时间：2023-05-30 08:54:50
开篇：写作不仅是一种记录，更是一种创造，它让我们能够捕捉那些稍纵即逝的灵感，将它们永久地定格在纸上。下面是小编精心整理的12篇蛋白酶体，希望这些内容能成为您创作过程中的良师益友，陪伴您不断探索和进步。
［摘要］ 蛋白酶体抑制剂是一类通过对泛素化通路阻断的一类新抗肿瘤药物，对肿瘤治疗具有良好的应用前景。蛋白酶体是广泛分布于真核细胞质和细胞核中，具有多种功能的蛋白酶复合物，而泛素―蛋白酶体系统是生物体内进行蛋白质选择性降解的重要途径之一，这些蛋白包括转录因子、肿瘤抑制蛋白、原癌基因等。体外试验和动物模型实验中已显示蛋白酶体抑制剂具有广泛抗肿瘤作用，早期临床试验也为蛋白酶体抑制剂进一步临床应用提供了依据。
［关键词］ 蛋白酶体抑制剂；癌症；治疗
泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin proteasome pathway，UPP）是细胞质和细胞核内依赖ATP不同于溶酶体途径的蛋白质降解通路，80%以上的细胞内蛋白质，包括调节细胞周期的多种蛋白的降解均由此途径完成。其成分的改变将引起蛋白降解异常，导致细胞功能紊乱。因此蛋白酶体可成为肿瘤治疗的靶点，其抑制剂代表了一类全新的分子靶向抗肿瘤药物。
1 蛋白酶体的结构与功能
1.1 蛋白酶体的结构 蛋白酶体存在于所有真核细胞的胞质及核内，是高度保守具有多种催化功能的蛋白酶复合物［1］。26 S蛋白酶体包括1个20 S的催化单位和2个19 S的调节单位，20 S 蛋白酶体呈桶状外形，由内层2 个β环和外层2 个α环组成，每个环含有7 个亚基。α亚单位促使底物移位进入中央孔隙水解中心，并使20 S复合体和19 S调节复合体之间发生构象改变；β亚单位N 末端苏氨酸残基是蛋白酶体的水解中心，β1、β2、β5亚单位分别具有半胱氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶样活性［1，2］。
1.2 蛋白酶体生物学功能 泛素的靶蛋白包括:细胞周期、调节因子、肿瘤抑制因子、转录激活因子和抑制因子、细胞表面受体，如：细胞周期素及其依赖性激酶抑制剂（P19，P21，P27，P57）;肿瘤抑制因子（P53，Rb）;原癌基因（c-myc，c-fos and c-jun）;促凋亡分子（Bax，MDM2 and IAPs）；转录因子（E2A，E2F and STAT）；NF-κB 及其抑制因子Ⅰ－κB 等。Ⅰ－κB 能裂解胞浆中NF-κB 的p50/p65 异二聚体，使NF-κB 介导的转录被阻止，细胞应激反应（包括化疗和放疗） 可减轻这种抑制，引起ⅠκB 的降解:Ⅰ－κB 的N 端特殊的丝氨酸残基磷酸化，促进内部赖氨酸残基泛素反应;泛素化的Ⅰ－κB 被蛋白酶体识别和降解，NF-κB 释放，易位进入核内与DNA结合激活细胞增殖、分化、抗凋亡等多种基因转录。因此抑制NF-κB 活性是逆转化疗耐药关键因素，可以增加肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性。蛋白酶体抑制剂可以稳定Ⅰ－κB，抑制其被磷酸化降解，而阻止NF-κB 激活，发挥抗肿瘤作用［3，4］。
2 蛋白酶体抑制剂
乳胞素是链霉菌属的天然代谢物，其活性中间体的β-内酯可选择性但不可逆地结合于蛋白酶体的β5（糜蛋白活性）亚单位。抑制糜凝乳蛋白酶样活性最快，而胰蛋白酶样和肽基谷氨酰肽水解酶活性被抑制较慢，丝氨酸和酪氨酸蛋白酶活性不受抑制。随着X线结晶照相术应用于分析蛋白酶体结构，许多高选择性、活性更强可逆蛋白酶体抑制剂被合成，包括醛基肽PSI、MG132，可逆抑制蛋白酶体β2、β5亚单位。同时，也可抑制钙蛋白酶与组织蛋白酶B。由于其特定的结构决定了其代谢不稳定性，其在体内的应用时特异性较差，生物利用度也不高。新一代合成的蛋白酶体抑制剂（包括MG262，硼替佐米），能够与蛋白酶体活性中心苏氨酸残基稳定结合，这种结合方式也是可逆的。硼替佐米较醛基肽相比其对糜蛋白酶高度敏感，效率也在1000倍以上，并具有高度的选择性。
3 蛋白酶体抑制剂临床前研究
美国国立癌症研究所首次证明硼替佐米抑制前列腺癌PC-3细胞株生长，引起细胞凋亡是通过稳定p21，将细胞阻滞于G2/M期及PARP的清除［5］。此外，联合硼替佐米可增加化疗或放射治疗对结肠癌异基因移植的治疗效果。在这些研究中，都能证明蛋白酶体靶点包括p21，ⅠκB 和NF-κB［6］。在体内动物模型研究中硼替佐米对肿瘤有明显抑制作用，在脑、直肠、肝、骨骼肌、前列腺及中药代动力学显示了较好的耐受力。进一步体内、体外试验证明了蛋白酶体抑制剂对多种肿瘤细胞具有促凋亡作用，包括小细胞肺癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤、人细胞胶质瘤、成人B细胞、T细胞白血病。硼替佐米可以显著上调非小细胞肺癌NCL-H520、NCL-H460细胞株p21和p53表达水平，同时下调BCL-2蛋白水平，抑制这两株细胞生长，促进其凋亡。同时使c-jun氨基端激酶和c-jun磷酸化，增强激活蛋白AP-1与DNA的结合。用JNK抑制剂SP600125阻断JNK/c－jun/AP-1通路，p21表达水平不再有变化，而p53表达仍然上调。因此JNK/c－jun/AP-1通路在硼替佐米诱导凋亡途径中期有重要作用［7］。硼替佐米可与其他分子靶向药物联用，ErbB2高表达的人乳腺癌细胞SKBR3对trastuzumab（曲妥单抗）抵抗，联合应用硼替佐米可以增强其疗效，其机制在于硼替佐米增加PTEN （phosphatase and tension homolog deleted on chromosome）表达相关。PTEN基因表达产物与抑制磷脂酰肌醇-3-激酶PI3K/Akt通路相关。肿瘤组织PTEN低表达与trastuzumab化学敏感性较差相关［8］。最新合成的蛋白酶体抑制剂NPI-0052结构和作用机制与硼替佐米完全不同，但对蛋白酶体胰蛋白酶、糜蛋白样活性抑制作用更强［9］。NPI-0052诱导淋巴瘤细胞凋亡机制在于使线粒体膜去电势，细胞色素C等超氧化物酶释放，激活caspase-8/9/3等。NPI-0052对正常淋巴细胞毒性更低，可口服给药，与硼替佐米联合应用，可减低药物毒性，克服硼替佐米耐药，提高疗效［10］。NPI-0052也即将进入Ⅰ期临床研究。
4 蛋白酶体抑制剂临床试验研究
4.1 蛋白酶体抑制剂单药临床试验 在几项血液恶性肿瘤和实体瘤（前列腺癌，非小细胞肺癌）临床研究中，硼替佐米最大耐受剂量（MTD）在1.04～1.06 mg/kg之间，常见限制性毒性（DLT）有低血压，晕厥，腹泻，疲乏，周围神经病变，电解质紊乱，血小板减少。根据Ⅰ期临床试验结果，进行了一个多中心开放、非随机的Ⅱ期临床试验，202例复发性/难治性多发性骨髓瘤患者参加了试验，患者以前至少接受过3种治疗，患者接受硼替佐米1.3 mg/kg静脉bolous给药，每2周2次后休息1周，此为1个周期，共8个周期。共有27.7%的患者获得完全缓解或部分缓解，首次中位反应时间为1.3个月，整个中位反应期为12个月，202例患者中位生存期为16个月。3级以上的不良事件包括:血小板减少（28%）、疲劳（12%）、周围神经病变（11%）［11］。首个Ⅲ期临床试验研究在669例复发性/难治性多发性骨髓瘤患者中进行了硼替佐米和地塞米松单药治疗的疗效比较。硼替佐米和地塞米松组的4级毒性反应发生率、严重不良反应和治疗相关死亡率基本相似，并且都能持续使用。研究结果显示，与地塞米松相比，硼替佐米具有更高的有效率（分别为38% 对18%，包括PR、nCR和CR）、TTP（6.2个月对3.5个月）和生存时间（1年为80%对66%）。以硼替佐米作为二线治疗的患者，在TTP及总生存率方面获益最大［12］。进一步神经内分泌肿瘤，肾癌和乳腺癌Ⅱ期临床试验仅有少量证据证明硼替佐米单药使用时有相关临床作用［13～15］。其他的一些临床Ⅱ期试验正在进行中，包括：难治性结肠癌，进展性非小细胞肺癌，复发或进展期非霍奇金淋巴瘤等。
4.2 蛋白酶体抑制剂与其他化疗药物联用
许多化疗药物可以诱导NF-κB，从而激活肿瘤细胞的抗凋亡程序。而蛋白酶体抑制剂可阻断放化疗对NF-κB的激活，还可直接诱导BCL-2的磷酸化及剪切、抑制P-糖蛋白的成熟、抑制细胞的DNA损伤修复等途径，增强某些化疗药物的治疗效果。这些决定了蛋白酶体抑制剂不但可以单独用于抗肿瘤治疗，而且可以和其他的化疗药物联合应用。硼替佐米治疗复发/难治性多发性骨髓瘤的两项Ⅱ期临床研究结果表明，处于疾病进展期或四程化疗后仍处于平台期的患者，可以在硼替佐米的基础上加用地塞米松单药有效率分别为30％和38％，加用地塞米松后分别为37％和50％［16］。Berenson JR治疗了34例骨髓瘤患者，于 1、4、8、11、28天给予患者硼替佐米静脉注射，美法仑从1～4天口服。硼替佐米和美法仑MTD分别为1.0 mg/m2，0.1 mg/kg，有效率（最小/部分/完全反应）为68％，其中2例获得完全缓解，11例部分缓解，中位疾病进展时间8个月［17］。在一些实体瘤中硼替佐米也有应用，卡铂联用硼替佐米被用来治疗复发卵巢癌，在这个I期临床试验中观察了最大耐受剂量、药效动力学、安全性。硼替佐米最大耐受剂量为1.5 mg/m2，卡铂对硼替佐米药效动力学没有影响，硼替佐米可以抑制卡铂对NF-κB的激活。主要毒性有腹泻，皮疹，神经毒性，便秘，减少药物剂量后症状都可控制。15例病例有效率为47％，包括2例完全缓解，5例部分缓解，建议Ⅱ期临床试验时硼替佐米剂量为1.3 mg/m2［18］。36位进展期实体瘤患者（26位为非小细胞肺癌）接受多西紫杉醇（d1）与硼替佐米（d1，4，8，11）治疗，3周为1个周期。多西紫杉醇/硼替佐米最大耐受剂量分别为75/1.0 mg/m2，患者能够较好地耐受，最常见的副反应有腹泻，疲乏，恶心，周围神经病变。2例患者获得部分缓解，7例患者病情保持稳定［19］。
蛋白酶体抑制剂有望成为治疗癌症的新途径，它能克服传统抗癌药物的耐受性，表现出了潜在的抗肿瘤活性，临床研究又提供了令人鼓舞的试验数据。随着蛋白酶体抑制剂抗肿瘤作用机制进一步被阐明，这必将为肿瘤治疗提供新的临床思路。
［参考文献］
1 Tanaka K，Yoshimura T，Kumatori A，et al.Proteasomes （multiprotease complexes） as 20S ringshaped particles in a variety of eukaryotic cells.J Biol Chem，1988，263:16209-16217.
2 Adams J，Behnke M，Chen S，et al.Potent and selective inhibitors of the proteasome:dipeptidyl boronic acids.Bioorg Med Chem Lett，1998，8:3333-3338.
3 Baldwin AS.Control of oncogenesis and cancer therapy resistance by the transcription factor NFκB.J Clin Invest，2001，107（3）:241-246.
4 Adams J.Proteasome inhibition:a novel approach to cancer therapy.Trends Mol Med，2002，8 （4）:S49-S54.
5 Adams J，Palombella VJ，Sausville EA，et al.Proteasome inhibitors:a novel class of potent and effective antitumor agents.Cancer Res，1999，59:2615-2622.
6 Shah SA，Potter MW，Mcdade TP，et al.26S proteasome inhibition induces apoptosis and limits growth of human pancreatic cancer.J Cell Biochem，2001，82 （1）:110-112.
7 Yang Y，Takeyuki I，Tsuyako S，et al.Proteasome inhibitor PS341 induces growth arrest and apoptosis of nonsmall cell lung cancer cells via the JNK/cJun/AP1 signaling.Cancer Sci，2004，95:176-180.
8 Fujita T，Doihara H，Washio K，et al.Proteasome inhibitor bortezomib increases PTEN expression and enhances trastuzumabinduced growth inhibition in trastuzumabresistant cells.AntiCancer Drugs，2006，17（4）:455-462.
9 Chauhan D，Chao T，Catley L，et al.In vitro and in vivo proteasome activity profiles of bortezomib and a novel proteasome inhibitor NPI-0052.Blood，2005，106.
10 Chauhan D，Li G，Podar K，et al.A novel orally available proteasome inhibitor NPI-0052 induces killing in multiple myeloma （MM） cells resistant to conventional and bortezomib therapies.Blood，2004，104.
11 Richardson PG，Barlogie B，Berenson J，et al.A phase 2 study of bortezomib in relapsed，refractory myeloma.N Engl J Med，2003，348:2609-2617.
12 Orlowski，Robert Z.Is bortezomib superior to highdose dexamethasone for the treatment of relapsed multiple myeloma? Nature Clinical Practice Oncology，2006，3（1）:16-17.
13 Shah MH，Young D，Kindler HL，et al.Phase Ⅱ study of the proteasome inhibitor bortezomib （PS-341） in patients with metastatic neuroendocrine tumors.Clin Cancer Res，2004，10:6111-6118.
14 Davis NB，Taber DA，Ansari RH，et al.Phase Ⅱ trial of PS-341 in patients with renal cell cancer:a University of Chicago phase Ⅱ consortium study.J Clin Oncol，2004，22:115-119.
15 Yang CH，GonzalezAngulo AM，Reuben JM，et al.Bortezomib （VELCADE（R）） in metastatic breast cancer:pharmacodynamics，biological effects，and prediction of clinical benefits.Annals of Oncology，2006，17（5）:813-817.
16 Jagannath S，Barlogie B，Berenson J，et al.A phase 2 study of two doses of bortezomib in relapsed or refractory myeloma.Br J Haematol，2004，127:165-172.
17 Berenson JR，Yang HH，Sadler K，et al.Phase I/Ⅱ trial assessing bortezomib and melphalan combination therapy for the treatment of patients with relapsed or refractory multiple myeloma.Journal of Clinical Oncology，2006，24（6）:937-944.
