因的高效定点修饰，对研究基因的功能具有重要意义。
3.1 ZFN的结构及作用机理
ZFN是由锌指蛋白（ZFP）结构域和核酸内切酶（FokⅠ）的切割结构域两部分组成[27]。ZFP结构域主要负责识别并特异结合靶DNA序列。FokⅠ的切割结构域主要负责切割靶DNA。
ZFP结构域一般是由3～6个Cys2-His2型的锌指结构域串联组成，多个锌指结构的串联不仅可识别较长的靶DNA序列，还可以增加其修饰的特异性。每个锌指折叠成α-β-β（C端-N端）型的二级结构[30]，其中的α螺旋可插入到DNA双螺旋的大沟，α螺旋中的-1～+6位的7个氨基酸残基（+4位通常为亮氨酸残基）决定了对靶DNA识别的特异性[31]。每个锌指蛋白可识别并结合一个三联体密码（图1a）[32]。
FokⅠ是海床黄杆菌（Flavobacterium okeanokoites）表达的一种限制性内切酶，通过与ZFP的C端融合形成ZFN单体。FokⅠ的切割结构域必须形成二聚体才能发挥内切酶活性[33]。因此，在切割靶位点时，2个ZFN单体按照一定的距离和方向同各自的靶DNA链特异结合，2个FokⅠ切割结构域恰好可形成有活性的二聚体，在2个结合位点的间隔区（Spacer，通常为5～7 bp）切割DNA产生DSB切口。细胞再通过非同源性末端接合（NHEJ）或同源重组（HR）等方式对基因进行修复，改变靶DNA序列，从而达到基因敲除的目的[34]（图1b）。构建能特异性识别靶DNA的ZFP结构域是ZFN技术的关键。因此，只需根据目的基因设计出锌指结构域，再与FokⅠ融合形成ZFNs。然后将融合的ZFNs通^电穿孔、转染及病毒运输等方式导入细胞核中完成对靶基因敲除。
3.2 ZFN技术的应用
ZFN作为一种靶向修饰技术，可以精确地修饰基因及其周围调控元件，在生物体基因组改造与基因功能研究等方面得到广泛应用。ZFN已经成功应用于线虫、大鼠、小鼠、中国仓鼠、果蝇、海胆、斑马鱼、家蚕、植物、猪及人类iPS细胞和ES细胞中[35]。主要包括以下两方面：①对动植物基因组的靶向修饰。Bibikova等[29]利用ZFN技术对果蝇X性染色体的yellow基因进行定点修饰，结果发现50%的雄性果蝇发生颜色的改变。Zhang等[36]设计了针对敲除拟南芥ADH1和TT4基因的ZFN，通过雌激素诱导启动子表达，研究发现T1代分别有7%和16%的植物含有体细胞突变，并且能稳定遗传给后代。②疾病的治疗。Li等[37]利用ZFN技术治愈了血友病B型小鼠，这为以后利用ZFN技术治疗基因疾病提供了新的有效手段。
3.3 ZFN技术的优缺点
ZFN作为第一代人工核酸内切酶技术，打破了只能通过同源重组的方式对基因组进行改造的观念。ZFN技术的优点包括：①与传统的方法相比较，ZFN技术提高了基因组的编辑效率，操作简单，可以快速敲除目的基因。②能够广泛地应用于各种生物，并诱导靶位点进行定点突变。
ZFN技术也存在着许多的局限性：①存在脱靶现象。由于ZFN对靶位点进行切割时容易脱靶，导致细胞代谢紊乱，从而对细胞产生毒副作用。②存在上下文依赖效应[38]。ZFN在识别靶DNA位点时，识别靶DNA的重复氨基酸之间会相互作用，导致识别的特异性发生改变，即识别靶DNA的特异性不高，影响基因打靶的效果。③成本高。由于ZFN的特异性不高，很难设计出高特异性的锌指组合，目前该技术一直被生物公司垄断。
4 转录激活子样效应物核酸酶（TALEN）技术
1989年一类可以使植物患病的转录激活子样效应蛋白TALE（Transcription activator-like effector）在黄单胞杆菌（Xanthomonas）中分离得到[39]。2007年Kay等[40]发现一种TALE蛋白（AvrBs3）可以被黄单胞杆菌注入到宿主细胞内，然后进入宿主细胞核，与宿主upa20基因的启动子结合，激活宿主upa20基因的表达。2009年Moscou等[41]发现了TALE蛋白特异结合宿主基因启动子的机制。随着对TALE蛋白的深入了解，科学家发现TALE蛋白可以补足第一代人工合成的核酸内切酶（ZFN）技术的许多缺陷。2010年Christian等[42]首次报道了人工构建的TALEN技术。2011年Li等[43]用AvrXa7和PthXo1中天然存在的TALE重复序列进行了类似的试验，发现FokⅠ结构域连接到TALE结构域的C端的切割效果好于连接到N端。2012年Deng等[44]通过解析TALE蛋白的晶体结构，清晰揭示了TALE蛋白结合DNA的作用机制，为以后更好改造和应用TALEN打下了基础。
4.1 TALEN的结构及作用机理
TALEN是由TALE结构域和核酸内切酶（FokⅠ）的切割结构域两部分组成[45]。与ZFN技术原理类似，TALE结构域主要负责识别并特异结合靶DNA序列，FokⅠ的切割结构域主要负责切割靶DNA。
TALE蛋白是由N端的具有分泌信号功能的易位结构域（Translocation domain，TD）、中部DNA特异识别结合域、C端核定位信号（Nuclear localization signal，NLS）和转录激活结构域（Activation domain，AD）4部分构成。其中，中部DNA特异识别结合域是由一系列数目不定的串联重复单元组成。每个重复单元通常由34个氨基酸组成[46]，其中32个氨基酸是高度保守的，只有12位和13位上的氨基酸是可变化的，这2个氨基酸又被称为重复可变双残基（Repeat variable diresidue，RVD）。每个重复单元只识别1个核苷酸，其识别的特异性由RVD决定，并且RVD可与4种碱基有特定的配对关系，即NI特异识别A，HD特异识别C，NG特异识别T，NH特异识别G，NN对应G或A[41，46]。研究发现，第12位氨基酸主要起稳定RVD环的功能，第13位氨基酸是真正识别特异碱基的氨基酸，决定识别的特异性[44，47]（图2a）。
FokⅠ与TALE的C端融合形成TALEN。对靶DNA进行切割时，FokⅠ也需要形成二聚体发挥切割作用，当两个TALEN分别结合到各自的靶DNA序列上时，2个FokⅠ会在靶DNA序列的间隔区（Spacer，14～18 bp）处形成二聚体[48]，并对靶DNA进行切割，形成DSB切口，进而引发细胞内的NHEJ和HR修复机制，导致基因沉默（图2b）。总之，通过构建不同的TALE就可实现对不同靶DNA的切割。
4.2 TALEN技术的应用
TALEN技术的发明使得基因组编辑效率明显提高，因此，在人、小鼠、大鼠、斑马鱼、水稻、拟南芥等物种中得到广泛应用。①遗传病治疗方面的应用。科研人员利用TALEN技术对来源β-地中海贫血病人的非整合型iPSCs进行珠蛋白基因HBB修复，研究发现细胞在修复过程中没有产生TALEN引发的脱靶突变并且这些修复好的iPSCs具有多能性及正常核型，表明这种方法可作为一种治疗地中海贫血疾病的有效途径[50]。②生物模型的构建。2014年中国科学家利用TALEN技术成功的敲除了食蟹猴基因。首次用该技术成功构建了非人类灵长类动物模型[51]。③新品种的培育。Li等[52]利用TALEN技术剔除掉了水稻基因组中对水稻白叶枯病敏感基因Os11N3，获得了稳定遗传的抗病水稻新品种。这也显示出了TALEN技术介导的基因定点修饰在作物遗传育种中具有广阔的应用前景。
