时间：2023-05-30 09:04:10
开篇：写作不仅是一种记录，更是一种创造，它让我们能够捕捉那些稍纵即逝的灵感，将它们永久地定格在纸上。下面是小编精心整理的12篇细胞核的功能，希望这些内容能成为您创作过程中的良师益友，陪伴您不断探索和进步。
一、导入新课
创设情景：播放视频草履虫的生殖、应激性、变形虫的取食运动和人体白细胞吞噬病菌的过程。
师：同学们想一想：他们在进行生命活动的时候，究竟是细胞中的哪部分结构起着决定性的作用呢？通过前面的学习，我们知道细胞作为生命系统中最小的结构层次，其内部每时每刻都在进行着各种精确而有序的生物化学反应，这又是受谁的控制呢？（停顿片刻），这就是我们今天要学习的，系统的控制中心：细胞核（板书）
二、讲授新课
师：细胞核在细胞的生命活动是如何起作用？为了研究这个问题，科学家们做了很多实验，今天我们就沿着科学家走过的足迹，去看看他们是如何进行科学探究的。（屏幕显示：科学探究的基本步骤，教师简单解说）
师：（黑白美西螈图片）美西螈是一种两栖类动物，根据肤色可分为美西螈和白美西螈两种，于是科学家们提出这样一个问题：美西螈的肤色是由细胞核还是细胞质控制的呢？
生：是细胞核控制的。
师：这个假设是否正确还需用实验来证明，下面我们看科学家是如何证明的，请同学读教材52页资料1。
生：学生朗读。（幻灯片展示美西螈核移植图解）
师：（教师解释核移植技术）根据这个实验能否充分证明假设是正确呢？
生：不能。
师：如何再设计实验使实验结果更具有说服力呢？
（学生小组讨论）
生：将白美西螈胚胎细胞的核取出，移植到黑美西螈的去核的卵细胞中，看植入核的卵细胞发育成的美西螈的肤色。
师：通过两组实验的对比，使实验更加的严密，这样可以得出结论：美西螈的肤色是由细胞核控制的。
师：（幻灯展示伞藻图片）伞藻是单细胞的绿藻，分为帽、柄和假根，其中细胞核位于假根部位，根据帽形可分为伞形帽和形帽，伞藻再生性很强，即帽切除之后，很短时间内能够生出新的帽，是什么决定了帽的形态呢？如何设计一个实验证实自己的假设呢？
（学生小组讨论）
生：将两种伞藻帽切除并且去掉核，再分别植入另外一种的细胞核，看看他们分别再生出哪种形态的帽。
师：（幻灯放映伞藻核移植图解）你很有发展成科学家的潜质，非常好。这样就可以说明细胞核决定了伞藻帽的形态建成，但是科学家们当时并没有直接想到利用核移植来验证，而是先做了两种伞藻嫁接的实验（展示实验过程图解），同学们分析一下，这个实验能否证明就是细胞核决定了伞藻帽的形态呢？为什么？
（学生小组讨论）
生：不能，因为假根部分还有部分细胞质存在，所以不能排除细胞质的影响。
师：回答得非常精彩，（掌声鼓励），同学们还记得初中学过的科学家们利用类似的核移植方法诞生的动物明星――多莉吗？（幻灯显示：克隆羊多莉诞生的过程图解）下面有哪位同学能结合图解，描述一下多莉的诞生过程？
生：学生回答，教师适当补充。
师：非常棒！小多莉虽然是由C羊生出来的，但多莉长得像谁？为什么？
生：像 B 羊，因为多莉的细胞核来自 B 羊。
师：结合前面的资料分析和多莉的产生过程，我们能看出生物体的性状遗传主要是由细胞核决定的。这与细胞核中的什么物质有关呢？
生：DNA，DNA 是遗传信息的载体，主要分布在细胞核中。
师：因此可以说，细胞核是遗传信息库。（板书：一、功能：遗传信息库）
师：以上的资料说明细胞核与细胞的遗传有关，那细胞核与细胞的代谢活动是否关系呢？我们看资料2。
生：读教材52页资料2。
师：（屏幕展示过程图解）结合图解能得出什么结论？
生：细胞核与细胞的分裂、分化有关系。
师：细胞核还与细胞其他的生命活动有关系吗？科学家用变形虫做了一个这样的实验。
生：认真阅读教材53页资料3。（学生边读，教师边播放图解）
师：既然无核部分即将死亡，有核部分能正常生活，为什么科学家还要将有核一半中的核钩出来，然后再移植回去，这样做的目的是什么呢？
（学生小组讨论）
生：这样做可以使实验更加严密，因为细胞质内有大量的细胞器，很可能通过切割使两部分的细胞器分布不均，造成了无核的部分没有细胞器也就不能再继续生存下去。
生：细胞质中也有少量的 DNA 和 RNA 在一定程度上也能影响生物体的生命活动。
师：回答的太棒了，那人的成熟红细胞还能生长分裂吗？为什么？
生：不能，因为没有细胞核。
师：综合这些资料，找同学概括一下，细胞核具有什么功能？
生：细胞核是细胞遗传和代谢的控制中心。（板书）
师：我们知道结构决定功能（板书），细胞核有如此重要的功能，它的结构又是怎样的呢？给同学们3分钟时间阅读课本53页细胞核的结构并完成学案（细胞核结构表格略）。
师：接下来给同学们5分钟时间，认真阅读54页第一自然段，看一下作为遗传信息载体的染色质和染色体有什么区别和联系，并完成学案（染色体与染色质比较的表格）。
纵观各地高考卷不难发现，本考点多次考查，命题多围绕细胞核的结构与功能进行，尤其是核膜、核孔、核仁，在最后复习阶段需予以重视.一、考点扫描考点一：细胞核的结构1.细胞核的有无（个数）对于真核生物来说，绝大多数细胞具有一个核.凡是无核细胞，既不能生长也不能分裂，如哺乳动物和人的成熟红细胞、血小板、植物的筛管细胞；人工去核的细胞，一般不能存活太久.也有的生物细胞具有两个或是多个核，例如双小核草履虫；人的骨骼肌细胞中细胞核多达数百个.对于原核生物，由于其没有核膜包被的细胞核，故称作拟核.2.细胞核的结构（1）染色质与染色体的关系同种物质（DNA与蛋白质组成）在不同时期的两种形态（分裂间期染色质，分裂期染色体），如同钢丝与弹簧.染色质分裂前期：螺旋变粗分裂末期：解螺旋，变细变长染色体（2）核膜双层膜，外膜与内质网相连，且有核糖体附着；在有丝分裂中周期性地消失和重建；具有选择透过性（如无机小分子、有机小分子包括ATP、离子）.核膜是不连续的，上面分布有核孔.（3）核孔核孔并不是一个简单的孔洞，而是一个相对独立镶嵌着由多种不同的蛋白质构成的复杂结构――核孔复合体，实现核质之间频繁的物质交换和信息交流.一些大分子物质依据自身的拟定位信号和与核孔中专一受体蛋白（载体）结合而实现主动运输.如细胞质合成的DNA和RNA所需的聚合酶以及染色体中的组蛋白和核糖体蛋白都要通过核孔运入核内，核内生成的各种RNA以及组装好的核糖体亚基等大分子又必须通过核孔运出.但是它控制物质的通过不光依靠孔径的大小，还依靠核膜，核孔周围的各种蛋白质，即使是直径小于核孔的物质，也不一定能顺利通过，所以仍然具有选择性.（4）核仁折光性强，将碘液滴加到新鲜洋葱鳞茎表皮细胞，可见细胞核被染成红褐色，而核仁染得更深，易与其他结构区分；在有丝分裂中周期性地消失和重现，参与rRNA的合成及核糖体的形成 .（5）核孔的数量、核仁的大小与细胞代谢有关，如代谢旺盛、蛋白质合成量大的细胞，核孔数多，核仁较大，如两栖类的卵母细胞，核孔数可达百万.核孔的作用是实现核质之间频繁的物质交换和信息交流，因此代谢旺盛的细胞核孔数目较多.考点二：细胞核的功能遗传信息库，遗传和代谢的控制中心，但不是细胞代谢的中心（细胞代谢的主要场所是细胞质基质）.二、例题解析例1（2014宿迁调研改编）如图1为细胞核结构模式图，下列有关叙述正确的是（）.A.①主要由DNA和蛋白质组成，在细胞分裂不同时期形态相同B.破坏②不会影响胰岛素的合成C.核膜由两层磷脂分子构成，在细胞分裂中发生周期性变化D.蛋白质和RNA等生物大分子穿过核孔进出细胞核需要能量解析选D.解答本题的关键是： （1）正确识别图中的①为染色质，②为核仁. （2）明确核孔具有选择透过性.图中①为染色质，由丝状DNA和蛋白质构成，在细胞分裂不同时期形态不同；②为核仁，其功能是与rRNA的合成和核糖体的形成有关，若破坏核仁，则核糖体无法形成，不能合成胰岛素；核膜是双层膜，即四层磷脂分子构成；蛋白质和RNA等大分子物质通过核孔完成细胞质与细胞核之间的物质交换，需要能量.例2（2009山东高考）真核细胞单位面积的核孔数目与细胞类型和代谢水平有关.以下细胞中核孔数目最少的是（）.A.胰岛细胞
B.造血干细胞C.效应B细胞（浆细胞）
D.口腔上皮细胞解析选D.细胞的代谢越旺盛，则核孔的数目越多.A、C中的细胞分别分泌胰岛素（或胰高血糖素）和抗体，代谢旺盛.B中细胞的分裂能力很强，代谢旺盛.只有D为高度分化的细胞，代谢较弱.故而D中的口腔上皮细胞的核孔数目最少. 例3（2014安徽联考）如图2为某种生物的细胞核及相关结构示意图，有关叙述正确的是（
）.图2A.核孔是大分子物质进出细胞核的通道，不具有选择性B.图示中有中心体，说明该生物为低等植物或动物 C.在衰老的细胞中，细胞核体积减小，染色质浓缩 D.rRNA（核糖体RNA）和蛋白质在核仁中合成并组装成核糖体解析选B.核孔也具有选择透过性，不允许核内DNA外出；中心体存在低等植物细胞或动物细胞中；在衰老的细胞中，由于代谢缓慢，细胞核代偿性增大，染色质浓缩；蛋白质合成的场所是核糖体.例4（2014南通调研改编）下列关于细胞核的叙述正确的是（
）.A.真核细胞的核膜上有大量的多种酶，有利于多种化学反应的顺利进行B.在显微镜下观察分裂间期的真核细胞，可以看到细胞核的主要结构有核膜、核仁和染色体C.叶肉细胞利用核孔实现核内外DNA，RNA和蛋白质的交换D.原核细胞的拟核除没有核膜外，其他方面与真核细胞的细胞核没有差别 解析选A.核膜为酶提供了大量的附着位点，有利于多种生化反应的顺利进行.真核细胞分裂间期的核中无染色体，有丝状染色质；DNA分子不能通过核孔，而RNA及某些蛋白质分子可以通过；原核细胞的拟核不仅无核膜，而且它只是一个的大型环状DNA分子，没有与蛋白质结合成染色体，也无核仁等结构.（收稿日期：2015-06-13）
细胞学知识是生物学的核心基础知识，在高中教材中占有举足轻重的地位。其中，多种多样的细胞、细胞膜系统的结构和功能、主要细胞器的结构与功能、细胞核的结构与功能、细胞的有丝分裂、细胞的分化、细胞的全能性、细胞的衰老和凋亡与人体健康的关系在考纲中属于Ⅱ类要求，即理解所列知识和其他相关知识之间的联系与区别，并能在较复杂情景中综合应用其进行分析、判断、推理和评价。
分析2013年各地高考试题发现：细胞学知识大多通过结构图、模式图、坐标图等形式，并与细胞代谢综合起来进行考查，如江苏卷第29题将细胞器、细胞膜和蛋白质的转运相结合进行考查（例4）；江苏卷第3题和浙江卷第1题侧重考查了有丝分裂的相关知识；山东卷第2题考查了细胞分化的知识；江苏卷第7题综合考查了分化、衰老、凋亡与癌变的相关知识。另外从题型上看，这方面的知识涉及的考查点多，内容比较浅显，所以大多以选择题形式出现，如新课标全国卷I第3题，山东卷第1题，天津卷第1题，安徽卷第1题，北京卷第1题，浙江卷第2题等。
二、2013年典型高考试题的剖析
例1 （2013・安徽卷）生物膜将真核细胞分隔成不同的区室，使得细胞内能够同时进行多种化学反应，而不会相互干扰。下列叙述正确的是（ ）
A.细胞核是mRNA合成和加工的场所
B.高尔基体是肽链合成和加工的场所
C.线粒体将葡萄糖氧化分解成CO2和H2O
D.溶酶体合成和分泌多种酸性水解酶
【解析】细胞核是转录的场所，所以是mRNA合成和加工的场所，A正确。核糖体是肽链的合成场所，B错误。葡萄糖是不能进入线粒体的，C错误。溶酶体中的酶是在核糖体上合成的，并经内质网和高尔基体加工和修饰后分泌的，D错误。
【答案】A。
〖点评〗此题题干是课文原话，可见课本知识是必须要牢牢掌握的。这四个选项是细胞核功能和几种细胞器功能的组合，难度不大，体现了对基础知识的考查。尽管课文没有涉及细胞核是mRNA加工的场所，但只要同学们对蛋白质的合成场所、呼吸作用的过程知识熟练，通过排除法是可以准确作答的。
例2 （2013・天津卷）下列过程未体现生物膜信息传递功能的是（ ）
A.蔗糖溶液使洋葱表皮细胞发生质壁分离