26S 蛋白酶体是存在于真核生物中的一种高度保守且依赖 ATP 的复合酶。26S 蛋白酶体能够快速精确地降解目的蛋白，在几乎所有生命活动中都发挥重要作用，如细胞周期、细胞凋亡、DNA 损伤修复、免疫应答、信号转导及细胞代谢等[1]。26S蛋白酶体由 20S 核心复合物 (core particle，CP) 和 19S 调节复合物 (regulatoryparticle，RP)组成。20S 核心复合物约 700 kD，呈圆筒形，由外部的两个 α 环和内部的两个β环组成，主要负责蛋白质的降解。在低等生物 (如古细菌) 中，20S 核心复合物由 14个相同的α亚基和14 个相同的 β 亚基组成。在真核生物中，20S 的 α 环和 β 环分别由 7 个亚基构成。α 环和 β 环在结构上是类似的[2]，α环形成轴向门控通道，β环形成降解腔。β亚基的活性位点均位于环的内侧。β1、β2 和 β5 亚基具有水解功能，能够切割酸性残基、碱性残基或者疏水残基C 端肽键[3～5]。19S 调节复合物位于 20S 核心复合物的一侧或者两侧，由 19 个不同的亚基组成，可分为 ATPase 类亚基 Rpt (regulatory particle triple-A protein，Rpt1～6) 和非 ATPase 类亚基Rpn (regulatory particle non-ATPase protein，Rpn1～13) 两大类，共同组成了盖子和基底两部分[6]。基底由 6 个 Rpt 亚基 (Rpt1～6) 和 3 个 Rpn 亚基 (Rpn1、Rpn2、Rpn13) 组成。ATPase亚基介导底物的去折叠和 α 环的打开，以利于底物最终被 20S 核心复合物降解。Rpn1、Rpn13、Rpn10 和 Rpt5 负责捕获泛素化修饰的蛋白或是含有 UBL ( ubiquitin-likedomain)或UBA (ubiquitin-associated domain)结构域的蛋白[7]。盖子由 Rpn3,5～9,11,12,15组成，可将已捕获的蛋白去泛素化，从而进入降解腔，完成蛋白质的降解[8]。基底的ATPase 类亚基 (Rpt1～6) 形成异源六聚圆环，与 20S 核心复合物的 α 环相连[9]，而Rpn10负责连接盖子和基底。19S 调节复合物能够识别多泛素化修饰的底物蛋白质，而后通过一系列的去泛素化、去折叠过程将其运送到降解腔，最终实现蛋白质的降解，这些过程均需要ATP的参与[10]。
真核生物20S核心复合物组装的分子机制
20S核心复合物可以单独存在或与 19S 调节复合物组成 26S 蛋白酶体，其组装过程不需要 19S 调节复合物的参与。在酵母[11]和哺乳动物[12]中，20S 的结构都是相同的，其组装过程也是高度保守的。20S核心复合物是由 4 个七亚基环垛叠而成的圆筒状结构，排布的顺序为α1-7β1-7β1-7α1-7，每一个亚基的站位都是固定的，此规律性排布模式受到严格的调控。
α环的组装
20S核心复合物的组装始于α环的组装。在人源细胞中，为保证 7 个亚基具有固定的排布次序，复合体PAC1 (proteasome assembling chaperone 1) -PAC2在其中发挥关键的作用[13]。PAC1-PAC2 复合体与 α5 和 α7 直接相连，且连接方式与 PAC3-PAC4 和 α 环的连接方式相反[14]。研究发现，缺失 PAC1 或 PAC2 会导致 α 环的正常组装率下降，错误装配的α环增多；而且，缺失其中一个分子会引起另一个分子的表达缺失。因此，PAC1-PAC2 必须形成异源二聚体才能行使维持并监控α环准确组装的作用[15]。在 α 环组装过程中，PAC1-PAC2与 20S 核心复合物的前体相连，待 20S 核心复合物组装完成以后，PAC1-PAC2被已形成的20S 核心复合物降解，其寿命较短，半衰期约为 30～40 min[13,15]。然而，目前关于 PAC1-PAC2 在 20S 核心复合物中的定位依然存在争议。有报道表明，如果此复合于20S的表面，那么它可以保护 20S 的入口[16]。小分子PAC3 和 PAC4 在 20S 组装过程中也发挥重要作用。相对于 PAC1-PAC2，PAC3寿命较长，在20S 组装完成之前即离开 α 环。PAC3、PAC4 可以形成异源二聚体[17]，通过校正α亚基的排布来抑制α亚基之间的错误连接。酵母中，PAC1、PAC2、PAC3 和 PAC4分别对应于 Pba1 (proteasome biogenesis-associated 1；also known as Poc1)、Pba2 (alsoknown as Add66 and Poc2)、Pba3 (also known as Poc3，Dmp2 and Irc25)和Pba4 (alsoknown as Poc4 and Dmp1)。在酵母中，当α环组装时，Pba3 与 Pba4、α5 形成三元复合物，从而募集周围的α亚基。当 β2 进入到 20S 的组装中时，Pba3 与 Pba4 离开 α 环[18]。研究发现，在酵母细胞中，Pba3 或 Pba4 表达的缺失，会导致 α 环和 20S 的含量降低，并且伴随中间组装体的聚集。在缺失 Pba4 的细胞中，出现了含有两个 α4 亚基而缺失 α3 亚基的新型蛋白酶体形式[19]，且这种蛋白酶体具有抵抗重金属压力的特点。然而，在哺乳动物细胞中是否也存在类似现象，还有待进一步深入研究。
β环的组装
α环在β环的组装中发挥支架作用。β环的组装以β2开始，然后依次是β3、β4、β5、β6和β1，最后是β7[20]。在酵母和哺乳动物中均能检测到含有 β2、β3、β4 与 α 环的组装中间过渡体13S 复合物，表明 β 亚基定位于 α 环上[21]。当最后进入 β 环的 β7 亚基组装完成后 ，20S 核 心 复 合 物 即 已 经 组 装 了 一 半 ， 称 为 15S 复 合 物 ， 又 叫 半 蛋 白 酶 体( half-proteasome)[22]， 其 包 括α1 ～7、 β1 ～7、 Ump1 ( ubiquitin maturation protein1)和PAC1-PAC2[20]。人类细胞中，PAC3 在体外可直接结合 β3，β3 可能通过与 PAC3 短暂的相互作用结合到组装中间体，PAC3 的释放介导了 β3 的组装[23]。Ump1是第一个鉴定到的β环组装蛋白酶体的分子伴侣，存在于α环和未组装的β亚基上。在 Ump1 缺失的酵母突变体中，泛素介导的蛋白酶体降解不能发生。Ump1 促进 β3 至 β6 亚基的有序组装和半蛋白酶体的二聚化，而 Ump1 最终被新合成的 20S 蛋白酶体包裹并降解[24]。在人源细胞中，Ump1敲除后只有α环的聚集，而没有β环聚集。可见，Ump1 参与整个 β 环的组装，而不是只参与其中某一进程。此外，β7的羧基端在 20S 核心复合物的最后成熟阶段起到独特的伴侣功能，其羧基端和β1与另一个β环的β2相互作用，启动半蛋白酶体的二聚化。有研究者在酵母成熟的 20S 核心复合物的晶体结构解析中发现，β7 的羧基端可以延伸到下一个β环上，同时发现β7和β4与另一个β环的β1和β2均有相互作用[17]。由此可见，β 环的正确组装不仅需要分子伴侣 Ump1、PACs 的辅助[25]，α和β亚基间的相互作用也为20S 核心复合物的形成提供了重要保障。20S 最后是由两个半蛋白酶体的 β 环连接而成的，其组装过程如图 1[14]所示。而蛋白水解活性的成熟就标志着 20S 组装的完成。
19S调节复合物组装的分子机制
基底的组装机制
19S调节复合物的基底由 6 个 ATPase 类亚基 (Rpt1～6) 和 3 个非 ATPase 类亚基组成。6个 ATPase 亚基组成了一个异六聚环与 α 环相连，Rpn1、Rpn2 位于这个 ATPase 亚基环中。在哺乳动物中，P27、P28、S5b 和 Rpn14 开始被认为是蛋白酶体的成员，后来发现它们只是蛋白酶体相互作用蛋白，与 Rpt 亚基的羧基端结合，参与 ATP 六聚环的形成[26～28]。在细胞内，19S 基底部的亚基通常成对存在，只有 Rpn2 可以独立存在。Rpt3 与 Rpt6 相连，Rpt1和 Rpt2 与 Rpn1 相连，Rpt4 与 Rpt5 相连。P28 和 Rpn14 与 Rpt3-Rpt6 复合体相连，S5b与 Rpt1-Rpt2-Rpn1 复合体相连，且分子伴侣 P28 和 S5b 极大地促进了这两个复合物的结合。而 P27 抑制 Rpt4-Rpt5 与其他复合体结合。P27 敲除后，P28 复合物与 S5b 复合物不再能结合 Rpt4-Rpt5，从而导致基底正常组装的障碍。研究发现，基底的组装起始于 P28-Rpt3-Rpt6-Rpn14，或者是 S5b-Rpt1-Rpt2-Rpn1，待这两个复合物结合后，P27 就会由抑制结合转变为促进 Rpt4-Rpt5 与它们的两复合体结合[29]，进一步表明，在特定分子伴侣的作用下，19S不同亚基可以有序规律组装。随后，Rpn2 和 Rpn13 结合到此复合体上，完成基底部分的组装[30]。最终通过 Rpn10 与盖子连接形成 19S 调节复合物体，其组装图如图 2[31]。近期在对酵母的研究中发现，Rpt6的羧基端与 P27 和 S5b 的分解有关[30]，介导其在基底形成后从复合物中的解离过程。然而，P28 在 19S 调节复合物彻底成熟后才被解离，提示 P28 可能参与调节20S核心复合物和 19S 调节复合物的结合。分子伴侣在19S 调节复合物的组装过程中发挥非常重要的作用，但是关于 19S 的形成过程目前还存在一定争议，近年提出了19S 组装的另外一种模式。在这种模式中，20S 核心复合物在19S 调节复合物组装中起到核心作用[32,34]。19S 的亚基 Rpt2、Rpt4、Rpt6 及 Rpt3首先组装到20S 上，然后间接结合 Hsm3-Rpt1-Rpt2-Rpn1-Rpt5 复合物。Rpn14、Nas2 (P27)和Nas6 (P28)被认为与19S 调节复合物中亚基的羧基端有相互作用，同时，这些伴侣分子还可以保护20S通道的开关[33]。但大家还是普遍认可前一种组装模式。Rpt亚基组成的异源六聚环，其羧基端均插入到 20S 核心复合物的 α 环中，其中有 4个 Rpt 亚基的羧基端含有 Hb-Y-X 模序，能够帮助打开 α 环[34]。近年来，研究人员已通过晶体结构方法解析出19S中 Rpt 亚基六聚环各个亚基的排布结构，其模式为 Rpt1-Rpt2-Rpt6-Rpt3-Rpt4-Rpt5[35]。这一发现使我们更为清晰地了解了 19S 调节复合物的组装情况，并发现了其潜在的中间体，同时也为揭示 19S 调节复合物在组装过程中的分子伴侣功能提供了结构依据。
盖子的组装
20S的β环的组装必须在α环形成的基础上进行。与此不同，19S 的盖子和基底是两个独立的组装过程，最后，它们由Rpn10连接起来。盖子分为两个组分，Rpn5、Rpn6、Rpn8、Rpn9 和 Rpn11 构成一组，另一组是由 Rpn3、Rpn7、Rpn12 和 Rpn15 组成。首先是Rpn5-Rpn6-Rpn8-Rpn9形成复合物，与 Rpn11 相互作用形成 Rpn5-Rpn6-Rpn8-Rpn9-Rpn11；Rpn3-Rpn7-Rpn15 复合物与 Rpn12 相互作用形成 Rpn3-Rpn7-Rpn15-Rpn12 复合物[36,37]；然后这两组通过 Rpn3 和 Rpn5 联系到一起[38,39]。目前对于 19S 调节复合物组装的研究还不够透彻。因为盖子是一个独立的组装过程，所以，盖子的组装一定需要分子伴侣的参与。酵母中分子伴侣 Hsp90 的失活促使盖子复合体裂解[40]，体内重新活化 Hsp90，或者加入 Hsp90和ATP，使盖子复合物重新装配进蛋白酶体，因此，Hsp90 被认为是 19S 盖子组装及各亚基稳定过程中的重要分子伴侣。Hsp90 在哺乳动物中的具体作用值得深入挖掘。
[关键词] 肺腺癌；蛋白酶体抑制剂；A549细胞；Bcl-2；Bad
[中图分类号] R734.2；R730.54 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2011）12（a）-032-03
The effect and mechanism on the apoptosis of adenocarcinoma of lung A549 cell treated with MG132
ZHU Yi, GONG Li, NIU Hongyan
Department of Chest Aurgery, the Second People's Hospital of Huai'an City Affiliated of Xuzhou Medical College, Jiangsu Province, Huai'an 223002, China
[Abstract] Objective: To study the apoptosis of adenocarcinoma of lung A549 cell treated with different concentrations of proteasomes inhibitor MG132, and to observe the expression of Bcl-2 and Bad in A549 cells. Methods: In vitro, A549 cells were exposed to 0, 5, 10, 20, 40 μmol/L of MG132. 24 hours later, the survival rate of A549 cells was detected with MTT chromatometry, flow cytometry detected the apoptosis rate of A549 cells, and the expression of Bcl-2 and Bad in A549 cells was measured with Western Blot. Results: MG132 caused the apoptosis of A549 cells in a concentration-dependent manner, the survival rate of cells was gradually decreased while the apoptosis rate of cells was increased after 24 hours exposure to MG132. Meanwhile, the expression of Bcl-2 was decreased, and the Bad expression was unchanged in A549 cells. Conclusion: MG132 could induce A549 cells apoptosis partly through depressing the expression of Bcl-2, but not promoting Bad expression.
[Key words] Adenocarcinoma of lung; Proteasomes inhibitor; A549 cell; Bcl-2; Bad
近几十年来，肺癌的发病率和死亡率不断升高。在1998~2002年，肺癌的发病率和死亡率在我国大多数地区居恶性肿瘤的首位[1]；而在2002年肺癌的新病例和死亡人数在全世界也居恶性肿瘤首位[2]。肺癌的病理分型出现腺癌比例增加的趋势。在生物体内蛋白质进行选择性降解的重要途径之一是泛素-蛋白酶体通路（ubiquitin proteasome pathway，简称UPP 通路），它在调节细胞凋亡过程中的作用非常重要[3-4]，在研究UPP在细胞凋亡中的作用时，蛋白酶体抑制剂（MG132）的应用为我们提供了有力的手段。有研究表明，蛋白酶体抑制剂能够诱导多种人肿瘤细胞的凋亡是通过阻断泛素化通路而实现，但其具体作用机制到目前仍未被阐明[5-6]。该研究应用体外培养的人肺腺癌细胞株A549，并且给予不同浓度的MG132处理，观察其对A549细胞凋亡率的影响，以及细胞内Bcl-2和Bad蛋白表达水平的变化。探讨MG132调控A549细胞凋亡的可能机制，为进一步研究MG132诱导A549凋亡的机制和其他类型肺癌以及其他肿瘤的作用提供参考。
1 材料与方法
1.1 A549细胞和试剂
人肺腺癌细胞株A549购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所。新生牛血清（NBS，杭州四季青生物工程材料研究所）；RPMI-1640培养基（Gibco公司）；AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒（上海博蕴生物试剂有限公司）；MG132、一抗Bcl-2和Bad、MTT（Sigma公司）。
1.2 细胞培养及处理
将A549细胞常规复苏后，以RPMI-1640培养液加10%NBS培养，放入37℃、5%CO2的培养箱内培养，细胞传2~3代后按照需要接种于不同培养板中，当细胞融合密度约70%时，换无血清的RPMI-1640培养液培养，MG132在给药前应用RPMI-1640培养液现配。并且进一步稀释使其在培养液中的终浓度为：0、5、10、20、40 μmol/L，并设空白对照组（不做任何处理）。培养24 h，检测相关指标。
1.3 MTT比色法检测细胞存活率
细胞按照需要接种于96孔板，处理方法同“1.2”所述，将培养24 h后的每组细胞，每孔中加入MTT 20 μl（PBS配制、5 g/L）。4 h后终止培养，吸弃所有液体，再加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）200 μl充分溶解，静置于37℃条件下30 min。用酶标仪测定570 nm光密度（OD）值，计算细胞存活率（即每组OD值/正常对照组OD值×100%＝该组的细胞存活率）。
1.4 蛋白免疫印迹（Western Blot）
将传代后细胞接种于培养瓶内，处理同方法“1.2”所述。培养24 h后收集细胞，应用胞浆蛋白抽提试剂盒提取蛋白，测蛋白后分装，保存于-80℃冰箱中备用。将等量蛋白以10%聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，半干转法至NC膜上，随后经5%脱脂奶粉封闭，室温下1 h，加入稀释的一抗Bcl-2（1∶300）和Bad（1∶300），4℃条件下过夜。第2日晨复温30 min，常规方法洗膜，NBT/BCIP显色，双蒸水洗膜终止反应。应用图像处理仪（Gene Company）扫描结果，Image J软件进行半定量分析。
1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率
细胞传代后接种于6孔板，处理方法同“1.2”所述。培养24 h，吸尽培养基，用胰蛋白酶（0.25%）消化细胞后收集，磷酸盐缓冲液（PBS）液洗2次，每组细胞收集为1管，每管加入凋亡试剂盒中的结合缓冲液将细胞重悬，随后将细胞转移到试管中。每管再分别加入10 μl的PI和5 μl的Annexin V-FITC。避光，室温放置5 min，流式细胞仪检测细胞的凋亡率。
1.6 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，Sigma Plot 2000作图。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用最小显著差（LSD-t）法，以P
2 结果
2.1 MG132对A549细胞成活率的影响
MTT法检测结果显示，随着MG132浓度的增加A549细胞存活率逐渐下降（表1），呈现浓度依赖性关系。并且，与正常对照组比较，除了0 μmol/L组外，其余各组差异均有统计学意义（均P＜0.05）。
表1 MG132对A549细胞存活率的影响（n=5）
注：与空白对照组比较，*P＜0.05
2.2 MG132对A549细胞凋亡率的影响
Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测结果显示，空白对照组A549细胞凋亡率约（4.0±1.4）%，0 μmol/L组凋亡率为（4.1±1.7）%、5 μmol/L组凋亡率为（12.2±2.1）%、10 μmol/L组凋亡率为（26.3±2.9）%、20 μmol/L组凋亡率为（33.1±3.0）%、40 μmol/L组凋亡率为（54.2±4.7）%，与空白对照组比，除0 μmol/L组外，其余各组差异均有统计学意义（均P＜0.05）。
2.3 MG132对A549细胞中Bcl-2和Bad蛋白的影响
Western Blot结果显示，随着MG132的浓度增高A549细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达逐渐降低（图1A），除0 μmol/L组外，其余各组与空白对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。而促凋亡蛋白Bad的表达在各组中无明显变化（图1B）。与空白对照组比，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。
A代表Bcl-2在各组中的表达，B代表Bad在各组中的表达；与空白对照组比，*P＜0.05，与空白对照组比，#P＞0.05
图1 Western Blot检测细胞内Bcl-2和Bad蛋白的表达
3 讨论
泛素-蛋白酶体通路[7]（UPP）调控着真核生物细胞内绝大部分蛋白质的降解过程，参与细胞转录、蛋白质稳定、蛋白质降解、细胞凋亡、应激反应和受体胞吞等多种生理过程，能够通过多种途径影响细胞周期的进行，是真核细胞内重要的蛋白质质控系统。MG132[8]（Z-Leu-Leu-Leu-CHO，三肽基乙醛）可以抑制UPP途径介导的蛋白质降解，是一种常用的肽醛类26S蛋白酶体抑制剂，如影响NF-κB、调节细胞内凋亡信号通路、调节细胞周期相关蛋白和凋亡调控蛋白等过程，从而抑制细胞的增殖促进细胞凋亡，是很有发展前途的抗肿瘤药物。也有研究表明：与凋亡调控相关的Bcl-2家族、caspase和凋亡抑制因子等的降解均与UPP有关[9-10]。在本研究中笔者特别关注Bcl-2家族在UPP通路中的作用，在细胞凋亡调控机制方面，Bcl-2是迄今研究最广泛而深入的凋亡调控基因之一，在细胞凋亡中起着非常重要的作用，Bcl-2能够抑制细胞凋亡，而Bad则促进细胞的凋亡，是该家族中两组作用相反的蛋白。本研究应用体外培养的A549人肺腺癌细胞，给予不同浓度蛋白酶体抑制剂MG132处理一段时间后，检测细胞凋亡率的变化，同时观察对细胞中Bcl-2和Bad两种蛋白表达水平的影响，初步探讨在A549细胞凋亡中UPP通路的作用及其可能的机制。
该研究结果显示，随着MG132浓度增加A549细胞的凋亡率逐渐增加，并且细胞中Bcl-2蛋白的表达水平也逐渐降低。同时在笔者的实验中也发现，Bad蛋白的表达水平在各组中没有明显变化。因此，笔者推测，MG132可能是通过减少Bcl-2蛋白的表达诱导A549细胞凋亡，而Bad蛋白似乎不参与MG132诱导A549细胞凋亡的作用。Pigneux 等[11]发现MG132 能够明显地增强一种抗肿瘤药物（IDA）诱导白血病细胞的凋亡， 而此作用是通过上调促凋亡蛋白Bim和Bax的表达实现。Yan等[12]观察到MG132 处理的MG-63细胞内除了Caspase-8活性增加、p27聚集外，Bcl-2和Bax比值也明显增加， 说明Bcl-2家族蛋白之间的比例失衡可能也是MG132诱导细胞凋亡的机制之一。Guzman等[13]发现MG132能够诱导人白血病细胞的凋亡， 而对正常的白细胞几乎没有作用。MG132与目前大多数的抗肿瘤药物对细胞无选择性的杀伤作用有明显的不同，因此笔者设想，蛋白酶体抑制剂的应用为肿瘤的治疗提供了新的方向。
然而，对于MG132其抑制肿瘤的作用和机制还有很多需要回答的问题，例如其是否还影响Bcl-2家族中其他成员的表达；是否影响另外两个与凋亡相关的家族蛋白Caspase家族和凋亡抑制蛋白（IAP）家族成员的表达，以及其与临床常用的抗肿瘤药物有何差异等，这些问题还有待于在以后的研究中深入探讨。
[参考文献]
[1] 陈万青,张思维,李连弟,等.中国部分市县1998-2002年肺癌的发病与死亡[J].中国肿瘤,2006,15(9):570-574.
[2] Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.
[3] Asams J. The proteasome: structure, function, and role in the cell [J]. Cancer Treatment Reviews,2003,29:3-9.
[4] Podar K, Gouill SL, Zhang J, et al. A pivotal role for Mcl-1 in Bortezomib-induced apoptosis [J]. Oncogene,2008,27(6):721-731.
[5] 张卫国,吴清明,于皆平,等.泛素-蛋白酶体抑制剂对食管癌细胞增殖的影响[J].中国药理学通报,2004,20(3):355-356.
[6] Adams J, Palombella VJ , Sausville EA, et al. Proteasome inhibitors: a novel class of potent and effective antitumor agents [J]. Cancer Research,1999,59:2615-2622.
[7] Wu HJ, Zhang ZG. Ubiquitin-Proteasome pathway and its significance [J]. Journal of International Pathology and Clinical Medicine,2006,26(1):7.
[8] Inoue S, Nakase H, Mat suura M, et al. The effect of proteasome inhibit or MG132 on experimental inflammatory bowel disease [J]. Clinical and Experimental Immunology,2009,156(1):172.
[9] Melikova MS, Kondratov KA, Kornilova ES. Two different stages of epidermal growth factor (EGF) receptor endocytosis are sensitive to free ubiquitin depletion produced by proteasome inhibitor MG 132 [J]. Cell Biol Int,2006,30(1):31-43.
[10] Letoha T, Somlai C, Takacs T, et al. The proteasome inhibitor MG132 protects against acute pancreatitis [J]. Free Radic Biol Med,2005,39 (9):1142-1151.
[11] Pigneux A, Mahon FX, Moreau Gaudry F, et al . Prot easome inhibit ion specifically sensitizes leukemic cel ls to anthracyclin-induced apoptosis through the accumulat ion of Bim and Bax pro-apoptotic proteins [J]. Cancer Biol Ther,2007,6(4):603-611.
[12] Yan XB, Yang DS, Gao X, et al. Caspase- 8 dependent ost eosarcoma cell apoptosis induced by prot easome inhibitor MG132 [J] . Cell Biol Int,2007,31(10):1136-1143.
[关键词] 硼替佐米; 地塞米松;多发性骨髓瘤
[中图分类号] R33.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)13-48-03
Bortezomib in Combination with Dexamethasone for Multiple Myeloma:A Clinical Study
SONG Chunge1 HUA Baoyong2
1.The 5th Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China;2.College of Public Health of Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China
[Abstract] ObjectiveTo evaluate the efficacy and safety of bortezomib combined with dexamethasone in the treatment of multiple myeloma (MM). MethodsTwelve patients newly diagnosed as MM and 6 patients with relapsed or refractory MM were treated with bortezomib combined with dexamethasone(bortezomib 1.3mg/m2,d1,4,8,11,dexamethasone 20-40mg,d1-4,8-11) in 3 weeks as a course of treatment. The patients received 1to 6 courses of treatment. Response was evaluated according to the EBMT criteria and adverse reactions were graded according to the NCI-CTCAE(version 3.0). ResultsThe 6-month(2-11months) median follow-up showed out of the 12 patients newly diagnosed MM,two achieved complete response(CR),six partial response(PR),three minor response(MR)and no change for one. The 6 patients with refractory/relapsed myeloma achieved CR(2/6),PR(2/6),NR(1/6)and one died. Clinical response rate was 83.33%). The overall response rate (CR+PR) was 72.22%. The most adverse events observed were fatigue(11/18,61.11%),thrombocytopenia(5/18,27.67%),neutropenia(2/18, 11.11%),diarrhea(3/18,16.67%),peripheral neuropathy(3/18,16.67%)and paroxysmal atrial fibrillation(1/18,5.56%). ConclusionBortezomib combined with dexamethasone is a new and effective treatment for MM patients,with mild adverse reactions.