4.3 TALEN技术的优缺点
作为第二代人工合成的核酸内切酶技术，与ZFN技术相比，TALEN技术具有明显的优势。①与ZFN技术相比，TALEN筛选更为简便，它不需要复杂的筛选过程，只需要简单的分子克隆技术就可以获得高效的TALEN。②脱靶现象减少，降低了对细胞的毒性。③切割位点的特异性强。
TALEN技术虽然有很多优点，但也存在许多不足。主要包括：①TALE蛋白较大，并且序列重复性很强，构建表达载体较为复杂[53]。一般由生物公司合成，r格较贵。②仍然存在脱靶现象。③一对TALEN只能对一个靶基因进行修饰。当对多个基因同时进行编辑时，需要共转染多个TALEN载体，这样会导致转染效率下降，很难获得所需的阳性细胞[54]。
5 CRISPR-Cas核酸酶（CRISPR-Cas RGNs）技术
1987年Ishino等[55]首先在大肠杆菌的碱性磷酸酶基因下游发现了成簇的短间隔重复序列，但该序列当时没有引起人们的足够重视。随着研究的不断深入，发现大约40%的细菌和90%的古生菌都存在这种成簇的短间隔重复序列。2002年这种成簇的短间隔重复序列被命名为串联间隔短回文重复序列[56，57]（Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR）。此外，在CRISPR位点附近还存在着多个与CRISPR相关的Cas（CRISPR-associated genes）基因。随后的研究又发现，CRISPR中的间隔序列与质粒或噬菌体等外源DNA序列高度同源。当病毒入侵宿主细胞时，细菌和古细菌中的CRISPR序列就能够引导CRISPR相关（CRISPR-associated，Cas）蛋白使外源DNA降解，从而起到免疫保护的作用[58]。
5.1 CRISPR-Cas系统的结构及作用机理
CRISPR-Cas系统主要是由CRISPR序列元件和Cas基因家族蛋白组成[59]。目前，CRISPR-Cas系统一般被分为3种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系统在介导靶DNA双链降解时需要多种Cas蛋白的参与，而Ⅱ型CRISPR-Cas系统只需要Cas9就可完成对靶DNA双链的切割[60]。通过比较，Ⅱ型CRISPR-Cas系统更为简便，更适合应用于基因编辑。目前，CRISPR-Cas技术主要是Cas9系统的应用，本研究将对CRISPR-Cas9系统进行阐述。
CRISPR序列元件主要是由一个前导序列（Leader）、多个重复序列（Repeats）及多个间隔序列（Spacers）组成，其中重复序列和间隔序列以相互交替的方式连接（图3）。前导序列是一段富含AT，长度为550 bp的不保守序列，位于CRISPR的上游，可启动CRISPR序列转录；重复序列是一组长度为23～50 bp，平均长度为31 bp的高度保守的短小序列；间隔序列为来源于噬菌体、质粒等的平均长度为36 bp的外源基因片段即原间隔序列（Protospacers）[61]。Cas9是一个多结构域蛋白，主要由α-螺旋组成的识别区（REC）、位于蛋白中间位置的HNH核酸酶结构域、 位于氨基末端的RuvC-like结构域以及位于C端的PAM结合区组成[62]。
CRISPR-Cas9系统[63]的作用机理可分为3个阶段：①可变间隔序列的获得[64]。CRISPR-Cas9系统能够识别外源核酸中的特殊片段，该特殊片段中存在原型间隔序列毗邻基序（Protospacer-associated motif，PAM），并将PAM旁的原型间隔序列加工整合入自身基因组中的CRISPR序列中。②crRNA（CRISPR-derived RNA）的形成[60]。在前导序列的启动下CRISPR转录产生前体CRISPR RNA（pre-CRISPR RNA，pre-crRNA），随后CRISPR转录产生的tracrRNA（trans- activating crRNA）与pre-crRNA形成RNA异二聚体，在Cas蛋白的作用下，pre-crRNA被加工成crRNA。③对外源DNA的切割[64]。成熟的crRNA、tracrRNA及Cas9结合形成一个三元的沉默复合物。而后在crRNA的引导下由Cas9蛋白对目的基因进行切割。在切割时Cas9蛋白的HNH能够特异性识别与crRNA互补配对的模板链并对其切割，切割位点位于PAM上游3 nt处；RuvC-1ike参与另一条链特定位点的切割，切割位点位于PAM上游3～8 nt处（NGG位点）[65]。Cas9蛋白对外源DNA进行切割后也会产生DSB切口，并通过NHEJ和HR的方式进行修复[66]（图4）。因此，通过设计不同的crRNA可以使CRISPR-Cas9剪切不同的DNA序列。Jinek等[67]将成熟的crRNA和tracrRNA这两种RNA构建成一个向导RNA（single-guide RNA，sgRNA）与Cas9融合，发现由sgRNA和Cas9蛋白构成的新CRISPR-Cas系统仍可对目的基因进行切割。所以，可将CRISPR-Cas9系统简化成Cas9蛋白与sgRNA。
5.2 CRISPR-Cas系统的应用
目前，CRISPR-Cas系统的应用仍处在初级阶段，但在基因功能的研究、模式生物的构建、遗传育种等方面得到广泛应用。①在基因功能研究中的应用。与传统的基因敲除技术相比，CRISPR-Cas系统能够对多种细胞及生物体的目的基因进行高效快速的敲除，是研究基因功能的重要工具。Shalem等[68]构建了一个含有65 000种sgRNA的文库，这些sgRNA可以靶向人类基因组中18 080种基因，几乎涵盖了每个已知的基因。并将编码这些sgRNA的基因和编码Cas9蛋白的基因一起转运到人类细胞中，从而筛选出具有特定功能的基因。②动物模型的构建。2013年Wang等[69]在小鼠的胚胎干细胞中使用CRISPR-Cas9系统，对Tet1、Tet2、Tet3、Sry和Uty-8这5个基因进行同时编辑，产生了基因敲除新个体。这为研究基因家族成员的功能相关性提供新方法。③新品种的改良与培育方面的应用。Shan等[70]利用CRISPR-Cas9技术去掉了一个小麦基因，得到了耐白粉病的小麦新品种。还利用CRISPR-Cas9技术定点突变了水稻和小麦两种作物的OsPDS和TaMLO基因，发现原生质体中基因突变效率为14.5%～38.0%，水稻转基因植物中突变效率4.0%～9.4%，并且在T0代获得了水稻纯合PDS突变体，呈现预期的白化和矮小表型。
5.3 CRISPR-Cas系统的优缺点
作为第三代人工合成的核酸酶，与ZFN技术和TALEN技术相比具有明显的优势。主要表现在：①CRISPR-Cas系统的切割能力更强。CRISPR-Cas系统可以切割一些ZFN和TALEN不能接近的位点[71]。②操作更为简便，试验周期更短，成本更低。突变不同的靶位点只需设计与靶位点互补的sgRNA，然后将sgRNA克隆到表达质粒上即可。③CRISPR-Cas系统可以同时对多个靶基因进行定点修饰，因此大大提高了修饰效率。