B.抗原刺激引发记忆细胞增殖分化
C.胰岛素调节靶细胞对葡萄糖的摄取
D.传出神经细胞兴奋引起肌肉收缩
【解析】当外界蔗糖溶液浓度较高时，洋葱表皮细胞渗透失水发生质壁分离，该过程不涉及信息传递；记忆细胞与抗原具有特异性识别作用，该过程与细胞膜上的糖蛋白有关，糖蛋白具有信息识别功能；靶细胞膜表面的受体能与胰岛素结合，从而使胰岛素发挥作用；传出神经细胞兴奋引起肌肉收缩的过程中有神经递质与细胞膜上相应受体的结合。B，C，D项均体现了生物膜的信息传递功能。
【答案】A。
〖点评〗此题难度中等偏上。考查学生对生物膜信息传递概念的理解，只有彻底理解这部分内容，才能准确评判生物学过程或生物学现象。对此概念课文没有过多的文字阐述，而是列举了具体事例并用彩图直观告知。在教学时需要老师高度概括提炼这一概念的要素和要点。确认是否为信息传递，需有三个基本要素：信号分子、靶细胞受体、靶细胞内发生复杂的生物效应。①信号分子具有传递信息的作用：胰岛素、神经递质与靶细胞受体结合后，引起靶细胞内发生一系列复杂的反应，说明二者属于信号分子，能够传递某种信息；而抗原表面的特异性蛋白等物质（免疫学上称之为表面抗原或抗原决定簇）也相当于信号分子，刺激记忆细胞后，引发了记忆细胞增殖分化。②靶细胞上有和信号分子结合的受体。③靶细胞上的受体与信号分子特异性结合后，必须发生一系列复杂的生物效应，如生化反应水平提高、膜电位变化等，才能说明体现了信息传递功能。
例3 （2013・山东卷）将小鼠myoD基因导入体外培养的未分化肌肉前体细胞，细胞分化及肌纤维形成过程如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A.携带myoD基因的载体以协助扩散的方式进入肌肉前体细胞
B.检测图中细胞核糖体蛋白基因是否表达可确定细胞分化与否
C.完成分化的肌肉细胞通过有丝分裂增加细胞数量形成肌纤维
D.肌肉前体细胞比肌肉细胞在受到电离辐射时更容易发生癌变
【解析】携带myoD基因的载体为环状DNA分子，该大分子物质不会以协助扩散的方式进入细胞，在基因工程中用显微注射法，A错误。核糖体蛋白基因控制合成核糖体蛋白，该基因在每个活细胞中均会表达，B错误。完成分化的肌肉细胞已失去了分裂能力，不再进行细胞分裂，C错误。由题意可知，肌肉前体细胞属于未分化细胞，处于分裂状态，DNA复制时受电离辐射的影响程度远大于已不再分裂的肌肉细胞，因此更容易发生癌变，D正确。
【答案】D。
〖点评〗此题考查了学生对细胞的分裂、分化和癌变等知识理解和应用能力。在细胞分化的过程中控制基本生命活动的有关蛋白质基因是活细胞，它均可以表达，而有些基因是选择性表达的，因此细胞之间有了稳定性的差异――细胞分化，所以只有检测肌肉细胞特有的蛋白质才能确定细胞分化与否。B选项对学生有一定的难度。题图告诉我们肌肉细胞是由肌肉前体细胞分裂分化而来，解题时不能忽视这一题图信息，平时要注意识图、析图能力训练。
例4 （2013・江苏卷）如图为某细胞的部分结构及蛋白质转运示意图，请回答下列问题：
（1）内质网上合成的蛋白质不能穿过 进入细胞核，表明这种转运具有 性。
（2）细胞膜选择透过性的分子基础是 具有疏水性和 具有专一性。
（3）若该细胞是高等植物的叶肉细胞，则图中未绘制的细胞器有 。
（4）若该细胞为小鼠骨髓造血干细胞，则图示细胞处于细胞周期的 ，此时在光学显微镜下观察明显可见细胞核中有 存在。
（5）研究表明硒对线粒体膜有稳定作用，可以推测人体缺硒时下列细胞中最易受损的是 （填序号）。
①脂肪细胞 ②淋巴细胞 ③心肌细胞 ④口腔上皮细胞
【解析】（1）由图可知附着于内质网的核糖体上合成的蛋白质，没有箭头指向细胞核，而是经高尔基体加工后有三个去向：成为细胞膜的成分之一、分泌到细胞外、变为溶酶体内的酶。不能进入细胞核，而细胞质内的蛋白质进入细胞核的通道是核孔。
（2）细胞膜上磷脂分子的尾部是脂肪酸，具有疏水性。细胞膜上的转运蛋白具有特定的空间结构，能与被转运的物质特异性结合，体现了膜对物质运输的选择性。
（3）高等植物的叶肉细胞内含有叶绿体，并且成熟的植物细胞具有大液泡。
（4）核膜在前期消失，在末期重现，图中可见完整的细胞核，说明该细胞处于细胞周期的间期。在细胞核中只有染色质和核仁，明显可见的只能是核仁了，即使图上看不到，也必须填写“核仁”。
（5）细胞内线粒体参与细胞有氧呼吸，缺硒线粒体膜无法稳定，进而影响到细胞内能量的产生，而题目提供的细胞中，心肌细胞对能量的要求最高，所以最易受损。
【答案】（1）核孔 选择 （2）磷脂双分子层 膜转运蛋白 （3）叶绿体和液泡 （4）分裂间期 核仁 （5）③
〖点评〗此题考查了学生识图、析图的能力和准确规范表达能力。首先从图中确认细胞器及蛋白质的种类，理解图中箭头所示的含义是解答本题的关键。题图展示了游离核糖体合成的蛋白质和附着于内质网的核糖体合成的蛋白质的不同去向。
要做到规范答题有效得分，应根据所填空格前后的语境和语意仔细推敲来确定内容，再组织语言，例如第（4）小题中关键词“明显可见”就确定了该空的答案。平时的复习需注意以下几点：①熟记乃至背诵教材语言。②套用一些平时作答时常用句式如“在一定的范围内”“等量且适量”“分组编号”“观察记录”等。③善于使用题干语言，有些空就是来自题干中的某一词或短语，作答时不宜更改或遗漏，与题干语言保持高度一致。
三、2014年高考复习策略及命题趋势预测
（一）复习策略
1.抓住教材，熟练掌握基础知识
知识是能力的载体，一定量的知识储备及良好的知识结构是各种能力形成和提高的必备条件。在本专题基础知识复习时可用图形、表格等形式，通过比较、辨析来加强理解记忆有关概念、过程、原理。如（1）真核细胞与原核细胞的比较；（2）植物细胞与动物细胞的比较；（3）叶绿体与线粒体的比较；（4）染色体、染色质和染色单体的比较；（5）有丝分裂与减数分裂的比较；（6）载体与运载体的比较；（7）原生质体与原生质层的比较；（8）糖蛋白、脂蛋白、球蛋白和分泌蛋白的比较；（9）细胞膜的信息传递功能与物质交换功能的比较；（10）细胞分裂与细胞分化的比较；（11）细胞衰老、凋亡和坏死的比较；（12）主动运输与被动运输的比较；（13）斐林试剂与双缩脲试剂的比较。通过对以上相关、相似、易混的概念进行比较，加强记忆，巩固基础知识。
2.精选巧练，提高解题能力
从每年的高考试题中选择有代表性的题目进行练习，由浅入深，由易到难，由基础知识到分析推理，形成一个循序渐进的训练过程，培养和提高解题能力。
审题能力：仔细审题，这是正确解答试题的前提。一些选择题题干中包含的关键词语，如“正确”与“错误”，“一对”与“一个”，“主要”与“次要”，“根本原因”与“直接原因”，“一定”“可能”“唯一”等。找准这些关键词语，对正确解题起到至关重要的作用。对于非选择题，在看题、读题、解题和答题过程中，同样要看准关键词，理解题意，然后正确作答。尤其是实验题，审准题目的性质和目的至关重要。
理解能力：在理解能力方面比较突出的问题是，对有关知识理解不透，掌握得不够牢固，因此，对题干所提供的信息材料不能正确理解，不懂得出题人的用意，不能准确地进行知识的迁移。如何提高理解能力呢？应注意三个方面：①夯实课本上的基础知识。②提高阅读理解能力，通常在解题时要养成良好习惯，快速泛读一遍，再细读一遍，将关键字词注上标记。③理解出题人的用意。
表达能力：在高考试题中的非选择题部分，重点体现《考试大纲》对考生表达能力的要求。如“能用文字、图表以及数学方式等多种表达形式准确地描述生物学方面的内容”。学生在这一部分失分较多，主要原因有：①表达时，用词随意，不能用生物学术语准确地描述。②在对生物现象解释时，组织的语言与之不构成因果关系。③在实验方法步骤的陈述中思路混乱，表达不清，语言拖泥带水，不能做到言简意赅。在做非选择题时，全面、准确地表达生物信息是得分的重要保障。在平时的训练中要模仿课文的表达模式及用词的严密性和完整性。
3.重视基本实验，提高分析能力
这部分的实验较多，有观察类实验（如观察多种多样的细胞、线粒体和叶绿体、有丝分裂）、探究类实验（如探究植物细胞的吸水和失水）、模拟实验（如细胞大小与物质运输的关系实验、渗透作用实验），还有制备细胞膜等实验。高考试题常以课本实验为模本进行组合、拓展和迁移，特别注重对基本实验操作步骤、原理、现象的考查。因此，平时训练时要立足教材实验，提高观察能力、设计实验的能力、分析实验现象的能力。
最后，在复习中要形成如生物体结构与功能相适应的观点、生物体局部与整体相统一的观点、生命活动的对立统一观点，提高生物科学素养。
（二）高考命题预测
1.将线粒体与叶绿体的结构和功能及有关实验与光合作用、呼吸作用过程原理融于一体进行命题，以此来考查学生的综合应用能力。
二十世纪70年代Naftolin等的研究工作奠定了脑芳香化酶(Aromatase， AROM)假说的基础，该假说认为在脑组织局部，AROM可以将雄激素转化为雌激素（主要是雌二醇，E2）。以往的研究认为脑内AROM的表达只见于出生前后一短暂时期，成年后则不表达，外周E2是成年脑E2的唯一来源。近年随着研究技术的进步，在成年某些脑区如海马、下丘脑也检出AROM的表达，且不仅见于神经元胞体也见于突触前成分，证明成年脑仍然能够合成E2［1］。目前为止已经发现了两类E2受体，即经典的核受体ERα和ERβ（Hawkins等从硬骨鱼体内发现的核受体ERγ经研究证实它是ERβ的一个亚型；见Filby AL，Biol Reprod， 2005)，以及近年新发现的膜性受体ERX以及属于G蛋白偶联受体家族的GPR30和GαqER［2］。
1 经典的雌激素受体
经典的ERα和ERβ位于细胞核内，它们通过调节靶基因的转录而发挥“基因型”调节效应。两种经典ER在脑内的分布具有脑区特异性。如高表达的ERα见于下丘脑、终纹床核与生殖调节有关的脑区；ERβ高表达于嗅球、基底前脑、大脑皮质、海马锥体细胞、小脑浦肯野细胞、黑质等与学习记忆、运动调控有关的脑区部位。脑垂体内几乎所有的催乳素阳性细胞都不表达ERβ，提示ERβ在泌乳中枢的调节可能有限的，而ERα对泌乳中枢的调节起着主要作用 。在功能方面，经典ER介导的雌激素效应可能有所不同，但也可能协同发挥作用。如ERα主要参与对生殖调控的作用，因为阻断ERα可改变动物的性行为；ERβ可能主要参与了对高级脑功能如学习记忆、神经退行性疾病等的调节，因为敲除ERβ基因严重影响学习记忆行为、LTP和突触强度 ［36］。
2 非经典的膜性雌激素受体
E2能在数秒钟内改变神经元的电生理特性、在几分钟之内降低不表达核受体的神经元的Ca2+电流，导致特异性增强基因表达的蛋白质如MAPK途径、PKA、CREB等的活化。这些效应受经典ERs的膜性成分或近年新发现的膜性ER的介导，E2通过这一类ER主要发挥“非基因型”的调节作用，其信号转导通路涉及到对Ca2+、cAMP等第二信使以及各蛋白激酶级联的活化，如src、ras、MEK和MAPK。
2.1 膜性ERα
研究发现ERα也可位于细胞膜，甚至突触后致密物即PSD。1～10 nm的E2在1 h内能增强作为抑制学习记忆指标之一的长时程抑制即LTD，2 h内能增加海马CA1中锥体神经元的树突棘密度，然而CA3中锥体神经元的棘样结构却减少；实验证明E2的快速调节作用是与通过细胞膜ERα而结合产生的。Hojo等因此认为海马锥体细胞膜性ERα在诱导LTD和树突棘再生中有重要作用，并认为这有助于“忘掉该忘掉的记忆”从而与细胞核ERβ协同发挥对学习记忆的调节作用［7］。
2.2 膜性ERβ