[Key Words]Bortezomib; Dexamethasone; Multiple myeloma
多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种浆细胞克隆性异常增殖的恶性血液肿瘤[1],多好发于老年患者,在许多国家为发病率第二的血液恶性肿瘤,约占血液恶性肿瘤的10%,常规联合化疗方案完全缓解率(CR)不足10%,中位总生存期仅3年左右,同时骨髓瘤细胞易发生耐药,并经常复发,成为复发/难治性MM。因此如何提高MM患者的疗效就成为血液病中需要解决的难题之一。硼替佐米是一种蛋白酶体的抑制剂,是一种新型的靶向治疗药物,近年来多项研究发现其能有效治疗多发性骨髓瘤,在初治和复发难治性MM患者中均取得了一定疗效[2-6],同时应用地塞米松可增强抗瘤效果[2]。为进一步了解其疗效及不良反应,本研究通过硼替佐米联合地塞米松治疗12例初发及6例复发/难治性MM患者,现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
自2008年2月~ 2009年2月,我们对18例MM患者采用硼替佐米联合地塞米松化疗,初发12例,复发/难治6例;所有MM患者均符合《血液病诊断及疗效标准》[7]。其中男11例,女7例,中位年龄为53.5岁(32～77岁);IgG型10例,IgA型4例,IgD型1例,轻链型3例,(其中κ型2例,λ型1例)。诊断时Durie-Salmon分期为:ⅡA期2例,ⅢA期13例,ⅢB期3例;ISS分期为Ⅰ期4例,Ⅱ期11例,Ⅲ期3例。病程平均12个月(3～20个月)。其中6例复发、难治患者既往治疗包括VAD方案(长春新碱+阿霉素+地塞米松)、M2方案(长春新碱+卡莫司汀+美法仑+环磷酰胺+泼尼松)、VATD方案(长春新碱+阿霉素+地塞米松+沙利度胺)、DVD方案(楷莱+长春新碱+地塞米松)等标准化疗至少3个疗程。3例患者以剧烈骨痛(均为腰椎压缩性骨折)为主要表现。
1.2 治疗方案
18例所有患者均采用硼替佐米(商品名:万珂,规格:3.5mg/瓶,美国Ben Venue Laboratories Inc生产)联合地塞米松治疗,硼替佐米1.3mg/m2,第1、4、8、11天快速静脉注射;地塞米松常规剂量40mg/d,合并糖尿病及感染患者给予20mg/d,第1~4、8~11天静脉滴注或口服;患者共接受1～6个疗程治疗(平均3.2个疗程),同时每月给予1次帕米磷酸二钠静脉滴注辅助治疗。
1.3 疗效评价
根据EMBT(European Group for Blood and Marrow Transplantation)标准[8],疗效分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、轻微反应(MR)、无变化(NC)和疾病进展(PD)。每个疗程前均行血常规、肝肾功能、电解质、血尿M蛋白鉴定、免疫球蛋白、蛋白电泳、骨髓形态学及免疫分型等检查。不良反应评价:根据NCI-CTCAE(National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events,version3.0)标准判断不良反应,分为1、2、3、4级。
2 结果
2.1 临床疗效
18例接受硼替佐米联合地塞米松化疗的MM患者中位随访6个月(2～11个月),15例对治疗有反应,总反应率83.33%。12例初治患者中3例CR(25%),6例PR(50%),2例MR(16.67%),1例NC(8.33%),有效率为75%(9/12)。6例难治复发患者中2例CR(33.33%),2例PR(33.33%),1例NR(16.67%),1例死亡(16.67%),有效率为66.67%(4/6)。两组有效率差异无统计学意义(P>0.05)。中位起效和达最佳疗效时间分别为1个疗程和4个疗程后。其中2例初治患者CR后已进行了自体外周血造血干细胞移植;3例剧烈骨痛的患者症状基本缓解;1例难治性患者既往曾接受2个疗程的VAD方案及1个疗程的M2方案化疗,有慢性支气管炎病史,在给予1个疗程硼替佐米+地塞米松联合方案化疗后1周出现高热合并Ⅰ型呼吸衰竭,1周后死亡。
2.2 不良反应
18例MM患者在治疗过程中均出现不同程度的不良反应,主要不良反应为乏力,11例(61.11%)出现乏力症状,其中9例为Ⅰ级,2例为Ⅱ级,均未给予特殊处理,疗程结束后自行缓解;5例(27.67%)患者出现外周血血小板计数减少,血小板减少CTCAE 1级1例、2级2例、3级1例、4级1例,4级需给予输注血小板治疗,血小板计数最低出现在治疗第12～16天,均能在第21天前后恢复。白细胞减少2例(11.11%),CTCAE分级1级;腹泻3例(16.67%),CTCAE为2级;周围神经病变3例(16.67%),主要为手足麻木,CTCAE为1～2级;阵发性房颤1例(5.56%),CTCAE为4级,采用延迟疗程,并给予强心剂及抗心律失常等治疗1d后缓解。以上所有不良反应均可经对症治疗后恢复,无1例患者因药物相关毒性停用硼替佐米。
3 讨论
多发性骨髓瘤目前仍被认为是一种不可治愈的血液系统恶性疾病,采用传统化疗虽可使病情得到一定程度的控制,但缓解率极低,尤其对于难治/复发性MM,很多患者皆因得不到有效治疗而死亡,因此积极探讨更加有效的化疗方案具有重要意义。
近几年来,随着对MM生物学特性的深入研究,蛋白酶体得到了格外的关注。蛋白酶体是多酶复合体,存在于所有真核细胞,当蛋白酶体超出其正常生理作用时会引发各种肿瘤。抑制蛋白酶体能提高调节蛋白水平,阻止肿瘤生长,导致肿瘤细胞凋亡,因此抑制蛋白酶体已成为抗肿瘤治疗的重要靶点。
硼替佐米(曾用名PS341)是一种人工合成的蛋白酶体竞争性抑制剂,它对26S蛋白酶体具有高度特异性抑制能力,在骨髓瘤细胞中,抑制NF-κB的激活,使骨髓瘤细胞增殖相关基因表达受抑,白介素6(IL-6)等骨髓瘤细胞生长因子、黏附分子等表达减少,最终骨髓瘤细胞发生凋亡。在一项多中心Ⅱ期临床SUMMIT研究中,硼替佐米显示出令人鼓舞的疗效[2]。202例曾接受过多种治疗的复发难治骨髓瘤患者(64%曾接受造血干细胞移植)接受硼替佐米治疗的ORR为35%,CR 4%,PR 13%。中位总生存时间17.5个月,明显高于历史对照组预期中位生存时间(6～9个月)。另一项多中心Ⅱ期随机对照CREST研究显示,硼替佐米1.3mg/m2单药治疗的总反应率高于1.0mg/m2组(50%、33%),而联合应用地塞米松可使反应率增加18%[9]。APEXⅢ期临床扩大试验[10]其ORR达35%,CR+nCR6%。而且,大量研究发现硼替佐米与传统化疗药物联合具有协同作用,且未见增强不良反应[5,9,10]。
本研究中的6例难治复发患者经硼替佐米联合其他化疗药物治疗后,2例达CR,2例达PR,提示对传统化疗药物耐药的多发性骨髓瘤对硼替佐米治疗仍然敏感。本研究中硼替佐米对12例初治患者也取得了一定疗效,12例初治患者中3例CR、6例PR、2例MR、ORR为91.67%,其中2例初治患者CR后已进行了自体外周血造血干细胞移植,提示硼替佐米治疗不影响自体造血干细胞的动员采集以及移植后的造血重建。
本研究中最常见的不良反应是乏力,其次为血小板减少、白细胞减少、周围神经病变、腹泻和阵发性房颤等,除阵发性房颤外均为既往研究中所发现和报道的,且多数为轻度、可逆的,一般化疗结束或对症治疗后均可恢复,无1例患者因药物相关毒性停用硼替佐米。说明硼替佐米的不良反应是可以预见和控制的。故本研究提示,硼替佐米治疗初发及难治复发多发性骨髓瘤有较好疗效,且严重不良反应较少,是一种新的安全、有效、可耐受的方案。但有1例出现阵发性房颤,考虑为患者既往曾有阵发性房颤发作病史,本次化疗后再次诱发,故对患有心脏基础疾病的MM患者,在化疗中应同时给予保护心肌治疗,动态监测心脏功能,预防心脏急症发生,为硼替佐米安全有效应用提供更好的保障与依据。
[参考文献]
[1] Smith RA,Cokkinides V,Eyre HJ. American Cancer Society guidelines for the early detection of cancer,2006[J]. CA Cancer J Clin JT-CA:a cancer journal for clinicians,2006,56(1):11-25;49-50.
[2] Richardson PG,Barlogie B,Berenson NJ,et al. A phase 2 study of bortezomib in relapsed,refractory myeloma[J]. N Engl J Med,2003,348:2609- 2617.
[3] Kropff MH,Bisping G,Wenning D,et al. Bortezomib in combination with dexamethasone for relapsed multiple myeloma[J]. Leuk Res,2005,29:587-590.
[4] Jagannath S,Richardson PG,Barlogie B,et al. Bortezomib in combination with dexamethasone for the treatment of patients with relapsed and/or refractory multiple myeloma with less than optimal response to bortezomib alone[J]. Haematologica,2006,91:929-934.
[5] Mitsiades N,Mitsiades CS,Richardson PG,et al. The proteasome inhibitor PS-341 potentiates sensitivity of multiple myeloma cells to conventional chemotherapeutic agents:therapeutic applications[J]. Blood,2003,101:2377-2380.
[6] Jagannath S,Durie BG,Wolf J,et al. Bortezomib therapy alone and in combination with dexamethasone for previously untreated symptomatic multiple myeloma[J]. Br J Haematol,2005,129:776-783.
[7] 张之南,沈梯. 血液病诊断及疗效标准[M]. 北京:科学出版社,2001:218.
[8] Blade J,Samson D,Reece D,et al. Criteria for evaluating disease response and progression in patients with multiple myeloma treated by high dose therapy and haemopoietic stem celltransplantation. Myeloma Subco- mmitte for the EBMT[J]. Br J haematol,1998,102:1115-1123.
[9] Jagannath S,Barlogie B,Berenson J,et al. A phase 2 study of two doses of bortezomib in relapsed or refractory myeloma[J]. Br J Haematol,2004, 127(2):165-172.
[关键词] 铜（Ⅱ）配合物；结构特征；抗癌活性；共价作用；诱导凋亡
[中图分类号] R979.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）16-30-04
60年代末期，顺铂（cis-platin）做为抗肿瘤药物应用于临床，引导金属配合物抗癌药物研究步入了一个新领域，引起了人们对金属配合物抗肿瘤研究的重视。近年来已证实锗、钼、钯、铜、锌等金属配合物也具有抗肿瘤活性，对金属配合物的研究已经成为抗肿瘤药物研究中的热点之一[1]。
铜是一种很重要的微量金属元素，它在人体内的含量仅次于铁和锌。所有的动物、植物都需要靠它来生存和维持正常的生理机能。同时铜还是机体内氧化还原体系中有着独特作用的催化剂。目前已知铜存在于生物体内金属蛋白和金属酶的活性部位，对造血系统和中枢神经系统的发育，骨骼和结缔组织的形成以及皮肤色素的沉积等过程具有重要作用[2]。铜作为配合物的活性中心还存在于具有生物功能的蛋白质分子中，其配合物多变的配位结构和活化小分子的催化活性，使其对生命体系有特殊的生物活性和催化作用。而目前的研究表明：铜是生物体内正常的新陈代谢所必须的，亦是治疗许多疾病的一个主要因素。近期研究也证实铜与肿瘤血管的形成有密切关系，因此铜配合物已成为抗肿瘤药物的研究热点。早在1912年，德国就用一种由铜的氯化物和蛋黄素组成的混合物来治疗患有面部癌的患者。这一治疗的成功说明铜化合物具有抗癌功能[3]。在众多的过渡金属中，铜具有良好的配位特性，且其配合物具有良好的光裂解活性[4]，众多的研究者们开始将铜配合物作为研究对象。
本研究在参阅大量文献的基础上，结合自己的工作，从以下几方面对铜（Ⅱ）配合物抗癌活性的研究进展作了介绍。
1 铜（Ⅱ）配合物的结构特征
Cu（Ⅱ）金属原子的配位多含O、N原子，Cu（Ⅱ）配位数从4～6多变，配位构型有四面体、三角双锥、八面体等。既有螯合型的，又有桥联型的，Cu（Ⅱ）金属配合物多是双核的。
胡喜兰等[5]合成了一种新型双核铜配合物[Cu（pht）2（ba）2]2，该新型铜配合物中，Cu（II）离子配位于变形的三角双锥中，两个铜原子之间与C，O，N原子相互作用桥接构成一个八元环结构，配合物通过氢键连接成一个稳定的网状结构；李庆祥等[6]合成了1-亚甲基苯并眯唑-1，4，7-三氮环壬烷和[Cu（C14H21N5）Br]2[CuBr4]的铜配合物，研究其结构发现，该配合物由两个1-亚甲基苯并咪唑-1，4，7一三氮环壬烷一溴合铜配阳离子和一个四溴合铜配阴离子组成。在两个配阳离子中Cu（II）离子位于一个变形四方锥的中心，在配阴离子中Cu（II）离子与四个溴阴离子配位，位于一个稍变形的四面体的中心。尹富玲等[7]利用联吡啶的DNA靶向作用及去甲基斑蝥酸根的抗癌、水溶性作用，合成了2，2'-2联吡啶和去甲基斑蝥酸根合铜（Ⅱ）桥联三元混配合物，并研究了它的结构特征和抗肿瘤生物活性。配合物中2个铜原子呈六配位的拉长畸变八面体构型，生物测试表明该配合物具有较强的抗癌活性。Ferrari等[8]合成了新的5-甲酰尿嘧啶缩氨基硫脲配合物并用x射线单晶衍射进行了结构表征。发现所有的配合物中配体均以S、N、O通过三螯合来与金属键合。其中铜配合物的结构是四方锥体，配体组成基底的平面四方形。
2 铜（Ⅱ）和铂（Ⅱ）配合物的活性对比
铂（Ⅱ）配合物是当今抗肿瘤药物开发中应用较多的一种，但在使用过程中同时还表现出的一些副作用，如明显的毒性及抗药性。多数含有机配体的铜配合物都具有抗细胞增殖活性。反式一二（水杨醛肟）合铜（Ⅱ）和一些大环配体与铜的化合物对实验性动物肿瘤具有较强的抵抗能力。1，2-双（二苯基膦）乙烷及相关的苯代二磷化合物对许多肿瘤细胞都具有抑制作用。某些含Cu（Ⅱ）的药物如丁二酮肟铜，博莱霉素等都表现出抗癌活性。赵喜荣等[9] 研究发现苯乙酮缩氨基硫脲与金属铜（Ⅱ）形成的二齿配合物具有很好的抗癌活性，对S180腹水瘤细胞的生长有良好的抑制作用。当表阿霉素、丝裂霉素C与铜配合物联合作用时，对HeLa-S3人宫颈癌细胞的生长有明显的协同抑制作用，铜与丙二酸衍生物的配合物和表阿霉素及顺铂联合作用时对人乳腺癌和宫颈癌细胞的生长也有显著的协同抑制作用。
2004年，张寿春等[10]合成了两种新型的8-氨基喹啉-蛋氨酸衍生物Cu（Ⅱ）配合物[Cu（CMQA）（H2O）]（Ⅰ）和[Cu（MQA）（Ac）]（Ⅱ）。这两个配合物具有相似的配位结构，但其细胞毒活性及与GSH之间的反应性能差异比较大。配合物Ⅱ对P-388小鼠白血病细胞和A-549肺癌细胞都有明显的抑制作用，并且在相同的实验浓度范围内其抗肿瘤活性强于顺铂。同时又合成了一种新型三元1，10-菲咯啉-苏氨酸-铜（Ⅱ）配合物，该配合物对HL-60和SGC-7901肿瘤细胞都显示出明显的体外细胞毒活性，且在多数的实验浓度范围内其抗肿瘤活性强于顺铂。
Zhong等[11]以新的席夫碱为配体合成了铜络合物。体外抗肿瘤活性实验结果表明，新络合物及其配体对肿瘤细胞有一定程度的抑制作用。贺飞等[12]以DTC为配体合成了一系列新型的DTC金属络合物，并对六种人肿瘤细胞进行了体外试验，结果发现SR-Cu具有较好的抗肿瘤活性，其他的金属则不具次活性。而以氟喹诺酮类药物环丙沙星与Cu-2，2-联吡啶或1-10邻菲咯啉（phen）形成的双核铜络合物对BEL-7402人肝癌细胞和HL-60人白血病细胞均具有较强的抑制作用。
另研究表明，带Cu动态平衡路径的金属键合运送器能够阻止Pt药物对癌细胞的抵抗力。研究所提供的证据是顺铂和h-Ctrl蛋白质间的直接相互作用，并且证实了顺铂和铜在其输送过程中具有明显的生化结果[13]。贾磊等[14]以席夫碱为配体，合成了一种含有邻菲咯啉和氨基酸的三元双核铜配合物，对该配合物进行研究后发现，铜配合物在较低浓度时即对HL-60细胞显示出较高的抑制率，对A-549细胞的抑制率相对低一些。但两者均比顺铂的抗肿瘤活性要高。
3 铜（Ⅱ）配合物与DNA的作用
核酸（DNA）是一类重要的生命物质，它几乎包含了细胞功能所有的遗传信息，对生物的生长、发育和繁殖等起着关键的作用。因此DNA在生命过程中扮演着很重要的角色。DNA包含了细胞功能几乎所有的遗传信息.因此它在生命过程中扮演了很重要的角色。
但是，一旦DNA分子与其他分子发生反应，其结构极易被破坏，从而导致生物体发生许多病理性改变。生物试验证明，DNA是抗癌试剂的靶向分子，从抑制癌细胞中DNA分子的角度来讲，与DNA相互作用的分子可作为潜在的新治疗剂，小分子可与DNA相互作用从而阻止癌细胞DNA的复制，导致癌细胞的死亡。研究抗癌的新药都是以DNA为作用靶进行设计的[15]。
近年来，过渡金属配合物作为抗癌药物和DNA结构探针等方面表现出了巨大的应用前景，受到了人们的广泛重视。研究金属配合物与DNA的作用方式与机理，对于探索金属配合物在生物医学等领域的应用具有重要的指导意义。从而为合成新抗癌药物开辟了新的途径。
由于系统开始研究铜（Ⅱ）抗肿瘤配合物相对较晚，且主要研究目标侧重在活性配合物上。铜配合物发挥抗癌作用的原因可能是铜与药物化合物配位后增加了配合物的亲脂性，使其更易跨膜进入细胞内，进一步对癌细胞DNA的插入或其它方式以破坏DNA碱基对间的氢键，使DNA损伤失去复制功能而发挥作用。最近美国相关研究表明：实体性肿瘤患者服用适量的铜的配合物治疗后，肿瘤的生长和转移得到了明显的抑制，从而提高了生存率。但这些配合物并不是消灭了癌细胞，只是将其转化为了正常细胞。报道已合成出了一系列具有核酸酶活性的铜配合物.如单核铜配合物，双核铜配合物及多核铜配合物等[16]。另有文献报道[17]：配合物与DNA作用主要有共价键结合，插入结合，静电作用和沟槽结合四种基本方式。
多吡啶铜配合物与DNA之间有相互作用，有些还存在插入结合。一些抗肿瘤药物分子就是通过插入DNA从而使DNA的构象发生改变，使其无法进行复制而显示出抗肿瘤活性[18]。另有研究发现水杨醛类希夫碱的过渡金属配合物对DNA具有选择性断裂作用，氨基酸分子的引入能够增强药物的脂溶性，缓解对细胞的毒性[19]。铜配合物因具有核酸酶活性引起了研究者的极大兴趣。如dimetallo-copper-bipyridyl porphyrins20就可以通过插入结合的方式与DNA键合，还可以在一定条件下连接和附着于DNA上。其独特的结构对于DNA的影响在分子生物学实验和药物设计上都是很有价值的[20]。
Sigman等[21]于1979发现，Cu（phen）2及其肽或蛋白质衍生物的核酸酶活性甚至优于天然核酸酶。该配合物与DNA的反应在还原剂H2O2或硫醇存在时，对核酸聚合酶有抑制作用；张寿春[10]合成了一种新型三元1，10-菲咯啉-苏氨酸-铜（Ⅱ）配合物，该配合物以嵌入方式与DNA结合，当以抗坏血酸作为还原剂时，配合物还能显著切割超螺旋pBR322 DNA。机理研究表明，该切割反应的活性部位可能为羟基自由基。
4 铜（Ⅱ）配合物与氨基酸的共价作用
氨基酸是生物体不可缺少的物质，它是构成蛋白质并同生命活动有关的基本单元，可以识别DNA的特殊碱基对。
一些氨基酸席夫碱配合物具有抑菌、抗癌等生物活性，这类化合物的研究已经相当活跃。特别值得一提的是，由于氨基酸特有的羧酸基团，更利于金属的配位，再加上癌变细胞对氨基酸的需求量比正常细胞大得多，因而铜与氨基酸的配合物就可能将抗癌基团运载到癌变细胞内，从而提高到达靶标的有效剂量，增大杀伤癌变细胞的选择性。氨基酸铜配合物切割DNA的研究受到了人们的广泛关注，因此含有氨基酸的铜化合物可以作为模板被用来研究含有铜的生物酶的作用模式，已有报道表明某些含有氨基酸的铜配合物具潜在的抗癌活性及人造核酸酶的性质[22]-苏氨酸的引入可能使配合物与DNA之间发生选择性相互作用，并且L-苏氨酸作为辅助配体，可以有效改变Cu-phen配合物的人工核酸酶和抗肿瘤活性[23]。
陈建化等[24]成了N-（2-羟基萘甲醛）甘氨酸席夫碱配体及其铜（Ⅱ）、镍（Ⅱ）的配合物，通过动物体内抗癌活性试验表明，配体对小白鼠EAc（艾氏腹水癌细胞）无抑制作用，而其铜配合物却有一定的抑制作用。
5 铜（Ⅱ）配合物对癌细胞的诱导凋亡作用
细胞凋亡是生物体组织中发生的程序性细胞死亡过程。研究表明，金属元素可以诱导细胞凋亡的发生。而关于金属配合物对细胞凋亡的作用研究并不多见。
梁峰等[25]研究了含羟基三氮环多氨铜配合物对肝癌细胞BEL-7402的诱导凋亡行为，结果发现铜配合物主要在机体内通过调节氧化损伤机制来参与细胞凋亡的过程。Dou，Chen等[26]报道了一系列的铜配合物抑制恶性肿瘤细胞中蛋白酶体的活性进而诱导肿瘤细胞凋亡的现象。Milacic等[27]研究了Cu（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）离子对纯20S蛋白酶体的抑制作用，比较发现二者的IC50分别为5.3μm和13.8μm，还研究了Cu（Ⅱ）配合物抑制蛋白酶体活性的能力及对细胞凋亡的诱导作用，结果发现其能通过抑制蛋白酶体的活性进而诱导肿瘤细胞的凋亡。体内或者体外试验中，有机配体可以与游离的或肿瘤细胞表皮内的铜离子反应生成蛋白酶体抑制剂，进而诱导前列腺癌细胞及人乳腺癌细胞凋亡。Adsule等[28]合成了4个喹啉-2-甲醛衍生的席夫碱化合物，并使其分别与铜（II）形成1∶1的配合物，体外实验表明这8个化合物都能够抑制前列腺癌细胞系LNCaP和PC-3细胞的蛋白酶体糜蛋白酶样活性，诱导细胞凋亡。Daniel等[29]报道了有机铜配合物NCl-109268、8-羟基喹啉铜（II）配合物Cu（8-OHQ）2能有效并选择性地抑制白血病细胞蛋白酶体麇蛋白酶样活性，诱导白血病细胞凋亡。
Dou等[30]报道了一系列铜配合物，该配合物作为蛋白酶体抑制剂具有抗肿瘤活性。体外实验发现有机铜配合物与铜离子相比，前者不但体外可以抑制纯化的20S蛋白酶体，而且可以通过抑制整细胞中26S蛋白酶体的活性进而诱导肿瘤细胞凋亡，成为具有研究价值的蛋白酶体抑制剂。
6 结论
由于癌症仍在威胁着人类的健康与生命，而人类还远远没有征服它甚至对它的认识还很不够。因此可以预见，开展对癌症进行治疗的探索和研究仍是今后人们所关注的问题。金属配合物作为抗癌药物，目前多数仍处于试验阶段，深入研究抗癌金属配合物与肿瘤细胞的作用机制，设计和合成出新型高效低毒的金属抗癌化合物是当前的重要任务。随着越来越多的具有抗癌活性的金属配合物药物被发现，及人们对其抗癌活性研究的逐步深入，将会有更多的金属配合物作为抗癌药物应用于临床。
[参考文献]
[1] 周双生，程俊，鲁传华，等.N-取代四氮杂大环镧（Ⅲ）配合物的合成及其生物活性[J].中国药物化学杂志，2007，17（4）：246-248.