CRISPR-Cas系统的应用仍处于初级阶段，存在许多不足：①5′-GN19NGG-3′的结构有时会出现限制性，会对靶位点以外的序列进行编辑，产生多余的DNA突变[72]。②CRISPR-Cas系统识别靶序列的长度较短，不能根据需求进行调节。③仍存在脱靶现象。
6 展望
基因功能缺失技术已经在生物学各个领域得到广泛应用，成为了研究基因的主要方法。随着基因功能缺失技术的不断更新，已从反义RNA技术发展到了CRISPR-Cas技术，并且其应用范围越来越广泛，对目的基因的编辑效率越来越高，操作越来越简便。目前基因功能缺失技g仍存在许多不足，限制了其发展。随着研究的不断深入与发展，基因功能缺失技术必将得到不断改进和完善，也一定会对基因功能方面的研究做出更大的贡献。
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中国的情况更为严重。
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对于大多数需要器官移植的患者来说，最糟的不是病情越来越重甚至死亡，而是漫长的等待。
科学家们试图打通一条解决器官供体短缺的道路――异种移植，即从动物身上获取健康的器官、组织或细胞，将其移植到患者体内发挥功能。以动物为供体的器官移植，需迈过三道坎，即生理功能、人体排异反应和动物自身携带的病毒风险。
最理想的技术路径有两条，通过基因工程方法改造动物器官，或者在动物体内培育人体器官（即人源化）。后者相当于人自己的器官，排异反应更小，更符合人的生理功能。然而，后者所涉伦理问题更严于前者，全球多数实验室还仅处于理论证明阶段。而前者已经积累了大量的研究案例，距离应用更近。
猪是生理指标和人体最接近的动物之一，且实验成本较低，所以全球大批实验室都选用猪作为实验供体。近期，美国哈佛大学和生物技术公司eGenesis的联合研究团队在《科学》上发表了一项成果，利用基因组编辑技术，敲除了猪基因组中可能有害的病毒基因。
这传达出一个信息，一批站在前沿的研究团队正在努力启动异种移植的临床研究，将给全世界急需器官移植的患者点亮希望。 最艰难的一步
排斥反应，不仅是器官移植的最大障碍，更是异种器官移植的珠穆朗玛峰。
世界上第一例异种移植手术发生于1905年。当时，法国医生布兰斯多（Princeteau）将家兔的肾脏移植给一个肾衰竭的儿童，术后移植肾排尿良好。但16天后，患儿死于肺部感染。
此后，法、德、美等国的研究者先后加入到异种移植器官研究中，试验对象包括兔、狗、羊、猴等物种。
将猪的心瓣膜等组织用于人体治疗已有数十年历史。但这些移植物大多为处理后的结构组织支架，原有的猪细胞被去除。真正的异种器官移植，是提供有活力的猪器官和细胞，在临床移植到人体后，它们能继续保持生理功能，且能克服免疫排斥反应。
最著名的异种器官移植案例发生在美国南加利福尼亚州。1984年10月，女婴费伊诞生。不幸的是，她的心脏存在缺陷，供血能力不足，只能维持几周生命。为了拯救费伊，医生将一颗七个月大的狒狒的心脏移植入她的胸膛。遗憾的是，费伊在21天后死于排斥反应。
异种器官移植的免疫排斥反应非常复杂，会发生超急性排斥反应、急性血管排斥反应、急（慢）性细胞性排斥反应等。最为凶险的超急性排斥反应，源自猪体内物质半乳糖分子（α-GAL）与人体体内抗体和补体联合产生的剧烈排斥反应。一旦发生，被移植的猪器官往往会在几分钟至数小时内，出现血栓、水肿等现象，并最终坏死。
近两年大热的基因组编辑技术解决了这个问题，直接、彻底地敲除猪基因组中的α-GT基因，使得被移植的猪器官中不含α-GAL。异种移植最大的突破就是通过基因组编辑，提高了猪组织移植后的免疫保护，降低了免疫排斥。
猪的基因组包含30亿个碱基对，基因修改就像打靶一样。江苏省异种移植重点实验室主任、南京医科大学特聘教授戴一凡对《财经》记者说：“利用这个技术做免疫排除研究，比传统手段要快很多。”
基因操作已经在几代动物中证实稳定。目前基本上不受超急性、急性细胞性排斥反应的限制，但其他问题仍突出，如移植体内会发生血栓性微血管病或受体内发生系统性消耗性凝血病，这有待进一步的研究去解决。 剪除病毒
其实，在动物实验中，科学家们首先想到的是人类的近亲灵长目动物，猴子、狒狒、猩猩等作为器官提供者似乎顺理成章。很快，他们发现灵长目动物每胎产仔少，成熟周期长，不够用，实验成本高。
更要命的是，灵长目动物体内可能携带危险的病毒。
北京大学医学部实验动物科学部主任郑振辉告诉《财经》记者，一个物种的进化程度越接近于人类，其传播疾病的危险就越大。像艾滋病就是灵长目动物传给人的。基于伦理和安全考虑，灵长目动物被禁止作为异种器官移植的供体。于是，科学家的聚光灯逐渐集中到猪的身上。
猪具有多重优势，其器官与人体器官形状、大小相似，生理性质相近，而且繁殖能力强，生长周期短。
在20世纪90年代初，猪的神经元细胞被植入帕金森病人的大脑，至今这些被治愈的患者中还有人在健康地生活，没有帕金森的症状。
但好景不长，科学家在猪的基因组中发现了内源性逆转录病毒（PERV）。其传播途径是通过遗传，而不是猪与猪之间的接触。所有的猪都含有PERV，这对猪本身无害，但令人担忧的是，当进行以猪为供体的异种移植时，PERV会不会从猪的基因组“跳”到人的基因组中，成为一种新的异种病毒在人群中传播？相关研究也不能给出确定性答案。实验表明，在接受过猪器官移植的小鼠体内发现了PERV的感染，但在狒狒体内又没有发现类似情况。
“国外过去20年一直在研究，国外有些实验室收集了几百例猪细胞移植案例病人的血样，实验发现没有病毒传播，可以基本得出结论这个病毒不重要，对患者没有危害。”戴一凡说。
不过，也有研究者建议对异种移植持谨慎态度，毕竟病毒感染有潜伏期和体内突变的可能性。
中国社会科学院研究员、生命伦理学家邱仁宗告诉《财经》记者，“首先应该用动物实验证明安全有效，并经过专家鉴定，确认动物实验有效度，才可能考虑制订临床试验的计划，临床试验首先应在没有人器官来源，不移植就要死亡的病例上做，并事先征得病人同意。”
2005年4月，世界卫生组织（WHO）在日内瓦异种移植咨询性磋商会的声明称，迄今为止，没有迹象显示利用诸如猪类的其他动物进行的异体移植发生感染的情况。然而，异体移植具有在某时发生这类疾病的潜在危险。
基因组编辑技术或许能敲除猪基因组中可能有害的病毒基因。“我们在过去的一年内，证明了技术上的可能性。”哈佛大学医学院遗传学系博士后杨璐菡告诉《财经》记者。
杨璐菡的团队掌握了一把“剪刀”――CRISPR技术。作为基因组编辑三大利器之一，CRISPR技术2012年由加州和欧洲的科学家共同发现，并在短期内迅速强大。在不到两年时间里，CRISPR技术从一个不太确定有用的想法，变成一项几乎所有生物学毕业生都要掌握的技能，并被寄希望可能获得诺贝尔奖。
此前，大多数的基因组改造都是一个基因层面的修改，不能实现多个基因的敲除、插入。CRISPR技术使一切变得简单而高效，能同时作用于多个靶位点。
