时间：2023-05-30 09:12:31
开篇：写作不仅是一种记录，更是一种创造，它让我们能够捕捉那些稍纵即逝的灵感，将它们永久地定格在纸上。下面是小编精心整理的12篇凝胶色谱法，希望这些内容能成为您创作过程中的良师益友，陪伴您不断探索和进步。
中图分类号：TH23 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）10-0332-01
头孢美唑钠是一种半合成抗生素，其属于第三代头孢菌素，在临床治疗中有着广泛的应用，在临床应用中发现，这一药物的抗菌性比较强，而且有着良好的药效。通过测定实验发现，为了提高头孢美唑钠的药效，必须控制好其生产的质量，控制高分子杂质的产生，这样可以防止患者的服用这一药物时出现过敏反应，还可以降低药物的毒性，防止药品医疗事故的发生。本文通过建立凝胶色谱法测定头孢美唑钠中聚合物的方法，提高了药品质量检测结果的可靠性，对药品生产安全也有着保障作用。
一、仪器与试药
1、仪器
KGF-02型高分子聚合物测定仪（上海金达生化仪器厂）；WHSOO}JSB伍豪色谱土作站（上海伍豪信息科技有限公司）；色谱柱（40一120 μm葡聚糖凝胶G 10为填料）；玻璃柱（内径1.3一1. 6 cm，柱高30一40 cm） ； BP211 D型分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。
2、药品与试剂
头孢美唑钠对照品（批号：MZW S0901，质量分数：91.7%）；注射用头孢美唑钠（批号：090101，090102，090103深圳立健药业股份有限公司）；Naz HPOQ ， NaHz PO、均为分析纯；纯化水为公司自制；葡聚糖凝胶（Sephadex） G-0、蓝色葡聚糖2000（Amersham Bioscience公司）。
二、方法与结果
1、溶液的制备
1.1对照溶液的制备
实验人员首先需要称取适量头孢美唑钠原料，然后加入纯化水进行溶解，将其制备为1mL溶液含0.2mg头孢美唑的对照溶液。这一过程主要是定量稀释，对精确度有着较高的要求。
1.2供试品溶液的制备
采用精密的仪器，称取0.2g注射用头孢美唑钠，然后将其置于10mL的容量瓶中，再加入一定量的纯化水进行稀释，达到规定的刻度后做摇匀处理。这一过程要求研究人员必须规范操作。
2、色谱条件
色谱柱为葡聚糖凝胶G-10柱（40一120μm，柱内径1.3一1. 6 cm，柱高30一40 cm）；流动相A为pH7. 0的0. 02 mol/L磷酸盐缓冲液[0. 02 mol/LNaz HPOQ -0. 02 mol / L NaH2 PO4（体积比61： 39 ） ]，流动相B为纯化水；流速为1.5 mL/min；检测波长为254 nm；进样量为200μL。
3、系统适用性试验
精密称取蓝色葡聚糖2000适量，加纯化水定量稀释成质量浓度为0. 1 mg/mL的溶液，精密量取200 μL，注入液相色谱仪，分别以流动相A，B进行测定，记录色谱图。按蓝色葡聚糖2000峰计算理论塔板数应不低于700，拖尾因子应小于2. 0。在2种流动相系统中蓝色葡聚糖2000的保留时间的比值应在0. 93一1. 07之间，对照溶液主峰、供试品溶液中聚合物峰与相应色谱系统中蓝色葡聚糖2000峰的保留时间的比值均应在0. 93一1. 07之间。称取注射用头孢美唑钠约0. 2 g，置10 mL容量瓶中，用1 mg/mL的蓝色葡聚糖2000溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取200μL注入液相色谱仪，用流动相A进行测定，记录色谱图。聚合物峰高与单体间，及聚合物之间的谷高比（分离度R）应大于2.0。另以流动相B为流动相，精密量取对照溶液200μL，连续测定5次，峰面积RSD值应不大于5. 0% 。见图1、表1（其中A表示蓝色葡聚糖2000在流动相A中，B表示蓝色葡聚糖2000在流动相B中，C表示对照溶液在流动相B中，D表示供试品溶液在流动相A中）。
4、注射用头孢美唑钠中聚合物的测定
取注射用头孢美唑钠约0. 2 g，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀。立即精密量取200 μL注入液相色谱仪，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图。另精密量取对照溶液200 μL注入液相色谱仪，以流动相B为流动相进行测定，记录色谱图。
5、定量限的测定
分别取头孢美唑钠对照品适量，精密称定，加水稀释制成系列质量浓度的对照溶液。分别精密量取上述溶液200 μL注入液相色谱仪，以流动相B为流动相依法进行测定，以信噪比10： 1为指标，测得定量限为0.034μg/mL。
6、稳定性试验
取同一批注射用头孢美唑钠（批号：090101）约0. 2 g，精密称定，置于10 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别于0，1，2，4 h精密吸取200 μL注入液相色谱仪，以流动相A为流动相进行测定，结果聚合物峰面积的RSD值为15. 62%，表明供试品溶液中聚合物的峰面积随放置时一间的延长而增大，因此应在供试品溶液配制后立即进样测定。
三、讨论
在不同的酸碱条件下，头孢菌素发生聚合反应的难易程度不同，一般在强碱与强酸条件下，注射用头孢美唑钠较易发生聚合反应，会生成一定量聚合物，本文采用凝胶色谱法对这一聚合物进行了测定，通过分析注射用头孢美唑钠的高分子聚合物含量，可以为头孢美唑钠的质量检验提供依据。由于头孢菌素在碱性以及酸性条件下会发生聚合反应，所以，在测定的过程中，选用了pH值为7的磷酸盐缓冲液作为流动相。
分子排阻色谱法是一种有效的药物检测方法，其对头孢高分子杂质有着较好的检测效果。在本次实验中，由于头孢美唑钠高分子聚合物对照品不宜获取，而且实验样品中高聚物的数量也比较少，为了提高实验的准确性，需要在配制检测分离度时，加入一定量的葡萄糖，这可以增加聚合物峰值面积，加入量的具体数值可依实际情况稳定，要保证聚合物峰面积达到规定值的2倍左右。通过实验证明，头孢美唑钠聚合物的分离度、拖尾因子以及保留时间符合药品适用性的要求。本次实验采用了封闭式凝胶柱，流相的流速达到了1.5mL/min，在洗脱处理后，聚合物既满足分离的质量要求，也提高了分离的效率，缩短了分析时间。
注射用头孢美唑钠聚合物的形成具有动态性，聚合物样品中高分子杂质的数量与溶液放置的时间有着较大关系，一般放置的时间越长，聚合物的质量分数越大，所以，为了保证测定的准确性，研究人员需要掌握好时间，这样才能提高测定结果的可靠性。当供试品溶液配制中得到聚合物后，一定要及时测定。另外，在测定的过程中，测定方法的选用需要参考《中国药典》的 相关检测要求，一定要考虑高分子杂质的影响。本次试验与研究表明：凝胶色谱法测定注射用头孢美唑钠聚合物，具有操作简单、灵敏度高、可控性强等优点，可以有效提高头孢美唑钠聚合物的质量控制水平。
参考文献
[1] 边原，何林，夏祺悦. 反相高效液相色谱法测定注射用头孢美唑钠的含量[J]. 中国药业. 2010（05）
[2] 蔡尾玉，黄凯文. 高效液相色谱法测定注射用头孢美唑钠中头孢美唑含量[J]. 中国民族民间医药. 2012（04）
■ 一、 实验原理及分析
提取和分离蛋白质的原理：利用蛋白质的各种理化特性（如形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等）的差异，由此提取和分离各种蛋白质。
1. 凝胶色谱法（分配色谱法）
（1） 原理：根据相对分子量的大小分离蛋白质的一种有效方法（分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢）。
（2） 凝胶材料：大多数是由多糖化合物（如葡聚糖、琼脂糖等）构成的微小多孔球体，如下图所示。
（3） 作用：分离蛋白质，测定生物大分子分子量等。
2. 缓冲溶液
（1） 原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节缓冲剂的比例可以制成在不同pH范围内使用的缓冲液。
（2） 缓冲液作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，保持溶液的pH基本不变。
3. 凝胶电泳
（1） 原理：在电泳过程中，决定带电分子迁移方向的是带电分子带电性质的差异，决定带电分子迁移快慢的是带电分子形状、大小和电量的不同。
（2） 分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
（3） 分离过程：在一定的pH下，许多生物大分子上可解离的基团就会带上正电或负电。加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
4. 实验操作
（1） 样品处理：
① 红细胞的洗涤。
洗涤的目的是除去血浆中的杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。为防止血液凝固，应预先加入柠檬酸钠；采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯。
所用洗涤液是五倍于红细胞液的生理盐水；洗涤中用玻璃棒缓慢搅拌，用离心机低速短时离心；洗涤干净的标准是上清液没有黄色。
② 血红蛋白的释放。
释放的目的是将血红蛋白从红细胞中释放出来。在红细胞液中加入等体积的蒸馏水和40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌。红细胞破裂释放出血红蛋白。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。
（2） 粗分离：
① 分离血红蛋白溶液。