在某些脑区，ERβ也可能位于细胞核以外的部位，如胞浆，甚至突起内，最早见于Li等1997年的报道。我们先前的免疫组化研究发现在成年大鼠CA1、CA2、动眼神经核、蓝斑下核等部位除了细胞核着色以外胞浆和突起也有淡淡的着色，三叉神经运动核内有一些仅为胞浆和突起着色的阳性细胞［4］。在研究生后大鼠基底前脑ERβ的发育学表达过程中，我们注意到在出生14 d后ERβ免疫阳性反应主要位于细胞核，但是胞浆和突起内也可见到微弱的染色，其余时相点以及在小鼠均是位于细胞核，其生理意义上不清楚。Herrick等报道海马齿状回在新生或成年大鼠新生细胞的胞膜、线粒体和内质网检测到ERβ免疫阳性反应，提示该部位细胞核外ERβ的表达可能与神经干细胞的活动有关［8］。
2.3 ERX
该受体由ToranAllerand所在实验室于2000年首次报道并做了几篇研究报告，认为ERX介导了E2对MAPK/ERK通路的活化，其62kDa成分表达受到发育的调节，高表达的ERX见于野生型与ERα基因敲除鼠、转基因AD模型鼠生后1～7 d而非成年的新皮质、下丘脑、小脑，缺血性脑损伤或可以诱导其表达［9］。
2.4 GPR30
这是目前研究最多的一种膜性ER。它是一个具有7次跨膜结构、375个氨基酸的G蛋白偶联受体，与IL8受体有30%的同源性。1996年从B细胞cDNA文库中分离出来，在巨噬细胞和神经胶质细胞中有广泛表达。自1997年到2002年，较多文献报道了GPR30在乳腺癌中的表达、调控与作用研究，2000年即发现E2对ERK的活化需要GPR30的参与，2005年德克萨斯大学的Thomas等正式提出GPR30是一种新的雌激素受体［1011］。
脑内GPR30的功能研究方面目前报道还不多，已有资料表明它可能参与了雌激素对下丘脑促性腺激素释放激素细胞内突触前GABA末梢对Ca2+的调节以及对海马结构与功能的调节，在生后7 d以及成年鼠(hamster)的下丘脑、杏仁复合体与小脑发现有GPR表达的性别差异，提示该受体可能参与了对这些部位神经结构的调节［12］。
2.5 GαqER
2008年，Qiu等报道对小鼠和豚鼠的研究中发现下丘脑有一种调节GABAB受体去敏感化的ER，与GPR30一样，它也属于G蛋白偶联受体家族，于是将其命名为GαqER。应用ERα和/或ERβ基因敲除小鼠证明它与上述两种受体不同；通过GPR30基因敲除小鼠研究证明GαqER与GPR30也是不同的。它参与了对PLCPKCPKA途径的调节， 具体过程可能是：① E2与该受体结合，引起Gαq的活化；②PLC被活化;③活化的PLC 水解PIP2并释放DAG，游离DAG刺激PKCδ;④PKCδ 激活腺苷酸环化酶导致cAMP浓度升高;⑤cAMP刺激PKA;⑥PKA使细胞膜上与K+通道功能有关的靶蛋白磷酸化［1314］。
综上所述，近年新发现的膜性ER尤其是经典ER也可以位于细胞核外并发挥功能的研究打破了ER是核受体、只能位于细胞核的传统观念，对阐明E2在脑内的功能及其机制发挥了巨大作用。两种类型的ER并不是孤立地介导E2的作用，而是可以相互作用与整合以全面调节神经元的功能，例如膜性E2受体可以导致经典核受体及其辅助活化因子的磷酸化，诱导产生第三信使如Cyclin D1和cfos等从而也能调节基因的转录。随着研究手段的进步，将来也许还会发现更多的核ER或膜性ER，从而为深入认识和利用E2提供坚实的基础。
参考文献
［1］ Ishii H， Tsurugizawa T， OgiueIkeda M，et al. Local production of sex hormones and their modulation of hippocampal synaptic plasticity［J］. Neuroscientist， 2007， 13(4):323-334.
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七年级生物上知识点第一单元 生物和生物圈
生物的特征：1、生物的生活需要营养 2、生物能进行呼吸 3、生物能排出体内产生的废物4、生物能对外界刺激做出反应 5、生物能生长和繁殖 6、由细胞构成(病毒除外)
调查的一般方法
步骤：明确调查目的、确定调查对象、制定合理的调查方案、调查记录、对调查结果进行整理、撰写调查报告
生物的分类
按照形态结构分：动物、植物、其他生物
按照生活环境分：陆生生物、水生生物
按照用途分：作物、家禽、家畜、宠物
生物圈是所有生物的家
生物圈的范围：大气圈的底部：可飞翔的鸟类、昆虫、细菌等
水圈的大部：距海平面150米内的水层
岩石圈的表面：是一切陆生生物的“立足点”
生物圈为生物的生存提供了基本条件：营养物质、阳光、空气和水，适宜的温度和一定的生存空间
环境对生物的影响
非生物因素对生物的影响：光、水分、温度等
光对鼠妇生活影响的实验P15
探究的过程：1、提出问题 2、作出假设 3、制定计划 4、实施计划 5、得出结论 6、表达和交流
对照实验 P15
生物因素对生物的影响：
最常见的是捕食关系，还有竞争关系、合作关系
生物对环境的适应和影响
生物对环境的适应P19的例子
生物对环境的影响：植物的蒸腾作用调节空气湿度、植物的枯叶枯枝腐烂后可调节土壤肥力、动物粪便改良土壤、蚯蚓松土
生态系统的概念：在一定地域内，生物与环境所形成的统一整体叫生态系统。一片森林，一块农田，一片草原，一个湖泊，等都可以看作一个生态系统。
生态系统的组成：
生物部分：生产者、消费者、分解者
非生物部分：阳光、水、空气、温度
如果将生态系统中的每一个环节中的所有生物分别称重，在一般情况下数量做大的应该是生产者。
植物是生态系统中的生产者，动物是生态系统中的消费者，细菌和真菌是生态系统中的分解者。
食物链和食物网：
食物链以生产者为起点，终点为消费者，且是不被其他动物捕食的“最高级”动物。
物质和能量沿着食物链和食物网流动的。
营养级越高，生物数量越少;营养级越高，有毒物质沿食物链积累(富集)。
生态系统具有一定的自动调节能力。
在一般情况下，生态系统中生物的数量和所占比例是相对稳定的。但这种自动调节能力有一定限度，超过则会遭到破坏。
例如：在草原上人工种草，为了防止鸟吃草籽，用网把试验区罩上，结果发现，网罩内的草的叶子几乎被虫吃光，而未加网罩的地方，草反而生长良好。原因是：食物链被破坏而造成生态系统平衡失调。
生物圈是最大的生态系统。人类活动对环境的影响有许多是全球性的。
生态系统的类型p29
森林生态系统、草原生态系统、农田生态系统、海洋生态系统、城市生态系统等
生物圈是一个统一的整体p30
注意DDT的例子 (富集)课本26页。
课本27页1题33页生物圈2号
生物的生存依赖于环境，以各种方式适应环境，影响环境。
七年级生物上知识点第二单元 生物和细胞
显微镜的结构
镜座：稳定镜身;
镜柱：支持镜柱以上的部分;
镜臂：握镜的部位;
载物台：放置玻片标本的地方。中央有通光孔，两旁各有一个压片夹，用于固定所观察的物体。
遮光器：上面有大小不等的圆孔，叫光圈。每个光圈都可以对准通光孔。用来调节光线的强弱。
反光镜：可以转动，使光线经过通光孔反射上来。其两面是不同的：光强时使用平面镜，光弱时使用凹面镜。
镜筒：上端装目镜，下端有转换器，在转换器上装有物镜，后方有准焦螺旋。
准焦螺旋：粗准焦螺旋：转动时镜筒升降的幅度大;细准焦螺旋。
转动方向和升降方向的关系：顺时针转动准焦螺旋，镜筒下降;反之则上升
显微镜的使用 P37-38 的图要掌握
观察的物像与实际图像相反。注意玻片的移动方向和视野中物象的移动方向相反。
放大倍数=物镜倍数X目镜倍数
放在显微镜下观察的生物标本，应该薄而透明，光线能透过，才能观察清楚。因此必须加工制成玻片标本。
观察植物细胞：实验过程P43-44
切片、涂片、装片的区别 P42
植物细胞的基本结构
细胞壁：支持、保护
细胞膜：控制物质的进出，
细胞质：液态的，可以流动的。细胞质里有液泡，液泡内的液泡内溶解着多种物质(如糖分)
细胞核：贮存和传递遗传信息
叶绿体：进行光合作用的场所，
液泡：细胞液
观察口腔上皮细胞实验P47
动物细胞的结构
细胞膜：控制物质的进出
细胞核：贮存和传递遗传信息
细胞质：液态，可以流动
植物细胞与动物细胞的相同点：都有细胞膜、细胞质、细胞核
植物细胞与动物细胞的不同点：植物细胞有细胞壁和液泡，动物细胞没有。
细胞的生活需要物质和能量
细胞是构成生物体的结构和功能基本单位。
细胞是物质、能量、和信息的统一体。细胞通过分裂产生新细胞。
细胞中的物质
有机物(一般含碳，可烧)：糖类、脂类、蛋白质、核酸，这些都是大分子
无机物(一般不含碳)：水、无机物、氧等，这些都是小分子
细胞膜控制物质的进出，对物质有选择性，有用物质进入，废物排出。注意课本52页图叫什么
细胞内的能量转换器：
叶绿体：进行光合作用，是细胞内的把二氧化碳和水合成有机物，并产生氧。线粒体：进行呼吸作用，是细胞内的“动力工厂”“发动机”。
二者联系：都是细胞中的能量转换器
二者区别：叶绿体将光能转变成化学能储存在有机物中;
线粒体分解有机物，将有机物中储存的化学能释放出来供细胞利用。
动植物细胞都有线粒体。
细胞核是遗传信息库，遗传信息存在于细胞核中
多莉羊的例子p55，
57页1题
细胞核中的遗传信息的载体——DNA
DNA的结构像一个螺旋形的梯子
基因是DNA上的一个具有特定遗传信息的片断
DNA和蛋白质组成染色体
不同的生物个体，染色体的形态、数量完全不同
同种生物个体，染色体在形态、数量保持一定
染色体容易被碱性染料染成深色
染色体数量要保持恒定，否则会有严重的遗传病
细胞的控制中心是细胞核
细胞通过分裂产生新细胞
生物的由小长大是由于：细胞的分裂和细胞的生长
细胞的分裂
1、染色体进行复制
2、细胞核分成等同的两个细胞核
3、细胞质分成两份
4、植物细胞：在原细胞中间形成新的细胞膜和细胞壁
动物细胞：细胞膜逐渐内陷，便形成两个新细胞
新生命的开端---受精卵
经细胞分化形成的各种各样的细胞各自聚集在一起才能行使其功能，这些形态结构相似、功能相同的细胞聚集起来所形成的细胞群叫做组织。
不同的组织按一定的次序结合在一起构成器官。
动物和人的基本组织可以分为四种：上皮组织、结缔组织、肌肉组织、神经组织。
四种组织按照一定的次序构成，并且以其中的一种组织为主，形成器官。
能够共同完成一种或几种生理功能的多个器官按照一定的次序组成在一起构成系统。
系统：运动系统、消化系统、呼吸系统、循环系统、泌尿系统，神经系统、内分泌系统、生殖系统。
动物和人的基本结构层次(小到大)：细胞→组织→器官→系统→动物体和人体
植物结构层次(小到大)：细胞→组织→器官→植物体
P65题3
第二节 植物体的结构层次
绿色开花植物的六大器官
营养器官：根、茎、叶 ;
生殖器官：花、果实、种子
第三节 只有一个细胞的生物体
单细胞生物：草履虫、酵母菌、、衣藻、眼虫、变形虫
关键词： 核转录因子κB;核转录因子κB抑制因子;中性粒细胞;凋亡
急性肺损伤、急性胰腺炎等炎症反应过程中，中性粒细胞首先浸润于炎症灶中，并可能过度活化导致全身炎症反应综合征〔1〕。核转录因子κB（NFκB）作为多种介质的转录调控因子，不仅参与炎症介质的调控，同时也对中性粒细胞凋亡基因的表达调控有重要作用。因此，NFκB自身的活性状况对炎症进程有至关重要的作用。本研究通过脂多糖(LPS)刺激中性粒细胞，探讨NFκB天然抑制调节因子IκBα对中性粒细胞凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
LPS、来普霉素B（leptomycin B，LMB）购自深圳晶美生物公司，IκBα单抗、Western印迹试剂盒购自武汉博士德公司,Trans AMTM NFκBp65 kit 为大连宝生物公司产品。细胞核浆蛋白制备试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。