[2] 王飞利，常艳玲，安丽荣，等.非铂类金属抗癌化合物的研究进展[J].化学研究与应用，2003，15（5）：612-616.
[3] 刘新勇，刘洛生，王慧才，等.铂（Ⅳ）类配合物的合成及其抗肿瘤活性[J].中国药物化学杂志，2002，12（5）：272-275.
[4] 孙献茹，程鹏，廖代正，等.草酸根桥联的钒氧铜配合物的合成、表征及抗肿瘤活性研究[J].化学通讯社，1997，12（4）：44
[5] 胡喜兰，施鹏飞，徐兴友，等.双核铜配合物[Cu（pht）2（ba）2]2的合成、晶体结构和抑菌活性[J].人工晶体学报，2009，38（5）：1285-1289
[6] 李庆祥，沈云军，孟祥高.1-亚甲基苯并咪唑-1，4，7-三氮环壬烷配体及其铜配合物[Cu（C14H21N5）Br2].[CuBr4]的合成与晶体结构[J].化学学报，2008，66（2）：268
[7] 尹富玲，申佳，邹佳嘉，等.2.2-联吡啶和去甲基斑蝥酸根桥联双核铜（Ⅱ）配合物的合成、结构表征及抗癌活性的研究[J].化学学报，2003，6l（4）：556―561.
[8] Ferrari MB，Bisceglie F，Pelosi C，et al.Synthesis，characterisation，X-ray structure and biological activity 0f three new 5-formyluracil thiosemicarbazone complexes[J].J Inorg Biochem，2001，83（2-3）：169-179.
[9] 赵喜荣，莫简.对氯对甲氧基苯乙酮缩氨基硫脲合铜（Ⅱ）配合物的合成表征及其抗癌活性[J].药学学报，2002，17（3）：137-139.
[10] 张寿春.新型含铂、铜络合物杭肿瘤活性与DNA切割活性研究[D].南京：南京大学，2004：53-56.
[11] Jie Liu，Tixiang Zhang，Tongbu Lu，et al.DNA-binding and cleavage studies of macrocyclic copper（II）complexes[J].J Inorg Biochem，2002，91：269.
[12] 俞志刚，丁为民，纪红蕊，等.1-对氯苯基-3苯基-4-苯甲酰基-吡唑啉酮-5缩胺类席夫碱铜配合物的合成与抑菌活性[J].有机化学，2010，30（9）：1363.
[13] 周建良，春晓改，周琳姣，等.新型三元铜配合物的合成、晶体结构及与DNA的相互作用[J].无机化学学报，2010，26（4）：645-650.
[14] 贾磊，唐宁.含有邻菲咯啉和氨基酸支链的三元铜（Ⅱ）配合物的合成，表征，DNA-binding性质及其抗癌活性的研究[J].安徽大学学报（自然科学版），2010，34（2）：104-107.
[15] Lainé M，Richad F，Tarnaud E，et al.Synthesis of novel types of copper-bipyridy l porphyrins and characterization of their interactions and reactivity with DNA[J].J Inorg BioChem.2004，9：550-562.
[16] hang S，Zhu Y，Tu C，et al.A novel cytotoxic ternary copper（II） complex of 1，10-phenanthroline and L-threonine with DNA nuclease activity[J].J Inorg Biochem，2004，98：2099.
[17] Geromichalos GD，Katsoulos GAA，Had-Jikostas CC，et al.In vitro synergistic effects of some novel Cu（Ⅱ）complexes in combination with epirubicin and mitomycin C against HeLa_S3 cervical cancer cell line[J].Anticancer Drugs，1996，7（4）：469-475.
[18] 王彦美，韩杰，周绍兵.铂抗癌药物研究进展[J].合成化学，2003，11（1）：27-29.
[19]宋智军，乐学义.多吡啶氨基酸铜配合物研究进展[J].广东化工，2004，6：22-24.
[20] Belicchi FM，Bisceglie F，Pelosi G，et al.Synthesis，characterrization and X-ray structures of new antiproliferative and proapoptotic natural aldehyde thiosemicarbazones and their nickel （Ⅱ）and copper （Ⅱ）complexes[J].J Inorg Biochem，2002，90（3-4）：113-126.
[21] 孙颖.8-羟基喹啉衍生物化合物库的设计、合成与抗癌活性的初步研究[D].济南：山东大学，2009：41-45.
[22] 蔡小强，潘逆娜，郑忠亮.菲咯啉铜配合物与组蛋白H1的相互作用[J].武汉大学学报（理学版），2008，54（4）：443-446.
[23] 马小芳，田金磊，顾文.水杨醛缩酪氨酸还原Schiff碱铜配合物的合成、结构及与DNA键合作用的光谱学研究[J].南开大学学报（自然科学版），2008，41（1）：61-64.
[24] 陈建华，李常胜，李习俊.N-（2-羟基萘甲醛）甘氨酸席夫碱及其铜（Ⅱ）、镍（Ⅱ）配合物的合成、表征和抗癌活性[J].中国药物化学杂志，1995，5（3）：192.
[25] 梁峰，吴成泰，李朝阳，等.含羟基三氮环多氨铜配合物诱导细胞凋亡研究[J].南开大学学报（自然科学版），2008，41（1）：61-64.
[26] 王硕.邻菲罗啉铜锰钴配合物及其抗癌抗肿瘤活性[D].北京：首都师范大学，2008：48-52.
[27] Pattubala ANR，Bidyut KS，Munirathinam N，et al.Metal-assisted light-induced DNA cleavage activity of 2-（methylthio）phenylsalicylaldimine Schiff base copper（II）complexes having planar heterocyclic bases[J].J Inorg Biochem，2004，98：377.
[28] 高恩君，程卯生，王克华.钯配合物抗癌活性研究进展[J].中华医药杂志，2006，2：45.
[29] 古琴，乐学义.铜（?）二肽配合物的配位形式、结构和稳定性研究进展[J].化学研究与应用，2006，18（2）：113-118.
【摘要】 目的 探讨膜联蛋白A7氧化修饰水平变化在帕金森病(PD)发病机制中的可能作用。方法 应用10 μmol/L PSI处理PC12细胞24 h建立PD细胞模型。通过2，4二硝基苯肼(DNP)的衍生将含有羰基的氧化蛋白质标记上。首次采用2D凝胶电泳、质谱鉴定与免疫印迹技术相结合的方法比较PD细胞模型和正常对照组中膜联蛋白A7氧化修饰水平的变化。结果 与对照组比较，PD细胞模型中膜联蛋白A7氧化修饰水平显著降低(P
【关键词】 帕金森病;膜联蛋白A7;发病机制;氧化修饰;蛋白质组学鉴定
研究表明，帕金森病(PD)黑质多巴胺能神经元内蛋白质羰基水平显著升高〔1〕。因此，目前多数学者将兴趣集中于氧化应激损害，认为氧化应激在PD黑质多巴胺能神经元死亡过程中起重要作用。迄今为止，尚未见膜联蛋白A7(annexin A7)发生氧化修饰的报道。本实验通过2，4二硝基苯肼(DNP)的衍生步骤将含有羰基的氧化蛋白质标记上，而后采用2D凝胶电泳、质谱鉴定与Western印迹技术相结合的方法首次发现了annexin A7氧化修饰。期望为PD发病机制的研究及治疗药物的研发提供线索。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器 PC12细胞购自中国科学院上海细胞库。高糖DMEM培养基购自Gibco公司。新生牛血清由杭州四季青生物制品厂生产。吖啶橙、二抗、显色液等购自Sigma公司。溴化乙啶为Amresco产品。荧光倒置相差显微镜为日本Olympus产品;低温高速离心机为Heraeus Sepatech产品。DNP购自东京化工业株式会社。一抗购自Molecular Probe公司。硝纤膜、Cleanup及2D Quant试剂盒、固相13 cm IPG胶条、聚焦仪、电泳系统、凝胶图像扫描仪、2D Evolution分析软件和质谱仪为Amersham Biosciences公司产品。
1.2 方法
1.2.1 PD细胞模型的建立 PC12细胞复苏后，以2×105/ml的密度接种于底面积25 cm2的塑料培养瓶(10 ml/瓶)，于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。每2～3 d更换1次培养液。选取对数生长期细胞进行传代。细胞以1×105/ml密度接种于底面积25 cm2的塑料培养瓶。24 h后更换培养液，实验组加入终浓度10 μmol/L的PSI(以DMSO溶解)，对照组加入DMSO，实验组与对照组DMSO终浓度均为0.1%，继续孵育24 h后收集两组细胞用于实验。MTT法检测细胞存活率;吖啶橙和溴化乙啶染色观察细胞凋亡的存在;HE染色观察细胞内包含体的形成。
1.2.2 蛋白样品的制备 倾去培养液，以冷PBS洗涤3次，计算细胞重量。按重量比1∶10加入裂解液，室温作用1 h。离心30 min，收集上清液。应用Cleanup试剂盒去除杂质，2D Quant定量试剂盒进行蛋白质定量(样品浓度控制在5～10 mg/ml)。
1.2.3 一向等电聚焦电泳及IPG胶条的DNP衍生 240 μg样品与一向电泳缓冲液混合后均匀加入胶条槽，IPG胶条胶面朝下放入胶条槽，在电泳仪上进行水化及等电聚焦电泳。而后将IPG胶条在含20 mmol/L DNP的2 mol/L的HCl溶液中室温孵育20 min，而后在含30%甘油的2 mol/L TrisBase溶液中洗15 min。
1.2.4 二向凝胶电泳 将平衡后的IPG胶条转移至12.5% SDSPAGE凝胶(16 cm×15 cm×1.0 mm)上端，在垂直电泳仪上进行二向电泳。待溴酚蓝距底边约4 cm时停止电泳。
1.2.5 分析胶进行免疫印迹染色 将用作分析胶的二向胶电转移至硝酸纤维素膜。以3%BSA/TBST封闭硝酸纤维素膜。以1∶200的兔抗鼠DNP抗体作为一抗，4℃过夜孵育。以1∶10 000的羊抗兔碱性磷酸酶偶联抗体作为二抗，室温孵育1 h。以BCIP/NBT溶液作为显色液，至蓝紫色蛋白点清晰呈现后，以双蒸水终止反应。
1.2.6 制备胶进行热考马斯亮蓝染色 制备胶于20% TCA中固定2 h以上。蒸馏水漂洗凝胶20 min，加入热考染液，50℃摇床振荡30 min。加入脱色液，50℃摇床振荡脱色，每次1 h，以背景蓝色脱净为止。
1.2.7 图像分析、统计学处理及质谱鉴定 扫描Western印迹及考染的制备胶图像，应用Image Master 2D Evolution软件进行分析，在制备胶上找到与Western印迹结果相匹配的蛋白点。以单个蛋白抗DNP免疫染色强度/制备胶蛋白考染强度来标准化蛋白的氧化水平，对来自4次重复实验的结果以x±s表示，采用t检验。对与对照组比较PSI处理组氧化水平有显著差异的蛋白点进一步做质谱鉴定。
2 结 果
2.1 细胞模型结果 10 μmol/L PSI作用PC12细胞24 h的情况下，细胞存活率降至(85.46±1.75)%，与对照组(高为100%)比较有显著性差异(P
2.2 蛋白质的鉴定结果 扫描考染的制备胶及Western印迹图像，可见制备胶上的蛋白点与Western印迹图像匹配较好(见图1)。应用2D Evolution软件进行分析，与对照组比较有统计学意义的表达显著降低的蛋白点有8个(P
图1 蛋白点99在实验组和对照组考染的制备胶及Western印迹上表达比对
3 讨 论
PD的基本病理特征为黑质致密部多巴胺能神经元变性缺失，残存的神经元胞浆内出现嗜酸性包含体即Lewy小体。尸检研究表明PD黑质多巴胺能神经元内蛋白质羰基水平显著升高。羰基是蛋白质氧化的标志之一，反应性羰基作为氧化损伤的神经毒性介质涉及许多神经系统变性疾病的进展〔2〕。羰基通过修饰细胞亲核基团及破坏细胞动态平衡在神经变性病的发病机制中发挥重要作用〔3〕。
泛素蛋白酶体系统(UPS)是细胞内重要的非溶酶体蛋白降解途径，可清除真核细胞内突变、损伤及异常折叠的蛋白质，起到调控蛋白质和维持细胞内环境稳定的作用〔4〕。有研究表明，蛋白酶体抑制剂处理的动物及细胞模型可导致自由基的生成及氧化应激，较全面地模拟PD的病理特征，如细胞凋亡死亡、αsynuclein异常、酪氨酸羟化酶损伤及包含体形成〔5，6〕，提示有必要在蛋白酶体抑制的PD模型中研究氧化应激机制。
本实验在蛋白酶体抑制的PD细胞模型中，首先通过DNP的衍生步骤将含有羰基的氧化蛋白质标记上，而后采用2D凝胶电泳、质谱鉴定与Western印迹技术相结合的方法鉴定氧化修饰的蛋白质。结果首次在蛋白酶体抑制的PD模型中发现了annexin A7的氧化修饰，与对照组比较其氧化水平显著降低。
蛋白点99被鉴定为annexin A7。Annexin是一组高度同源的钙依赖磷脂结合蛋白，迄今为止在哺乳动物中已发现13种annexin。基于annexin A7在体外能聚集嗜铬颗粒，因而是第一个被分离的annexin钙结合蛋白〔7〕。除肾上腺髓质外，已在许多哺乳动物组织中检测到annexin A7，包括脑、肝脏、腮腺、脾、肺及骨骼肌〔8，9〕。在细胞水平，annexin A7涉及膜运输、胞外分泌、钙离子动态平衡及肿瘤抑制等多种生物学功能。
一些证据显示钙结合蛋白在损伤的和/或衰老的脑组织中发挥保护作用〔10〕。有研究表明在神经变性病AD中，表达高水平钙结合蛋白的神经元不发生变性〔11〕，表达钙结合蛋白的培养的神经细胞对兴奋性氨基酸或淀粉样肽诱导的细胞死亡有相当的抵抗性〔12〕。因此推测脑皮层神经元内annexin钙结合蛋白的丰富表达，可能是啮齿动物脑对AD型病理过程相对抵抗的一个因素。
Krapfenbauer等〔13〕用神经毒素海人藻酸处理大鼠脑组织，用蛋白质组学的方法检测到了在凋亡发生时annexin A7的丰度降低。Yu等〔14〕进一步发现，在凋亡因子刺激的条件下，annexin A7的下调可阻止半乳凝素3发挥抗凋亡作用。这提示本实验中annexin A7氧化修饰水平的降低可能与PD细胞模型中发生的凋亡有关;另一方面，残留annexin A7的氧化修饰则进一步影响其行使正常的生物学功能。钙离子依赖的信号转导路径功能异常可能涉及PD的发病机制，对信号转导路径关键步骤的干预可能阻止凋亡的进程。钙依赖的磷脂结合蛋白annexin A7在PD等神经系统变性病中的可能作用值得进一步深入研究，同时可能为PD分子靶向药物治疗的研发提供有价值的线索。
参考文献
1 Alam ZI，Daniel SE，Lee AJ，et al.A generalised increase in protein carbonyls in the brain in Parkinson′s but not incidental Lewy body disease〔J〕.J Neurochem，1997;69(3):13269.
2 Sohal RS，Agarwal A，Agarwal S，et al.Simultaneous overexpression of copper and zinccontaining superoxide dismutase and catalase retards agerelated oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster〔J〕.J Biol Chem，1995;270(26):1567174.
3 Picklo MJ，Montine TJ，Amarnath V，et al.Carbonyl toxicology and Alzheimer′s disease〔J〕.Toxicol Appl Pharmacol，2002;184(3):18797.
4 Pickart CM.Mechanisms underlying ubiquitination〔J〕.Annu Rev Biochem，2001;70(5):50333.
5 Rideout HJ，Larsen KE，Sulzer D，et al.Proteasomal inhibition leads to formation of ubiquitin/alphasynucleinimmunoreactive inclusions in PC12 cells〔J〕.J Neurochem，2001;78(4):899908.
6 McNaught KS，Perl DP，Brownell AL，et al.Systemic exposure to proteasome inhibitors causes a progressive model of Parkinson′s disease〔J〕. Ann Neurol，2004;56(1):14962.
7 Brownawell AM，Creutz CE.Calciumdependent binding of sorcin to the Nterminal domain of synexin (annexin Ⅶ)〔J〕.J Biol Chem，1997;272(35):2218290.
8 Clemen CS，Herr C，Lie AA，et al.Annexin Ⅶ:an astroglial protein exhibiting a Ca2+dependent subcellular distribution〔J〕.Neuroreport，2001;12 (6):113944.
9 Magendzo K，Shirvan A，Cultraro C，et al.Alternative splicing of human synexin mRNA in brain，cardiac，and skeletal muscle alters the unique Nterminal domain〔J〕.J Biol Chem，1991;266(5):322832.
10 Pascale A，Etcheberrigaray R.Calcium alterations in Alzheimer′s disease:pathophysiology，models and therapeutic opportunities〔J〕. Pharmacol Res，1999;39(2):818.
11 Iacopino AM，Quintero EM，Miller EK.CalbindinD28K:a potential neuroprotective protein〔J〕.Neurodegeneration，1994;3(1):120.
12 Guo Q，Christakos S，Robinson N，et al.Calbindin D28k blocks the proapoptotic actions of mutant presenilin 1:reduced oxidative stress and preserved mitochondrial function〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1998;95(6):322732.