目的是从红细胞破碎混合液中分离出血红蛋白溶液。将红细胞破碎混合液进行高速离心处理后，离心管中的溶液分为4层。从上到下依次是：无色透明的甲苯层、白色固体的脂溶性沉淀层、红色透明的血红蛋白溶液层和暗红色的破碎物沉淀层。用滤纸过滤以除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置后分离出血红蛋白溶液。
② 透析。
目的是除去血红蛋白溶液中的无机盐离子和有机小分子等分子量较小的杂质。将血红蛋白溶液装入透析袋中，放入磷酸缓冲液中透析12 h。
5. 凝胶色谱操作（分离纯化）
① 凝胶色谱柱的制作。
② 凝胶色谱柱的装填：
实验所用凝胶是交联葡聚糖凝胶（G－75），其中G表示交联程度、膨胀程度和分离范围；75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5 g。
将凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内，使凝胶装填均匀并不能有气泡存在。然后用磷酸缓冲液充分洗涤平衡12 h，使凝胶装填紧密。
③ 样品的加入和洗脱：
调节缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
加入蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后，关闭出口。
调节缓冲液面：加入20 mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度。
洗脱：连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。
收集分装蛋白质：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。
④ 纯度鉴定――SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
■ 二、 解题指导及思路点拨
1. 题型探究：凝胶色谱法分离蛋白质
考生特别要注意对缓冲溶液的组成、作用机理、配制方法等方面的理解。
■ 例1 凝胶色谱法分离蛋白质的原理是（ ）
A. 根据蛋白质分子的形状
B. 根据蛋白质相对分子质量的大小
C. 根据蛋白质所带电荷的多少
D. 根据蛋白质溶解度的大小
■ 思路点拨 凝胶色谱法所用的凝胶是一种微小的多孔球体，在小球内部有许多贯穿的通道，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长。移动速度较慢，相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
■ 答案 B
■ 例2 将经处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是（ ）
A. 血红蛋白、甲苯层、脂类物质层、沉淀层
B. 甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂类物质层
C. 脂类物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层
D. 甲苯层、脂类物质层、血红蛋白、沉淀层
思路点拨 混合液经离心后，按密度大小排列，在离心管中从上到下的顺序依次是：第一层为无色透明的甲苯层；第二层为白色薄层固体，是脂溶性物质沉淀层；第三层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液；第四层为暗红色沉淀物，主要是红细胞破碎物沉淀。
■ 答案 D
■ 例3 凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很好的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且，已经大规模地用于工业生产。据右图回答问题：
（1） a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是_______________，原因是____________________________________。
（2） 自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由_______替代。
（3） 装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是_________。
（4） 洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体_________（填“相同”或“不同”），洗脱时，对洗脱液的流速要求是_________。
■ 思路点拨 用凝胶色谱技术分离各种大分子物质时，大分子物质先洗脱出来，然后是小分子物质。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔，即进入凝胶内，在向下移动的过程中，从一个凝胶颗粒内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质从而落后于大分子物质洗脱出来。在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙：一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；二是凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。
■ 答案 （1） a a分子量大，不易进入凝胶颗粒的微孔而通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快
（2） 尼龙网和尼龙纱
（3） 气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
（4） 相同 保持稳定
2. 题型探究二、与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质分离的意义
哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
■ 例4 关于血红蛋白分子组成的叙述正确的是（ ）
A. 两个α-肽链、两个β-肽链、一个亚铁血红素基团
B. 一个α-肽链、三个β-肽链、四个亚铁血红素基团
C. 两个α-肽链、两个β-肽链、四个亚铁血红素基团
D. 两个α-肽链、两个β-肽链、两个亚铁血红素基团
■ 思路点拨 血红蛋白又称血色素，是红细胞的主要组成成分。血红蛋白由四个肽链组成，它包括2个α-肽链、2个β-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，因此共有四个亚铁血红素基团。
■ 答案 C
3. 题型探究三、探讨电泳的原理
电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。
■ 例5 蛋白质分子中，氨基酸的α-氨基和α-羧基虽然大部分结合成为肽键，但是蛋白质分子内仍含有各种酸性基团和碱性基团，如肽链末端的α-氨基和α-羧基、天冬氨酸和谷氨酸残基中的羧基、赖氨酸和组氨酸残基中的各种碱性基团，所以蛋白质是两性电解质。在酸性溶液中，碱性基团的解离增大，使蛋白质带正电荷；在碱性溶液中酸性基团的解离加强，使蛋白质带负电荷。当溶液到达某一pH时，蛋白质可因内部酸性和碱性基团的解离相等而呈等电状态，这时的溶液pH叫做蛋白质的等电点。不处于等电点状态的蛋白质分子的正、负电荷量是不相同的。试回答下列问题：
（1） 多数蛋白质的等电点近于5，一般含碱性基团较多的蛋白质的等电点_________（“偏高”还是“偏低”）。
（2） 根据等电点的不同，你能用_______方法将不同种类的蛋白质分子分开。
（3） 简述根据等电点分离不同种类的蛋白质分子的原理________________________
_____________________________________。
■ 思路点拨 含碱性基团较多的蛋白质溶液，在pH近于5时解离程度较大，蛋白质带正电荷。要使蛋白质内部酸性和碱性基团解离相等呈等电状态，必须提高溶液的pH，使酸性基团解离增加，故蛋白质的等电点提高。根据等电点不同，可以利用电泳法将特定的蛋白质分离出来。
■ 答案 （1） 偏高
（2） 电泳
（3） 不处于等电点状态的蛋白质分子的正、负电荷量是不相同，在电泳过程中，决定蛋白质迁移方向的是蛋白质带电性质的差异，决定蛋白质迁移快慢的是蛋白质分子形状、大小和电量的不同。
■ 巩固训练
1. 用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（ ）
A. 路程较长，移动速度较慢
B. 路程较长，移动速度较快
C. 路程较短，移动速度较慢
D. 路程较短，移动速度较快
2. 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是（ ）
A. 鸡的红细胞无血红蛋白，人的红细胞有血红蛋白
B. 鸡的红细胞有线粒体，人的红细胞无线粒体
C. 鸡的红细胞有细胞核，人的红细胞无细胞核
D. 鸡的红细胞进行有氧呼吸，人的红细胞进行无氧呼吸
3. 蛋白质提取和分离的步骤包括（ ）
A. 样品处理、凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
B. 样品处理、凝胶色谱操作、纯化
C. 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定