杨璐菡团队利用CRISPR-Cas9将猪细胞中的62个PERV基因拷贝进行修改，并且保持了基因组的完整性。之前这一技术的最高纪录也就是一次改造6个基因拷贝。要打靶62个基因，意味着要将打靶的效率提高近两个数量级;而且还必须打得准，不能把别的地方给破坏了，否则会影响猪的生长发育或带来其他不可预测的风险。2015年10月11日《科学》网站刊登了这一研究结果。 临床实验还有多远
许多发达国家政府和大公司竞相投巨资开展器官移植用猪的研究，并描绘出一幅美丽的图景，未来的“器官农场”中会有充足的供体，向病人们提供肾、心脏、脾、胰、肝等异种器官。
郑振辉分析，异种器官移植不但能解决器官短缺，优点还在于，移植的器官可以提前预定，总处于新鲜状态;医生有了足够的时间，可按计划对患者进行充分的预处理;对猪进行遗传或生化操作，除了降低排斥反应的危险，甚至可以表达一些新的基因或生化过程来满足患者的需要。
获得这些新鲜器官最理想的方法是，把一个人的诱导性多功能干细胞打到猪体内，定向培育出与干细胞提供者完全匹配的人体器官。但还有太多的未知，人的细胞在猪的胚胎发育时，能否顺利发育成器官还不确定。目前，戴一凡团队已经做出了没有肺的猪胚胎，然后会将人体干细胞注入进去，希望能长出人类的肺。美国萨克生物研究所（Salk Institute for biological studies）、斯坦福大学也已展开类似研究。
这类研究涉及的伦理问题实在太多了。比如人的器官长在猪的神经系统会不会有人的思维，人的干细胞长在猪的生殖系统会不会产生人的、卵子等。
因此，科学界的火力还是集中在异种移植研究。已有的大动物实验显示，异种移植到灵长目动物的猪器官和细胞，最长存活期依次是：微囊包裹的胰岛、神经元、胰岛、角膜、肝细胞、异位心脏、肾脏、原位心脏、肝脏、肺。其中，肺、小肠和心脏的移植还不成熟，已有的实验不是原位移植。如心脏实验中，是把猪的心脏放到猴子肚子里，只看有没有排斥反应，不计功能。
“现在只是解决了排斥反应问题，下一步要解决功能问题，在功能性得到解决以前还不能做临床研究。”戴一凡说。
进展快速的首推猪胰岛移植。戴一凡的团队用经基因改造的猪胰岛在猴子身上进行试验，胰岛在猴子体内存活了400天，还使得猴子血糖回归到正常数值，不再依赖胰岛素。
用于实验的猪通常为克隆猪。基因组编辑技术降低了供体猪培育的费用，将效率提升几十倍。2014年戴一凡团队培育了100多头克隆猪，成本约250万-300万元。100多头猪并不是用于一次实验，根据不同的课题，可以移植不同的细胞类型，敲除基因和插入基因不同，同一种细胞要重复做六次到八次实验。
看上去一切都已就绪，理论上，当人体排异障碍被扫清后，就可以做临床实验。可至今没有一个实验室走到临床阶段，都还在大动物实验上尝试。原因在于美国FDA盯得很紧，除了人体排异反应，还有超洁净的养殖环境。
超洁净环境牵涉到外源性感染，FDA明确列出了一些猪携带的有害病毒和细菌，移植的器官在用于人体之前，需要检测供体猪，不能携带这些病毒和细菌。目前，各实验室的养殖猪的环境仅比普通猪养殖环境略好。
保有一个超洁净的养殖基地需一笔巨大的投资，不是一个实验室能够承担的，这让各个研究组挠头不已。前期投资特大，风险也大，企业也还在犹豫。
戴一凡分析，大动物实验很多实验室已经完成，大规模临床研究就等企业来承担和推动，目前最有希望投资临床研究的是从事生物技术的美国联合治疗公司（United Therapeutics Corp），可是它此前没有做最有希望获临床批文的胰岛、心脏、肾脏等的移植研究，主攻方向是肺，而猪的肺几乎没有希望上临床，排异反应很严重。
在中国，如果地方政府有意愿，可能起到实验室跟企业之间的中介作用。深圳市政府认为这是一个新兴的领域，于是通过2010年10月推出的引进高级人才计划――“孔雀计划”来直接支持引进生物领域人才，深圳市政府也有意愿帮助建小型的实验用猪舍，之后，产业化阶段引入企业。
问：编辑同志，您好。最近社会上尤其是互联网上对转基因食品的安全性比较关注，争论也很激烈。请介绍一下什么是转基因食品，国外是如何管理转基因食品的？
广东读者：张辉
张辉同志：
您好！随着生物技术的不断进步，转基因食品的种类和数量不断增加，转基因食品的安全性也备受关注。
所谓转基因食品 ， 是指利用现代分子生物技术， 将某些生物的基因转移到其他物种中去， 改造生物遗传特性， 使其在形状、营养、品质等方面向人们所需目标转变的食品。换句话说，就是以转基因生物为直接食品， 或为原料加工生产的食品就是转基因食品。转基因作为一种新兴的生物技术手段，它的不成熟和不确定性，使得转基因食品的安全性成为人们关注的焦点。对于转基因食品的安全问题， 科学家无法给出确定的答案， 各国的管理也是基于国内政治、 经济、科技、文化等不同因素而呈现出不同的模式。
目前，国外对转基因食品的管理大体可分为美国和欧盟两种模式。美国被认为是世界上最大的转基因食品生产国。美国主张，只要在科学上无法证明转基因食品的危险性，就不应该限制，因而美国对转基因食品的管理相对宽松。欧洲国家对转基因食品可能危害健康和环境的担忧比较强烈，认为只要不能否定转基因食品的危险性，就应该加以限制。因此，欧盟对转基因食品的管理比较严格、复杂，法律体系较为完备。
美国对转基因食品的管理是以产品为基础， 认为转基因生物与非转基因生物没有本质的区别， 监控管理的对象是生物技术产品， 而不是生物技术本身。美国农业部动植物健康检验局负责管理转基因植物的开发和田间试验；美国环保局负责对转基因植物的环境影响进行评估，而食品与药品管理局则负责转基因食品和饲料的安全性评估。美国最初对转基因食品采取开放式管理， 如1992 年食品与药品管理局有关转基因植物作为食物的法律提到，相关产品不需作市场前评价， 除非它引起新的安全问题。但自星联玉米事件后，美国政府开始采取谨慎态度， 并于2001 年1 月出台了转基因食品管理草案。此后， 为监测和控制转基因食品的安全性， 美国政府制定了一系列管理条例。
欧盟实行以工艺过程为基础的管理模式， 即重组基因技术有潜在危险， 不论是何种基因、哪类生物， 只要是通过重组技术获得的转基因生物， 都要接受安全性评价和监控。欧盟的转基因食品管理机构是欧盟食品安全局， 在对食品安全有直接或间接影响的所有领域内， 提供独立、科学的建议。
总的来说，欧盟支持风险预防原则， 美国采用转基因食品和非转基因食品实质等同原则； 在上市制度方面， 欧盟采用严格审批制度， 美国则是自愿咨询制度； 在标签制度上， 欧盟采用强制标签制度， 而美国坚持自愿标识制度。上述差异形成的原因主要是欧美转基因产业发展不同， 政府与消费者对转基因食品风险的认识和接受度不同， 各阵营利益集团立法博弈力量不同。
转基因技术是个新事物，人们存在疑虑是可以理解的，在加强监管的同时，各国也都比较重视人们的知情权和参与权，即让人们明白哪些是转基因食品，吃与不吃人们可以自愿选择。随着生物技术的发展和管理的改进，人们和转基因食品的和谐相处应该是可以预期的。
日前，中国中山大学基因工程教育部重点实验室副教授黄军就等人，在《蛋白质与细胞》杂志上，发表了他们的课题组利用CRISPR/Cas9系统对人类胚胎基因组改造的研究结果，由此也引发了新一轮的伦理学争论。