1.2 中性粒细胞分离培养及细胞核、浆蛋白制备
2 w内未服用药物的健康成人志愿者（为献血员），参照文献〔2〕进行中性粒细胞分离纯化。纯化后的细胞悬浮于含10%胎牛血清的RPMI1640溶液中至终浓度为5×109/L,于37℃振荡培养。将离体培养的中性粒细胞分为4组：（1）生理盐水对照组（A组）；（2）LMB干预组（B组）；（3）LPS刺激组（C组）；LMB+LPS组（D组）。LPS刺激的终浓度为0.1 g/L；LMB+LPS组中，予LPS刺激前45 min加入1‰（V/V）LMB。应用北京博奥森生物技术有限公司细胞核浆蛋白制备试剂盒提取核浆蛋白，步骤参照说明书进行。应用Bradford法测定制备蛋白浓度。
1.3 细胞核NFκB活性检测
采用Trans AMTM NFκBp65 试剂盒进行检测。以不加入核提取物为空白对照，实验组中每个时相点进行5次测定，读取分光光度计450 nm处A值进行统计学处理。
1.4 细胞核、浆IκBα含量检测
将提取的各组细胞核、浆蛋白进行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（SDSPAGE）蛋白电泳。上样量20 μg，90 V电泳2 h后，电转至硝酸纤维素膜。5%（W/V）脱脂奶粉封闭1h,加入兔抗IκBα多克隆抗体（1∶200）4℃过夜，羊抗兔Ⅱ抗（1∶5 000）室温下孵育1 h。应用化学发光试剂盒进行检测，凝胶图像分析系统扫描分析，并用测得目的条带的灰度×面积表示结果。
1.5 中性粒细胞凋亡的检测
采用流式细胞仪DNA倍体分析法：收集1×105个中性粒细胞，1 000 r/min离心5 min,弃培养液，用PBS液洗2次后加入70%冷乙醇2 ml混匀，4℃固定30 min。再以1 000 r/min离心5 min,弃培养液，用PBS洗2次后加入1 ml碘化丙啶（PI）染色，4℃孵育30 min，上机分析。
1.6 统计学处理
以SPSS10.0软件进行统计分析，以x±s表示，进行t检验。
2 结 果
2.1 细胞核NFκB活性检测结果
LMB干预组细胞核NFκB活性(0.041 2±0.003 1)与对照组(0.042 1±0.003 3)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。给予LPS刺激后，NFκB活性(0.622 0±0.053 6)较对照组显著增强(P＜0.05)；而给予LPS刺激的同时加入LMP，NFκB活性(0.050 0±0.003 6)明显受到抑制。
2.2 细胞核、浆IκBα含量检测结果
细胞核、浆IκBα Western印迹结果见图1。细胞核、浆IκBα凝胶图像扫描结果见表1。对照组、LMB干预组胞浆与胞核中IκBα含量无显著性差异；LPS刺激组中胞浆含量略低于胞核(P＜0.05)，且LPS刺激组胞浆及胞核中含量均低于对照组(P＜0.05)；LMB+LPS组胞浆明显低于胞核。表1 细胞核、浆IκBα凝胶图像扫描结果（略)
2.3 中性粒细胞凋亡检测结果
见图2。与对照组相比，LMB干预组中性粒细胞凋亡百分比无明显改变；而LPS刺激组显著下降(P＜0.05)。LMB+LPS组与LPS刺激组比较，中性粒细胞凋亡百分比明显上升(P＜0.05)。
3 讨 论
中性粒细胞作为机体内最活跃的炎症细胞，在脏器内大量扣押、活化是导致急性肺损伤等炎性疾病恶化的中心环节。激活的中性粒细胞通过呼吸爆发产生大量自由基、蛋白水解酶及炎症介质等有害物质造成组织损伤。适度清除中性粒细胞是控制炎症发展的重要措施。凋亡的中性粒细胞脱颗粒、呼吸爆发等致炎功能下降，而且更易被吞噬细胞吞噬。被整体吞噬的中性粒细胞致炎能力显著下降。因此，凋亡作为中性粒细胞重要的非炎性清除方式，对炎症疾病转归有重要作用〔3，4〕。
【关键词】胰腺内分泌肿瘤 临床病理学 免疫组化特点分析
【Summary】：To pick: ：To the advancement of pathological and the clinical characteristics of the immunity. the method of 23 respectively， for example， pets and pas， immune to the organization ’s - chemical (p method dyeing) observation. the example the average age of 23 pets 42. four years， there was a tumor. part 2， there is more solid envelope lump， they will be poor. the organization， lymphoma cells in a small circular， streaming. the thin cell in quality in nuclear chromatin Fine grainy. cells in trabecula ， glands make or truth. immunization group ： 23 cases in the pets syn 13， and 10 nse cga ck 7 and ins 6 cases. the positive conclusion ： endocrine the tumor may the man of unusual characteristics and clinical psychologists immunization form.
【Keywords】：The key words：The endocrine the tumor， clinical pathology， the analysis of the characteristics of immunity
免疫组织化学：预后胰腺内分泌肿瘤(pancreaticendocrinetumors，PETs)仅占所有胰腺肿瘤的1%～2%是临床上非常少见的肿瘤。笔者对收集的PETs病例进行临床回顾性研究，探讨PETs的临床病理学特征、免疫表型及预后。
1、临床资料
选取本院2001～2006年病理诊断为PETs的资料齐全病例共18例，经两位病理主任医师重复阅片确诊。18例PETs患者中5例因上腹部不适，3例因偶然发现上腹部肿块，7例因反复头晕乏力而入院就诊。1例肿块为多发，其余均为单发。B超10例示胰腺肿块，3例示后腹膜块，1例示胆总管后肿块。CT示7例胰腺实性肿块。18例随访1.5～5年，2例复发。标本经10%的福尔马林固定、石蜡包埋，4μm厚切片，HE染色、PAS染色及免疫组化染色。
免疫组化抗体：抗糜蛋白酶(AACT)、波形蛋白(Vim)、突触素(Syn)、嗜铬粒蛋白(CgA)、神经元烯醇化酶(NSE)、细胞角蛋白(CK)、胰岛素(Ins)均为福州迈新生物技术公司产品，方法为S-P法，使用LabVision全自动免疫组化染色系统(美国)。每次染色设阴性及阳性对照。
2、病理检查结果
2.1巨检11例手术切除PETs肿块标本，1例为灰白色，余均为褐色或粉红色，肿块与周围组织分界清楚。6例有完整包膜，1例有部分包膜，4例无明显包膜。直径1.5～5.5cm，平均直径2.4cm。10例切面为实性质软(其中3例有出血)，1例切面为囊实性，囊内有出血。
2.2镜检23例PETs中部分肿块有厚薄不均匀的纤维包膜，肿瘤细胞由形态相对一致的小圆形细胞构成，胞浆嗜酸性或嗜双色性，细胞核居中，核染色质呈细颗粒状、肿瘤细胞排列成小梁状、腺胞状或实性。间质有丰富的血管。恶性PETs可见包膜浸润和周围淋巴结、肠系膜等转移。6例肿瘤细胞核异型明显。
2.3生物学行为与预后病例1有胰腺、周围脂肪组织、小灶性血管侵犯病例4有包膜、血管侵犯以及胰周淋巴结转移病例5有包膜侵犯病例10有肠系膜转移病例11有肝转移且肿块为多发性，4例确诊为恶性经手术后随访2例复发。
3、讨论
3.1临床特征PETs好发于成年人，女性多于男性2、本文报道的23例PETs中7例为男性，16例为女性，患者的平均年龄为42.4岁，PETs分为功能性和非功能性两类。大多数PETs为功能性，而非功能性仅占其中的15%左右。非功能性PETs通常没有明显的临床内分泌紊乱症状，患者多以上腹部不适或偶发上腹部包块就诊。而功能性PETs可因肿瘤分泌的主要激素不同而分为不同的亚型，它们各自都有特征性的临床症状。胰岛素瘤是最常见的功能性PETs。影像学所见对于PETs的术前定位及定性诊断有重要价值。B超与CT不仅能显示胰腺全貌，而且还能显示周围器官及淋巴结有无转移，为术前判定肿瘤良恶性、术式选择及切除范围提供依据。实验室检测血糖浓度、血浆激素水平等生化指标对功能性PETs的诊断也有重要价值。
关键词：红瘰疣螈（Tylototriton verrucoosus Anderson）;消化系统;消化腺
中图分类号：Q945.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）12-2846-04
Microanatomy Observation of Digestive System in Tylototriton verrucoosus Anderson
XIAO Xiao-liu，PENG Dong-yan，DU-qin，LI Hong-mei
（Yuxi Normal University， Yuxi 653100，Yunnan，China）
Abstract： In this experiment， paraffin-embedded， HE staining， conventional continuous slice were adopted on digestive histological observation of Tylototriton verrucoosus Anderson. The results showed that the esophagus of Tylototriton verrucoosus Anderson consisted of epithelial cells， mucosal layer， submucosa， muscle layer， esophageal glands， goblet cells， outer membrane; and the stomach composed of epithelial cells， folds， submucosa， gastric pits， tunica propria， muscle layers and gastric gland. The duodenum， ileum， rectum were made of the epithelial cells， folds， goblet cells， muscle layers. The gastrointestinal epithelium was simple columnar cells. The esophagus had groups of esophageal glands， thick mucous layer which folded inward to form plica， and developed single tubular gastric gland. The intestinal were rich of goblet cells yet least in duodenum and gradually increasing in ileum and rectum.