D. 样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定
4. 在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是（ ）
A. 防止血红蛋白被O2氧化
B. 血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和
C. 磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
D. 让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能
5. （多选）人体血液中的缓冲物质都是由一种弱酸和相应的强碱盐组成，下列缓冲对正确的是（ ）
A. Na2CO3/NaHCO3
B. Na3PO4/NaH2PO4
C. NaH2PO4/Na2HPO4
D. H2CO3/NaHCO3
6. 某同学在实验课前从学校附近的屠宰场取新鲜的猪血，并在采血容器中预先加入了抗凝血剂柠檬酸钠，取血回来马上进行实验，请回答有关红细胞洗涤的有关问题：
（1） 洗涤红细胞的目的是___________。
（2） 你如何知道红细胞已洗涤干净：__________________________________。
（3） 分离红细胞时的离心速度及离心时间分别是___________________________。
（4） 如若离心速度过高和时间过长，则结果会怎样___________________________。
7. 红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带O2或CO2，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：
（1） 实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。
① 加入柠檬酸钠的目的是__________。
② 以上所述的过程即样品处理，它包括________________、________________、收集血红蛋白溶液。
（2） 收集的血红蛋白溶液在透析袋中经过透析，这就是样品的粗分离。
① 透析的目的是_________________。
② 透析的原理是___________________
____________________________________。
（3） 通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
① 样品纯化的目的是_______________
_____________________________________。
② 血红蛋白的特点是_______________
_____________________________________。
这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义____________________________________
_____________________________________。
■ 答案
1. D
2. C
3. C
4. D
5. CD
6. （1） 去除血浆蛋白
（2） 离心后的上清液没有黄色
（3） 低速（如500 r/min）短时间（如2 min）
（4） 离心速度过高和时间过长会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度
7. （1） ① 防止血液的凝固
② 红细胞的洗涤 血红蛋白的释放
（2） ① 去除相对分子质量较小的杂质
② 透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内
(1.上海市浦东新区疾病预防控制中心，上海 200136；2.上海杰诺质量检测技术有限公司，上海 200136)
多环芳烃(PAHs)中包括苯并(a)芘等十几种致癌物质。国家食品卫生标准中规定各类食用油中苯并(a)芘的限值为10μg/kg。国家标准GB5009.27-2003《食品中苯并(a)芘的测定》[1]规定了两种检测方法，分别是荧光分光光度法和目视比色法。我们研究了利用凝胶净化技术进行前处理，用液相色谱法测定橄榄油中苯并(a)芘等5种PAHs的含量[2~4]。该法自动化程度高，有机溶剂使用量少，回收率高，满足相关标准的要求。
1 材料与方法
1.1 仪器
液相色谱仪(HP1100型，荧光检测器，美国安捷伦公司)；液相色谱柱(HPLC-Cartridge 250-3 LiChrospher® PHA 5μ，MERCK公司)；全自动凝胶净化系统GPC(VARIO，德国LCTech公司)；GPC净化柱(填充Bio-Beads S-X3 200～400目)；全自动定量浓缩仪(EVA III，德国LCTech公司)。
1.2 试剂
环己烷，色谱鉴定无干扰杂峰；乙酸乙酯，色谱鉴定无干扰杂峰；乙腈，色谱鉴定无干扰杂峰。标准品：5种PAHs单标[SUPELCO公司，苯并(a)芘，苯并(a)蒽，苯并(b)荧蒽，苯并(g，h，i)北和茚苯(1，2，3-cd)芘]，各化合物浓度均为200 μg/mL。GPC洗脱液：环己烷∶乙酸乙酯=1∶1 。
1.3 测定方法
1.3.1 GPC方法 流速5 mL/min，洗脱共计4 000s，收集时间段为2 100s～3 300s 。
1.3.2 液相色谱条件 流速为0.6 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为20 μL。以乙腈和水梯度洗脱(表1)，不同特征波长检测(表2)。
1.3.3 标准曲线的绘制 用乙腈稀释配制混合标准系列，浓度系列为0、5、10、25、50、100 ng/mL；分别取1.0 μL注入液相色谱仪测定，每个浓度重复6次，以保留时间定性，以峰面积的均值分别对各毒物的含量绘制标准曲线。
1.3.4 样品前处理 准确称取5 g橄榄油，以环己烷溶解定容至10 mL。取5 mL直接通过GPC净化洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、氮吹至净干，乙腈定容至0.20 mL待测。
1.3.5 样品测定 在标准曲线测定的相同条件下，分别取1.0 μL样品提取液和试剂空白对照注入液相色谱仪测定。以保留时间定性，测得样品峰面积值后由标准曲线查得各毒物的含量。
计算：C=c×v×n / m
式中C为样品中PAHs的浓度(μg/kg)，c为由标准曲线查得提取液中PAHs的含量(ng/mL)，v 为提取液定容体积(mL)，n为稀释倍数，m为取样质量(g)。
2 结果与讨论
2.1 GPC条件
根据分段收集实验测定，PAHs分布于2 100s～3 300s的时间段。
2.2 色谱柱选择
选择PAHs专用分析色谱柱HPLC-Cartridge 250-3 LiChrospher® PHA 5μ，该柱能从常见十多种PAHs中较好地分离出苯并(a)芘，苯并(a)蒽，苯并(b)荧蒽，苯并(g，h，i)北和茚苯(1，2，3-cd)芘)，见图1。
2.3 标准曲线
按照本方法选定的条件，苯并(a)芘、苯并(a)蒽、苯并(b)荧蒽、苯并(g，h，i)北和茚苯(1，2，3-cd)芘)的线性相关系数均大于0.999(表3)。
2.4 精密度试验
对某质控样分别测定6次，5种PAHs的测定值均在允许范围内，相对标准偏差(RSD) 均
2.5 加标回收试验
对12份样品(每份称取5g)分别进行高、低浓度加标回收测试，5种PAHs的平均回收率为81%～95%(表5)。
2.6 试剂本底干扰
试验中发现，GPC洗脱液环己烷和乙酸乙酯的本底杂质会对待测物产生干扰。因此，使用农残级或提纯处理的试剂是保证检测结果准确的关键步骤之一。
采用直接溶解样品，应用GPC凝胶净化技术处理，以液相色谱法测定橄榄油中苯并(a)芘等5种PAHs的含量。该方法操作简便，线性范围、精密度等各项技术指标满足痕量分析的要求。
3 参考文献
[1]GB/T 5009.27-2003，食品中苯并(a)芘的测定[S].
[2]杨红梅，王浩，刘艳琴，等.高效液相色谱法测定肉类食品中苯并芘残留的研究[J].食品研究与开发，2006，27(10)：124-126.
[3]李伟红，戴延灿，周瑶敏，等.高效液相色谱法测定熟肉制品中的苯并(a)芘[J].江西农业学报，2008，20(1)：86-88.
在这里，我们是用过离子交换柱和凝胶柱来达到纯化多糖样品的目的。采用的离子交换柱为CM-纤维素柱，凝胶柱则为SephadexG-100。我们采用的是先过离子柱洗脱再过凝胶柱洗脱。1.材料1.1仪 器 玻璃柱(规格为Ф2×30cm),玻璃柱(规格为Ф2×100cm），LC-10ATSHIMADZU液相泵2台(一作主泵A,一作副泵B)，BSZ-100自动分布收集仪，收集管,756MC紫外分光计1.2试剂
5mM的NaAC溶液（PH=4.5,0.4g/L），1N的NaCL（溶于5mM的NaAC溶液中），0.1NNaCL溶液，水为经过脱气过滤处理的去离子水。0.1g蒽酮与50ml浓硫酸混合成的蒽酮－硫酸液，均为分析纯。1.3其它材料CM－纤维素填料SephadexG-100凝胶填料两者均为进口。2.实验方法2.1 过CM－纤维素离子交换柱