伦理问题想避也避不开 研究人员利用了一种“不能存活”的受精卵来进行研究。这种受精卵含有一个卵细胞和两个的三个细胞核，从而不能正常发育成婴儿。研究人员使用一种最近很火的叫做“CRISPR/Cas9”的生殖细胞系剪接技术，来剪切受精卵中人的HBB基因，因为HBB基因突变会导致β地中海贫血症，该疾病会导致血液失调，造成患者死亡。
黄军就认为，他们的研究是一个很有意义的模型，一个比动物模型或者成体细胞更接近正常人类胚胎的模型。“我们想让全世界的人都知道这种模型真正发生了什么，而不是在没有数据的前提下，口头讨论会发生什么。”课题组为了避免伦理争论，一开始就设计了“不能存活”的三核受精卵来进行研究，但还是引来了一系列的争论。
一些人认为，基因编辑胚胎研究具有光明的未来，因为它能在孩子出生之前来消除严重的遗传性疾病。而另一些人认为这种研究跨越了伦理底线，因为这种胚胎修饰是可遗传的，可能会对未来带来意想不到的后果。还有人担心，因为这种技术的简单易操作，会有人进行不安全或者不道德的应用。
技术上不成熟停止研究 研究人员指出，在对人体胚胎使用“CRISPR/Cas9”生殖细胞系剪接技术出现了“严重的障碍”。非靶向突变的出现也说明这一技术存在一定的问题，因为这些非靶向的突变通常都是有害的。
黄军就表示，他们只检测了一段基因组，所以只发现了一部分非靶向突变。如果做全基因组测序，会发现更多的非靶向基因被修饰了。虽然黄军就认为造成这一结果的原因可能是“不正常”的三核受精卵，因为在利用该技术研究动物胚胎和人类正常体细胞的时候，并没有这么糟糕的结果。但是，鉴于从来没有对“正常”的人类胚胎进行这方面的研究，谁也不知道结果会怎么样。最终，黄军就认为如果想在医学上应用“CRISPR/Cas9”技术，还需要改进该技术的准确性和保真性。
黄军就说：“如果要对正常人类胚胎进行实验，成功率必须接近100%，这就是为什么我们要停止研究，当前我们认为这项研究过于不成熟。”
美国《技术评论》杂志称，目前全球有多个类似实验已经计划好或正在进行，实验的目的是促进基因疗法的发展，比如或许可以在癌症和艾滋病的治疗上找到突破口。
工信部：2018年将继续推动全面取消二手车限迁政策，加快修订《二手车流通管理办法》，推进二手车信息和信用体系建设，带动汽配、维修、保险等相关服务业发展。
河南省政府工作报告提出，推进河南自贸试验区建设，赋予各片区更大改革自主权，全面落实160项改革试点任务，积极申建自由贸易港。
据消息人士称，中国计划加强对国内公司在海外创立的私募股权基金的监管，包括披露投资人身份，以降低金融风险，并密切关注新一波海外融资潮。
据美国国立卫生研究院(NIH)官网23日宣布，该机构将拿出1.9亿美元资助基因组编辑研究项目——“体细胞基因组编辑”计划，旨在开发安全有效的人类基因组编辑工具，消除将这项革命性技术应用于治疗人类患者的障碍。
据财经报道，快手正在进行新一轮10亿美元的融资，投后估值在180亿美元，腾讯、红杉将继续跟进。
海航回应：上市公司集中停牌与流动性无关，去年新增银行授信逾1900亿。
新一代车用锂电池明年商用、钛铌材料成就颠覆性技术
据媒体报道，东芝官方近期宣布已成功研发新一代车用锂离子电池，有望在2019年商用。该电池采用钛铌氧化物阳极材料，相对目前三元、磷酸铁锂等技术，实现了一个颠覆性的进步。新电池具备能量密度高、充电效率快等优点，只需充电6分钟就能达到90%的电量，在日本JC08测试标准下，可行驶320公里。目前锂电池平均需要30分钟才能充至80%电量。同时，该电池在充放电5000次之后，仍能保持90%以上的电池容量，损耗率极低。而且在零下10度的低温环境中也能实现快充，在零下30度仍可正常使用。照此计算，如果每天充电一次，该电池可使用近14年。
业内认为，钛铌电池的正式商用，相关金属材料的需求有望大幅提升。
东方钽业（000962）是国内最大的铌产品生产基地，是国内科技先导型的钽铌研究中心；
青少年高校科学营西部营首次开营
为推动高端科研资源科普化，服务区域青少年科学素质提升，中国科学院昆明分院组织系统科研单位（昆明植物所、昆明动物所、版纳植物园、地球化学所、云南天文台）科研人员，立足天文科学、生命科学、地球科学的学科优势、科研资源和区域特色，组织编写了近40个近探究性科研实践课程和特色科普教育活动，经过遴选和专家论证，六个探究性科研实践课程在西部营期间试点启动。让青少年走进中科院，走进实验室，与科研人员一起一起探索热点、前沿科学问题。
此次活动前期得到了云南省科技厅、团省委、省科协、省教育厅、共青团云南省委、云南大学等多家政府职能部门、高校以及中科院的领导和专家的指导、支持。
在开营仪式上，中科院科研人员代表课程指导团队――昆明植物所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室、昆明动物所遗传资源与进化国家重点实验室、云南天文台中国科学院天体结构与演化重点实验室，现场了六个探究性科研实践课程，欢迎小小科学家的到来。
六个探究性科研实践课程
3天，中学生营员与中科院科研人员一起泡实验室、查文献、写报告、成果答辩……让营员了解科学研究的真实过程，感受科学研究的苦与乐，激发探索自然的好奇心。
一、血管保卫战
――抗血小板聚集化合物活性检测
课程指导团队：中国科学院昆明植物研究所天然药物活性筛选中心植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室
冠心病、心肌梗塞、肺栓塞、缺血性脑卒中……这些血栓性疾病无论在我国还是在西方国家都已成为人口死亡与致残的首因，其发病率高居各类疾病之首，严重威胁人类的生命健康，近年来仍有渐增之势，是当代医学研究的重点、热点之一。目前临床上抗血栓主要用抗凝药物和抗血小板凝集药物，后者的应用更为广泛。
本课程带领营员走进天然药物活性筛选中心，建立抗血小板凝集检测模型，对不同植物天然产物的抗血栓活性进行评价，探讨具有抗血小板治疗作用的化合物对抗血栓药物研发的科学意义。
二、受人青睐的天然抗氧化剂
――不同植物抗氧化活性评价及活性成分追踪
课程指导团队：中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室
自由基与多种疾病的关系已愈来愈引起人们的重视，而抗氧化剂则能帮助捕获并中和自由基，从而祛除自由基对人体的损害，有抗癌防癌、抗衰老、调节免疫等多种功效。此外，天然抗氧化剂在食品添加剂中的使用能防止或延缓食品氧化，提高食品稳定性，延长食品储存期，给我们提供更好的食品安全。通过测定天然产物的抗氧化能力来筛选生物活性物质成为生物化学和医药学的研究热点。
从寻找生活中具有抗氧化的植物活性成分入手，通过化学方法进行抗氧化活性成分的分离及鉴别，通过生物学方法进行抗氧化活性的定性定量分析并指导进一步的活性成分追踪，最终完成对不同植物的抗氧化活性评价及有效成分的获得。
本课程带领营员走进中国一流的天然药物化学研究平台，亲自动手，应用化学和生物学方法探究身边那些具有抗氧化植物的活性成分之谜。
三、基因重组技术
――“剪切”、“拼接”的大肠杆菌会发光
指导团队：中国科学院昆明动物所遗传资源与进化国家重点实验室（进化基因组学与基因起源研究组）