关键词： 糖尿病；愈合；创面
随着世界各国社会经济的发展，居民生活水平的提高，由于饮食结构的改变、日趋紧张的生活节奏以及少动多坐的生活方式等诸多因素，全球糖尿病发病率及患病率增长迅速，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。糖尿病患者皮肤易受损伤，损伤后往往反复发作，迁延不愈，形成顽固难愈性溃疡。因此，糖尿病溃疡的治疗是临床急需解决的重要课题之一。随着近年来分子生物学等学科的发展，对糖尿病创面愈合机制的研究也日趋深入，围绕信号通路、血管生成、神经肽、糖基化终末产物、细胞凋亡及基质金属蛋白酶等方面的研究逐渐成为热点。
1 信号转导通路
创面的愈合需要多种细胞、细胞因子和细胞外基质等因素的共同参与。各因素通过细胞因子相互作用，共同协调，构成一个复杂的生物网络。任何一种细胞因子的缺乏都可能导致创面不愈或愈合延迟。同时，细胞因子与靶细胞受体间信号转导“失耦联”以及多种因子间网络调节“失控”也可能是导致创面不愈的关键因素。
1．1 转化生长因子β(TGFβ)与smad信号通路
TGFβ有β1～β5五个亚型，哺乳动物体内，TGFβ13是主要的三种，其中又以TGFβ1占大多数。smad蛋白家族是把TGFβ与其受体结合后产生的信号从胞质传导到细胞核内的中介分子，各类smad蛋白相互联系制约，并通过不同途径参与TGFβ的信号转导。
TGFβ1可以促进成纤维细胞的迁移、增殖，强烈趋化成纤维细胞和炎性细胞，抑制上皮细胞生长但加速血管形成，可以通过刺激成纤维细胞合成胶原等细胞外基质、抑制基质蛋白酶活性并增强胶原酶抑制剂的表达来调节ECM蛋白的表达，在创面愈合的早期TGFβ1即被释放，伤后5～7 d呈现第二个高峰。伤口愈合过程中内源性Smad3的表达、激活与炎症反应的启动、结束及胶原合成密切相关。
糖尿病患者溃疡区TGFβ1正常的伤后上调反应缺失，而TGFβ3却表达上调，可以部分地解释其慢性难愈创面的特点；Chesnoy等［1］通过糖尿病小鼠创面皮内注射质粒DNA来转染TGFβ1基因发现：创面的细胞增殖率和细胞外新生基质的密度、有序性排列比对照组明显提高，且愈合时间可提前约50％。
1．2 Ras信号通路
Ras信号通路在糖尿病创面愈合延迟或不愈病理机制中扮演着重要的角色，并逐渐成为研究的热点。Ras信号通路包括如下几部分(1)细胞外生长因子与受体偶联；(2)受体二聚化激活；(3)丝裂原活性蛋白激酶(MAPK)级联反应；(4)核内活化蛋白1(AP1)激活；(5)基因的转录和表达。
信号转导的复杂网络需要传递信号分子精确的时空排列，当脱离原本正常的细胞环境，许多转信号分子就杂乱的相互作用。初步研究认为高糖抑制Ras信号途径受体和其中的关键激酶Ras、Raf的磷酸化活化［2］，信号分子表达异常，细胞周期停滞于G0、G1期，细胞增殖的乏力可能促发凋亡，增生细胞减少，凋亡细胞增多显然会破坏创面愈合，可能是通路失活的主要原因。
1．3 Wnt信号通路
Wnt细胞信号转导途径是调控细胞生长、发育和分化的关键途径。在肿瘤的发生、侵袭转移、细胞黏连极性及细胞凋亡等方面成为目前的研究热点。目前已知的Wnt作用机制有两种：规范途径和非规范途径。
规范途径: Wnt与受体卷曲蛋白Frz及低密度脂蛋白相关蛋白LRP5／6结合，胞内散乱蛋白Dsh与Frz胞内区结合后被磷酸化激活，抑制丝／苏氨酸激酶GSK3β活性，使得βcatenin不能被磷酸化，不能被泛素蛋白酶体系统降解。不能降解的βcatenin在胞质内大量积累并进入核内，与转录活化因子TCF／LEF结合，启动下游靶基因的表达。无Wnt信号刺激细胞时酪蛋白激酶I(casine kinase，CKI)将细胞质中βcatenin的Ser45磷酸化，磷酸化后的βcatenin与轴蛋白Axin，GSK3β，结肠腺瘤肉病基因蛋白APC等形成“破坏复合体”，复合体中的GSK3β相继使βcatenin的Ser41，Thr33，Thr37磷酸化而使βcatenin能被泛素连接酶复合体E3的亚单位βTrCP(Btransducin repeatcontaining proteins)识别，经蛋白酶体途径降解，因而此时细胞内的βcatenin水平较低。
非规范途径：Wnt只与Wnt受体复合物的亚基Frz作用，而不需要LRP5/6，包括Wnt/Ca2+通路和平面细胞极性信号通路。
既往在肿瘤的研究中发现：βcatenin不仅受经典的Wnt信号调控，而且受前列腺素PGE/EP2信号，表皮生长因子EGF/EGFR/PI3K/AKT，以及钙粘蛋白Ecadherin信号调控，这些分子之间有较为复杂的crosstalk系统［3］。而目前的研究发现：高糖通过PI3KAkt信号途径抑制内皮细胞迁移和增殖及血管发生改变，也能引起黏附分子Ecadherin的上调。ChunLiang Lin等［3］报道，Wnt/βcatenin信号的上调能提高高糖导致的肾系膜细胞的活性；研究表明：Wnt以及βcatenin表达增强，表皮细胞的增殖、分化和迁移能力增强，且创面愈合加快［4，5］；皮肤角质化细胞wnt信号途径影响创伤后皮肤的厚度及色素沉着［6］；wnt信号途径参与保护高糖导致的血管内皮细胞的损伤［7］。
2 血管生成与创面愈合
摘要Metacaspase是由YCA1/MCA1编码的一种哺乳动物caspases同系物。由于其分子结构的差异，使其断裂为不同的特异性底物。在哺乳动物中，凋亡被一组蛋白酶caspases定向激活，断裂特异性底物且触发细胞死亡。环境损伤、细胞内缺陷、预凋亡基因的异源表达诱导具有典型凋亡特征的酵母细胞死亡与metacaspase紧密相关。删除metacaspase可以阻碍不同因素引起的死亡，metacaspase在酵母细胞凋亡中具有核心作用。
关键词酵母;YCA1;凋亡
AbstractMetacaspase is a kind of mammal caspases homolog which coded by the YCA1/MCA1 gene. It can break into different specificity substrates because its difference in molecular structure. In mammals，apoptosis can be activated directly by a group of proteases，called caspases，then cleave specific substrates and trigger cell death. Damaging environment，certain intracellular defects and heterologous expression of pro-apoptotic genes inducing death in yeast cells exhibiting typical markers of apoptosis was closely related with themetacaspase. Metacaspase deletion may hinder the death which was caused by different factors. Metacaspase played a central role in yeast apoptosis progress.
Key wordsyeast;YCA1;apoptosis
细胞凋亡(apoptosis)或编程性细胞死亡(programmed cell death，PCD)是一个高度被协调的细胞自杀过程，其对健康状态的维持和组织功能起决定性作用，细胞凋亡紊乱可导致癌症或神经退行性病变(neurodegenerative disorders)。
细胞有多种死亡方式，细胞凋亡应指仅仅是形态改变的细胞死亡。这些改变包括细胞聚集，细胞体积变小，染色质浓缩，核断裂，胞质细胞器少有或没有超微结构修饰，磷脂酰丝氨酸外翻，质膜起泡和维持质膜完整性直到凋亡晚期。虽然酵母基因组中没有哺乳动物Bax和Bcl家族的基因类似物，但由Bax介导的酿酒酵母细胞死亡具有典型的凋亡特征，如细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸外翻，细胞色素C释放，膜起泡，染色质凝聚和边缘化，DNA断裂。若同时表达Bcl-xL可阻止这些现象发生和细胞死亡[1]。酿酒酵母基因组突变诱导的细胞死亡也具有哺乳动物凋亡细胞的表型特征[2]。酵母细胞死亡涉及的一些基因已被证实为后生动物凋亡调控子。被研究的哺乳动物凋亡级联的一些必要元件的酵母类似物有caspase [3]，Omi [4]，AIF [5] and Endo G [6]，这说明凋亡的基本元素在单细胞有机体中是确实存在并起功能的。随着研究的深入，人们已经认识到，凋亡不仅存在于多细胞生物中，也存在于单细胞真核生物中，近年来，酿酒酵母发生凋亡已被公认。
1Metacaspase
Caspases是一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶。其命名由半胱氨酸依赖天冬氨酸的特异性而来。Metacaspase是caspases和paracaspase的同系物。Uren等通过PSI-BLAST研究发现metacaspase和paracaspase。以前的酵母基因组分析表明其不存在caspase，但通过序列比较发现ORF YOR197w编码一个类caspase蛋白，符合1型metacaspase的被命名为MCA1。后来因为YOR197w可被作为酵母的一个真实的caspase基因并被更名为YCA1[7]。
分子水平的系统进化分析表明，植物、真菌和原生动物的metacaspases 在进化上起源于caspases。酵母YCA1具有caspase的保守结构域。虽然保守，但差异是不可避免的。caspase特异性断裂天冬氨酸，其分为起始caspase(caspase 8， 9，10，12)和效应caspase(caspase 3，6，7)2类，而酵母只有YCA1，其在N末端含有1个富含脯氨酸的区域，酵母中的YCA1被激活起始通过水解掉1个12kDa的小亚基。但酵母的metacaspase和部分植物的metacaspase具有精氨酸、赖氨酸特异性。
虽然酵母YCA1与动物caspase在分子结构和断裂特异性底物上存在一些差异，但它们都介导细胞凋亡过程。YCA1是酵母中迄今发现的仅有的类caspase蛋白，YCA1在外源刺激和内源信号引起的众多凋亡过程中起核心作用。
2生理条件下的酵母凋亡与YCA1的作用
酵母细胞在时序衰老[8]、杀伤毒素产生的生理条件下发生的凋亡需要YCA1。时序衰老死亡的酵母菌显示典型的凋亡特征，如氧自由基的积累和YCA1的活化。通过删除YCA1可增加其长期培养的存活率进而破坏凋亡机制，虽然对整个菌落是不利的[8]。德尔饮食限制一段时间后，即使有可利用的营养，衰老的YCA1缺陷株也不能再生长，使菌落产生严重损伤和大量老细胞。这显示酵母凋亡的生理作用在衰老相关细胞死亡中进行适当细胞的选择起重要作用。对整个种群具有“清洁”效应。
产生杀伤毒素的细胞表型在多种酵母属种中普遍存在，损伤与低分子量蛋白或糖蛋白毒素(杀伤毒素)的分泌相关，其能杀伤敏感的细胞，在第2阶段的受体介导进程中没有细胞间的直接接触。在酵母中发现3个不同的杀伤毒素(K1，K2，and K28)，其由细胞质双链RNA病毒编码，作为分泌α/β毒素的前体。在低浓度下，这3个病毒编码酵母毒素诱导凋亡标志的死亡。酵母YCA1和ROS介导这个过程。相反，高浓度诱导坏死，而不是凋亡，其不依赖YCA1和 ROS[9]。所以，在自然环境中，毒素浓度是低的，杀伤细胞通过诱发凋亡能清除竞争的敏感细胞。
3外源刺激诱导酵母凋亡与YCA1的作用
很多应激条件和药物能够诱导酵母细胞凋亡，其中大部分都需要YCA1的作用。低剂量的H2O2和醋酸是最常见的诱导物[10-11]。删除YCA1的菌株经H2O2处理比野生型存活好，蛋白酶体活力增加，减小凋亡，而过表达YCA1的细胞死亡程度增加且显示凋亡特征，使细胞提早死亡[10]。但经400 mmol/L醋酸诱导的凋亡仅有20%~30%的caspase阳性细胞，说明这个凋亡过程与caspase有较小的相关性[11]。适当的渗透应激可使酵母细胞发生凋亡和YCA1活化，但在YCA1缺陷株中，渗透性应激后仍有微量的metacaspase激活。渗透应激过程中，YCA1激活依赖Sro77p，在缺乏SRO77的突变株中caspase活力与YCA1缺陷株的细胞相似。而Sro77p同系物Sro7p，对YCA1激活起负向作用[12]，但盐敏感的Sro7p突变株中caspase活力比野生型高。且sro77/yca1 和 sro7/sro77/yca1突变株，仍然显示凋亡特征，这都显示有不依赖YCA1的凋亡路径存在。
YCA1缺陷株经25 mmol/L丙戊酸(VPA)处理具有90%的存活率，这个浓度使野生型细胞完全致死[13]。有毒非金属砷处理后的酵母细胞存活率YCA1缺陷株(91.3%)比野生株(50.3%)高。此外，经TUNEL染色确定DNA断裂率在突变株(1.5%)中显著高于野生株(34.3%)[14]。而暴露于高水平的锰(Mn)中，可致使锰中毒，Mn2+诱导的细胞凋亡通过caspase途径[15] 。但铜诱导的凋亡不涉及YCA。咖啡因对预凋亡突变株(Kllsm4Δ1)敏感，并被同时失活的YCA1抑制[16]。
4内源诱导酵母凋亡与YCA1的作用
酵母凋亡首先被描述在CDC48基因突变细胞中，其编码AAA-ATPase，对细胞分裂、泛素依赖的内质网相关蛋白降解和囊泡运输起作用。在cdc48S565G突变细胞中caspase活力增加，暗示在这个突变株中，YCA1被激活[17]。缺乏功能性细胞色素C的突变株cyc1cyc7和cyc3与野生型相比，有caspase活力的细胞减少且增加存活率[18]。其他突变株也显示凋亡表型，其中大部分YCA1作为突变诱导细胞死亡的执行者。YCA1激活也与众多的细胞基本进程缺陷相关，如DNA复制，线粒体功能，RNA和蛋白稳定。
4.1DNA复制
当由DNA损伤药物阿多来新诱导酵母以蛋白酶体依赖方式进行凋亡时，Cdc6p(DNA复制起始必需的预复制复合物元件)很快被降解[19]。ORC2编码ORC和orc2-1突变细胞的一个亚基，在非许可温度，DNA复制起始缺陷，激活DNA损伤并凋亡[20]。Orc2-1细胞凋亡诱导活性氧(ROS)产生和YCA1激活，促成orc2-1突变体死亡。ROS和YCA1的激活可能由与DNA复制叉崩溃相关的DNA损伤所诱导[20]。
4.2mRNA稳定
在酵母中，mRNA翻译至少沿行3个蜕变路径。其中2个是mRNAs的5′/3′核酸外切消化紧跟着一个脱盖事件，第3个路径中，转录物经3′/5′核酸外切消化被降解。在脱帽依赖路径，mRNAs在特定的细胞质位置被降解，叫P-体，在生长过程和细胞应激后，其大小和数量改变。P-体元件(dcp1，dcp2，dhh1，lsm1-7)突变显示凋亡表型和加速时序衰老。至少其中一个突变(Kllsm4Δ1)中，凋亡死亡依赖YCA1活力，lsm4Δ1/yca1Δ双突变凋亡细胞减少，时序衰老过程中生存力增加[16]。
4.3蛋白稳定性
蛋白的翻译后修饰被泛素(Ub)共价附着，这是调控细胞死亡程序的一个主要生物机制。在酵母中，泛素化与凋亡相关。事实上，通过蛋白酶体使内质网相关蛋白降解和Stm1p积聚时，需要Cdc48p，它是一种蛋白酶体底物，特异性诱导细胞死亡，当细胞缺乏Stm1p经氧化氢诱导凋亡后显示高存活率。而UBP10的缺失，会导致细胞过早死亡，可通过删除YCA1有效地援救此行为[21]。
5外源凋亡蛋白表达与YCA1的作用
哺乳动物凋亡蛋白在酵母中的异源表达显示凋亡的特征，说明在酵母中有一个保守的细胞死亡程序。
仅仅caspase 8在酵母中的过表达致使细胞死亡，而caspase 3的过表达不能致死仅能抑制酵母生长。后生动物(人类，果蝇和线虫)caspases的异源表达使酵母的原生质和核膜断裂致使电势降低，没有损坏DNA。但异源caspases的作用不需要酵母凋亡自身调控者YCA1和AIF1。此外，YCA1或AIF1的缺失并没有导致保护预凋亡蛋白Bax诱导的毒力[22-23]，所以在这里，细胞死亡可能通过自体吞噬发生。
植物和原生动物诸虫的metacaspases在酵母中表达时，其中一些能补偿YCA1的缺失。如拟南芥的2个metac-aspases(AtMCP1b and AtMCP2b)在yca1突变细胞中表达被证实在衰老过程和氧化应激诱导凋亡中被涉及[24]。来自寄生虫硕大利什曼原虫的单个metacaspase基因在YCA1无效突变细胞中表达能修复酵母细胞对氧化应激的敏感性，成活率水平和凋亡特征与有YCA1补助的突变细胞相似[25]。
酵母也是研究有丝分裂细胞的衰老相关退化的有用模型，如烟胺比林病理学。烟胺比林蛋白α结瘢(alpha-syn)是连接帕金森病(PD)因素之一。酵母细胞表达alpha-syn积累脂滴，显示空泡、溶酶体缺损并显示凋亡标志，包括磷脂酰丝氨酸外翻，细胞色素c释放和活性氧的积累。YCA1基因的删除废止alpha-syn诱导的ROS积累并促进alpha-syn-表达细胞的强力生长。这些研究表明，alpha-syn-诱导的ROS产生由caspase介导，并指出alpha-syn的表达激活caspase活力，然后刺激ROS的产生并触发凋亡[26]。
亨延顿舞蹈病由亨廷顿蛋白的特异性突变引起。亨廷顿一个聚谷氨酸(polyQ)重复扩大导致神经元中蛋白聚集，紧接着有凋亡标志的细胞死亡。在酵母中存在类似的情况，在核子中扩大polyQ聚集物积累并诱导线粒体断裂，caspase激活和细胞死亡。虽然YCA1的缺失没有显著营救菌落生长中polyQ的有害效应，但聚集体的细胞内定位被强烈影响，缺失型突变体比野生型有四倍体的核定位。
6酵母凋亡过程中YCA1的分子机制
哺乳动物中，死亡受体通路和线粒体通路是导致依赖caspase凋亡的主要途径。激活起始caspase，紧接着激活效应caspase，最后切断细胞死亡必要的底物。caspase蛋白家族一旦被激活后便不可逆地启动细胞死亡的执行阶段。
在酵母中还没有发现死亡受体相关类似物，但YCA1起着经典的起始caspase作用。只有人类caspase 8在酵母中异源表达有毒力，而其他的caspase异源表达无毒力。其高效断裂对于caspase 8有高效特异性的IETD-AMC底物，而不能断裂效应caspase3特异底物DEVD-AMC。但DEVD-VAD抑制由H2O2诱导的fis1突变株死亡，指出YCA1活力也与效应caspases相似(主要caspase3和7)。
在线粒体通路过程中，哺乳动物释放的细胞色素C与Apaf1结合使其寡聚化，随后pro-caspase-9复原并活化，形成的复合物被称为“apoptosome”。caspase激活需要细胞色素C已经被很好的论证。酵母中细胞色素C的释放最先在细胞中表达人预凋亡蛋白Bax被证实的。基于Bax表达，细胞色素C氧化酶减少和大量细胞色素C释放到细胞质中。删除酵母中编码细胞色素C的2个亚型的基因虽不能废止死亡，但能推迟酵母细胞应对一些死亡刺激[27]。
由aac1/2/3编码的ADP/ATP 携带(AAC)蛋白突变株中过表达yca1并不能增加细胞死亡，因为没有细胞色素C的释放。高葡萄糖或山梨醇的培养基导致线粒体膨胀和细胞色素C释放，伴随caspase 活力增加和细胞死亡。删除YCA1显著营救这些表型。突变株cyc1cyc7和cyc3与野生型相比，caspase活力细胞减少且存活率增加[27]。这些发现支持在酵母YCA1激活中涉及线粒体和细胞色素C的后继活力。然而在酵母中没有发现哺乳动物凋亡相关因子Apaf1的同源物和相似功能的蛋白，所以酵母中细胞色素C释放的上游机制及其如何激活YCA1仍不清楚。
与细胞色素C释放无关的死亡通路在哺乳动物中存在且涉及EndoG和AIF1，凋亡刺激后，这2个核酸酶从线粒体定位到核中。酵母中有编码这些蛋白的基因同源物，分别为NUC1(YJL208c)and YNR074c，这可能阐明细胞色素C和YCA1不相关的凋亡途径[5-6]。
由过氧化氢或醋酸处理引起的酵母细胞死亡，Dnm1p启动线粒体断裂，进而发生细胞凋亡。删除线粒体裂变因子FIS1可诱导细胞死亡，但删除yca1可以废除其作用[28]。
7结语
酵母凋亡过程的保守性及其在分子生物学研究方面的先天优势，成为凋亡研究新的模式生物。YCA1是哺乳动物caspase的垂直同源物，在酵母细胞凋亡中具有核心作用，外源刺激，氧化压力、衰老等多种因素导致的细胞凋亡过程中，干扰YCA1 均能避免形成凋亡表型由YCA1介导的且与线粒体相关的细胞死亡，与后生动物的内在凋亡路径如出一辙。但含有重组体YCA1的细菌浸液显示精氨酸、赖氨酸特异的半胱氨酸肽链内切酶活力，且其不被caspase z-VAD-fmk的抑制剂抑制[24]，这个表示YCA1具有一个不同于后生动物caspase的特异性位点。此外，酵母基因组可能含有除了YCA1的其他metacaspases，它们可能不能断裂普遍被识别的caspase底物，而由其他的细胞死亡调节器起作用。
YCA1在凋亡过程中的作用及其分子机制既有保守的一面也有复杂的一面，不同的生长条件下YCA1是怎样影响基因表达和细胞代谢仍不清楚，它的上下游通路及其作用的具体机制还不是很清楚，所以YCA1其相关物质的发掘与作用还需要更深入的研究，这样会更了解酵母凋亡路径和，对比高等真核生物研究，为其他物种的研究做出指导。
8参考文献
[1] LIGR M，MADEO F，FROHLICH E，et al. Bax triggers apoptotic changes in yeast[J].FEBS Lett，1998(438):61-65.