先将CM－纤维素填料装入玻璃柱（规格为Ф2×23cm）中，以5mM的NaAC洗脱液将两个液相泵(A泵和B泵)与柱联接成一真空系统，以0.5ml/min的流速平衡一天，之后即可上样，采用梯度洗脱，母液为5mM的NaAC溶液，梯度液为1N的NaCL溶液（从0.2N～0.8N），上样量为5ml（浓度0.1g/ml），流速0.5ml/min，隔15min收集一管，从第20管开始进行梯度洗脱。每隔两管用蒽酮－硫酸法监测[以管号为横坐标，620nm处紫外吸收值（OD值）为纵坐标作图]，分别按相关峰位收集并冻干。之后取主要产物过SephadexG-100柱进行进一步的分离。2.2过SephadexG-100凝胶柱将SephadexG-100凝胶填料装柱（规格为Ф2×85cm），再通过0.1NNaCL洗脱液把A泵与柱连接起来，以0.3ml/min流速平衡一天，之后即可上样，上样量为5ml（浓度0.1g/ml），用0.1NNaCL缓冲溶液以0.3ml/min流速洗脱，隔15min收集一管。以蒽酮－硫酸法监测，分别按相关峰位收集并冻干。（二）结果与分析1.过CM－纤维素离子交换柱结果山楂叶粗品多糖KS经过CM－纤维素柱梯度洗脱，分别按相关峰位收集并冻干之后，得到四个组分：KS1、KS2、KS3、KS4（如图2）。其中，KS1占14，KS2占25，KS3占52，KS4占9，均为白色絮状物。这里，KS3是主要组分。2.过SephadexG－100凝胶柱洗脱结果当KS3经过SephadexG-100柱洗脱，按相关峰位收集并冻干之后，可分成两个组分KS3′、KS3″（如图3）。KS3′占28，KS3″占72。这里，根据含量比例大小的比较，KS3″为主要产物。图2山楂叶多糖粗品（KS）过CM-纤维素柱洗脱曲线Fig2ElutionpatternsofCrataeguspinnatifidaleaves’crudepolysaccharide（KS）extractonCM-cellulosecolumn图3山楂叶多糖（KS3）过SephadexG-100凝胶柱洗脱曲线Fig3ElutionpatternsofCrataeguspinnatifidaleaves’crudepolysaccharide（KS3）extractonSephadexG-100column二、纯度测定这里，纯度的测定方法我们是采用了醋酸纤维薄膜电泳法、SephadexG-200凝胶过柱法和高效液相凝胶色谱法（HPGPC）；分子量的测定则是采用了高效液相凝胶色谱法（HPGPC）。（一）材料与方法1. 仪 器DYY—Ⅲ型水平电泳槽（北京六一仪器厂产）、美国产BIO-RAD电泳仪、冰箱，Waters液相色谱仪、RID-6A示差检测器，柱为MACROSEPHEREGPC（250mm×4.6mm），LC-10ATSHIMADZU液相泵、756MC紫外分光计，Waters510液相泵，5ul微量进样器。2. 试 剂2.1测纯度所需试剂2.1.1醋酸纤维素薄膜电泳所需试剂
硼酸盐溶液：0.2N硼酸溶液及KCL溶液各125ML，0.2N氢氧化钠溶液219.5ML混合后加水稀释至1L。氧 化 液：1.2g高碘酸溶于30ml水中，加入15ml0.2N醋酸
钠溶液及100ml乙醇，置暗处，可使用数日。还 原 液：5gKI 5gNa2SO3溶于100ml水，加入150ml乙醇
及2.5ml2NHCL，随加随搅动，现用现配。染 色 液：2g碱性品红溶于400ml沸水中，冷至50℃过滤，
通入二氧化硫气体至褪色，密封后置暗冷处保存，
如溶液变红，则不能使用。
冲 洗 液：1ml浓盐酸加0.4g偏重亚硫酸钾溶于100ml水中。2.1.2HPGPC和过SephadexG-200柱所需试剂去离子水（经过脱气过滤处理），0.1NNaCL溶液。2.2测分子量所需试剂去离子水（经过脱气过滤处理）,已知分子量的葡聚糖系列BluG（蓝色葡聚糖）、Wt66,900、Wt37,500、Wt20,000、Wt9,900、Glc(葡萄糖)、样品。这里，Wt后的数字为该标品的分子量。另外，所有标品和样品均用去离子水配成0.2浓度。标品为德国进口纯。3.其它材料SephadexG-200凝胶填料——进口 醋酸纤维素薄膜——国产4.检测多糖纯度4.1醋酸纤维素薄膜电泳
取8×12cm长度的醋酸纤维薄膜，在PH10.0硼酸盐溶液中浸透后，将其夹于两张干净滤纸中间吸干，再于无光泽面点样，然后将其架于电泳槽上，尽量平直，然后用微量注射器吸取2~4μL的1的样品溶液（溶于缓冲液中），在薄膜的无光泽面上距一端2cm处呈线状点样，注意使点样线宽度不超过1mm且两端距薄膜边缘不少于4mm。点样面向下，以滤纸搭桥，取电压220V，在0℃下电泳20min，然后取出膜条置95乙醇溶液中固定，再置于氧化液中氧化6min，取出用70乙醇浸洗，之后再浸入还原液中还原8min，取出用70乙醇浸洗，然后浸入染色液中染色，至色带出现为止，再用冲洗液冲洗，则有糖区显紫红色，无糖区无色。这里，共做三个样品的电泳图谱：混合标样（Wt9,900、Wt66,000、Wt37,500、Wt20,000，比例相同）、单一标样Wt20,000的标样、KS3″。4.2高效液相凝胶色谱法（HPGPC）将样品用缓冲液配成0.2浓度，每次进样量为20ul，流速为0.3ml/min，温度25～30℃。4.3过SephadexG-200柱
将SephadexG-200凝胶填料装柱（规格为Ф2×85cm），再通过0.1NNaCL洗脱液把A泵与柱连接起来以0.3ml/min流速平衡一天，之后即可上样，上样量为5ml（浓度0.1g/ml），用0.1NNaCL缓冲溶液以0.3ml/min流速洗脱，隔15min收集一管。以蒽酮－硫酸法监测，分别按相关峰位收集并冻干。5.测定分子量这里，采用高效液相凝胶色谱法（HPGPC）测定多糖精品的分子量。基本操作条件与前面的4.2HPGPC纯度测定相同，不同的是这里是依次将各个标准样品多糖洗脱，记下出峰时间tR。再将多糖样品液洗脱，记下出峰时间，然后根据公式算出对应样品的分子量。（二）结果与讨论1.纯度鉴定方面1.1醋酸纤维素薄膜电泳实验结果显示，电泳方向为由正极向负极移动。KS3″ 电泳图谱为单一色带，单一标品亦为单一色带，而标品混合样为一色斑（如图4）。1.2过高效液相色谱检测
KS3″经过HPGPC检测为单一组分（如图5）1.3 结 论
关键词：GC-FID；烘焙坚果食品；BHA；BHT
中图分类号：R917 文献识别码：A 文章编号：1001-828X（2016）006-000-02
引言
食用油脂和含有食用油脂的食品在不适当的保存条件下或者超过保质期就会发生酸败现象。为了避免酸败现象或者延缓其发生时间，通常会加入BHA、BHT或者其他的抗氧化剂和防腐剂，然而资料表明，BHA有潜在的致癌性，BHT危险小一些，不过动物实验也发现它能致癌。因此，研究食品中的BHA、BHT的检测方法就十分重要。目前检测BHA、BHT等抗氧化剂的方法有气相色谱法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法等。利用这些方法提取烘焙坚果食品中的油脂都需要将样品中油脂提取出来，然后再通过柱层析或者凝胶色谱方法去除掉脂肪。由于柱层析与凝胶色谱法操作繁琐、试剂消耗大等。因此，本文用甲醇直接提取油脂中的BHA、BHT，提取液经过冷藏静置后过滤，减压浓缩至近干用乙醇定容。待分析。
一、实验部分
1.材料试剂
石油醚（30℃～60℃）、甲醇、均为分析纯；BHA、BHT标样，纯度均高于99%；氮气，纯度99.999%。
2.仪器与设备
GC-2010（日本岛津公司）-氢火焰离子化检测器（FID）、振荡器、旋转蒸发仪、离心机、冰箱。
3.色谱条件
色谱柱为DB-WAX石英毛细管柱，长30m、内径0.25mm、膜厚0.25μm；柱温：初始温度为80℃，保持1min，以10℃/min升温至230 ℃，保持8min；进样口温度150℃，不分流进样，进样量1μm。检测器：FID 温度250℃。载气流量：氮气4.38 mL/min、氢气40mL/min、空气400mL/min。
4.样品处理
（1）脂肪的提取
称取样品50～100g（视样品脂肪含量而定），混合均匀，置于250mL具塞锥形瓶中，加入适量石油醚浸泡试样，震摇10min静置2-3h后快速滤纸过滤，减压回收溶剂残留脂肪备用。
（2）样品的制备
准确称取样品1-2g（精确至0.001g）于15 mL离心管中，用10 mL甲醇分3次萃取（三次比例为4mL、4mL、3mL），震荡2min/次，静置10min后吸取甲醇溶液合并于15mL离心管中（如果静置后乳化较为严重，可以3000rmm离心3min），合并好的甲醇溶液置于冰箱-4℃冷冻1h后用快速定性滤纸过滤，再用约3mL甲醇冲洗滤纸上残渣，合并甲醇溶液，减压浓缩至近干，用乙醇定容至2.0mL，该溶液为待测溶液。
二、结果与讨论
1.色谱条件的优化
本实验采用DB-WAX毛细管柱，以及梯度升温的方法测定混合标样的含量和分离情况，结果如图1所示。图1表明，随着温度的升高BHA、BHT能够达到很好的基线分离，且峰形较好。
2.线性关系及检出限
分别绘制BHA、BHT的标准曲线，再0.02～0.5mg/L范围内两种物质的浓度与峰面积的线性关系良好，其线性方程及相关系数见表1。以三倍的信噪比（3S/N）计算检出限。
3.方法的回收率
取已知不含待测物的样品，分别添加80ng和160ng的BHA和BHT标准品，每一梯度取3个样待测，同时定容2mL经0.45μm微孔滤膜过滤后，按照1.3节色谱分析条件平行测定三次，计算回收率。实验表明，BHA、BHT的平均回收率分别为95.5%、95.2%，见表2。
4.烘烤榛子仁样品的分析检测
实验采用本研究的方法，对3批次实际样品惊醒测试，结果见表3。监测数据表明，烘烤榛子仁中BHA、BHT的含量均为0。图2为烘烤榛子仁样品色谱图。
三、结论
本文采用冷冻过滤提取烘烤榛子仁中的油脂作为前处理，并用气象色谱法对烘烤榛子仁样品中的BHA、BHT进行了检测。检测结果显示，BHA、BHT在80ng-160ng添加浓度范围内，回收率均大于95%，相对标准偏差均小于0.2%。该方法简单、高效，而且其准确性和重复性较好，可用于检测坚果食品中抗氧化剂的限度。
参考文献：
[1]伍先绍，柳永英，赖丽琼.液相色谱法同时快速测定植物中TBHQ、BHA/BHT探讨[J].粮食与油脂，2012，25（4）：26-29.