Key words： Tylototriton verrucoosus Anderson; digestive system; digestive gland
红瘰疣螈（Tylototriton verrucoosus Anderson）是两栖纲（Amphibia）有尾目（Caudata）蝾螈科（Salamandridae）疣螈属（Tylototriton）的代表动物之一，云南省主要分布于丽江、腾冲、保山、景洪、新平等地区[1]。体色因其生活环境而有所差异[2]，指4，趾5。主要以蚯蚓、蜈蚣、步行虫、蜗牛、黄粉虫等为食，为杂食性动物。红瘰疣螈属于水生脊椎动物向陆生脊椎动物过渡阶段的一个类群，其生活环境特殊，因而其对研究动物系统进化有重要意义[3]。目前，中国有很多学者对红瘰疣螈做了研究，例如，从线粒体Cyt b基因探讨红瘰疣螈物种地位的有效性[4]、体温调节[5]、繁殖生态[6，7]、皮肤显微结构观察[8]等。本研究对红瘰疣螈消化系统做了组织学研究，并与其他动物作比较，探究其内部构造对其生活环境的适应性，也为两栖动物组织学研究提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用活体红瘰疣螈采自云南凤庆县小湾镇，3雌1雄，平均体长15.5～18.6 cm，游标卡尺测量。平均体重14.4～22.1 g，雌性个体比雄性个体大，体色鲜艳且生长状况良好。
1.2 方法
取消化系统和呼吸系统各部分组织用8%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，常规石蜡切片，切片厚度一般为5 μm左右，经HE染色，显微镜拍照，观察。
2 结果与分析
为叙述方便起见，将红瘰疣螈消化道分为食道、胃、十二指肠、回肠、直肠。
2.1 消化系统的组织结构
红瘰疣螈的食道由固有膜和单层上皮细胞共同向食道腔形成多个褶皱（图1-1），皱襞高度为153.6～706.4 μm 。黏膜上皮为单层柱状上皮，黏膜层厚度为67.2～124.8 μm。表皮细胞有4～6层，细胞核椭圆形，位于细胞基底部，厚度为57.6～134.4 μm。表皮细胞间有杯状细胞，大小为9.6～38.4 μm。黏膜基底层上皮细胞呈矮柱状，细胞核呈圆形或椭圆形，黏膜基底层可见不甚明显的泡状食管腺，黏膜下层为疏松结缔组织（图1），其间分布有血管、神经和空泡状细胞，其下为肌肉层，肌肉层由平滑肌构成内环外纵两层，其间还有扁平状的浆细胞。外膜由外向内由浆膜和纤维膜构成，浆膜厚105.6～192.0 μm，纤维膜厚度为1.5 μm左右。
胃可分为贲门胃、胃体和幽门胃三部分。红瘰疣螈胃的腔面里有10～12个褶皱组成的皱襞群（图1-2），高度为163.2～556.8 μm，由黏膜层和黏膜下层组成。黏膜上皮为单层柱状细胞，大小为3.4～6.8 μm，细胞核为椭圆形被染成深紫色，位于细胞基底部，细胞质被染成粉红色，嗜酸性。胃黏膜上皮下陷到固有膜形成单管状胃腺，且胃腺发达，细胞核大且呈圆形或近似于圆形，位于细胞中央。黏膜下层由疏松结缔组织组成，在结缔组织之间有成堆的脂肪细胞和血管，以及壁细胞和颈黏液细胞，壁细胞近似于圆形，细胞核呈圆形且位于细胞中央，颈黏液细胞为长柱状细胞，细胞核椭圆形，位于细胞基部。胃肌肉层由内层环肌和外层纵肌构成，环肌较厚，占肌肉层的2/3，最外层膜为一层纤维膜。
红瘰疣螈十二指肠黏膜层较发达（图1-3），黏膜上皮为单层柱状上皮。黏膜向肠腔内形成10～15个皱襞，皱襞高201.0～668.4 μm，皱襞的表层有较丰富的绒毛，绒毛高9.6～28.8 μm，其下为高柱状细胞，在小肠中数量最多，大小为7.8～14.4 μm，细胞核椭圆形或长椭圆形，位于细胞中央，大小为4.8～7.8 μm。在柱状细胞中有巨型杯状细胞，杯状细胞为长椭圆形，个体较大。固有膜内分布着肠腺，还可见少量的乳糜管。黏膜肌层较胃肌层薄，由内环外纵两层平滑肌组成，环肌较厚，纵肌较薄，两层肌肉之间有疏松结缔组织连接，可见微血管，黏膜下层为疏松结缔组织，分布有血管、神经等。
红瘰疣螈黏膜向肠腔内形成多个以单个个体形式存在的皱襞（图1-4），黏膜上皮为单层柱状上皮，黏膜表层有一层绒毛（图1-5），柱状细胞数目较多，大小为23.5～35.8 μm，细胞核大多为圆形，少数为椭圆形，较小，位于细胞中央。在柱状细胞中有杯状细胞，呈短椭圆形，直肠中最多（表1）。肌层较明显，但不发达，内环外纵，环肌较薄，纵肌较厚。
直肠黏膜上皮为单层柱状上皮（图1-6），具微绒毛，柱状细胞数目最多，细胞呈椭圆形或圆形，细胞核近圆形，位于细胞中央，柱状细胞中还分布有较多的杯状细胞，杯状细胞近似于圆形。直肠肌肉层环肌和纵肌同等发达，内环外纵，纵肌上分布有脂肪细胞。
2.2 消化腺的组织结构
由单层柱状细胞及肌肉层组成（图1-7），细胞层排列整齐紧密，大小为1.0～12.5 μm细胞为椭圆形，相邻细胞分界不明显，细胞核呈椭圆形，位于细胞中央。肌肉层较薄，厚度为15～50 μm，为单层的纵肌，其间分布有脂肪细胞。
在40倍光学显微镜下观察到肝小叶之间分界不明显，肝小叶分界处有肝管（图1-8），在肝小叶的中央有一条中央静脉（图1-9），管径小，静脉腔不明显。肝细胞呈不规则的多边形，分界清楚，胞质丰富，呈颗粒状，部分肝细胞出现空泡和空隙（图1-8）。细胞核呈圆形或椭圆形，位于细胞中央。肝细胞由6～10个围绕中央静脉呈放射状排列成肝细胞索（图9），大小为33.6～76.8 μm，肝细胞索之间形成的空隙为窦状隙，窦状隙呈狭长型，其内可见残留的血细胞。此外，肝实质内有黑色颗粒聚缩形成黑色素团，体积大小不一样，分布也不均匀，其间分布有肝血窦。肝的表面为一层薄薄的浆膜，结缔组织少，紧接着结缔组织是由5～6层单层扁平细胞组成的表皮细胞。
外膜为一薄层结缔组织（图1-10），胰腺细胞形状不规则，细胞核椭圆形，位于细胞基底。排泄管贯穿于腺细胞之间，排泄管内可见分泌物（图1-11），经HE染色后呈红色，嗜酸性。
3 讨论
红瘰疣螈处于水生到陆生的过渡阶段，它的消化系统需要面临由水生生活转变为陆生生活带来的序列问题，所以在结构上有一序列相应的特征之与相适应。
3.1 红瘰疣螈消化道与其他两栖类动物的比较
从解剖学上来讲红瘰疣螈食道短而粗，利于红瘰疣螈在捕食时将整个食物都吞进去，与大鲵[9]相似。从组织学上来讲，红瘰疣螈食管内有纵行的皱襞，当吞咽食物时，皱襞平展，这就大大扩大了食道管腔的面积，且皱襞上有黏液细胞，可以分泌黏液以湿润食物助于吞咽。红瘰疣螈黏膜下层相对较厚，增强了消化道各部分组织的舒展性，使食物在消化道中得到充分的消化吸收，与鲢鱼[10]黏膜下层较薄有差异，这一点说明红瘰疣螈在进化过程中细胞分化更为完全。在食道黏膜下层分化出体积大小不等的两种杯状细胞，与中华蟾蜍[11]、版纳鱼螈[12]食道黏膜上皮细胞中的杯状细胞相似，其主要功能是分泌蛋白[13]，起作用，能够保护消化道并利于食物顺利通过。与版纳鱼螈等有尾及大多无尾两栖类[11，14，15]相似，都有食道腺，但与版纳鱼螈[12]不同，版纳鱼螈食道腺为团泡状腺，红瘰疣螈为单管状食道腺。食道最外层为浆膜层，与鲢鱼[10]浆膜层相似，由扁平细胞组成。
红瘰疣螈胃内壁较粗大的皱襞和发达的肌肉结合，大大增加了胃的舒展性，可以容纳体积较大的食物，而花背蟾蜍[16]胃中皱襞更加发达，为5～7条纵行的皱襞组成且胃中皱襞高度相对其他组织高，这表明它的胃具有较强的舒张性，皱襞高就使得食物在胃中停留时间延长。胃的上表皮有丰富的单层柱状上皮细胞和颈黏液细胞、壁细胞，它们共同促进了胃对食物的蠕动。胃里还有丰富的胃腺，分泌胃液，使食物得到湿润，有利于食物的消化吸收，这些结构的结合使得食物得到初步的消化并被迅速送到肠内。
红瘰疣螈的十二指肠、回肠、直肠有高度不同的皱襞，从前到后皱襞逐渐变矮，皱襞在食物消化过程中起到了屏障作用，使食物在消化道内停留的时间加长。小肠内壁有丰富的绒毛，增加了食物与肠道的接触面积，使食物的消化吸收更加充分，同时绒毛还具有缓冲作用，可预防食物对消化道的机械损伤。十二指肠中有丰富的绒毛（高9.6～28.8 μm），体现了十二指肠的重吸收作用，但没有中华蟾蜍[11]绒毛发达（高40.8～52.8 μm）。肠中有丰富的杯状细胞，食道、十二指肠、回肠、直肠中数目依次增加，与文县疣螈[17]相似，在排便过程中水分得到重吸收，体内水分得到保持，干燥的粪便顺利排出体外，减少对水分的散失，更加适应陆地生活。
3.2 红瘰疣螈消化腺与其他两栖类动物的比较
红瘰疣螈肝脏较发达，肝细胞为不规则多边形，细胞核较大，位于细胞中央，呈圆形。肝细胞中还有大量的空泡和空隙，与大凉疣螈相似，李蓓等[18]在成体大凉疣螈肝脏的组织形态学观察中认为肝脏细胞质空泡和空隙中分布着脂质和糖原，是重要的储能器官。红瘰疣螈与大凉疣螈为同一属的动物，因此也认为红瘰疣螈肝脏细胞的空泡和空隙有脂质和糖原的分布，能储存更多的能量。肝实质内还有黑色素颗粒组成的黑色素团，且成堆存在，经分析认为，这与已报道的蝾螈科[18]种类相似，是低氧环境下保护性适应的结果。肝脏还是重要的代谢器官，发达的肝细胞增强了红瘰疣螈的代谢功能，红瘰疣螈肝脏细胞特点与其功能相适应。
致谢：感谢李泽君老师及茶云肖、段生丽同学对本项目研究提供的帮助。
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乙肝是一类大病，在我国感染人数有1到2亿，目前国内或者国外对于乙肝的治疗主要方法还是抗病毒保肝护肝的治疗。主要是由于乙型肝炎病毒cccDNA在感染者肝内长期存在，并作为HBV复制的模板，成为根治乙型肝炎病毒感染的困难所在。然而，患者的病情往往会反反复复，即使对于患者的病情控制的非常得当，也只能在一段时间内起到较好的效果。如何能够彻底的治愈，现在还没有很好的方案，因此，准确地检测肝内和/或血清HBV cccDNA的量对病情判断、疗效评估和预后均有重要的意义。
1 HBV 感染与复制过程
1.1感染途径 ：乙型肝炎病毒感染人体主要是通过血液传播，大多数情况通过注射；二是通过母婴传播；其次性传播。无论通过哪个途径，乙肝病毒进入血液循环在体内流动，会经过人体的一个非特异性免疫清除，在血液循环里面要经过吞噬细胞的吞噬。病毒在循环中突破了这些屏障，游离到它需要复制的靶位，即肝细胞。病毒进入肝细胞复制，首先要使肝细胞接受它，也就是说肝细胞上要有受体与病毒结合。病毒可以依靠肝细胞的细胞膜的某一部分，通过胞引作用进到肝细胞内。病毒可以在此释放核酸，核酸在肝细胞内依靠细胞内的原料进行复制和合成。1.2复制与免疫应答：病毒一旦在肝细胞内复制，肝细胞就会有核酸出现，核酸产生后核心抗原就会相应的出现。核心抗原会包裹核酸，但由于核酸分子较小，包裹以后会有多余的一部分结构。多余的部分可以被核内的一些酶切掉，这一部分就是 E 抗原。因此 E 抗原的存在就是乙肝病毒复制的一个标志。 E 抗原从肝细胞释放到细胞以外，血液循环里面就能够检测到 E 抗原的存在。人体的免疫细胞就会通过免疫的应答产生相应的抗体，即 E 抗体。在病毒复制的初期， E 抗原产生的量要大于抗体，因此这时检测到的是 E 抗原而 E 抗体检测不到。如果病毒处于复制的高峰期，释放的抗原在血液循环内增加，特别是大蛋白的抗原，包括表面抗原的大蛋白，就可以诱导的人体细胞对它进行识别和应答。1.3免疫损伤：人体除在血液循环内对抗原进行应答之外，含有病毒复制的肝细胞还会有细胞膜结构的一些变化。这些变化可以诱导人体的免疫细胞，对有病毒的肝细胞进行免疫应答，从而对该细胞进行杀伤，使肝细胞发生免疫损伤，细胞内的转氨酶就会释放到血液循环内，细胞核也会破碎从而把细胞内的物质释放出来，这就是免疫应答的过程，导致了免疫损伤。因此也导致了我们所说的肝功能损害，通过一些生化指标的监测可以监测到肝功的损害。1.4cccDNA 的形成：乙肝是慢性疾病，乙肝病毒在肝细胞内是连续传代。病毒一旦进入肝细胞以后就会开始复制，复制出的病毒就会从肝细胞里面释放出来，而释放出来的病毒除了被人体免疫系统进行识别和杀伤之外，还有一部分会再侵犯其他的肝细胞，并在其他肝细胞里面再进行这样的复制，如此循环。能够在肝细胞里复制的病毒是有活性的，这种乙肝病毒它的 DNA 是松散的双链结构。它是个这种双链结构是松散的而不是闭合的环结构。但是，有些病毒的核酸在进到肝细胞的细胞核以后，在 DNA 聚合酶的作用下，将环形松散的缺口补齐，变成一个超螺旋的共价、闭合、环状 DNA ，即 cccDNA 。