大肠杆菌是人和动物肠道中最著名的一种细菌，也是食品检测的重要指标。同时，大肠杆菌也是一种常用的基因工程菌，它作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，备受遗传工程专家的重视。在自然界，很多生物都可以发光，但只能被少部分的幸运儿观赏到。
本课程带领营员走进国家重点实验室，采用基因重组技术，制造一种可以自己发光，又易于培养的大肠杆菌品种（生物工程用菌株），探究基因重组技术的科学意义与魅力。
四、CRISPR-Cas9“魔法剪刀”
――柑橘凤蝶CRISPR-Cas9基因编辑实验
指导团队：中国科学院昆明动物研究所遗传资源与进化国家重点实验室（进化基因组学与基因起源研究组）
蝴蝶是自然界中最美丽的会飞的花朵，以其翅膀的美丽和多样化而著称，不仅在物种之间，在种群、性别、甚至季节间都存在差异。其翅膀之所以非常多变，是因为它们具有多种功能，与保护色、警戒色、拟态、温度调节和择偶等作用有关。
此外，蝴蝶在行为、生物地理学、细胞生物学和生物化学几乎所有方面都很多样化。这些特点使蝴蝶成为探索遗传学、进化、形态多样性及物种形成的一个有前景的系统。
CRISPR/Cas9是最近发展起来的高效基因编辑技术：简单、高效（命中率高），首次在蝴蝶上成功实现了该技术。
CRISPR/Cas9技术被誉为基因编辑的“神器”，本课程带领营员走进国家重点实验室，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，揭开美丽蝴蝶身上的各个谜团。
五、“百变星君”
――探寻小行星的前世今生
指导团队：云南天文台-中国科学院天体结构与演化重点实验室（系外行星研究团组）
科学家最新研究发现，在大约6600多万年前的史前白垩纪，小行星撞击地球的威力原比人们想象中的更为强大，它导致恐龙灭绝的同时，也让93%的哺乳动物遭遇灭顶之灾。近年来，科学家关于小行星冲撞地球预测的报道屡见不鲜，令人们不禁联想到《世界末日》、《天地大冲撞》等众多科幻影片中的场景。
本课程带领营员利用望远镜的“巨目”，探秘小行星物理性质的特征，揭开太阳系形成伊始物质状态的朦胧面纱，以及那波澜壮阔的太阳系演化历史。
六、“外星人”发来的信号？
――探寻神秘的脉冲星
指导团队：中国科学院云南天文台天体结构与演化重点实验室（系外行星研究团组）
1967年，英国剑桥大学一位女研究生贝尔本想通过天体闪烁来研究类星体，却无意间发现狐狸星座有一颗星会发出一种快速的有规律的周期性脉冲信号。一开始，人们对此相当困惑，甚至有人认为这可能是外星人在向我们发电报联系。到1968年终于证实，这是一种未知天体发出的电磁脉冲信号，并把它命名为脉冲星。脉冲星是高速旋转的磁化中子星，其脉冲周期就是自转周期。
本课程带领营员，利用云南天文台40米射电望远镜观测脉冲星，根据获取的观测数据分析推算脉冲星的位置、周期、密度、色散，以及由星际介质引起的脉冲随时间和频率变化的动态谱。
四个特色科普教育活动
实地考察，亲手制作，亲口品尝，妙趣横生的活动，带领中学生营员们在科学殿堂趣味翱翔……
一、“滇池古董”的回家之路
――滇池金线的荧光标记及放流
指导团队：昆明动物所
滇池金线，又名金线鱼，国家II 级保护动物，濒危物种，长于滇池形成时的320万年前，云南传统四大名鱼之首，到1986年已在滇池湖体中消失，仅在湖周少数支流的溪流和泉池中保存有少量个体。从2000年起，昆明动物所科研人员开展了保护、种群恢复、繁殖和可持续利用等一系列的保育研究，实现了滇池金线的人工繁殖、增殖、放流、监测以及野外种群的恢复，为保护和恢复鱼类资源和滇池水生生态做出了突出贡献。
本次活动中，昆明动物所科研人员带领营员学习鱼类野外监测的方法，动手参与到生物多样性保护的行动中。
二、味蕾与植物的完美邂逅
――美味植物的探秘之旅
指导团队：昆明植物所
“你随风飘扬的笑，有迷迭香的味道，语带薄荷味的撒娇，对我发出恋爱的讯号……”一首周杰伦的《迷迭香》，用植物特有的香气描写出恋爱微妙的气氛。迷迭香、薄荷、紫苏、薰衣草、藿香、罗勒、留兰香、百里香……这些大名鼎鼎的植物同属唇形科，这个庞大的家族以富含多种芳香油而著称，其中有很多著名的食药两用植物。紫苏干烧鱼、紫苏鸭、紫苏炒田螺、苏盐贴饼、紫苏百合炒羊肉、薄荷叶煎蛋、薄荷鸡、薄荷茶、迷迭香烤牛排、香草冰激凌……这些使人“唇齿留香”的美味背后又有着哪些不为人知的故事呢？
昆明植物所科研人员带领营员一起聊起药用植物和美食植物的科学八卦，生动有趣，他们还一起动手创造舌尖上的植物美食，来一场“美食+知识”的趣味之旅。
三、当科学遇见艺术
――自然笔记
指导团队：版纳植物园
自然笔记是一种目前国内外社会流行的自然体验方式，通过深入到自然环境中近距离地与自然界的万事万物进行亲密接触和细致观察，运用图画和文字等的方式来描绘记录者所观察到的动植物及其之间的相互联系，记录其中的变化和有趣故事，感受大自然的神奇魅力。
版纳植物园科普专家带领营员走进昆明植物园，用画笔和心智，为自然写日记。
四、参访国立西南联合大学旧址
国立西南联合大学是一所与相始终的战时大学，在昆8年，大师云集、名家荟萃，在极度简陋和艰苦的环境中，一批名师巨匠鼎立治学研究，坚持为国育才，无数从这里走出的学生成为中国乃至世界的栋梁之才。至今，中国两院院士中有联大师生173位。
对参加高校科学营的高中生们而言，科学营不仅可以探索科学奥秘，近距离感受科学与科技的魅力，还收获了纯真的友谊，播种了希望的梦想。
七天相聚的时间很短，离别总是那么难舍，联大的校歌仍在耳旁回响，青中国梦已经起航……
链接：
全国青少年高校科学营
青少年高校科学营由中国科协、教育部共同主办，中国科学院为支持单位，由中国科协提供经费支持。为落实《国家中长期教育改革和发展规划纲要》精神，旨在充分利用重点大学的科技教育资源，激发青少年对科学的兴趣，培养青少年的科学精神、创新意识和实践能力。
2012年首届全国青少年高校科学营承办高校总数为41所，以清华大学和北京大学为首，均为全国重点大学。四年来，高校科学营活动共招募全国31个省（自治区、直辖市）和新疆生产建设兵团，以及港澳台地区的营员37315名，承办高校也增加到51所。
一个是打假斗士，一个是著名主持，一个代表着公众对转基因的普遍焦虑，一个代表着部分人士推进转基因的决心。一场始于微博的论战，最终竟然走向法院，事情的发展出乎人们的预料，由此引发的全民关注也可想而知。1月16日，记者在百度中输入“方舟子崔永元”，搜索出的网页高达59万个，连英国BBC中文网都对这一事件进行了报道。而由腾讯网发起的“转基因食品调查”，人气值更是高达51.9万。
从乐观的角度看，“方崔之争”已成为一场向广大网民普及转基因知识的公开课。
缘起：20余名网友品尝转基因玉米
2013年9月7日上午，20多名主动报名的网友参加中国农业大学玉米试验基地的活动，现场采摘转基因玉米并煮熟品尝。作为活动的发起人之一，方舟子表示：“品尝转基因玉米虽无科学研究价值，但有科普价值，应当创造条件让国人可以天天吃转基因食品。”
此言一出，引发网上热议。崔永元也转发了微博“转基因食品，你吃吗？你可以选择吃，我可以选择不吃。你可以说你懂科学，我有理由有权利质疑你懂的科学到底科学不科学。你可以说我，我也可以说你白吃。”