关键词：液相色谱法 高效液相色谱法 油气地质 应用现状
中图分类号：TE31
文献标识码：A
文章编号：1007-3973（2012）003-052-02
1 液相色谱法、高效液相色谱(HPLC)法简介
1.1 液相色谱法、高效液相色谱的由来
经典的液相色谱，是历史最为悠久的色谱技术。60年代后期，气相色谱塔板理论、高压输液泵、高效固定相、高灵敏度检测器技术被成功地运用于液相色谱技术，使其实现了分析速度快、分离效率高以及操作自动化，发展成为了高效液相色谱技术。
1.2 液相色谱法、高效液相色谱、气相色谱法的对比
经典液相色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，柱效低，分析时间冗长。
HPLC采用了装填于口径小、长度短的不锈钢柱内的全多孔微粒固定相。流动相在通过高压输液泵后，进入高柱压的色谱柱，从而使溶解在固定相的传质具有更大的扩散速度，使得整个分析过程具备高柱效和高分离能力。其适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。
1.3 高效液相色谱的分类、特点
据分离机制的不同，HPLC可分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、凝胶色谱等。
高效液相色谱具有以下突出的特点：
高压：高效液相色谱的流动相为被称为载体的液体，对色谱柱内的载液施加高压，可确保其克服较大阻力而顺利流过。
高速：高效液相色谱采用高压，其中的载液流速较快。
高效：相对经典液相色谱而言，高效液相色谱具有高效性。据统计，高效液相色谱法的柱效可达3万塔板/m以上。
高灵敏度：高效液相色谱采用的检测器，最小检测量可达0.001ug。
2 高效液相色谱法在油气地质中的应用现状
2.1 在油藏地球化学勘探上的应用
地球化学于1933年被列入油气勘探行业，至今化探方法已有了长足的发展。化探分析要求勘探速度快、勘探成本低、数据采集、处理误差小。而HPLC则完全具有高速、高效，高灵敏度这些特点。目前，在油气化探中，不少国内外工作者利用HPLC技术，不经萃取分离而对地质样品中的微量芳香化合物进行直接测定，并收到了较好效果。
利用液相色谱分析技术，对油页岩、含油砂岩、现代沉积进行测定，对比其液相色谱图，可知：极性芳香化合物在油页岩中含量丰富，在含油砂岩中含量贫瘠。芳烃物质的丰度决定着砂岩的含油性。现代沉积中的含水砂岩，芳烃物质丰度较低，几乎不具有含油性。图为油页岩、含油砂岩、现代沉积的液相色谱图。
另外，储层之上拥有力度较好、封闭性较好的盖层进行封闭(比如粘土、泥灰岩、页岩、盐岩) 是油气藏形成的必要要素之一。一般情况下，由于芳烃化合物的分子直径大，好的盖层能够对其运移起到良好的阻隔作用。所以，对上覆地层中芳烃化合物进行丰度测定，可以反映出盖层封闭性能力的高低。从这一角度而言，利用HPLC分析地质样品中芳香化合物的分子信息，可较好地进一步探讨油气化勘探中常见的一些基本问题，这对油气勘探工作无疑具有重要意义。
.2 在油气化学组成分析上的应用
石油中，含有许多热稳定性差、相对分子质量大、难以挥发而极性不同的生物性标识化合物，如芳香化合物、甾萜烷、卟啉等。生物标识化合物是由C、H和其他元素组成的复杂而特殊结构的有机化合物，其来源于原始生物母质，记录有特殊分子结构信息。利用高效液相色谱法对该类有机物进行测定分析，可有助于了解油气的化学组成。
2.3 在油气源对比上的应用
油气源对比的实质为运用有机地球化学的基本原理，合理选择对比参数来研究油气和源岩的各自特殊性，以分析彼此亲缘关系。其中指纹对比法，是常用的方法之一。
指纹对比法，具体是分别把油气和可能烃源岩相关的轻烃色谱图、原油饱和烃色谱图、甾烷和萜烷的色谱图等，直接进行指纹对比。而高效液相色谱分析技术通过高效液相色谱仪等，可对该类化学指纹进行相关研究。原油的物理性质与化学组成信息和人的指纹一样具有与生俱来的唯一性，这些独一无二的特征被称为“油指纹”。利用高效液相色谱技术，通过高效液相色谱仪等可对不同油种的化学指纹进行相关研究，对鉴别油种具有十分重要的意义。在开发过程中可以快速判断溢油点，也能为打击原油走私、偷运提供最直接的证据。
2.4 在烃源岩评价上的应用
烃源岩是控制油气藏形成与分布的关键性因素之一。确定有效烃源岩是含油气系统的基础。烃源岩评价主体上包括两大方面：烃源岩的地球化学特征评价和烃源岩的生烃能力评价。
烃源岩的地球化学特征评价主要是评价有机质的丰度、类型和成熟度。烃源岩的生烃能力评价主要是评价生烃强度、生烃量和排烃强度等。利用高效液相色普法测定氯仿沥青“A”和总经含量，可反映有机质的丰度。目前测定岩石样品中微量元素的两种HPLC技术以前已经开展，表明高效液相色谱法可用以对烃源岩的微量元素等加以分析。有机质成熟度由低到高，其有机物成分将相应发生规律性变化，如随有机质成熟度增加，CPI、OEP、R29的数值越来越接近于1，并趋于稳定。用高效液相色谱法对不同演化阶段的有机质进行色谱分析对比，据其色谱差异，可反映有机质的成熟度或干酪根的类型，据此进一步可对烃源岩的生烃能力进行一定程度上的评价。
3 高效液相色谱法在油气地质上应用的尚存不足
关键词：硝苯地平;智能水凝胶;质量标准;研究
硝苯地平智能胶的主要成分是硝苯地平，载体材料是高分子材料，制备方法为离子胶凝化法，这种一种智能药物，其对PH十分敏感。采用高效液相色谱法对于质量标准进行研究，这种方法可以有效的测定该药物中硝苯地平的含量，但是测定时，需要考虑高分子材料的干扰因素，尽量避免干扰，同时还需要注意避光，否则硝苯地平会逐渐的分解，难以实现质量控制效果[1]。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1200型高效液相色谱仪，由美国安捷伦公司生产;ODS-90TS（4.8mm×140mm，5m）色谱柱，G1315B二泵，G2170B色谱工作站和7730进样阀。HPD-44真空泵，天津市恒奥科技发展有限公司;F7超声波清洗仪（上海超声波仪器厂）。吉尼斯系列电子分析天平（德国塞多利斯仪器系统有限公司），78-5磁力加热搅拌器 （江苏省金坛市正基仪器有限公司）。
1.2 试药
苯地平智能水凝胶（哈尔滨医科大学，批号：20150118，20150119，2015
0120），硝苯地平精致品（自制，纯度99.7%），N-琥珀酰壳聚糖（中国研究院化学物理研究所，相对分子质量300000，脱乙酰度65%），海藻酸钠（浙江化学试剂站分装厂，批号041207），氯化钙（天津科密欧化学试剂有限公司，批号20140224）。
2 方法与结果
2.1 硝苯地平智能水凝胶的制备
精密称取N-琥珀酰壳聚糖和海藻酸钠适量，加入蒸馏水中，加热搅拌至完全溶解，得浓度为2%的水溶液。精密称取硝苯地平适量（药载比为1：4），加入上述水溶液中，搅拌至硝苯地平完全分散均匀，然后将上述混悬液通过5ml注射器针头（针头内径4.5mm）以1.2ml/min的速度滴加到轻度搅拌的CaCl2～2H2O溶液中交联30min，滴距5cm，反应完毕后过滤小球，水洗，室温放置自然干燥，得载药的N-琥珀酰壳聚糖一海藻酸钙凝胶小球[4]。
2.2 质量控制
2.2.1 紫外吸收。取含量测定项下的溶液，加等量的无水乙醇稀释后。照紫外一可见分光光度法测定，在237nm波长处有最大吸收，在320-355nm的波长处有较大的宽幅吸收。
图1 紫外光谱图
2.2.2 含量测定
（1）色谱条件：色谱柱：ODS-90TS（4.8mm×140mm，5m）;流动相：l%冰醋酸（三乙胺调pH至3-31）-甲醇（30：70，V/V）;流速：0.8ml/min;检测波长：237nm;进样量：20ml;柱温：35℃;保留时间：5min，分离度1.5。（2）对照品溶液的制备：避光，精密称取硝苯地平精制品6.94mg，置50m1棕色量瓶中。加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。（3）供试品溶液的制备：避光，取本品研细的粉末27mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入pH7.34的枸橼酸盐缓冲液（0.4%吐温-80）50ml，密塞，称定质量，超声处理20min，放冷，再称定质量，加枸橼酸盐缓冲液补足减失的质量，摇匀。转入分液漏斗中，用氯仿萃取3次（20、20、10m1），合并氯仿提取液，转移至50ml棕色量瓶中。加氯仿至刻度，摇匀，精密量取5ml氯仿液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移置25ml棕色量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用0.22m的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得[5]。（4）干扰试验：精密量取对照品溶液、供试品溶液、空白对照溶液各20ml，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。从实验中可见在与对照色谱相应的位置上，空白对照溶液在与硝苯地平色谱峰的位置上无干扰。（5）线性关系考察：精密吸取硝苯地平对照品贮备液0.2、1、2、3、5、6、8ml置10ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成系列浓度溶液，在上述色谱条件下进样测定。以峰面积（A）为纵坐标y，浓度（c）为横坐标进行线性回归，得回归方程为Y=69.5742505X-12.949778。r=0.9999。结果表明，硝苯地平在2.776-111.04μg/ml浓度范围内峰面积与浓度均呈良好线性关系。（6）精密度试验：取同一浓度硝苯地平对照品溶液，分别与1d内和4d内按供试品测定项下操作。测得硝苯地平日内RSD为0.73%（n=6），日间RSD为2.10%（n=6），表明仪器精密度良好。（7）加样回收率试验：取已知含量的供试品6份，每份约25mg，精密称定，按高、中、低剂量分别精密加入硝苯地平精制品，混匀，按供试品测定项下方法操作，测定其峰面积，按外标法计算。结果如表1。