2 HBV cccDNA 的概念及意义
2.1“睡眠”的病毒 DNA：cccDNA 形成之后状态比较稳定，可以称其为肝细胞核内“睡眠”的病毒 DNA ，当病毒活跃性复制时，它又可以作为一个模块来复制病毒。一般在每个肝细胞核内，可以有 5～50 拷贝的 cccDNA。2.2cccDNA 的意义：cccDNA在肝细胞内很稳定，只要肝细胞不被破坏很少释放到外周血液循环，因此很难从血液中检测。但如有大片肝细胞坏死，大量的 cccDNA 就会从细胞核内释放到血液循环，此时人体的免疫系统除对释放的 cccDNA 有应答外，对于人的细胞核也会产生抗体，即抗核抗体。抗核抗体的存在是细胞核暴露所引起的。目前通过肝活检来监测乙肝患者肝组织中的cccDNA水平变化存在着一定困难，因而监测血液中的cccDNA的动态变化也许更具有现实意义。当然，其中还存在一些问题有待研究和解决，比如血液中的cccDNA水平远远低于肝组织中的cccDNA水平，也远远低于血液中的的rcDNA水平，因此必须进一步提高cccDNA定量检测的灵敏度。
3 针对 cccDNA 的治疗现状
目前临床治疗时虽然很多抗病毒药物，但并没有能够进到细胞核以内的药物，还不能够达到清除细胞核内 cccDNA 的目的。现有的抗病毒治疗只是抑制病毒的复制，而不能把藏匿于核内的，复制的最基本模板―― cccDNA 去掉。因此肝病往往是慢性的，而且比较容易复发，所谓复发，就是在肝细胞核内“睡眠”的病毒 DNA 按照病毒自身的复制周期进行复制。 对于肝细胞以外的器官是否有 cccDNA 的存在，目前还在研究阶段。另外，目前还没有一个比较稳定、可靠和敏感的 cccDNA 检测的方法上市，因此 cccDNA 的检测和治疗都是相当困难的。
4 cccDNA 和 rcDNA 的差异
4.1一级结构差异：从核酸的一级结构来看 cccDNA 是一条完整的双链，是共价闭和环。松弛环状 DNA（ rcDNA ），虽然也是环状的，但是它是有缺口的，它不完整的。4.2空间结构差异：从核酸空间结构来看cccDNA 是超螺旋结构；rcDNA 是松弛环状，不是超螺旋的结构。4.3与蛋白结合差异：cccDNA 因为已经形成了稳定的共价闭合环状的结构，所以不能和蛋白结合。而 rcDNA 却可以和蛋白共价结合，因此如果通过沉淀蛋白的方法来提取乙肝病毒的DNA ，所得到的更多的是cccDNA ，因为rcDNA 可以和蛋白结合被沉淀下去。4.3核酸酶抗性差异：cccDNA 对某些核酸酶的抗性较强，一般不易被降解，而 rcDNA 则相对较弱，很容易被降解。
关键词： 5型腺病毒；间充质干细胞（MSCs）；胰腺十二指肠同源框蛋白1（PDX1）；成对盒基因4（PAX4）；转录因子
中图分类号：Q78文献标志码：A
文章编号：1672-1098（2016）02-0080-07
Abstract：With the use of pADxsi system， the recombinant adenovirus of expressing PDX1 and PAX4 is in place.GFP in the pShuttle-GFP-CMV vector is replaced with the target gene of PDX1 obtained from the pEGFP-N1-PDX1 plasmid， resulting in the pShuttleCMV-PDX1 plasmid. With the pEGFP-N1-PAX4 plasmid cut off， PAX4 is inserted into pShuttle-CMV-PDX1 to acquire the pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4 plasmid. Afterwards， the CMV-PDX1/CMV-PAX4 fragment is transferred to the ADxsi skeleton vector to get the pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4 virus vector. Finally， the recombinant adenovirus is packaged， amplificated， and titrated in HEK293 cells for the infection of human umbilical cord mesenchymal stem cells. The structure of pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4 adenovirus expression vector is confirmed by means of a restriction analysis and PCR. RT-PCR and Western blot results have established that the target genes are persistently expressed in the infected cells.The recombinant human PDX1 and PAX4 expressing adenovirus is successfully constructed， packaged， and amplificated.The target genes can be continuously presented in mesenchymal stem cells.
Key words：adenovims vector；pancreatic and duodenal homeobox factor 1；paired box gene 4；mesenchymal stem cells
糖尿病是由于胰岛β细胞功能绝对或相对缺陷，以慢性高血糖为特征的终身性代谢性疾病[1-2]。长期血糖增高，可导致大血管、微血管受损并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等，每年因糖尿病死亡者有一半以上是心脑血管所致，10%是肾病变所致；因糖尿病截肢是非糖尿病的10～20倍[3-4]。因此，预防糖尿病的并发症并最终控制血糖是重要的社会问题。
至目前为止，控制患者血糖仍主要是依赖每天胰岛素的补充，给患者生活带来极大的不便与沉重的经济负担。寻找具有合成与分泌胰岛素的细胞进行细胞替代治疗一直是研究的热点。近年来研究证实间充质干细胞具有多向分化的潜能且无免疫原性，是一类极具应用潜能的干细胞[4-5]。胰十二指肠同源框基因1 （pancreatic and duodenal homeobox factor 1，PDX 1）在胚胎发育过程中具有促进胚胎干细胞向胰腺的早期发育和晚期胰岛素分泌细胞分化的功能[6]；此外，还具有维持胰岛β细胞合成与分泌胰岛素的功能[7-8]；然而，单独的PDX1转录因子并不能有效诱导干细胞定向向胰岛β细胞分化，在胰腺前体分化与发育过程中，成对盒基因4（paired box gene 4，PAX4）表达将有利于胰腺前体细胞定向向β细胞分化，并参与调控β细胞功能的成熟[8-10]。因此，PDX1与PAX4联合作用对诱导MSCs定向向具有合成与分泌胰岛素功能的β样细胞可能具有促进作用，基于这一假设，在本研究中，选用对MSCs具有较高感染效率的Ⅴ型腺病毒载体，构建携带目的基因PDX1与PAX4的重组腺病毒ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4，感染MSCs细胞，以观测所携带的目的基因表达情况，为进一步研究PDX1与PAX4在诱导MSCs向具有合成与分泌胰岛素功能的β样细胞分化的可能及其分子机制奠定实验基础。
1材料和方法
1.1材料与试剂
Bgl II等多种限制性内切酶、Klenow及T4 DNAligase均购自美国Sigma 公司；CIP（Alkaline Phosphatase，Calf Intestinal）酶、质粒提取纯化试剂盒和凝胶回收试剂盒购自北京天恩泽公司；腺病毒pADxsi载体系统由上海汉恒生物有限公司提供；293细胞及DH5a菌株由深圳清华研究院郑义博士惠赠，pEGFP-N1-PAX4与pEGFP-N1-PDX1质粒为前期本实验室所构建。Anti-PAX4 antibody （ab42450）/IgG、Anti-PDX1 antibody （ab47383）/IgG购自美国Abcam公司，HRP标羊抗鼠IgG、HRP标羊抗兔IgG、FITC标羊抗兔IgG、CY5标羊抗鼠IgG购自eBioscience公司。Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成；RT-PCR试剂盒为北京天恩泽公司； DMEM/F12培养基购自武汉博士德生物工程有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Hyclone公司。原代人脐带间充质干细胞购自北京医科利昊生物科技有限公司。
1.2方法
1） pADxsi-CMV- PDX1/CMV- PAX4腺病毒载体的构建。 首先构建pShuttle-GFP-CMV- PDX1穿梭质粒：已知PDX1序列上游有Nhe I和Bgl II酶切位点，下游有Sal I和EcoR I酶切位点，首先用Sal I酶切pEGFP-N1- PDX1，再用Klenow平端处理，最后用Nhe I酶切，回收0.66 kb片段；其次用Nhe I和Pme I双酶切pShuttle-GFP-CMV载体，替换GFP， CIP去磷酸化处理，回收载体片段5.2 kb；最后，酶连切好的载体片段和插入片段，获得pShuttle-CMV-PDX1。再构建pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4穿梭质粒载体：从pEGFP-N1-PAX4上用BamH I和Sal I双酶切切下PAX4（PAX4序列上游存在BamH I和Bgl II酶切位点，下游存在Xba I和Sal I酶切位点）；同时对pShuttle-CMV- PDX1载体用BamH I和 Sal I双酶切，CIP去磷酸化处理，胶分别回收与纯化载体与酶切PAX4目的基因片段并用T4 DNA 连接酶酶连得到pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4穿梭质粒。最后用T4 DNA 连接酶酶连目的片段pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4和pADxsi骨架质粒；转化产物并转染DHSa，扩增pADxsi -CMV-PDX1/CMV- PAX4质粒，对质粒产物进行提取并进行电泳签定，产物由上海丰恒生物科技有限公司进行测序鉴定。
2） 重组腺病毒的包装、扩增和滴度测定。 Pac I酶切线性化重组腺病毒质粒，用Lipofectamine 2000脂质体转染细胞密度约80%的293细胞。3～5 d后，开始出现明显噬斑，待大部分细胞病变（cyto-pathic effect，CPE）时，收集细胞混悬液，于-80℃/25℃反复冻融3次，再离心收集上清，继续感染293细胞扩增病毒以提高腺病毒（ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4）滴度，TCID 50法测定病毒滴度。
3） ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4感染MSCs与目的基因表达。 于六孔板接种MSCs细胞5.0×105/孔，细胞密度达80%时，按感染指数为10PFU/细胞、50PFU/细胞、100PFU/细胞加入相应量的腺病毒液；同时设ADxsi-CMV-GFP感染的空病毒对照组。当实验进行到相应阶段时，即培养到24h、48h和72h等阶段分别收集细胞行WB、免疫细胞化学与间接荧光检测；同时RT-PCR检测目的基因表达，引物分别如下PDX1 的F：5′-AAGCTAGCCCGCAGCCATGA-3′、R：5′-TCCTCGAGTCATCGTGGTTCCTG-3′，Tm为61.5℃，扩增目的片段为882bp；PAX4：F：5′-TCCCAGTGTCTCCTCCATC-3′、R：5′-ACCTTTCCGGTGCTGTTGC-3′，Tm为60 ℃，扩增目的片段为515 bp；内参照分子GAPDH：F：5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′、R： 5′-TGAGGAGGGGAGATTCAGTG-3′。
（4）Western blotting检测
胰酶消化，收集目的细胞，裂解细胞并离心取上清液，应用15%的SDS-PAGE胶电泳2h后，湿转移法至PVDF膜，脱脂牛奶TBST液封闭1h，再分别加抗人PAX4、PDX1抗体IgG液振荡过夜，HRP标记相应二抗亲合反应后ECL显色。
2结果
2.1鉴定重组腺病毒质粒
Xho I酶切pADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4病毒质粒，阳性克隆pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4由以下6条带组成即：14 kb、11.8 kb、5.9 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb；而阴性克隆（pADxsi骨架质粒）只有以下6条带组成：14 kb、11.8 kb、4.0 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb；酶切结果阳性质粒均与理论预期一致，具体酶切结果（见图1）。
2.2重组腺病毒的包装和滴度测定
Pac I酶切线性化的pADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4重组腺病毒质粒经脂质体Lipofectamine2000转染293细胞后3 d，开始出现病变效应（见图3）。120 h后，此时约70%细胞悬浮，收集细胞与上清液体，冻融后，再应用293细胞重复扩增、收集病毒液。空斑计数法（PFU）测定病毒滴度为1.0×108 PFU/mL；使用同样方法测定对照组。空载腺病毒ADxsi的滴度为2.0×108 PFU/mL。
2.3 目的基因表达
MSCs在光学显微镜下呈典型的长梭形，呈漩涡状或放射状平行排列（见图4）； ADxsi-CMV-GFP空病毒感染后24 h即可在荧光镜下观察到GFP表达。免疫细胞化学染色与间接荧光分别证实ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4腺病毒以感染复数（MOI）=100感染目的细胞 （MSCs）24 h后，实验组MSCs的细胞核中即可检测到PDX1与PAX4 mRNA；细胞化学检测显示，PDX1与PAX4 主要定位于细胞核内，阳性率高于75%。间接荧光同样证实细胞核中PAX4（FITC）与PDX1 （CY5）均稳定表达（见图4）。
转染后光镜下的细胞形态相同于正常的MSCs细胞形态，呈梭形排列，应用ADxsi-CMV-EGFP空病毒感染细胞后，可见到细胞内绿色荧光表达，分别应用抗体检测PDX1与PAX4表达与定位，荧光结果显示PDX1与PAX4均定位于细胞核内，且免疫细胞化学检测也证实两转录因子定位于细胞核内，且稳定表达。
2.4 目的基因转录与表达
RT-PCR法与WB分别检测重组腺病毒ADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4转染后不同时段细胞内目的基因mRNA和蛋白表达结果显示：MSCs胞质内PDX1与PAX4 mRNA水平稳定；进一步Western blotting（WB）法检测感染后12 d的细胞核内PDX1与PAX4蛋白一直稳定表达（见图5），提示重组腺病毒ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4可以有效感染MSCs，且目的基因均能稳定表达，这为后续研究目的基因在MSCs转分化过程中的功能奠定实验基础。
3讨论
MSCs具有多向分化潜能，为探讨MSCs分化为合成与分泌胰岛素功能的胰腺β细胞，选用了在胰腺前体细胞向β细胞分化过程中起关键作用的两个转录因子PDX1与PAX4[8-11]，并构建对MSCs具有稳定转染能力的Ⅴ型腺病毒载体[12-13]，用PDX1换去示踪基因EGFP，把PAX4基因插入到多克隆位点，构建并包装成带PDX1与PAX4双目的基因的活性重组腺病毒（ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4），酶切结果与测序结果证实重组腺病毒构建成功，目的基因连接正确。
应用ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4感染MSCs结果显示，重组病毒可以稳定高效感染MSCs，间接荧光检测结果显示，转染的MSCs在细胞核稳定表达PDX1与PAX4分子，细胞化学染色结果同样证实PDX1与PAX4分子定位于在MSCs细胞核内，这提示带PDX1与PAX4转录因子基因的重组腺病毒不仅可以高效感染目的细胞，并且稳定表达目的转录因子，而且所带的转录因子均具有核定位功能。
另一方面应用RT-PCR技术检测转录重组腺病毒的MSCs细胞内目的基因的转录水平表明目的基因在重组腺病毒感染细胞后仍可以检测到转录目的基因的mRNA水平稳定，提示在腺病毒的CMV启动子的作用下，目的基因在细胞内稳定转录。进一步抽提感染腺病毒的MSCs的细胞白，并行WB检测PDX1和PAX4转录因子蛋白水平，发现两种转录因子在细胞核水平稳定，这一方面提示腺病毒的CMV启动子具有强的启动目的基因转录功能，另一方面，目的转录因子稳定定位于细胞核，说明表达的转录因子具有核定位能力。的并且能稳定转录与表达PDX1与PAX4分子。
综上检测结果证实， PDX1与PAX4双带目的基因的Ⅴ型重组腺病毒被成功构建，重组腺病毒所带的目的基因均能稳定转录与翻译成功能转录因子PDX1与PAX4，且两功能转录因子均具有核定位功能，这为下一步研究2功能转录因子在诱导MSCs定向向胰腺β细胞分化过程中的功能与分子机制奠定了实验基础。
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初见马炯，并没有想象中那么严肃。他坦诚、开朗、爱笑，直言不讳，又分寸有佳。他聊星座，说自己能在两个领域里吃香大概是“托了这个双子座的福”；还笑言自己是追星族，并拿出与诺奖得主的照片和记者一同分享。而谈及他的科研工作，马炯并没有太多地说起科研工作的辛苦，而是更多地分享他的步步历程。
一半是技术，一半是生物
马炯1999年进入复旦大学物理系，2008年取得物理系光学专业博士学位。博士阶段开始，马炯就致力于发展光学技术与生物课题相结合的研究工作。期间他曾作为访问学者前往南非罗德斯大学化学系和挪威奥斯陆大学生理系进行学术交流。
在南非期间，他确认水溶性CdTe量子点的光催灭机理，首次测定其单态氧产量，并开创出一种应用于其实现光动力治疗癌症的方法。2008年赴美从事博士后工作后，他一直致力于发展新型的单分子超分辨荧光显微镜，用于细胞核孔复合物的研究工作。在美国，马炯与Yang教授共同开发了SPEED显微技术，并在10nm空间精度和400μs时间精度下，研究了各类分子穿越细胞核孔的选择机制。他首次观测到细胞核孔内非折叠蛋白的三维结构，并首次获得生物小分子穿越细胞核孔三维路径，确定了其间的选择性机制，并于2010年及2012年在Proceedings of the National Academy of Sciences上发表了两篇高质量论文。
马炯还与Walter教授合作，开发应用于超分辨显微镜的mRNA荧光标记系统，结合单分子显微追踪技术，完成了mRNA穿越核孔的选择机制的初步研究，确认了mRNA核孔输出三维路径，纠正了一维路径数据所造成的认知误解，并发表在Nature Communication上。
而谈到技术和生物研究，马炯说他从来没有纠结两者之间的取舍，而是始终游走在两者的平衡之中。曾经在南非和挪威做访问学者的时候，他感到技术上偏重太多时，就在前去美国的时候有意识地加重了生物研究的选择。技术是他的“技”，而生物就是他的“巧”。有技方成巧，通过超分辨率光学显微镜的技术不断提高，他在细胞核孔复合物领域的研究也不断加深；以巧推动技，通过细胞核孔复合物实验研究的需求，他又不断革新超分辨光学显微镜的技术。双子的多面性，他展现在了科研领域中，并且大获成功。
2015年6月，马炯归国。他坦言，归国的一部分原因是因为故乡的父母，另一部分则是国家现在对于青年学者的重视，能够让他在最有精力的时刻投入到科研中去。“能够为国家做一点事情，国家也重视我做的事情，这当然是再好不过了。”马炯笑言。
超分辨光学显微镜下看世界
显微镜的发展满足了人们对观察微观世界的需求，让人们可以看得越来越“小”。但由于衍射极限的存在，几十年来光学显微镜的分辨率停滞在了200nm左右。2014年诺贝尔化学奖颁发给了美国及德国三位科学家Eric Betzig、Stefan W. Hell和William E. Moerner，获奖理由是“研制出超分辨率荧光显微镜”。几位获奖者巧妙设计了避开衍射极限的方法，其研究突破性地将光学显微镜带入了纳米维度。在纳米显微镜下，科学家实现了活体细胞中单个分子通路的可视化，能够观察到分子是如何在大脑神经细胞之间生成神经突触；可以追踪帕金森病、阿尔兹海默症和亨廷顿症患者体内相关蛋白的累积情况；还能跟踪受精卵在分裂形成胚胎时蛋白质的变化过程。现在已经进入了“光学显微镜2.0”的时代，超分辨荧光显微镜推动着新一轮生物医学的飞速发展。
现今，已具有多种不同超分辨成像技术实际应用于生物系统的范例，也已出现了商业化的超分辨显微镜系统，但仍然没有达到完美状态。在许多生物研究中，各类超分辨系统有着各自的局限性，如对于特殊荧光标记的发光特性依赖，或是高空间精度测量制约了探测时间进一步缩短。因此，研究和发展合适新的原理和方法，研制出适合专项生物课题研究的显微镜将是今后发展的一大方向。
谈起二维到三维的超分辨退卷积计算开发的时候，马炯说起了一个有意思的故事：他做出这个开发之后，花了整整一个星期的时间说服他的老师来相信他的成果，因为他的老师根本无法想象有人可以做出从二维分布中获取系统的三维分布的开发。而当他的老师认可了他的成果，他和他的老师又开始一起说服领域里的其他研究者一起应用这项成果的相关研究人员。“这告诉我们，固化思维的可怕。科技要进步，科研人员要创新研究，首先就要从打破自己的固有传统认知开始。”马炯严肃地说。
归国后的马炯将开始着手建立显微镜第二平台荧光返还探测技术，实现兼具超高的时间和空间分辨率的三维分子荧光追踪系统。他将把研究中所获得的信息将与跟踪RNA输出细胞核孔的研究互相印证，通过分析RNA在细胞核孔各位置的高时空精度动态过程，进一步研究细胞核孔蛋白调控基因的机理。此外，研究中所发展的原理和方法还将能够被广泛用于毫秒量级甚至更快的纤毛内分子运输、细胞间分子交换及跨膜通道开关等生物问题的研究。