[2] FROHLICH K U，FUSSI H，RUCKENSTUHL C.Yeast apoptosis-from genes to pathways[J].Semin. Cancer Biol，2007(17):112-121.
[3] MADEO F，HERKER E，MALDENER C，et al. A caspase-related prot-ease regulates apoptosis in yeast[J].Mol. Cell，2002(9):911-917.
[4] FAHRENKROG B，SAUDER U，AEBI U.The S. cerevisiae HtrA-like protein Nma111p is a nuclear serine protease that mediates yeast apoptosis[J].J Cell Sci，2004(117):115-126.
[5] WISSING S，LUDOVICO P，HERKER E，et al. An AIF orthologue regu-lates apoptosis in yeast[J]. J Cell Biol，2004(166):969-974.
[6] BUTTNER S，EISENBERG T，CARMONA-GUTIERREZ D，et al. End-onuclease G regulates budding yeast life and death[J]. Mol Cell，2007(25):233-246.
[7] UREN A G，O'ROURKE K，ARAVIND L A，et al. Identification of para-caspases and metacaspases:two ancient families of caspase-like proteins，one of which plays a key role in MALT lymphoma[J]. Mol Cell，2000(6):961-967.
[8] HERKER E，JUNGWIRTH H，LEHMANN K A，et al. Chronological aging leads to apoptosis in yeast[J]. J Cell Biol，2004(164):501-507.
[9] REITER J，HERKER E，MADEO F，et al. Viral killer toxins induce caspase mediated apoptosis in yeast[J].J Cell Biol，2005(168):353-358.
[10] MADEO F，FROHLICH E，LIGR M，et al. Oxygenstress: a regulator of apoptosis in yeast[J].J Cell Biol，1999(145):757-767.
[11] GUARAGNELLA N，PEREIRA C，SOUSA M J，et al. Giannattasio，YCA1 participates in the acetic acid induced yeast programmed cell death also in a manner unrelated to its caspase-like activity[J]. FEBS Lett，2006(580):6880-6884.
[12] WADSKOG I，MALDENER C，PROKSCH A，et al. Yeast lacking the SRO7/SOP1-encoded tumor suppressor homologue show increased susceptibility to apoptosis-like cell death on exposure to NaCl stress[J]. Mol Biol Cell，2004(15):1436-1444.
[13] MITSUI K，NAKAGAWA D，NAKAMURA M，et al. Valproic acid indu-ces apoptosis dependent of Yca1p at concentrations that mildly affect the proliferation of yeast[J]. FEBS Lett，2005(579):723-727.
[14] DU L，YU Y，CHEN J，et al. Arsenic induces caspase- and mitoc-hondria-mediated apoptosis in Saccharomyces cerevisiae[J]. FEMS Yeast Res，2007(7):860-865.
[15] LIANG Q，ZHOU B.Copper and manganese induce yeast apoptosis via different pathways[J].Mol Biol Cell，2007(18):4741-4749.
[16] HE Z，MA W Y，HASHIMOTO T，et al. Induction of apoptosis by caff-eine is mediated by the p53，Bax，and caspase 3 pathways[J]. Cancer Res，2003(63):4396-4401.
[17] BRAUN R J，ZISCHKA H，MADEO F，et al. Ueffing，Crucial mito-chondrial impairment upon CDC48 mutation in apoptotic yeast[J].J Biol Chem，2006(281):25757-25767.
[18] SILVA R D，SOTOCA R，JOHANSSON B，et al. Hyperosmotic stress induces metacaspase-and mitochondria dependent apoptosis in Saccharomyces cerevisiae[J]. Mol Microbiol，2005(58):824-834.
[19] CERVENY K L，TAMURA Y，ZHANG Z，et al. Regulation of mitoch-ondrial fusion and pision[J]. Trends Cell Biol，2007(17):563-569.
[20] WEINBERGER M，RAMACHANDRAN L，FENG L，et al. Apoptosis in budding yeast caused by defects in initiation of DNA replication[J].J Cell Sci，2005(118):3543-3553.
[21] BETTIGA M，CALZARI L，ORLANDI I，et al. Involvement of the yeast metacaspase Yca1 in ubp10 Delta-programmed cell death[J]. FEMS Yeast Res，2004(5):141-147.
[22] GUSCETTI F，NATH N，DENKO N. Functional characterization of human proapoptotic molecules in yeast S. cerevisiae[J]. FASEB J，2005(19):464-466.
[23] KISSOVA I，PLAMONDON L T，BRISSON L，et al. Evaluation of the roles of apoptosis，autophagy，and mitophagy in the loss of plating effi-ciency induced by Bax expression in yeast[J]. J Biol Chem，2006(281):36187-36197.
[24] WATANABE N，LAM E. Two Arabidopsis metacaspases AtMCP1b and AtMCP2b are arginine/lysine-specific cysteine proteases and activate apoptosis-like cell death in yeast[J].J Biol Chem，2005(280):14691-14699.
[25] GONZALEZ I J，DESPONDS C，SCHAFF C，et al. Leishmania major metaca-spase can replace yeast metacaspase in programmed cell death and has arginine-specific cysteine peptidase activity[J]. Int J Parasitol，2007(37):161-172.
[26] FLOWER T R，CHESNOKOVA L S，FROELICH C A，et al. Heat shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of Parkinson's disease[J]. J Mol Biol，2005(351):1081-1100.
生物学家通过对选定的生物物种进行科学研究，来揭示某种具有普遍规律的生命现象。此时，这种被选定的生物物种就是模式生物。例如果蝇，有谁会想到，这种红眼、双翅、羽状触角芒、身体分节、黄褐色的小昆虫，在近百年间竟然能够“成就”好几位获得诺贝尔奖的大科学家。
什么是自噬？
大隅良典研究的是酵母的细胞自噬机制。酿酒酵母是一种 模式生物 ，非常经典。经过20多年的研究，在酵母里已经发现了34种与自噬有关的基因。那么自噬到底是什么？当你真的了解它以后，你会发现，原来细胞这么“聪明”！
自噬，不就是自己吃自己吗？可以这样理解。自噬就是细胞自己降解自己结构的过程，即把一些暂时用不上的零件，拆解变成最小的模块，然后重新组装成自己需要的东西，这就是自噬。在植物细胞和酵母细胞里，自噬在液泡中发生。而在动物细胞里，自噬在溶酶体里发生。从一个蛋白质到整个细胞器，都是可以降解的。
自噬是细胞内分解代谢的一种途径。除此之外还有一种途径，称之为泛素蛋白酶体途径。简单说就是在蛋白质上加个泛素，做个标记，然后送进蛋白酶体中完成消化。
发现细胞自噬
首次提出自噬这一概念的，是诺贝尔奖生理学或医学奖获得者、比利时细胞和生物化学家克里斯汀・德・迪夫。他在20世纪50年代通过电子显微镜观察到自噬体，并在1963年溶酶体国际会议上正式提出，他也因此被誉为“自噬之父”。
到了20世纪90年代，大隅良典开始用酵母研究自噬。再后来越来越多科学家加入了研究自噬的队伍。
细胞自噬其实分为三种方式，这是根据如何“打包”物质和如何运送物质来划分的。
第一种叫宏自噬，也叫巨自噬，顾名思义就是自噬体比较大，用细胞膜或者其他的双层膜去把那些不想要的东西包裹起来，然后和溶酶体融合。
第二种叫微自噬。顾名思义就是自噬体比较小，溶酶体或者液泡直接用自身去吞噬那些需要降解的东西，也许是细胞器，也许是蛋白质。
第三种叫分子伴侣介导自噬。是指分子伴侣将细胞内的蛋白质先从折叠状态恢复为未折叠的状态，再放到溶酶体里。
这三种方式中，第一种方式是科学家们研究最为透彻的，所以有时自噬就是指巨自噬。而酵母细胞里发生的就是巨自噬。
自噬是这样发生的
首先，细胞核发出一种信号，指示细胞里某个部分需要降解了，或者是某些垃圾诱导细胞产生了某种反应，于是自噬发生了。
接着，自噬体逐渐扩张、收口、包裹那些垃圾。自噬体一般是球型的。
然后，自噬体和液泡或者溶酶体融合。
最后，在融合以后，细胞中那些暂时不需要的物质在某些酶的作用下便分解了，分解成氨基酸、脂肪酸之类，剩下的残渣就排出细胞了。当然也可能暂时保留，说不定能“废物利用”呢。
就这样，自噬发生了。但是最初包裹那些垃圾的膜是从哪来的呢？
原来，在酵母里，膜会在自噬体“组装”位点（这个位置是靠近液泡的），在Atg8以及其他蛋白质的作用下开始扩展生长，然后就形成了自噬体。
而在哺乳动物细胞里，这个过程就不一样了。形成自噬体的区域是分散在整个细胞里的。第一种假说认为，自噬体膜是来自内质网的，而自噬体就形成在内质网和线粒体接触的地方，所以还有一直说法认为自噬体膜来自线粒体外膜；还有三种假说分别认为自噬体膜来自 高尔基体、内吞体 以及细胞膜。这些假说各有证据，目前还很难说哪一个是对的，或者都是正确的，也不无可能。
高尔基体是真核细胞中内膜系统的组成之一，它由扁平膜囊、大囊泡、小囊泡三个基本成分组成。高尔基体在植物细胞中参与细胞壁的合成，但在动物细胞中它与腺细胞的分泌有很大关系。
内吞体即细胞内吞作用形成的网格蛋白有被小泡，将细胞外大分子物质摄入有被小泡，运输到早期胞内体，在这里遇到从高尔基体转运小泡运输来的溶酶体水解酶，再通过晚期胞内体，进一步形成溶酶体。
自噬=凋亡？
说到这，你一定还能想到一个词――凋亡。自噬和凋亡是一回事吧？答案是否定的。
细胞死亡分为三种：坏死、凋亡、自噬性细胞死亡。显然，自噬和凋亡是并列存在的。
坏死就是机体受到损伤，细胞代谢停止，功能丧失。溶酶体里的水解酶释放分解了整个细胞，或者是白细胞大老远地跑来释放了水解酶。
凋亡也称为1型程序性细胞死亡。依靠的是胱冬肽酶等多种水解酶。细胞凋亡有以下特点：染色体浓聚、细胞皱缩、DNA降解和凋亡小体形成，最后残余部分被巨噬细胞吃掉。
而自噬也叫2型程序性细胞死亡，它纯粹是在溶酶体的作用下发生的，而不依赖于某些酶。
由此可见，凋亡和自噬是一种动态平衡。自噬可能比凋亡早发生，通过启动自噬而抑制凋亡，从而保护细胞；自噬还可能向凋亡转化。
为了更好地生存，细胞也是“蛮拼的”
细胞发生自噬是一个非常“保守”的过程，几乎没有进化。细胞自噬的出现是为了适应环境，尤其是碰上了“不好的年景”，比如缺乏营养、饥饿难耐，或者细胞中氧气、水分特别少的时候，就需要自噬了。
关键词：糖尿病；愈合；创面
随着世界各国社会经济的发展，居民生活水平的提高，由于饮食结构的改变、日趋紧张的生活节奏以及少动多坐的生活方式等诸多因素，全球糖尿病发病率及患病率增长迅速，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。糖尿病患者皮肤易受损伤，损伤后往往反复发作，迁延不愈，形成顽固难愈性溃疡。因此，糖尿病溃疡的治疗是临床急需解决的重要课题之一。随着近年来分子生物学等学科的发展，对糖尿病创面愈合机制的研究也日趋深入，围绕信号通路、血管生成、神经肽、糖基化终末产物、细胞凋亡及基质金属蛋白酶等方面的研究逐渐成为热点。
1信号转导通路
创面的愈合需要多种细胞、细胞因子和细胞外基质等因素的共同参与。各因素通过细胞因子相互作用，共同协调，构成一个复杂的生物网络。任何一种细胞因子的缺乏都可能导致创面不愈或愈合延迟。同时，细胞因子与靶细胞受体间信号转导“失耦联”以及多种因子间网络调节“失控”也可能是导致创面不愈的关键因素。
1．1转化生长因子β(TGFβ)与smad信号通路
TGFβ有β1～β5五个亚型，哺乳动物体内，TGFβ13是主要的三种，其中又以TGFβ1占大多数。smad蛋白家族是把TGFβ与其受体结合后产生的信号从胞质传导到细胞核内的中介分子，各类smad蛋白相互联系制约，并通过不同途径参与TGFβ的信号转导。
TGFβ1可以促进成纤维细胞的迁移、增殖，强烈趋化成纤维细胞和炎性细胞，抑制上皮细胞生长但加速血管形成，可以通过刺激成纤维细胞合成胶原等细胞外基质、抑制基质蛋白酶活性并增强胶原酶抑制剂的表达来调节ECM蛋白的表达，在创面愈合的早期TGFβ1即被释放，伤后5～7d呈现第二个高峰。伤口愈合过程中内源性Smad3的表达、激活与炎症反应的启动、结束及胶原合成密切相关。
糖尿病患者溃疡区TGFβ1正常的伤后上调反应缺失，而TGFβ3却表达上调，可以部分地解释其慢性难愈创面的特点；Chesnoy等［1］通过糖尿病小鼠创面皮内注射质粒DNA来转染TGFβ1基因发现：创面的细胞增殖率和细胞外新生基质的密度、有序性排列比对照组明显提高，且愈合时间可提前约50％。
1．2Ras信号通路
Ras信号通路在糖尿病创面愈合延迟或不愈病理机制中扮演着重要的角色，并逐渐成为研究的热点。Ras信号通路包括如下几部分(1)细胞外生长因子与受体偶联；(2)受体二聚化激活；(3)丝裂原活性蛋白激酶(MAPK)级联反应；(4)核内活化蛋白1(AP1)激活；(5)基因的转录和表达。
信号转导的复杂网络需要传递信号分子精确的时空排列，当脱离原本正常的细胞环境，许多转信号分子就杂乱的相互作用。初步研究认为高糖抑制Ras信号途径受体和其中的关键激酶Ras、Raf的磷酸化活化［2］，信号分子表达异常，细胞周期停滞于G0、G1期，细胞增殖的乏力可能促发凋亡，增生细胞减少，凋亡细胞增多显然会破坏创面愈合，可能是通路失活的主要原因。
1．3Wnt信号通路
Wnt细胞信号转导途径是调控细胞生长、发育和分化的关键途径。在肿瘤的发生、侵袭转移、细胞黏连极性及细胞凋亡等方面成为目前的研究热点。目前已知的Wnt作用机制有两种：规范途径和非规范途径。
规范途径:Wnt与受体卷曲蛋白Frz及低密度脂蛋白相关蛋白LRP5／6结合，胞内散乱蛋白Dsh与Frz胞内区结合后被磷酸化激活，抑制丝／苏氨酸激酶GSK3β活性，使得βcatenin不能被磷酸化，不能被泛素蛋白酶体系统降解。不能降解的βcatenin在胞质内大量积累并进入核内，与转录活化因子TCF／LEF结合，启动下游靶基因的表达。无Wnt信号刺激细胞时酪蛋白激酶I(casinekinase，CKI)将细胞质中βcatenin的Ser45磷酸化，磷酸化后的βcatenin与轴蛋白Axin，GSK3β，结肠腺瘤肉病基因蛋白APC等形成“破坏复合体”，复合体中的GSK3β相继使βcatenin的Ser41，Thr33，Thr37磷酸化而使βcatenin能被泛素连接酶复合体E3的亚单位βTrCP(Btransducinrepeatcontainingproteins)识别，经蛋白酶体途径降解，因而此时细胞内的βcatenin水平较低。
非规范途径：Wnt只与Wnt受体复合物的亚基Frz作用，而不需要LRP5/6，包括Wnt/Ca2+通路和平面细胞极性信号通路。
既往在肿瘤的研究中发现：βcatenin不仅受经典的Wnt信号调控，而且受前列腺素PGE/EP2信号，表皮生长因子EGF/EGFR/PI3K/AKT，以及钙粘蛋白Ecadherin信号调控，这些分子之间有较为复杂的crosstalk系统［3］。而目前的研究发现：高糖通过PI3KAkt信号途径抑制内皮细胞迁移和增殖及血管发生改变，也能引起黏附分子Ecadherin的上调。ChunLiangLin等［3］报道，Wnt/βcatenin信号的上调能提高高糖导致的肾系膜细胞的活性；研究表明：Wnt以及βcatenin表达增强，表皮细胞的增殖、分化和迁移能力增强，且创面愈合加快［4，5］；皮肤角质化细胞wnt信号途径影响创伤后皮肤的厚度及色素沉着［6］；wnt信号途径参与保护高糖导致的血管内皮细胞的损伤［7］。
2血管生成与创面愈合
微循环障碍是糖尿病微血管病变的典型改变之一，内皮细胞结构和功能的完整是稳定微循环的关键。
SchrammJC等［8］发现血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的功能障碍导致血管舒张能力减弱，使糖尿病创面有效血流灌注及物质交换减弱，前列腺素PGE1及高糖参与其中；并且发现伴有代谢综合症发生微血管相关病变的频率明显增高［9］。
在机体发生创伤后，创伤部位的新生血管给创伤部位提供氧、营养物质和生物活性蛋白，局部组织的缺血可直接影响创伤愈合的程度及其预后。它与血管内皮细胞因子（VEGF）、血管形成因子1（Ang1）、碱性成纤维细胞因子（bFGF）等细胞因子密切相关，其中VEGF是一种强效的血管生成促进因子，也是最主要的血管生成因子［10］，还具有维持血管的功能。目前，各种促血管生成因子成为临床治疗糖尿病难愈创面的研究热点。
3创面愈合调控的神经因素
实验研究表明，神经因素亦参与创面愈合调控的过程。正常皮肤中可表达各种类型的神经肽(neuropeptides)，这些神经肽包括P物质(sP)、生长抑素、神经肽Y(NPY)等等，参与皮肤的诸多生理功能(如代谢、免疫等)和病理变化(最重要的即创伤愈合)。
随着神经免疫学的进展，发现神经末梢分泌的感觉神经肽P物质可能是介导机体创伤修复中神经调控的重要物质，是诱导来源于毛囊隆突部和表皮基底层的表皮干细胞（ESCs）向创缘表皮聚集、参与创伤愈合的修复信号因子。ESCs具有强大的多向分化潜能，可以形成皮肤中所有类型的细胞；Bickenbach等［11］应用Brdu／3HTdr双标法标记并连续观察，发现皮肤创伤后，位于毛囊膨大部的ESCs不断增殖并通过不对称分裂分化为TAC（短暂扩充细胞），后者迁移至创缘，促进创面愈合。但促使ESCs迁移、分化的原因还不清楚。糖尿病皮肤创缘sP浓度远低于正常水平［12］，这可能是由于糖尿病末梢神经病变所致。目前研究发现［13］，在糖尿病大鼠背部皮肤创伤模型上观察到外源性sP可以明显加速糖尿病难愈伤口愈合，提高愈合质量，并且观察到其诱导ESCs向创缘迁移，但其具体机制不清。令人感兴趣的是，最近的研究提示Wnt信号通路参与皮肤发育和再生修复过程，并在表皮干细胞增殖［14］分化过程中起重要的调控作用，我们不知道其中是否存在相关性。
另外，在伤口愈合过程中感觉神经肽sP可以促进修复细胞DNA合成以及创面肌成纤维细胞的增生，且能促进肌成纤维细胞增生和新生血管形成，这可能是其促进伤口加速收缩和愈合的机制之一。
因此，神经肽通过启动神经源性炎症反应、诱导趋化ESCs、促进伤口收缩及血管新生，参与糖尿病创面愈合的调控过程。
4糖基化终末产物相关学说
晚期糖基化终末产物(AGEs)一直是近年来糖尿病及其各类并发症的研究热点，在影响创面愈合方面取得了一定的进展。糖尿病患者体内的血糖波动、胰岛素敏感性降低等都可以使非酶促糖基化反应加速、AGEs水平升高，干扰内皮细胞与白细胞间的相互作用，还能使单核巨噬细胞功能受抑，分泌细胞因子的能力下降，且在创面浸润的时间延长［15］；内皮细胞和成纤维细胞都是创面愈合过程中的主要修复细胞，两者膜表面均存在多种AGEs结合蛋白，AGEs还可抑制内皮细胞增殖，并可以诱导其凋亡，而且与作用时间及含量相关［16］；糖基化修饰后的碱性成纤维细胞生长因子促有丝分裂的活性明显降低，而且，AGEs还能抑制成纤维细胞合成胶原的能力［17］。
5细胞凋亡与糖尿病难愈性创面
细胞凋亡存在于创面愈合的每个阶段，随着研究的深入逐渐成为研究的新方向和热点。Bcl2与bax是一对正负凋亡调节基因，前者抑制细胞凋亡，后者不仅本身能诱导细胞的凋亡，而且可以与前者一起调控细胞的凋亡。
糖尿病慢性溃疡创面观察显示，与正常糖尿病患者皮肤相比，溃疡创面凋亡阳性细胞数量均明显增多。在正常细胞到溃疡组织，bcl2含量逐渐下降而bax蛋白的表达呈增高趋势。难愈性创面的迁延不愈不仅仅和bcl基因家族的表达有关［18］，同时还与营养、血供、细胞因子等其他因素有关：糖尿病难愈创面组织中抑癌基因p53的表达增强，下调bcl2基因的表达和上调bax基因的表达，从而增加细胞的凋亡率；糖尿病患者血中氧自由基含量明显增高，使创面组织成纤维细胞bcl2的表达下调［19］；糖尿病难愈创面组织中高血糖可以诱导bax基因的表达增强；AGEs（糖基化终末产物）可引起氧化因素的高表达，从而引起bcl2基因的表达下调，诱发细胞凋亡的发生，创面细胞数目减少，创面难愈［20］；某些细胞因子，如IL2、IL4、IL7等可促进炎症细胞bcl2的表达，TNFα通过抑制bcl2基因的表达，来促进凋亡。
6MMPs家族动态平衡与DM难愈性创面修复
创伤愈合是个复杂而有序的生物学过程，细胞移行、肉芽组织的形成、新生血管化以及基质的重塑均有赖于细胞外基质(extracellularmatrix．ECM)的可控性代谢。ECM的过度沉积或降解将致创面修复异常。
基质金属蛋白酶(matrixmetaltoproteinases，MMPs)是一类具有共同生化性质的可降解ECM的锌依赖性肽链内切酶，是参与ECM降解的主要蛋白酶之一。MMPs可由皮肤的多种细胞如成纤维细胞，角化细胞，巨噬细胞，内皮细胞，肥大细胞，嗜酸性细胞在特殊信号如细胞因子【肿瘤坏死因子(TNFα)，白细胞介素1β(IL1β)，IL6等】的刺激下产生。按照作用底物可以分为胶原酶，明胶酶，间质溶素，膜型MMP等。蛋白酶的激活的调控有几种机制，包括转录水平，酶原激活和金属蛋白酶组织抑制物(tissueinhibitorsofmetalloproteases，TIMPs)的调控。
慢性溃疡的活检和伤口渗液显示高浓度的前炎症因子、MMPs和低浓度的生长因子，而可愈性伤口则表现为低浓度的前炎症因子，MMPs和高浓度的生长因子［21］。在糖尿病大鼠模型的实验中，未受损皮肤即存在菲薄的连接组织的破坏。而Wall等［22］对糖尿病患者未受损皮肤的观察也提示糖尿病未受损真皮成纤维细胞中MMP-2，MMP-3增高。在糖尿病难愈性创面中还出现MMP1，MMP2，MMP13水平增高的现象［23］，这可能是由于在角质细胞增殖中的MMP1的表达有助于重新上皮形成，而在愈合后期，MMP1在上皮中的过表达阻碍了基膜形成和肉芽组织形成，影响了组织重塑。在Lobmann等［23］的研究中，糖尿病难愈性创面组织中TIMP2蛋白低于对照组3倍，但由于TIMP与年龄相关，故认为MMP／TIMP的比例对反映伤口愈合情况更重要。
目前，对于糖尿病难愈性创面与MMPs关系研究的报道尚少见。MMPs在糖尿病患者创伤前后皮肤组织中时空表达异常以及MMPs／TIMP失衡可能是糖尿病创面愈合延迟的重要机制之一。
7小结与展望
随着分子生物学、免疫学和遗传学等实验技术手段的不断提高与成熟，影响创面愈合的因素正逐个被发现。这些领域的研究进展为治疗糖尿病难愈性创面提供了更广阔的思路和方式，我们可以期待在不久的将来，临床糖尿病难愈性创面的治疗必将会翻开新的一页，取得更大的进步。
【参考文献】
［1］ChesnoyS，LeePY，HuangL．Intradermalinjectionoftransforminggrowthfactor-betalgeneenhanceswoundhealingingeneticallydiabeticmice［J］．PharmRes，2003，20(3)：345～350．
［2］WertheimerE，SpravchikovN，TrebiczM，eta1．TheregulatlonofskinproliferationanddifferentiationintheIRnullmouse:implicationsforskincomplicationsofdiabetes［J］．Endocrinology，2001，142(3)：1234～1241.