表1 加样回收率试验结果
3 讨论
主要选择使用了三种流动相：（1）甲醇与水，比例为60：40;（2）甲醇与1%的冰醋酸，分别为60：40，70：30;3、1%冰醋酸与甲醇，比例为60：40;65：35;70：30，在使用前两种流动相时，发现其形成的品峰形效果不佳，存在着比较拖尾的现象，最终选择使用第三种流动相，其比例为70：30，这一比例不仅能够使阳平形成效果比较好的峰形，而且干扰条件比较少，能够达到彻底的分离。智能水凝胶的制备载体主要是高分子材料，在对此进行制备时，需要对样品进行前期处理，而且处理时还需要考虑高分子材料自身对样品含量会产生相应的影响。另外，高分子材料与样品中的药物主要是以氢键的形式而存在，必须破坏这种氢键，否则药物难以以要求的形式存在，而影响研究效果。本研究中所使用的枸橼酸盐缓冲液，以此来实现复合物的分离的目的。硝苯地平对光敏感，需避光。本文方法所得到的结果准确度高，操作简单，此外，重现性好，能够达到预期的回收效果，可以用来控制硝苯地平智能水凝胶的质量。
参考文献
[1]廖列文，龚涛，周静，周新华，崔英德.DMAEMA系列智能水凝胶的研究进展[J].化工进展，2011（2）.
[2]陈旭日，陈学刚.新型P（NIPAAm-co-IA）pH敏感智能水凝胶的合成与性能研究[J].化学推进剂与高分子材料，2011（2）.
[3]侯红瑞，张平泰.智能水凝胶在给药系统中的应用[J].价值工程，2011（15）.
【摘要】 目的研制康复新凝胶剂的制备工艺与质量控制。方法用卡波姆-980NF作为基质，甘油为润湿剂，三乙醇胺为中和剂，制成凝胶剂，采用薄层色谱法对5种氨基酸和嘧啶碱进行鉴别，采用紫外分光光度法测定氨基酸（以丙氨酸计）含量，建立质量标准，考察其稳定性。结果凝胶剂制备工艺可行，其组成药物可采用薄层色谱法鉴别；其pH值为5.0～7.0，平均回收率为98.44%，RSD=1.38%，稳定性好。结论 康复新凝胶制备工艺简便，质量可控，稳定性好，值得推广应用。
【关键词】 康复新凝胶； 制备工艺； 质量控制； 稳定性
Abstract：ObjectiveTo study the preparation and quality control of Kangfuxin gel.MethodsCarbopol-980NF was used as the gel matfix，Glycerin as wetting agent and triethanolamine as neutralizer. The Kangfuxin gel was prepared and TLC and UV-spectrometry methods were applied to identify. Its quality criteria was established and the stability were inspected. ResultsThe preparing technology of gels was feasible. Its compositions were identified by TLC and its pH value was 5.0～7.0， the average recovery rate of the technolgy were 98.44%，RSD=1.38%， and its stability determined the contents amino acids and pyrimidine base. ConclusionThe preparation of Kangfuxin gel is simple， stable and controlable.
Key words:Kangfuxin gels； Preparation； Quality control； Stability
康复新凝胶剂是由美洲大蠊单味药组成的外用制剂，该处方的液体制剂康复新液是较为成熟的一种剂型，具有通利血脉，养阴生肌的作用， 用于金疮、外伤、溃疡、瘘管、烧伤、烫伤、褥疮之创面，疗效确切。由于液体制剂不易涂布，易流失，药效维持时间较短，而凝胶剂是一种新型外用剂型，用于皮肤表面，其涂抹性好，无油腻感，不污染衣物，透皮吸收速度比洗液快，与外用溶剂相比较，凝胶剂皮肤表面停留时间长，是一种使用方便、透皮吸收速度快的优良剂型，本文将该液体制剂的处方研制成凝胶剂，效果良好。现将该凝胶剂的制备工艺与质量评价报告如下。
1 仪器与试药
TU1901紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；sartoriusBP211D电子天平（感量0.1 mg；0.01 mg。载量210 g；80g）；水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；autoscience超声波清洗器；PHS25型酸度计（上海雷磁仪器厂），卡波姆980NF（美国诺誉化工有限公司）；十八种氨基酸(套)对照品（624200104供含量测定用 中国药品生物制品检定所）；美洲大蠊（购于成都市五块石市场，符合《湖南省药材标准》1993年版“美洲大蠊”项下相关规定）。
2 处方及制备
2.1 处方组成
美洲大蠊100 g，卡波姆-980NF10 g，甘油50 g，山梨酸3 g，乳化香精0.2 g，三乙醇胺适量。
2.2 制备方法
取美洲大蠊粉碎成粗粉，用70%乙醇提取3次，合
提取液，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度1.35（70℃）的稠膏，备用；取卡波姆980NF 10 g，撒于适量蒸馏水中，静置，使充分溶胀；加入甘油、山梨酸、乳化香精搅匀，加入上述稠膏，搅匀；加入三乙醇胺，调pH值至5.0～7.0；加蒸馏水至1000 g，搅匀，分装，即得。
3 质量控制
3.1 性状
本品为淡黄色至棕黄色透明状胶体，气香。
3.2 pH值
取本品1 g，加水20 ml稀释后，测定pH值(《中国药典》2005年版Ⅰ部附录Ⅶ G) 5.0～7.0，符合有关皮肤给药的规定。
3.3 稳定性实验
3.3.1 耐热实验
取本品3份，每份10 g，于60℃恒温箱内保存24 h，取出，放至室温，均无分层现象。
3.3.2 耐寒实验
取本品3份，每份10 g，于-10℃条件下冷藏24 h，取出，放至室温，均无分层现象。
3.3.3 离心实验
取本品3份，每份10 g，装于离心管中，离心30 min（3000 r/min），均无分层现象。
3.4 鉴别
3.4.1 氨基酸鉴别
取本品7.5 g，加水100 ml使溶解，加于已处理好的732型阳离子交换树脂柱（内径1 cm，床高10cm）上，用水100 ml洗脱，弃去水液，再用氨试液40 ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加70%乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸对照品，分别加70%乙醇制成每毫升各含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法《中国药典》2005年版Ⅰ部（附录VI B）实验，吸取上述两种溶液各2～5 μl，分别点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰乙酸-水（4∶1∶1）为展开剂，展开18 cm，取出，晾干，喷以茚三酮试液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
3.4.2 嘧啶碱鉴别