在研究中，马炯将采用创新技术，促使实验系统同时具有很高的时间和三维空间分辨率，在不影响平面二维光学分辨精度的前提下，不通过拟合点扩散函数，而在亚毫秒级时间分辨量级和10nm三维空间分辨量级，实现对三维单分子荧光信息的实时探测和分析，满足高速动态生物学研究的特点和条件。在新型光学系统中，他还将利用凹面镜返还光程无色差的光学原理，创新设计凹面镜荧光返还光路系统，能够将z方向信息转换成x-y水平方向的信息，从而获取单分子z方向的位置信息。
细胞核孔复合物探寻
在细胞核孔复合物的研究中，马炯将利用SPEED显微镜技术，完成各类FG屏障与各类主要的传输分子间反应区域的三维分布测量。细胞核孔复合物是真核细胞中连接细胞质和细胞核之间的选择性双向通道，控制着绝大部分细胞核所需的蛋白输入，以及核内基因物质的输出。可以说，核孔是细胞内基因调控中非常重要的一个环节。核孔的缺陷会导致核孔相关的白血病及阿尔兹海默症等疾病。其本身更是各类病毒侵入细胞的重要关口之一，各类病毒会通过不同的方式通过核孔，最终侵入细胞的基因表达系统导致疾病发生。核孔的结构与功能的研究将为各类基因调控机制的研究提供一环重要的依据，对核孔蛋白缺失相关的白血病、阿尔兹海默症的致病机制，以及各种类病毒的侵入机制等核孔相关病理机制或基因治疗提供关键信息。
一个NPC是由30种多不同的核孔蛋白构成，长约200nm、直径为120nm、中心内径为50nm的大分子复合物。其中有三分之一的核孔蛋白富含苯丙氨酸-甘氨酸（FG）氨基酸片段，且在自然状态下呈现出非固定形态，我们称之为FG-Nups。这些FG-Nups组成了具有选择性机制的FG屏障。FG屏障选择性地调控基因相关物质按照被动运输或者主动介入运输的方式进出细胞核：只有小于60kDa的分子才能通过被动运输的方式，自由扩散通过NPC；另一种方式是主动运输，如含有入核信号或者核孔输出信号的蛋白或复合物分子，在核孔运输蛋白帮助下，形成复合物，通过TRs与FG片段相互作用，从而通过FG屏障。TRs与需要传输的蛋白形成的复合物的结合与解离，通过细胞核内外的RanGDP和RanGTP的浓度梯度来调节。通过电子显微镜可以观察到细胞核孔结构蛋白，但却无法获得这些高度自由的非折叠蛋白的结构，所以至今在生理状态下FG屏障及其相关的核孔物质传输的机理仍不清楚。
马炯将利用SPEED显微镜技术，完成各类FG屏障与各类主要的传输分子间反应区域的三维分布测量。他将确认活细胞内FG-Nup相互反应的存在及相应的水凝胶分布。综合各反应分布，完成接近完善的FG屏障的完整分布。他还将利用基因敲除，获取缺失核孔蛋白的分布，理解其对白血病的致病机理及对腺相关病毒（AAV）基因疗法的调控机制。从传输蛋白间的竞争情况，了解细胞核孔在大通量物质运输下对应的优先选择机制。
达成这项研究的基础，是SPEED显微技术能在超短的时间内获得高精度的空间位置信息，调控光学设置的稳定和准确，以及对各不同分子不同扩散速率下，在确保单分子荧光定位精度的同时，优化实验条件获取最多的数据量，是实验成功的关键。拥有丰富的超分辨光学经验，这让马炯能够满足数据的准确性及稳定地产出量。据此，他将创新领先技术，努力实现分子竞争通过核孔的实验设计创新。
未来故事
回国后的马炯选择了他的母校复旦大学作为科研工作的新起点。这里熟悉的环境让他很快就进入到了工作当中并规划新的征程。
首先，马炯将继续提升SPEED显微技术的性能及推广其应用范围。所有的对称体系研究中，马炯的SPEED显微技术都可以推广应用。而在快速跟踪领域中，这项技术也具有明显优势。其次，他将继续完善超快速的实时单分子三维追踪。再次，马炯将提高静态单分子荧光定位下的超分辨图像精度。现在的主流超分辨显微镜是用了一种光开关蛋白来实现，这将会造成单位时间内的信号光的损失。马炯换了其他方式，利用分子运动进特定区域时将这个分子可能发出的所有荧光进行收集，从而提高静态单分子荧光定位下的超分辨图像精度。
此外，马炯还将利用单分子荧光图像获取除未知外的其他信息。他认为这部分是相当有意思的内容。利用这些单分子图像可以看到，随着探测时间的加长，随着分子运动速度越来越快，这个分子的单分子影像所占区域会越来越大，马炯可以通过这些分子的大小探测到运动速率的快慢，确定这个区域的黏滞性有多大，从而找到这个分子所在纳米位置的环境信息。
【摘要】 目的 探讨冬眠心肌细胞内TNF-α mRNA与心肌细胞凋亡的变化和意义，初步探索冬眠心肌形成的分子生物学机制。方法 行冠状动脉搭桥手术（CABG）的冠心病患者10例，术前1周内用多巴酚丁胺超声负荷试验（DSE）结合多普勒组织成像(DTI)确定冬眠心肌及正常心肌的存在部位，CABG术中根据检测结果进行取材（分别取正常心肌和冬眠心肌），并经电镜证实。取材心肌用 Tunel法检测心肌细胞凋亡情况，原位杂交法(ISH)测定TNF-α mRNA的活性。分析TNF-α mRNA与心肌细胞凋亡的关系。结果 冬眠心肌细胞凋亡数及TNF-α mRNA的表达较正常细胞高；TNF-α mRNA与冬眠心肌细胞凋亡数相关（r＝0.816，P＜0.05）。结论 心肌缺血缺氧时，心肌细胞内TNF-α分泌增加，TNF-α促进冬眠心肌的形成并诱导心肌细胞凋亡。
【关键词】 冬眠心肌；肿瘤坏死因子α；分子生物学机制
心肌冬眠(hibernating myocardium，HM)是心脏自动适应心肌慢性低灌注的一种反应，此时心肌灌注和心肌功能之间达到一种新的平衡。HM已成为近年来冠心病研究领域的热点之一，但迄今HM形成的确切机制尚不完全清楚。有研究发现，HM局部收缩功能与肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)高表达呈负相关［1］，TNF-а的高表达可以促进动物心肌细胞凋亡。TNF-α的表达与冠心病患者HM凋亡之间的关系鲜见报道。本研究观察冠心病患者HM细胞的TNF-α mRNA表达，同时观察HM细胞凋亡情况。
1 材料和方法
1.1 实验材料 TNF-α mRNA原位杂交试剂盒、细胞凋亡试剂盒均购自武汉博士德生物公司。冠心病患者的心肌标本由徐州医学院附属医院胸心外科协助取材。
1.2 心肌标本来源 10例心肌标本均来自2004年8月—2006年3月在我院胸心外科行冠状动脉搭桥手术（CABG）的冠心病患者，冠状动脉造影至少有1支冠状动脉狭窄程度大于85%。男性7例，女性3例，平均年龄（58.3±4.24）岁。术中取HM及正常心肌（normal myocardium，NM）。
1.3 HM定位
1.3.1 采用多巴酚丁胺超声负荷试验(DSE)结合组织多普勒成像（DTI）技术。将左心室按美国超声心动图协会方法分为相对应的16个节段。
1.3.2 DSE检查方案 试验分为静息、多巴酚丁胺10 μg/(kg·min)、30 μg/(kg·min) 3个级别，每级负荷维持5 min，于每级负荷时记录超声图像，并记录常规12导联ECG和血压；终止指标为：出现心绞痛；收缩压
1.3.3 室壁节段运动异常的判定 DTI测量心肌收缩期峰值平均运动速度。如静息时平均运动速度低于正常速度，负荷10 μg/(kg·min) 多巴酚丁胺时心肌运动速度较静息时明显增高，负荷30 μg/(kg·min) 多巴酚丁胺时心肌运动速度反而减低，此时定义心肌运动呈双相反应，判定为HM。
1.4 心肌处理 4%戊二醛、10%甲醛（含0.1%焦碳酸二乙酯，DEPC）固定，在电子显微镜观察确认后分别进行ISH、Tunel试验。ISH法测TNF-α mRNA，Tunel法检测细胞凋亡。原位杂交及Tunel法均按试剂说明书进行操作。
原位杂交探针序列为：
（1）5′-GAGCA CTGAA AGCAT GATCC GGGAC GTGGA-3′
（2）5′-GAGTG ACAAG CCTGT AGCCC ATGTT GTAGC-3′
（3）5′-GGGCA GGTCT ACTTT GGGAT CATTG CCCTG-3′
1.5 统计学处理 计量数据以±s表示，统计软件采用SPSS 13.0，统计方法采用配对t检验。检验水准α＝0.05。
2 结 果
2.1 病理结果 电镜下(×12 000)可见HM与NM比较有以下一些特点：心肌纤维数量减少、稀疏，心肌纤维数量减少主要集中在细胞核周围。心肌纤维数量减少时细胞容量无变化（这一点与细胞萎缩不同）；心肌细胞内出现糖原积淀；心肌细胞内线粒体体积变小，散在分布于胞质内；细胞核扭曲，可见散在的异染色质；心肌细胞内没有发生小泡、水肿、染色体肿胀、细胞核崩解、脂质沉积等细胞坏死和萎缩时常见的变化。见图1A。
2.2 原位杂交结果 HM TNF-α mRNA胞质着色成棕黄色（图1B），原位杂交用Leica Qwin图像分析仪测定平均灰度值。HM组TNF-α胞质平均灰度值明显高于NM组(P＜0.05)。见表1。
2.3 心肌凋亡细胞计数 NM细胞核呈蓝色，而HM中凋亡心肌细胞核呈棕黄色（图1C）。在光学显微镜下计数5个高倍视野（HPF，×100）中凋亡阳性心肌细胞核数目求其均值，HM组阳性心肌细胞凋亡数明显高于NM组。见表1。
2.4 HM 组TNF-α mRNA表达水平与心肌细胞凋亡数的相关性 HM 组TNF-α mRNA胞质平均灰度值与心肌细胞凋亡数成正相关（r=0.816，P＜0.05）。 表1 2组TNF-α mRNA测定的灰度值及心肌细胞阳性凋亡数的比较
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3 讨 论
TNF-α是一种具有多种生物学效应的细胞因子，人体包括心肌细胞在内的大部分细胞都能够合成TNF-α［3］，其参与介导多种疾病发生发展的病理生理过程。TNF-α主要由单核巨噬细胞产生，血管内皮细胞、平滑肌细胞也可合成释放。心肌也可分泌TNF-α，而且心肌细胞膜存在TNF-α受体。因此，心肌既是TNF-α的分泌场所，也是其作用的靶目标［4］。在生理状态下，TNF-α具有调节免疫应答、促进细胞生长分化、参与机体免疫反应等多种生物活性；在病理状态下则引起炎症反应、器官损害，使心肌细胞收缩力下降、心肌肥大及心肌细胞纤维化，最终导致心功能不全［5］。研究发现，TNF-α在心肌梗死患者心肌细胞凋亡中发挥介导作用［8］。Krown等［9］研究表明，TNF-α可使培养鼠的心肌细胞发生凋亡，且凋亡细胞数量与TNF-α浓度成正比。刘亮等［10］研究发现，缺血再灌注损伤和持续缺血可导致心肌细胞凋亡，抗TNF-α单克隆抗体预处理能明显减轻心肌细胞凋亡程度。本研究用DSE结合DTI的方法定位冠心病患者HM的部位成功取材，经电镜观察证实HM中TNF-α mRNA表达及心肌细胞凋亡数较正常心肌明显升高。TNF-α mRNA表达与与HM凋亡数目成正相关。表明心肌缺血缺氧时，心肌细胞内TNF-α分泌增加。TNF-α促进HM的形成，并可介导细胞凋亡。HM内凋亡细胞会影响心肌功能，而大量存在的凋亡细胞会使血运重建后的HM功能恢复受限。本研究表明，通过观察心肌TNF-α mRNA的表达，能间接反映冠心病患者HM细胞凋亡的水平，为临床是否进行血运重建治疗提供依据。
本研究的不足之处是：采用DSE结合DTI检测HM的方法尚达不到HM检测的“金标准”，但经过电镜证实也能达到准确诊断的要求。 另外就是所收集的病例数有限。TNF-α对敏感细胞的凋亡效应是通过与细胞膜上特异性TNF受体（TNFR，主要是TNFR1）结合后，触发丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导介导细胞凋亡。至于TNF-α表达促进MAPK活化介导细胞凋亡的具体过程目前尚不十分清楚，仍需进一步研究证实。
参考文献
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