［3］Chun-LiangLin,Jeng-YiWang,Yu-TingHuang,etal.Wnt/beta-CateninSignalingModulatesSurvivalofHighGlucose–StressedMesangialCells［J］.JAmSocNephrol,2006，17（10）：2812～2820.
［4］FathkeC,WilsonL,ShahK,KimB,HockingA,MoonR,IsikF.Wntsignalinginducesepithelialdifferentiationduringcutaneouswoundhealing［J］.BMCCellBiol，2006，7(4)：1～9.
［5］CheonSS,WeiQ,GurungA,YounA,BrightT,PoonR,WhetstoneH,GuhaA,AlmanBABeta-cateninregulateswoundsizeandmediatestheeffectofTGF-betaincutaneoushealing［J］.FASEBJ，2006，20(6):692～701.
［6］YamaguchiY,PasseronT,HoashiT,etal.Dickkopf1(DKK1)regulatesskinpigmentationandthicknessbyaffectingWnt/beta-cateninsignalinginkeratinocytes［J］.FASEBJ，2008，22(4):1009～1020.
［7］ChongZZ，ShangYC，MaieseK.VascularinjuryduringelevatedglucosecanbemitigatedbyerythropoietinandWntsignaling［J］.CurrNeurovascRes，2007，4(3):194～204.
［8］SchrammJC，DinhT，VevesA．Microvascularchangesinthediabeticfoot［J］．Theinternationaljournaloflowerextremitywounds，2006，5(3)：149～159.
［9］Abdul-GhaniM，NawafG，NawafF，ItzhakB，MinuchinO，VardiP．Increasedprevalenceofmicrovascularcomplicationsintype2diabetespatientswiththemetabolicsyndrome［J］．IsrMedAssocJ，2006，8(6)：378～382.
［10］?ZhangF，LeiMP，OswaldTM，eta1．Theeffectofvascularendothelialgrowthfactoronthehea1ingofischaemicskinwounds［J］．BrJPlastSurg，2003,56(4)：334～341.
［11］?BickenbachJR，GrinnelKL．Epidermalstemcells：interactionsindevelopmentalenvironments［J］．Diferentiation，2004，72(8)：371～380．
［12］?GibranNS，JangYC，IsikFF，eta1．Diminishedneuropeptidelevelscontributetotheimpairedcutaneoushealingresponseassociatedwithdiabetesmellitus［J］．JSurgRes，2002，108(1)：122～128.
［13］刘育杰，赖西南，王正国，等.P物质对糖尿病鼠难愈创面修复的影响及其机制的初步研究［J］.中华创伤杂志，2007，23(12)：941～944.
［14］BienzM，Beta-catenin：apivotbetweencelladhesionandWntsignalling［J］．CurrBiol，2005，15(2)：64～67.
［15］LinWD，LuSL，QingC，eta1．Therelationshipofdiabeticnon-healingwoundandAGEs［J］．ChinJClinRehab，2003，7(17)：2491～2493．
［16］LinWD，LuSL，QingC，eta1．TheinhibitioneffectofAGEsonhumanbloodvesselendothelialcells［J］．NatlMedJChina，2003，83(7)：572～576．
［17］DuraisamyY，SlevinM，SmithN，eta1．Effectofglycationonbasicfibroblastgrowthfactorinducedangiogenesisandactivationofassociatedsignaltransductionpathwaysinvascularendothelialcells：possiblerelevancetowoundhealingindiabetes［J］．Angiogenesis，2001，4(4)：277～288．
［18］GalkowskaH，OlszewskiWL，WojewodzkaU．eta1．Expressionofapoptosisandcellcycle-relatedproteinsinepidermisofvenousleganddiabeticfootulcers［J］．Surgery(StLouis)，2003，134(2)：213～220．
［19］李爱冬，张晓，羊惠君，等．糖尿病大鼠视网膜血管内皮细胞p53、bc12及生长因子的表达与细胞周期阻滞［J］．中华眼底病杂志，2003，19(1)：29～33．
［20］?林炜栋，陆树良，青春，等．晚期糖基化终产物修饰人血清白蛋白对人血管内皮细胞的生长抑制作用［J］．中华医学杂志，2003，83(7)：572～576．
［21］?DasuMR，BarrowRE，SpiesM．eta1．Matrixmetalloproteinaseexpressionincytokinestimulatedhumandermalfibroblasts［J］．Burns，2003，29(6)：527～531.
关键词：牦牛肉；成熟；钙激活酶；嫩度
中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）06-0001-04
肉的嫩度是所有肉品质中最重要的指标之一，它将决定肉是否被重复购买[1-2]。成熟是改善肉嫩度的有效方法之一。肉的最终嫩度取决于由内源蛋白酶引起的肌原纤维结构改变和弱化的程度，这些内源蛋白酶包括钙激活酶、组织蛋白酶、细胞凋亡酶、蛋白酶体等[3]。目前，普遍认为，钙激活酶在肉的嫩化中起着重要的作用[4]。骨骼肌中的钙蛋白酶包括钙蛋白酶1（μ-calpain）、钙蛋白酶2（m-calpain）、钙蛋白酶3（p94）以及钙激活酶的内源性的专一抑制蛋白（calpastatin）[5]。
李诚等[6]研究表明，杜长大三元杂交猪的背最长肌（longissimus dorsi，LDM）、腰大肌（psoas major，PM）两种不同部位猪肉在宰后0～4℃冷却成熟过程中钙蛋白酶粗酶液活性、肌原纤维小片化指数（myofibril fragmentation index，MFI）和剪切力之间呈现较高的相关性。田甲春等[7]研究发现，青海牦牛肉成熟过程中MFI 和钙激活酶活性相关性极显著，与组织蛋白酶L活性相关性显著，钙激活酶活性与组织蛋白酶L活性呈显著负相关。郭兆斌等[8]研究了甘南牦牛肉成熟过程中食用品质、钙激活酶粗酶活性、肌原纤维超微结构的变化规律。关于宰后牦牛肉成熟过程中μ-calpain、m-calpain及calpastatin的变化报道极少，特别是甘南牦牛肉成熟过程中μ-calpain，m-calpain及calpastatin的变化及其与嫩度指标的相关性未见报道。本实验旨在研究甘南牦牛肉宰后成熟过程中μ-calpain、m-calpain及calpastatin的变化及其与嫩度指标的相关性，以便为构建牦牛肉嫩度的预测模型提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
随机选取甘南藏族自治州夏河县，自然放牧条件下，发育正常健康无病、年龄3岁左右的黑牦牛12头，进行屠宰，宰后牦牛的背最长肌立即被移除，分割成平均质量为50g的样品，带回实验室，在0～4℃的条件下成熟0、1、3、5、7、8d，不同成熟时间点收集的样品，一部分在-80℃的条件下冷冻用于测定钙激活酶的活性，另一部分测定剪切力、肌原纤维小片化指数及肌纤维直径。酪蛋白、Tris、MCE、亮肽素、PMSF、卵类黏蛋白抑制剂、EDTA均购自Sigma公司。
1.2 仪器与设备
C-LM型数显式肌肉嫩度仪 北京阳光亿事达贸易有限公司；PPS-2蛋白纯化系统 上海金达生化仪器公司；XSP-8CA显微镜 上海光学仪器一厂。
1.3 方法
1.3.1 肌原纤维小片化指数测定
参考Kriese等[9]的方法进行测定。
1.3.2 剪切力测定
沿着肌纤维方向取厚度3cm的肉样，在80℃水浴锅中恒温加热至肉样中心温度达75℃，取出冷却至室温后，用直径1.27cm的取样器沿肌纤维方向钻取3个肉柱测定样，用嫩度仪测定剪切力值，剪切力值以N表示。每个肉样平行测定3次，取平均值。
1.3.3 肌纤维直径测定
参考等[10]的方法，取背最长肌的中央部位 3cm×2cm×1cm肉块3块，浸泡到1：10（V/V）甲醛溶液中，然后在10×40倍显微镜下随机计数200根肌纤维直径，求其平均值。
1.3.4 钙激活酶活性的测定
1.3.4.1 酶的分离与纯化
参考Delgado等[11]的方法并稍做改动。取宰后不同时间点的牦牛肉样品，准确记录其质量，绞碎后于4℃匀浆，加入150mL抽提液（pH8.3、100mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，10mmol/L β-巯基乙醇（MCE），100mg/L 卵类黏蛋白抑制剂，2mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF），5mg/L亮抑酶肽），以匀浆3min，间隔3min模式运行，共5次。然后离心（4℃，18000×g，120min），去沉淀，取上清，并以0.45μm针式滤膜过滤。对过滤后的上清取（NH4）2SO4分级沉淀部分，用25mL匀浆缓冲液溶解沉淀部分并用25倍体积的透析液（4℃，40mmol/L Tris-HCl，pH7.35；5mmol/L EDTA；10mmol/L MCE）进行透析。透析后的溶液离心（4℃，18000×g，60min）取上清，并以0.45μm针式滤膜过滤后上柱。
DEAE-Sephacel离子交换柱（1.6cm×20cm），首先用平衡缓冲液（TEMA）（4℃，50mmol/L Tris-HCl，pH7.5；0.5mmol/L EDTA；10mmol/L MCE）进行平衡，用TEMA将杂蛋白洗脱至基线，目标蛋白用0400mmol/L NaCl的TEMA溶液进行线性梯度洗脱，流速0.5mL/min，每管3mL被收集，calpastatin在20～110mmol/L NaCl浓度的范围被洗脱下来，μ-calpain在110～165mmol/L NaCl浓度的范围被洗脱下来，m-calpain在220～330mmol/L NaCl浓度的范围被洗脱下来。
1.3.4.2 钙激活酶活性测定
参考Morton等[12]的方法。
1.4 数据处理与统计分析
用SPSS16.0对数据进行方差分析，并用Duncan 法进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 宰后牦牛肉成熟过程中钙激活酶活性的变化
由表1可知，在宰后牦牛肉成熟过程中，μ-calpain的活性在宰后5d之内显著降低，5d后，μ-calpain活性变化不显著，m-calpain的活性在宰后1d之内稍有降低，之后，变化不显著，calpastatin的活性在宰后3d内差异不显著，3d之后活性不断降低。3种酶在宰后成熟过程中的变化趋势与Delgado等[11]的报道基本一致。
μ-calpain与m-calpain需要足够的钙离子才能激活，激活后酶将遭受自溶，μ-calpain的自溶导致了酶的不稳定，最终导致了活力的丧失[13]。calpastatin活力的降低是由于钙激活酶抑制蛋白多肽的降解造成的[14]。
2.2 宰后牦牛肉成熟过程中嫩度指标的变化
2.2.1 剪切力值的变化
肉的嫩度又称为肉的柔软性，指肉在食用时口感的老嫩，反映了肉的质地。它在本质上取决于肌纤维直径、肌纤维密度、肌纤维类型、肌纤维完整性、肌内脂肪含量、结缔组织含量及类型等[15]。肉嫩度评定最常用的方法是用嫩度仪测定剪切力，剪切力值越低，肌肉越嫩。图1反映宰后牦牛肉在成熟8d的过程中剪切力值的变化，在宰后0～3d内，剪切力值显著升高，在3～5d内，剪切力值显著降低，7d后变化不显著。最初剪切力值的逐渐增加是肌肉僵直的典型特征，随后剪切力值的逐渐变小是逐渐成熟的过程[16]。
2.2.2 肌原纤维小片化指数
肌原纤维小片化指数是反映肌原纤维蛋白降解程度的有用标志，MFI值越大表明降解的越多，肉会变得越嫩[17]。从图2可以看出，肌原纤维小片化指数呈现显著增加的趋势，在前3d增加的速度较快，3d后增加的速度有所降低，成熟5d后不再发生显著变化。牦牛肉成熟过程中肌原纤维小片化指数的变化趋势与Watanabe等[18]的研究结果相一致。
2.2.3 肌纤维直径
图3反映了宰后牦牛肉成熟过程中，肌纤维直径的变化，在宰后0d时，肌纤维直径为48.23μm，随着成熟时间的延长，不断降低，前3d变化不显著，后5d明显降低，但是第7天与第8天差异不显著。
肌纤维直径是决定肉嫩度的重要因素，肌纤维越细，肌纤维密度越大，系水力越强，表现为肉质细嫩，在成熟过程中，由于肌纤维与肌内膜发生分离及汁液的流失，导致肌纤维直径下降[19]。
2.3 钙激活酶与嫩度指标的相关性
表2反映了宰后牦牛肉成熟过程中，μ-calpain、m-calpain、calpastatin 3种钙激活酶与剪切力、肌纤维直径、MFI 3个嫩度指标之间的相关性。从表2可以看出，μ-calpain、m-calpain、calpastatin与剪切力值、MFI均呈正相关性，但是，相关性不显著；3种酶均与肌原纤维小片化指数呈负相关，其中，μ-calpain与calpastatin呈显著负相关（P
3 结 论
3.1 宰后牦牛肉成熟过程中，μ-calpain与calpastatin的活力显著降低，m-calpain活力稍有降低；剪切力值先增大后减小，肌原纤维直径显著降低，MFI显著增加。
3.2 μ-calpain、m-calpain、calpastatin 3种酶与剪切力值及肌纤维直径均呈正相关，与肌原纤维小片化指数呈负相关，其中，μ-calpain与calpastatin呈显著负相关。因此，钙激活酶活力的变化可能导致了肌原纤维小片化指数的增加，肌原纤维的弱化和肉的嫩化，μ-calpain可能是牦牛肉嫩化的主要贡献者。
参考文献：
[1] MILLER M F， CARRM A， RAMSEY C B， et al. Consumer thresholds for establishing the value of beef tenderness[J]. Journal Animal Science， 2001， 79（12）： 3062-3068.
[2] MORGAN J B， SAVELL J W， HALE D S， et al. National beef tenderness survey[J]. Journal Animal Science， 1991， 69（8）： 3274-283.
[3] KEMP C M， SENSKY P L， BARDSLEY R G， et al. Tenderness-An enzymatic view[J]. Meat Science， 2010， 84（2）： 248-256.
[4] KOOHMARAIE M， GEESINK G H. Contribution of postmortem muscle biochemistry to the delivery of consistent meat quality with particular focus on the calpain system[J]. Meat Science， 2006， 74（1）： 34-43.
[5] WENDT A， THOMPSON V F， GOLL D E. Interaction of calpastatin with calpain： A review[J]. Biological Chemistry， 2004， 385（6）： 465-472.
[6] 李诚， 谢婷， 付刚， 等. 猪肉宰后冷却成熟过程中嫩度指标的相关性研究[J]. 食品科学， 2009， 30（17）： 163-166.
[7] 田甲春， 韩玲， 刘昕， 等. 牦牛肉宰后成熟机理与肉用品质研究[J]. 2012， 43（12）： 146-150.
[8] 郭兆斌， 韩玲， 余群力. 牦牛肉成熟过程中肉用品质及结构变化特点[J]. 肉类研究， 2012， 26（2）： 8-11.
[9] KRIESE P R， SOARES A L， GUARNIERI P D， et al. Biochemical and sensorial evaluation of intact and boned broiler breast meat tenderness during ageing[J]. Food Chemistry， 2007， 104（4）： 1618-1621.
[10] ， 王存堂， 韩玲， 等. 甘南牦牛肉质特性和营养成分分析[J]. 食品科学，2010， 31（2）： 414-416.
[11] DELGADO E F， GEESINK G H， MARCHELLO J A， et al. The calpain system in three muscles of normal and callipyge sheep[J]. Journal Animal Science， 2001， 79（2）： 398-412.
[12] MORTON J D， BICKERSTAFFE R， KENT M P， et al. Calpain-calpastatin and toughness in M. longissimus from electrically stimulated lamb and beef carcasses[J]. Meat Science， 1999， 52（1）： 71-79.