取本品5 g，加水100 ml使溶解，加于已处理好的732型阳离子交换树脂柱（内径1.5 cm，床高2 cm）上，收集流出液，用0.1 mol/L盐酸溶液10ml洗涤，收集洗涤液，与流出液合并，用2 mol/L氢氧化钠溶液调pH值至2.1～2.5，于沸水浴上浓缩至约5 ml，放冷，作为供试品溶液。另取尿嘧啶对照品，加水制成每毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2005年版Ⅰ部附录VI B）吸取上述溶液5～10 μl分别点样于同一硅胶GF254薄层板上，以水饱和正丁醇溶液作展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的主斑点。
3.5 含量测定
3.5.1 对照品溶液的制备
精密称取105℃干燥至恒重的丙氨酸对照品50 mg，置100 ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取5 ml，置100 ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每毫升相当于丙氨酸25 μg)。
3.5.2 供试品溶液的制备
精密称取样品2 g，置100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，剧烈振摇，即得。
3.5.3 测定波长的选择
将丙氨酸对照品和康复新凝胶样品，在450～800 nm间扫描，丙氨酸在570 nm 处有最大吸收，康复新凝胶样品在570 nm有最大吸收，故确定以570 nm为测定波长。
3.5.4 线性关系的考察
精密量取对照品溶液（25.86μg/ml）0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml分别置10ml具塞试管中，加水至1.0ml，加0.2mol/L枸橼酸缓冲液（pH5.0）1.0 ml，1%抗坏血酸溶液0.1 ml，茚三酮乙二醇甲醚试液3.0 ml，摇匀，置沸水浴中加热15 min，取出，放冷，再加80%乙醇3.0 ml，摇匀，照分光光度法(《中国药典》2005Ⅰ部附录Ⅴ B)试验，在570nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果见表1。表1 标准曲线测定数据（略）
3.5.5 测定法
精密量取供试品溶液1 ml置10 ml具塞试管中。照标准曲线的制备方法，自“0.2 mol/L枸橼酸缓冲液（pH5.0）1.0 ml”起，测定样品吸光度，从标准曲线谱中求得供试品中氨基氮的含量，计算即得。
3.5.6 精密度实验
取样品（批号051001）2 g，按“3.5.2供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液，再按“3.5.5测定法”项下重复测定6次，吸收度（A）的相对标准偏差为0.91%。结果见表2。表2 精密度考察结果（略）
3.5.7 稳定性实验对照品溶液的稳定性考察： 取丙氨酸对照品溶液，于制样后15，20，25，30，40，60 min测定，结果见表3。表3 丙氨酸对照品溶液的稳定性考察（略）
实验所得RSD为0.85%，说明丙氨酸对照品溶液在制样后60 min内测定稳定。
供试品溶液的稳定性考察 ：取样品（批号051001）2 g，精密称定，按“3.5.2供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液，再按“3.5.5测定法”项下于制样后15，20，25，30，40，60 min测定，结果见表4。表4 供试品溶液的稳定性考察（略）
实验所得RSD为1.09%，说明供试品溶液在制样后60 min内测定稳定。
3.5.8 重复性实验
取同一批样品（批号051001），称取6份，每份2 g，精密称定，按“3.5.2供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液，再按“3.5.5测定法” 项下进行含量测定，结果见表5。表5 重复性实验（略）
3.5.9 回收率实验
取已知含量的供试品（051001，含量0.674 mg/ml）2 g，精密称定，置100 ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取0.5 ml置10 ml具塞试管中，精密加入对照品（C＝25.86 μg/ml）0.5 ml，按“3.5.5”项下测定法进行含量测定，计算回收率，结果表明回收率的重现性好。结果见表6。表6 回收率测定结果（略）
回收率（%）=实测总氨基酸含量－样品中总氨基酸含量对照品加入量×100%
4 讨论
4.1 本品选用卡波姆-980NF作为水溶性凝胶基质，具有无油腻感、无刺激、易于涂布、皮肤偶合效果好等优点［3］；处方中甘油作为润湿剂和保湿剂；卡波姆-980NF形成水凝胶在pH﹤3或pH﹥12时黏度降低，故选用三乙醇胺调pH值为5.0～7.0［4～8］。
4.2 本品原剂型有腥味，难以为病人所接受，为调节本品的气味，选用了乳化香精作为矫嗅剂，用量为0.02%。
4.3 本品曾选择腺苷为含量测定指标，采用HPLC法对腺苷含量进行测定，以甲醇-0.3%冰醋酸（3∶97）为流动相，结果由于流动相中水相比例很大，色谱柱所需平衡时间较长，柱效下降也较快，测定的值很低，样品中腺苷含量为1.51～2.72 μg，容易导致检测数据的波动与误差；同时对色谱柱损害较大。鉴于上述实验的结果，使用紫外分光光度法进行的含量测定方法比较合理、科学，而且对产品质量的考核比较实用，故最终仍采用紫外分光光度法对氨基酸含量（以丙氨酸计）进行测定，并对其方法学进行考察。
本研制的康复新凝胶外观光洁透明，手感细腻，无刺激性，无油腻性，易于清洗，含量测定简单易行。
【参考文献】
［1］张兆旺.中药药剂学［M］.北京：中国中医药出版社，2002：307.
［2］谢秀琼.中药新制剂开发与应用，第2版［M］.北京：人民卫生出版社，2000：83.
［3］国家药典委员会.中国药典，Ⅱ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：897.
［4］曾凡林，万新祥，杨 芳.克癣灵凝胶剂的研制与质量评价［J］.第一军医大学分校学报，2003，26（6）：6.
［5］罗 毅，马俊玲，黄传俊，等.柏竹凝胶剂的制备［J］.中国药师，2005，8（4）：301.
［6］刘 福，吴功柱. 盐酸芦氟沙星凝胶剂的研制［J］.中国药房，2003，14（11）：665.
【关键词】头孢地嗪钠;高分子聚合物;分析;验证
抗生素是临床用量最大和较易发生不良反应的药物。其中最常见的一类不良反应就是过敏反应。多年来的研究已证明,在β-内酰胺类抗生素所致的速发型过敏反应中,药物分子本身只是半抗原,药物中存在的高分子聚合物才是引发速发型过敏反应的真正过敏原,因此严格控制抗生素中高分子聚合物的含量有着重要的意义。
头孢地嗪是德国赫斯特公司和法国罗塞尔公司共同开发的第三代注射用头孢菌素类抗生素,同时也是世界上第一个具有免疫增强功能的第三代头孢菌素,1990年首次在日本上市。与头孢三嗪、头孢氨噻肟等头孢菌素相似,在7位上具有一个含氨基噻唑结构(亚氨甲氧基氨噻唑)的侧链,这一结构使其不仅保持了对G+菌的抗菌活性,而且对G-菌也有效,并对β-内酰氨酶稳定。此外,在3'位上的巯基噻唑结构,使头孢地嗪不易被酶降解,在动物和人体中的半衰期明显延长,由于此基团赋予化合物独特的性质,使得头孢地嗪在广谱抗菌的同时,还具有其他头孢类药物所不具备的免疫增强作用,因此具有广泛的临床应用前景。
关于高分子聚合物的测定方法,国内外已有许多报道,主要的方法是色谱法。其中,以葡聚糖凝胶Sephadex G-10为基础的凝胶色谱分析方法在中国药典2005年版头孢类聚合物检查方法中普遍采用。本文参照中国药典2005年版附录分子排阻色谱法的相关要求,对头孢地嗪钠聚合物的检查方法进行研究。
1.试验仪器及试验材料
1.1仪器
LC-10AT高效液相色谱仪;色谱柱:Sephadex G-10柱,柱内径1.5cm,柱高度40cm。
1.2供试品、对照品与试剂
头孢地嗪钠来源于浙江永宁药业股份有限公司(批号:S081205);蓝色葡聚糖2000来自sigma公司;头孢地嗪对照品(批号:130520-200501),含量为88.6%,由中国药品生物制品检定所提供;其他试剂均为分析纯。
2.试验方法
2.1 流动相选择
参照中国药典2005年版头孢类聚合物检查方法,以pH7.0的0.3mol/L磷酸盐缓冲液〔0.3mol/L磷酸氢二钠溶液-0.3mol/L磷酸二氢钠溶液(61:39)〕为流动相、检测波长为254nm对样品进行测定,见色谱图1,聚合物峰分裂。因此,将流动相盐的浓度降低,以pH7.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲液〔0.2mol/L磷酸氢二钠溶液-0.2mol/L磷酸二氢钠溶液(61:39)〕为流动相对样品进行测定,见色谱图2,聚合物峰峰形好。
图1 0.3mol/L磷酸盐缓冲液为流动相聚合物峰分裂图谱
图20.2mol/L磷酸盐缓冲液为流动聚合物峰相图谱
2.2 色谱条件
照分子排阻色谱法(中国药典2005版二部附录V H)测定。