对此，方舟子在微博中回应称：“你当然可以选择不吃，但是不要传谣阻碍中国农业技术发展。我科普的是各国际权威科学机构认可的科学，你根本不懂，有何资格质疑？”
由此，一场论战在两人之间开启并持续发酵，直到4个多月后的现在，结果仍未见分晓。
方舟子：无需恐慌，学会接受转基因
作为“挺转”的中坚力量，方舟子在接受英国BBC网站记者采访时说，自己在转基因技术方面写过两本书，发表过100多篇文章。他认为，中国转基因问题的辩论已经超出了技术和专业知识的层面，涉及很多方方面面的问题。
方舟子分析说，在中国，主要有这么几类人反对转基因：一类是环保人士和绿色和平组织，这些人一直都在反对转基因；还有一些不了解情况的人因为不懂转基因，再加上所谓“阴谋论”的影响，因而也反对转基因……
方舟子认为，中国科学界的大部分人都是支持转基因的，只有个别科学家质疑转基因食品的安全性，因而反对转基因，但是他们数量不多且也不能代表其研究机构。
针对网上热议的“西方国家都反对转基因，只有中国推广转基因主粮，中国只是美国的试验田”，方舟子回应称，这种说法完全是一种无知。现在世界上种植转基因主粮面积最大的国家是美国，而欧盟国家总体上也是支持转基因作物的，只有法国反对，亚洲国家的韩国、日本，也是反对转基因的。
在方舟子看来，这些国家之所以反对转基因，主要是因为一些国家基于政治、经济、文化和的考虑，认为转基因作物破坏了作物自然属性，他们反对非自然产品，因而反对转基因；另一些国家则担心美国产品占领其国内市场，于是以反对转基因为借口，设置贸易壁垒，与美国打贸易战。
实际上，反对转基因的不仅有国家，还有为数众多的各国民众。2011年8月9日“滚出印度日”这一天，印度民间社会组织与相关人士举行了1000多项活动，数千人参加活动并高呼“孟山都滚出印度”、“禁止转基因作物试验”。2012年3月，美国反基因人士在加州、华盛顿州等30多个城市掀起反基因、反孟山都行动，并得到多国反基因人士响应。
在中国，由腾讯网发起的“转基因食品调查”中，近23.2万人认为转基因食品不安全，24.4万余人不支持转基因粮食在中国商业化种植，分别占受调查总人数的89.3%和94.1%。
对于这一现象的产生，方舟子认为，主要是由于人们不了解转基因技术和相关科学方法。例如，有人要求证明转基因食品绝对没有隐患才能上市，但这是不可能的。对于任何食品，没有人能证明它是绝对没有隐患的。而和其他技术一样，转基因技术用不好也可能会出问题或意外，但大家不应因为这种顾虑就反对它。总之，目前已经上市的转基因食品都经过理论论证和实验验证，都是安全的，没有经得起推敲的理由和证据，就不能怀疑它们的安全性。即使从长远来看，也是如此。
在方舟子看来，在今天，人们想要完全避开转基因食品几乎是不可能的。国内市场上绝大部分大豆油和调和油、几乎所有的木瓜以及相当一部分西红柿，都是转基因的。即使你刻意不在市场上购买转基因产品，上餐馆用餐时也难以避免。转基因食品早巳进入人们的生活，而且只会越来越多，因此无需恐慌，而应学会接受它。
崔永元：推广宜谨慎，应设商场专柜
自2013年12月崔永元自费50万前往日本、美国等地调查转基因产品后，他开始被网友视为新的“反转”代表。
崔永元认为，转基因问题横跨多个领域，涉及农业、医学、环境、定价等相关部门，因此转基因作物的产业化不应由农业部一家说了算。比如，日本通常是由农林水产省和环境省进行转基因作物生物多样性影响的审查，由农林水产省进行饲料安全审查，由厚生劳动省进行食品安全的审查，多个部门共同监管相互制衡。
对于被方舟子质疑为“外行”，崔永元认为，转基因新技术涉及方方面面，每个人都有发言权。日本政府在认可转基因农作物前，都要听取国民的意见，鼓励民众参与投票，并在做鉴定的同时公开向全社会征集消费者的意见和建议。
为什么中国政府发了转基因水稻安全证书，但大家仍不相信其安全？崔永元指出，转基因宣传特别需要公信力，美国FDA（食品和药物管理局）、日本厚生省都有一个共同特点，就是有公信力，要推行新的产品时大部分民众都选择相信。
崔永元表示，中国应加大对转基因技术的研究力度，这涉及到粮食安全、知识产权等，因此要坚决支持中国发展自己的转基因技术，研究上“一天都不要停”。但转基因作物商业化种植一定要谨慎，尤其是转基因主粮产业化一定要慎之又慎。
增强免疫细胞战斗力
白血病又被称作血癌，也就是血液和骨髓的癌症。急性淋巴细胞白血病是儿童最常患的白血病。正常的骨髓会制造成熟的血细胞，而急性淋巴细胞白血病患者的骨髓因为被癌细胞抑制，只能制造不成熟的血细胞，而且发展迅速。治疗一般会用化疗、放疗来杀死患者体内的癌细胞，然后再用干细胞移植来帮助患者重新建立健康的造血系统。不过，化疗和放疗会大规模杀死健康细胞，干细胞移植会带来严重的排异反应。
现在白血病的治疗又有新的方向――基因治疗。具体来说，是改变T细胞的基因。T细胞是一种重要的免疫细胞，它们在我们的身体里不停巡逻，其表面的蛋白质受体就像探测器，一旦发现异常细胞，例如被感染的细胞或者癌化的细胞时就会将它们杀死。可以说，T细胞是我们身体对抗癌症的先锋战士。然而，癌细胞十分狡猾，它们会通过进化来躲开T细胞。例如，T细胞表面有一种名为PD1的受体，其作用就像是一个开关，一旦被触碰就会让T细胞停止下来，本来是为了预防T细胞过激的反应。进化了的癌细胞会去触碰这个开关，让想要扫清它们的T细胞变得缓慢或者停止下来。有了这种能力的癌细胞十分危险。
如果能够避免T细胞被“关掉”，那么免疫系统的战斗力无疑能够得到提升，可以杀死更多进化了的癌细胞。现在有一种新兴药物――PD1抑制剂，就能避免T细胞被关闭。联合其他治疗方法，这种药物已经在癌症治疗中显示出了不错的效果，包括白血病。
修改T细胞的基因
在增强T细胞能力这方面，除了抑制PD1受体，另一种令人激动的方法是，通过修改T细胞的基因，使其能够更好地找到和杀死癌细胞。癌细胞表面的蛋白与正常的细胞有区别，T细胞通过基因改造，其表面的受体如同针对癌细胞表面的蛋白定制的一样，这种被改造的受体叫嵌合抗原受体（CARs）。受体就如同探测器，那么嵌合抗原受体就是癌细胞的专属探测器。关于嵌合抗原受体的研究从20世纪80年代就开始了，但从前几年才开始人类临床试验，并且展现出了惊人的结果。
在一次诺华制药公司赞助的CARs T细胞的临床试验中，一名1岁的女孩儿Layla获得了很好的疗效。传统的治疗方法对Layla都失败了，实验性的CARs T细胞疗法挽救了她的生命。在治疗中，医生本来需要先将T细胞移出患者体外，然后用基因技术将其改造为CARs T细胞，最后再放回患者体内。不过，由于Layla太小了，而且病得很重，医生无法从她体内获取足够多的T细胞用于基因改造，所以只能使用捐赠者的T细胞。由于排异反应，当捐赠者的T细胞进入到Layla体内后，会将她自身的细胞当作入侵物来攻击。因此，在治疗Layla的时候，除了需要修改T细胞的CAR基因，还要修改其他基因让T细胞不会攻击Layla的正常细胞。
不断完善基因治疗
以往的基因治疗只能添加基因，而现在修改基因的技术提供了更多的可能性。经过基因改造后的CARs T细胞能够治疗很多疾病。为了让更多的人获益，研究者们还在不断地改进这种疗法。首先，如果使用捐赠者的T细胞，那就必须解决排异反应的问题。虽然T细胞经过基因修改不会攻击患者的其他细胞，但是患者的免疫系统却会攻击外来的T细胞。还好的是，Layla之前接受的传统治疗方法已经让她的免疫系统停止了工作。对于其他患者，有什么办法可以不用事先摧毁他们的免疫系统吗？