[13] GOLL D E， THOMPSON V F， LI H， et al. The calpain system[J]. Physiological Reviews， 2003， 83（3）： 731-801.
[14] KOOHMARAIE M， SEIDEMAN S C， SCHOLLMEYER J E， et al. Effect of postmortem storage on Ca2+-dependent proteases， their inhibitor and myofibril fragmentation[J]. Meat Science， 1987， 19（3）： 187-196.
[15] 周光宏. 肉品加工学[M]. 北京： 中国农业出版社， 2008.
[16] THOMAS A R， GONDOZA H， HOFFMAN L C， et al. The roles of the proteasome， and cathepsins B， L， H and D， in ostrich meat tenderization[J]. Meat Science， 2004， 67（1）： 113-120.
[17] OLSON D G， PARRISH F C， STROMER M H. Myofibril fragmentation and shear resistance of three bovine muscles during post-mortem storage[J]. Journal of Food Science， 1976， 41（5）： 1036-1041
【摘要】 ：目的 研究中医肝阳化风证和血虚生风证帕金森病患者和正常人外周血单个核细胞(PBMC)的比较蛋白质组差异。从蛋白表达水平上探讨中医肝阳化风证和血虚生风证的本质。方法 用固相pH梯度双向凝胶电泳分离肝阳化风证和血虚生风证帕金森病患者和正常人PBMC总蛋白质，考马斯亮蓝染色，PDQuest 2-DE软件分析，对部分差异蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定其胶内酶解后的肽质指纹图谱，用Mascot查询系统查询SWISS-PROT数据库。结果 获得了分辨率和重复性均较好的双向电泳考染图谱，对其中的15个差异蛋白质点分别进行肽质指纹分析，经数据库查询，初步鉴定为一些与细胞骨架、抗氧化应激、蛋白降解、信号转导、细胞周期调控等有关的蛋白质。结论 建立了帕金森病肝阳化风证和血虚生风证PBMC的双向凝胶电泳图谱，提示帕金森病肝阳化风证和血虚生风证患者和正常人的PBMC的蛋白质表达具有差异，这种蛋白质组的差异分析有助于为研究肝阳化风证和血虚生风证本质在蛋白质水平上提供物质基础。
【关键词】 肝阳化风 血虚生风 帕金森病 单个核细胞 双向凝胶电泳 质谱
Abstract：Objective To investigate the comparative proteomes difference of PBMC between health adults and Parkinson Disease (PD) patients with Ganyang Huafeng syndrome and Xuexu Shengfeng syndrome. So to approach the essence of the two TCM syndromes from the protein expression level. Methods A series of methods， including immobilolized pH gradient two-dimensional polyacrylamide gel electrophpresis (2-DE)， Coomassie Brilliant Blue staining， PDQuest 2-DE analysis software， peptide massfingerprint based on matrix-assisted laser desorption/ionization time of flying mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) and SWISS-PROT database searching， were used to separate and indentify the proteome of PBMC between health adults and PD patients with Ganyang Huafeng syndrome and Xuexu Shengfeng syndrome. Results The good 2-DE pattern including resolution and reproducibility was obtained. After Coomassie Brilliant Blue staining， 15 spots were incised and analyzed by MALDI-TOF-MS. The typic peptide masses were searched in the SWISS-PROT database by Mascot software. All proteins were preliminarily identified， which ralated to cytoskeleton， anti-oxidative stress， protein degradation， signal transduction and cell cycle， etc. Conclusions The well-resolved， reproducible 2-DE patterns of Ganyang Huafeng syndrome and Xuexu Shengfeng syndrome PD were established and revealed the protein expression difference of PBMC between the two syndromes of PD patients. This research is helpful to provide substance evidence in investigation of the essence of Ganyang Huafeng syndrome and Xuexu Shengfeng syndrome on protein level.
Key words：Ganyang Huafeng syndrome；Xuexu Shengfeng syndrome；Parkinson Disease；PBMC；two-dimensional polyacrylamide gel electrophpresis (2-DE)；mass spectrometry
帕金森病(Parkinson Disease，PD)是中老年常见的第二大神经系统变性疾病，属于中医学“震掉”、“颤振”，甚至“痉病”和“肝风”的范畴，以黑质多巴胺(DA)能神经元变性缺失和路易小体(Lewy body)形成为特征。多数中医学者认为，本病以肝肾不足为本，正虚邪恋，虚实互见，总属本虚标实，病因繁多，病机复杂，是一个多病因、多病机参与的难治病。1991年11月，第三届中华全国中医学会老年脑病学术研讨会通过了《中医老年颤证诊断和疗效评定标准试行草案》(以下简称《草案》)，将老年颤证分为痰热动风、血瘀生风、气血两虚、肝肾不足、阴阳两虚五个证型，为PD的辨证分型提供了有益的借鉴。临床报道中有一些医生在《草案》的基础上又有诸多分型，如血虚生风、肝阳化风等，并依据中医辨证论治的原则，在实践中筛选出许多有效治疗方法和方药[1]。综观多年来中医药治疗PD的医学实践，其疗效是确切的，但也应看到仍存在诸多问题尚待解决。尤其是分型较多，且辨证分型过分强调证与证之间的区别，割裂了证与证之间的联系。
本实验利用双向凝胶电泳技术对PD肝阳化风证和血虚生风证患者和正常人外周血单个核细胞(PBMC)进行比较蛋白质组学研究，获得了较满意的双向电泳(2-DE)图谱，并用PDQuest分析软件对2-DE图谱进行了分析，差异蛋白质点经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定肽质指纹图谱，为进一步研究PD及其辨证提供了实验基础。
1 对象
PD病例选择均符合英国帕金森病脑库临床诊断标准[2]，中医肝阳化风及血虚生风辨证标准参照《中医肝脏象现代研究与临床》中有关标准[3]。30例PD患者均来自2006年3月－2006年7月中南大学湘雅医院神经内科门诊患者。其中肝阳化风证17例，男10例，女7例，年龄36～69岁，平均(56.71±10.93)岁；血虚生风证13例，男7例，女6例，年龄50～65岁，平均(59.23±4.80)岁。正常健康志愿者(对照组)10例，来自同期中南大学湘雅医院健康体检中心，男女各5例，年龄49～65岁，平均(57.30±5.85)岁。各组年龄分布上无差异(P＝0.699)。均排除心、肝、肾等功能不全者，有活动性胃肠病变者，血液及内分泌系统疾病者，过敏体质者，孕期或哺乳期妇女。入选对象均签署知情同意书。患者及正常组每人均抽取10 mL外周静脉血，PBMC的分离参照经典的葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法制备[4]。
2 方法
2.1 固相pH梯度双向凝胶电泳
2.1.1 细胞总蛋白质的制备
参照湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组重点实验室推荐程序制备。每EP管标本(约40～50 mg PBMC)放细胞裂解液50 μL，反复振荡令其充分溶解(10 s/次×8次)，每次间隔10 min，离心(7 500 g×1 h，4 ℃)，吸取上清液即为细胞总蛋白质。取5 μL分装，1.5～2 h后按BCA蛋白质定量试剂盒的微量测试法测定总蛋白质浓度。
2.1.2 双向电泳
主要参照Amersham公司二维凝胶电泳手册进行。IPGpH3-10NL，24 cm，采用胶内泡涨法。将含有1 mg蛋白质的各组蛋白提取液分别与IPG胶条水化液混合，进行一向等电聚焦电泳。电泳参数：30 V 13 h(水化)，依次经100 V 0.5 h、500 V 0.5 h、1 000 V 1 h、5 000 V 1 h、8 000 V >8 h(8.5 h，68 000 Vh)。等电聚焦结束后，将IPG胶条分别在含有DTT和碘乙酰胺的平衡液中各平衡15 min。将平衡后IPG的胶条移至12.5%的SDS凝胶上端，进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳条件：每胶2.5 W/T1恒流电泳30 min后，每胶12 W/T2恒流电泳至溴酚蓝离胶最底缘约1 mm处停止电泳。将凝胶置考马斯亮蓝染色液(G250＋磷酸＋硫酸铵＋甲醇＋DDH2O)中12 h后弃去考染液，双蒸水洗涤2次后，用20%乙醇摇床洗涤脱色至背景清晰后扫描。
2.2 凝胶图像分析
Imagescanner扫描仪扫描考染的凝胶获取图像，用PDQuest 2-DE分析软件进行图像分析。为消除误差，将同组的三张2-DE凝胶拟合成为一张平均胶，然后进行组间比较。以正常组2-DE凝胶为参考胶，PD肝阳化风组和PD血虚生风组与之相互匹配比较，寻找差异蛋白点。
2.3 差异蛋白质点的肽质指纹分析
切下凝胶差异蛋白点，脱色，胶内酶切，检测肽质指纹图(PMF)。Mascot Distiller软件检索SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质。
3 结果
3.1 差异蛋白质点的MALDI-TOF-MS肽质指纹分析
选取上述15个差异表达蛋白质点经质谱分析得到PMF图谱后，查询SWISS-PROT数据库，全部得到鉴定，共14种非冗余蛋白质，其功能主要与细胞骨架、抗氧化应激、蛋白降解、信号转导、细胞周期调控等有关，具体蛋白及其在各组的变化趋势见表1。表1 正常人及PD肝阳化风证、血虚生风证患者PBMC差异蛋白质鉴定（略）注：蛋白点的变化趋势均以正常组为参照，同一蛋白在不同组的胶图上进行比较，其中代表较正常组下调50%；代表下调75%以上，表示下调90%以上
3.2 双向凝胶电泳考染图谱及差异分析
在相同条件下对来自帕金森病和正常PBMC的总蛋白质样品分别进行了3次双向电泳(n＝3)。其总蛋白质的分布模式非常相似，以pI 4～8和Mr 20～60 kD范围的蛋白质斑点分布最多。经Imagescanner图像采集和PDQuest 2-DE分析软件分析，在相同条件下识别的图像分析探测到正常组PBMC的平均蛋白质点数为(700±30)个，肝阳化风证(602±15)个，血虚生风证(577±28)个，以正常组胶为参考胶进行胶间斑点匹配，其平均匹配点数肝阳化风证组为(552±16)个，平均匹配率为78.8%，血虚生风证组为(494±25)个，平均匹配率为70.6%。不同胶间蛋白质点的位置偏差在IEF方向为(2.85±0.48)mm，在SDS-PAGE方向为(2.69±0.37)mm。以上条件能满足两细胞间的差异蛋白质分析。采用PDQuest软件建立同组内3张2-DE凝胶的平均胶，即计算同组内所有凝胶上的同一蛋白质点的平均表达量，某个蛋白质点的表达量是其在胶上的灰度体积(面积×灰度)。比较3组平均胶的差异(均数进行成组比较的t检验，P
4 讨论
自Abramsky等于1978年提出免疫学异常可能是PD发病的重要影响因素之一以来[5]，近年来越来越多的研究表明，PD中枢神经变性及黑质，纹状体损伤均与细胞免疫介导的炎症反应密切相关[6-10]。本实验发现PD肝阳化风证和血虚生风证PBMC的蛋白质总数和一系列蛋白质发生下调，相关功能发生减弱。
4.1 细胞骨架相关蛋白
本实验发现，3个细胞骨架相关蛋白Talin-1、Rho GDP解离抑制因子2、CAP-1在PD肝阳化风证和血虚生风证中均有下调，而且血虚生风证下降更为明显。Talin-1作为肌动蛋白结合蛋白，调节微丝的聚合与解聚。Rho GDP解离抑制因子2则为Rho GDI家族成员，通过结合大量的Rho GTP酶从而调节应力纤维和粘着斑的形成。而基于CAP-1的肌动蛋白丝循环是细胞运动性的主要驱动力[11]，对于细胞的发育及形态学过程，运动、内吞及囊泡运输发挥重要作用[12]。此结果提示，在PD病理过程中发生了单个核细胞的激活以及其阿米巴运动和吞噬运动的减弱。而在PD血虚生风证中这种减弱较PD肝阳化风证更为显著。
4.2 泛素蛋白酶系
泛素蛋白酶体系统(UPS)是体内蛋白降解的重要通路。许多研究表明，PD以及其他神经变性疾病可能是一类蛋白降解障碍疾病。F-box protein 4是SCF型E3泛素连接酶复合物底物识别组件，介导蛋白质降解，从而影响如细胞周期、信号传导和基因表达等一系列功能。本实验发现，PD患者PBMC中F-box protein 4下调，血虚生风证较肝阳化风证进一步下调。推测肝阳化风证与血虚生风证与泛素蛋白酶体系统(UPS)功能障碍存在联系。
4.3 抗氧化应激酶系
氧化应激学说认为，多巴胺氧化代谢产物造成的胞内氧化压力过盛和细胞抗氧化能力不足是PD黑质多巴胺能神经元自发退变的主要原因。硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶(Peroxiredoxin Ⅲ，PrxⅢ)属于抗氧化蛋白Peroxiredoxin超家族，该蛋白定位于线粒体，调节细胞氧化还原，通过分生基团保护敏感酶避免氧化损伤。本实验发现，PrxⅢ在PD肝阳化风证和血虚生风证PBMC中依次表达下调，揭示肝阳化风证和血虚生风证与PrxⅢ下降导致的氧化应激功能减弱有关。
4.4 信号转导相关蛋白
不均一核糖核酸蛋白K(hnRNP-K)是一种核酸结合蛋白，能够结合细胞核及线粒体的前信使RNA及单链DNA，作为一个转录因子在信号转导、转录调节及细胞周期调节发挥作用，并影响线粒体的基因表达及功能。
Transgelin-2属于钙结合蛋白家族，以前仅在平滑肌细胞中研究较多，在淋巴细胞中很少报道。最近，Rubén Francés等发现，在腹膜B1细胞和被刺激的脾脏B2细胞中表达，并推测其作用机制为通过限制肌动蛋白的解聚作用从而调整BCR信号传导来激活该类细胞[13]。我们研究发现，hnRNP-K和Transgelin-2在PD肝阳化风证和血虚生风证PBMC中表达下调，血虚生风证中下降更为明显，提示在肝阳化风和血虚生风证中发生了细胞信号转导障碍。
4.5 Ras相关蛋白
另外，本实验发现，Rap1b蛋白和Ras抑制蛋白1(Rsu-1)两种Ras相关蛋白在PD肝阳化风证和血虚生风证中表达相继下降，Rap1b蛋白定位于细胞膜、脂锚、细胞质侧，是RAP1的主要异构体[14]。很多研究表明，Rap信号能够调整多种细胞过程包括细胞分化和粘附。而Ras抑制蛋白1(Rsu-1)在真核生物中的各种细胞和组织中广泛存在，作用于Ras 信号传导途径。Masuelli L等[15]研究提示，Rsu-1能够通过Ras途径激活神经生长因子，加速细胞分化。两种Ras相关蛋白在PD肝阳化风证和血虚生风证PBMC中表达相继下调，表明两证的发生与Ras相关的细胞分化障碍有关。
4.6 多功能蛋白酶
磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(PEBP-1)是一种高度保守的丝氨酸蛋白酶抑制剂，在各种组织特别是神经组织中广泛存在。有学者发现，hPEBP家族中的hPEBP4通过抑制MAPK途径的活化[16]及磷脂酰乙醇胺的分泌从而对抗TNF-α诱导的细胞凋亡[17]。PEBP的N端片断能够转化为海马胆碱能神经刺激肽HCNP，可能涉及到中枢海马区的发育成熟和中枢神经系统的突触前胆碱能神经元的功能[18]。Cyclophilin A是一种普遍存在且含量丰富的胞溶质蛋白，系免疫抑制剂环胞霉素A的作用靶，具有肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶(PPIase)活性，保证蛋白质的正确的空间折叠。一直以来，人们对于PPIase的研究主要集中在其介导的免疫抑制作用。但Gold[19]发现，同样具有PPIase活性的FKBP12在神经系统中的含量比在免疫系统中要高出50倍以上，其介导的FK506在体内外均可以促进神经再生。另有学者认为，Cyclophilin A是一种氧化应激诱导分泌的生长因子[20]。本实验发现，PD患者PBMC中PEBP-1和Cyclophilin A这两种抗凋亡和促进细胞生长的蛋白表达下降与帕金森病的神经退行性变是否存在联系值得进一步的探讨，对肝阳化风证和血虚生风证的本质有提示作用。
综上所述，PD肝阳化风证和血虚生风证PBMC中蛋白质数目下降和相关蛋白表达的改变导致PBMC的阿米巴运动和吞噬运动、抗氧化应激、蛋白降解、信号转导、生长分化、抗凋亡等功能均发生了不同程度的减弱，且PD血虚生风证下降较肝阳化风证更为显著。中医理论认为，肝阳化风和血虚生风同属肝风内动，其根本病机为肝肾阴虚，阴不制阳则阳亢化风，久病也可由肝血亏虚而诱发肝风内动，两者之别在于肝阳化风证为虚中夹实，血虚生风证则为虚中之虚。结合本实验，我们认为，肝肾阴虚肝风内动则PBMC相关功能发生减弱，肝阳化风证虚中挟实，PBMC功能减弱并不显著，机体尚能调节自身正气；久病机体正气愈伤，生血虚生风证为虚中之虚，PBMC功能进一步减退。研究结果在蛋白质水平上支持两证上述中医理论，为两者病机的联系及区别提供了物质基础。
【参考文献】
[1] 黄俊山.震颤麻痹辨证体会[J].实用中西医结合杂志，1996，9(1)：8.
[2] Hughes AJ， Daniel SE， Kilford L， et al. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson’s disease：a clinicopathological study of 100 cases[J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry，1992，55：181－184.
[3] 金益强.中医肝脏象现代研究与临床[M].北京：人民卫生出版社，2000. 235－240.
[4] 陈肃标，谢素和，曾庆馀.提高外周血淋巴细胞梯度离心分离率[J].汕头大学医学院学报，2001，14(2)：135－137.
[5] Abramsky O， Litvin Y. Automimmune response to dopamine-receptor as a possible mechanism in the pathogenesis of Parkinson’s disease and schizophenia[J]. Perspect Biol Med， 1978，22(1)：104－114.
[6] Bessler H， Djaldetti R， Salman H， et al. IL-1 beta， IL-2， IL-6 and TNF-alpha production by peripheral blood mononuclear cells from patients with Parkinson’s disease[J]. Biomed Pharmacother， 1999，53(3)：141－145.
[7] Josefsson E， Bergquist J， Ekman R， et al. Catecholamines are synthesized by mouse lymphocytes and regulate function of these cells by induction of apoptosis[J]. Immunology，1996，88(1)：140－146.
[8] Bieganowska K， Czonkowska A， Korlak J. Pargyline pretreatment prevents immunological changes induced by MPTP in mice[J]. Immunopharmacology，1996，35(2)：149－154.
[9] Kurkowska-Jastrzebska I， Wrońska A， Kohutnicka M， et al. The inflammatory reaction following 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6- tetrahydropyridine intoxication in mouse[J]. Exp Neurol，1999， 156(1)：50－61.
[10] O’Callaghan JP， Miller DB， Reinhard JF. Characterization of the origins of astrocyte response to injury using the dopaminergic neurotoxicant， 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine[J]. Brain Res，1990，521(1-2)：73－80.
[11] Moriyama K， Yahara I. Human CAP1 is a key factor in the recycling of cofilin and actin for rapid actin turnover[J]. J Cell Sci，2002， 115(Pt 8)：1591－1601.
[12] Bertling E， Hotulainen P， Mattila PK， et al. Cyclase-associated protein 1 (CAP1) promotes cofilin-induced actin dynamics in mammalian nonmuscle cells[J]. Mol Biol Cell，2004，15(5)：2324－2334.
[13] Francés R， Tumang JR， Kaku H， et al. B-1 cells express transgelin 2： unexpected lymphocyte expression of a smooth muscle protein identified by proteomic analysis of peritoneal B-1 cells[J]. Mol Immunol，2006，43(13)：2124－2129.
[14] Klinz FJ， Seifert R， Schwaner I， et al. Generation of specific antibodies against the rap1A， rap1B and rap2 small GTP-binding proteins. Analysis of rap and ras proteins in membranes from mammalian cells[J]. Eur J Biochem，1992，207(1)：207－213.
[15] Masuelli L， Ettenberg S， Vasaturo F， et al. The ras suppressor， RSU-1， enhances nerve growth factor-induced differentiation of PC12 cells and induces p21CIP expression[J]. Cell Growth Differ， 1999，10(8)：555－564.
[16] Yeung K， Seitz T， Li S， et al. Suppression of Raf-1 kinase activity and MAP kinase signalling by RKIP[J]. Nature，1999， 401(6749)：173－177.
[17] Wang X， Li N， Liu B， et al. A novel human phosphatidylethanolamine- binding protein resists tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis by inhibiting mitogen-activated protein kinase pathway activation and phosphatidylethanolamine externalization[J]. J Biol Chem，2004，279(44)：45855－45864.
[18] Banfield MJ， Barker JJ， Perry AC， et al. Function from structure? The crystal structure of human phosphatidylethanolamine-binding protein suggests a role in membrane signal transduction[J]. Structure，1998，(10)：1245－1254.