美国宾夕法尼亚大学的研究团队就利用CRISPR基因编辑技术关闭了患者的一个基因，让他的免疫系统不会将捐赠者的T细胞视作入侵者，降低了捐赠者的T细胞受到攻击的几率。
宾夕法尼亚大学的研究团队还关闭了CARs T细胞上的PD1受体基因。也就是说，CARs T细胞上的“开关”被拿掉了，这样一来癌细胞也就无法把CARs T细胞关掉了。这种更加优越的CARs T细胞已经在治疗小鼠的白血病实验中取得了成功。有可能在未来的几年内，这种治疗方法就可以运用于临床。当然，这种疗法并非完美无缺。例如，修改基因时很有可能“误伤”到其他不需要修改的基因，这有可能造成其他细胞癌变。还有，癌细胞可能会往别的方向进化，例如消除表面会被T细胞识别的蛋白质，这样CARs T细胞就无能为力了。而最大的问题是，CARs T细胞有没有可能对付实体肿瘤。在目前的实验中，CARs T细胞还无法单独消除实体肿瘤，只能作为其他治疗的辅助方法使用。
摘要:新时代新要求,各种创新被摆在了重要位置。加强教学创新,必先审视教育自身,科学发展在日新月异而我们的教学内容却不能与时俱进,新酒仍用旧瓶装的现象,制约了教学创新的又好又快发展。加强教学方法创新的同时不要忽视教学内容的更新,两手都要抓,两手都要硬,本文结合教学体会进行举证。
关键词:新课改 教材更新 教学创新
新世纪已拉开它那千年帷幕,展现出科技化、信息化的时代特征,竞争核心也转移到层次更高的创新能力竞争上。它呼唤有求异思维、创新能力、实践精神的复合型人才。审视我们的教育不难发现在科学与教学上双轨不同速;从小学开始便一步到位,进校就是拿出书本,学习现成的理论。知识更新慢,获取途径单一;中间缺少了质疑、假想、实践等知识的发现、发掘环节。这种现状下要实现知识的再发现、技术的再革新可以说是缘木求鱼,要得渠清如许,须源头有活水。
随着新课程改革如火如荼地进行,一个教材版本一统天下的局面被打破。试点地区有了相对的选择权,能够根据自己地区的特点、实际编写和选择不同版本的教材。百家争鸣才能异彩纷呈,原本不错的设想实施起来却是很不容易,不同版本教材的优、缺点逐渐呈现出来:有的版本注重知识的完整性,强调“再现知识的发现过程”,知识的系统性得到了保障,但受容量所限,在知识点的深刻性和完整性上必有取舍。有的版本在知识点上注重完整性、深刻性,而知识的系统性被割裂,鱼和熊掌确实难得。试验教材在编写时过分突出自己的特点,大有和原来教材彻底决裂的趋势,找不准传承和创新的结合点。一些地方是必须要改动的,但一些该统一的内容必须要统一。“甘薯”在不同的地方可以叫“地瓜”、“红薯”等,但它的学名只有一个。一些概念、名词统一起来未尝不是好事,尤其是对初学者,对他们将来学业的发展也是有帮助的。
教材知识在各学段的衔接不到位。有些知识重复,有些后学段用到了而以前却没有学习体验。分子遗传学内容较深奥、突兀,学生接受起来困难很大。高中教材在知识的延续性、概念的内涵和外延上有些地方做得欠缺:过于尊重知识的发现过程,没有很好地利用初中所学,也没有很好地结合时展和科技进步。如“基因”这个词在学完分离规律后才出现,授课时老师一会儿“遗传因子”一会儿“基因”,给教学带来很大麻烦。学生已经知道这个概念而且耳熟能详,也知道孟德尔豌豆实验中“遗传因子”就是通常所说的“基因”,教材完全可以稍事说明就直接用基因这个概念了。
即使同一教材需要改进的地方也有很多,有了创新的教学内容,才有创新的教学行为。多年来我们一直高喊教学创新,但是很多工作浅尝辄止,口头上的东西多,落实在行动上的少。不是缺乏创新土壤,而是缺乏创新的种子。教学内容更新的滞后,禁锢了创新思维的发展。甲型h1n1流感病毒携带有禽流感、猪流感和人流感三种流感病毒的脱氧核糖核酸基因片断,同时拥有亚洲猪流感和非洲猪流感病毒特征。这些就很难用教材中的内容来解释。(1)最初对基因的定义是“有遗传效应的dna片段”,流感病毒的核酸是rna,从最初的定义来看h1n1病毒的遗传物质不能叫“基因”。(2)由于病毒没有染色体,其变异方式肯定不是染色体变异,同时它又不能进行有性生殖,不符合通常所说的基因重组。一般来说病毒的变异方式只有基因突变,而且这种突变是点突变—— 只是碱基对的改变,应该不会有其他病毒的基因片段,这显然有悖于现实,因此我们应该以发展的眼光看问题,不能再拘泥于成规。甲型h1n1的最初来源应是基因重组,就像格里菲斯所做的“肺炎双球菌转化”实验那样,发生了非真核生物之间的基因重组。只是人、猪、家禽共处的时间已很长,该病毒出现的如此突然,变异的幅度如此之大是人们始料未及的。当前令人恐惧的超级细菌的产生可能正是这方面的原因。“基因”、“基因重组”等概念也应该与时具进作出相应的调整了。
生命科学密切联系生活实际,与学生的生活休戚相关,不缺乏兴奋点和创新的切入点。教学内容应时时、事事孕育创新,存在质疑的地方要加强讨论,形成共识,给出明确的结论或说明。目前对水的跨膜运输方式的共识是“自由扩散”,但是学生具备了相应的知识储备后提出:生物膜的支架是磷脂双分子层,根据相似相溶原理,水分是不能自由扩散的。这样通过分子间隙的水量应该很少而且速度也不会很快。“单纯的自由扩散”是很难用课本上的内容来解释的。这样的问题已经存在了很多年,也困扰了师生很多年。即使2003年peter agre教授因发现水通道蛋白(aquaporin)而获得诺贝尔化学奖,“膜内在蛋白质”,“形成的专门输送水穿膜通道,存在于红细胞和肾组织中,极大地增加膜的水通透性。”这些知识教材
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中提及的很少,原本公认浅显的内容反而成为知识障碍。
在普及和传承科学知识时严谨性不能大而化之,深、广度的定位不但要符合学生的认知,而且也要遵循知识自身的内在规律。2008年高考山东卷—— 理综第一题从细胞膜上提取了某种成分,用非酶法处理后, 加入双缩脲试剂出现紫色;若加入斐林或班氏并加热,出现砖红色。该成分是:(1)糖脂;(2)磷脂;(3)糖蛋白;(4)脂蛋白。“用非酶法处理”给出信息:不考虑外加物质(蛋白质)影响,双缩脲试剂颜色反应检测蛋白质;斐林(或班氏)试剂检测可溶性还原糖,蛋白质+糖选出c选项“糖蛋白”。本题在命题立意上属于容易层次,但是程度好、思维缜密的考生会发现糖蛋白上的糖不是可溶性还原糖,糖蛋白(glycoprotein)是分支的寡糖链与多肽链共价相连所构成的复合糖,这与他们掌握的“多糖不具有还原性”相矛盾。送分题送不出去,这些现象直接影响学生的学习情绪,同一问题从不同角度考虑可能有不同说法,使学生大多认为生物学难学。在教和学中学科特点要尊重,但是其科学性质和地位是不能打折的。“怎样教”是我们刻意钻研的,“教什么”同样需要深入研究。
“工欲善其事,必先利其器”。我们在大谈方法革新时,不妨考虑除了技术上的改进,还有原材料选择上的革新,用两条腿小跑总比单腿跳得快！加强教学方法创新的同时不要忽视教学内容的更新,两手都要抓,两手都要硬。
参考文献
[1] 全国高考题真题汇编[z].