用葡聚糖凝胶G-10(40～120μm)为填充剂;柱内径1.5cm,柱高度40cm。以pH7.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲液〔0.2mol/L磷酸氢二钠溶液-0.2mol/L磷酸二氢钠溶液(61:39)〕为流动相A,以水为流动相B,流速约为每分钟1.0ml,检测波长为254nm。分别以流动相A、B为流动相,取0.1mg/ml蓝色葡聚糖2000溶液200μl,注入液相色谱仪,理论板数以蓝色葡聚糖2000峰计算均不得低于700。拖尾因子均应小于2.0。在两种流动相系统中蓝色葡聚糖2000峰保留时间的比值应在0.93～1.07之间,对照溶液主峰和供试品溶液中聚合物峰与相应色谱系统中蓝色葡聚糖2000峰的保留时间的比值应在0.93～1.07之间。另以流动相B为流动相,精密量取对照溶液200μl,连续进样5次,峰面积的相对标准偏差应不大于5.0%。
2.3 进样量及溶剂的选择
参照中国药典2005年版头孢类聚合物检查时所采用的进样浓度,取样品约0.2g,精密称定,置10ml的量瓶中,加流动相A使溶解并稀释到刻度,摇匀,立即精密量取200μl注入液相色谱仪,以流动相A为流动相进行测定,见色谱图2,由图谱可知,进样量过高,检测器过载,为达到进样的准确性,将取样量分别更改为0.04g,0.02g,按照上述方法同法测定,见色谱图3、4,由图谱可见,当取样量为0.02g时,聚合物峰峰形好,聚合物峰结束点高度约为5000,聚合物峰高为13485,与主峰分离度约为2.6。另取样品以水为溶剂制成相同浓度的供试品,同法进行测定,见色谱图5,与用流动相A溶解的样品色谱峰相比,聚合物峰的保留时间和峰面积均无明显差异,因此采用水或是流动相为溶剂不影响测定结果。
图3进样量为0.04g时图谱图4进样量为0.02g时图谱图5以水为溶剂配制供试品溶液时图谱
2.4 系统适用性试验
取头孢地嗪钠适量,精密称定,加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含10μg的溶液,以流动相B为流动相,精密量取200μl,连续进样5次, 结果见下表。
分别以流动相B、A为流动相,取0.1mg/ml蓝色葡聚糖2000溶液200μl,注入液相色谱仪,理论板数以蓝色葡聚糖2000峰计算在流动相A中为1140,在流动相B中为1182;拖尾因子在流动相A中为1.497,在流动相B中为1.209,均小于2.0;保留时间在流动相A中为7.940,在流动相B中为7.548,保留时间的比值为0.95。
取样品约0.02g,精密称定,分别置10ml量瓶中,加流动相A溶解并定量稀释至刻度,摇匀,立即精密量取200μl注入液相色谱仪,以流动相A为流动相进行测定,样品聚合物峰保留时间为8.040。
流动相B中对照溶液主峰与蓝色葡聚糖2000峰的保留时间的比值为1.02,流动相A中供试品溶液聚合物峰与蓝色葡聚糖2000峰的保留时间的比值均为1.01。
2.5 线性关系考察
考察对照品溶液浓度在规定浓度的20%～200%范围内的线性关系。取头孢地嗪钠对照品适量,精密称定,加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含20μg的溶液,作为对照品浓溶液,分别精密量取适量,用水定量稀释制成浓度分别为20μg/ml,10μg/ml,5μg/ml,2μg/ml,1μg/ml的对照品溶液,以流动相B为流动相,精密量取上述对照溶液各200μl,分别注入液相色谱仪,每个浓度分别重复进样两次,测定数据见下表。
根据以上测定的数据,以两次测得峰面积的平均值为纵坐标,浓度为横坐标作图
图10.4.6-23
线性方程为y=508968x+49027 R2=0.9991
结果表明,头孢地嗪钠在浓度1～20μg/ml的范围内线性关系良好。
2.6 重复性试验
取样品约0.02g,置10ml量瓶中,加流动相A溶解并定量稀释至刻度,摇匀,立即精密量取200μl注入液相色谱仪,以流动相A进行测定,同批样品重复测定6次,另取头孢地嗪钠对照品适量,精密称定,加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含10μg的溶液,精密量取200μl注入液相色谱仪,以流动相B为流动相进行测定,按外标法以峰面积计算聚合物含量,结果见下表。
结果表明,连续测定6次的重复性良好。
2.7 溶液稳定性
取样品约0. 2g,置100ml量瓶中,加流动相A溶解并定量稀释至刻度,摇匀,室温放置,分别于0h,1.5h,3h,4.5h,6h精密量取200μl注入液相色谱仪,以流动相A进行测定,记录色谱图, 0～6h聚合物峰面积分别为:569895、676157、1552240、1802178、2121692,由以上数据可知,随供试品放置时间延长,聚合物峰面积增大,在进行聚合物测定时,供试品溶解后应立即进样。
2.8 检测限与定量限
配制不同浓度的头孢地嗪钠供试品溶液,测定相应聚合物的峰高,同时测定相同条件下的色谱基线噪音,取基线噪音约10倍值的量作为头孢地嗪钠的定量限,求得其定量限为2μg;取基线噪音约3倍值的量作为头孢地嗪钠的最低检测限,求得其最低检测限为0.8μg。
2.9结论
根据以上分析方法的筛选及方法学验证数据结果,采用所选择的检测方法,专属性强,能有效检出头孢地嗪所产生的聚合物,适合于对头孢地嗪钠进行聚合物的定量分析。
参考文献
[1]《中华人民共和国药典》二部附录分子排阻色谱法[S],2005版
关键词 液相色谱技术；农药残留；兽药残留；安全检测
中图分类号 O657.7+2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）08-0290-02
2015年，我国政府进一步加大了对食品安全问题的政策性导向。国务院总理在政府报告中指出，综合治理农药兽药残留问题，全面提高农产品质量和食品安全水平。为了贯彻中央的精神，农业部近期出台了相关具体工作精神，目的就是持续狠抓农产品质量安全监管，有效保障“米袋子”“菜篮子”和“肉盘子”的安全。为此，各级农检中心都在积极协调人员，集中对各类农产品质量安全检测技术进行专题式培训。目前，结合自身工作实际，本文就液相色谱检测技术在农产品中的应用研究进行简单阐述，目的是使人们进一步认识到液相色谱技术在农产品农药残留分析中的重要意义。
1 液相色谱技术
液相色谱法的分离机理是基于混合物中各组分对两相亲和力的差别。根据固定相不同，可分为液固色谱、液液色谱和键合相色谱，其中以液固色谱（以硅胶为填料）和键合相色谱（以微硅胶为基质）应用最广。根据固定相形式的不同，液相色谱法可分为柱色谱法、纸色谱法及薄层色谱法。按吸附力可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱。近年来，在液相柱色谱系统中加上高压液流系统，使流动相在高压下快速流动，以提高分离效果，因此出现了高效液相色谱法（HPLC）。而超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）借助于HPLC的理论及原理，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。目前，超高效液相色谱仪已经开始逐渐地投入液相试验中。
2 液相色谱技术在初级农产品检测中的应用
气相色谱法由于受技术条件的限制，无法对高沸点物质或热稳定性差的物质进行分析。而液相色谱法不需要气化，不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量>400的有机物（占有机物总数的75%～80%），原则上都可应用液相色谱法进行分离、分析。在已知化合物中，能用气相色谱法、液相色谱法进行分析的分别占约20%、70%～80%。
2.1 液相色谱检测技术在农药残留检测中的应用
随着人口的不断增长，对食物的产量提出了更高的要求，农药的产量和应用量也就不断加大，农药残留的危害也日益显著，已经引起全世界的关注。很多科研技术工作者也展开了对农药残留的技术分析工作，为政府部门做好技术保障。
田宏哲等[1]为建立同时测定牛奶中6种氨基甲酸酯类农药残留量的方法，样品经乙腈提取，Oasis HLB固相萃取柱净化后，采用高效液相色谱――离子阱质谱（HPLCESI-MS/MS）进行测定，测定条件为：C18色谱柱分离，甲醇―0.02mol/L醋酸铵溶液梯度洗脱，多反应监测模式检测。结果表明，6种杀虫剂的定量限、平均添加回收率、相对标准偏差分别为1.0～10.0 μg/kg、79.21%～91.38%、3.44%～5.71%，表明该测定方法完全可以满足当前农药残留分析的要求。
刘 谦等[2]应用快速溶剂萃取技术（ASE）――固相萃取―高效液相色谱串联质谱（HPLC/MS/MS）建立苹果、梨、橙子、橘子、草莓等水果和菜花、蘑菇、芦笋、豆角、黄瓜等蔬菜中吡虫啉、多菌灵、5种氨基甲酸酯类农药残留的新分析方法。样品由甲醇提取，固相萃取MCX柱净化，质谱检测器检测。结果证明，在所选的水果和蔬菜中吡虫啉、多菌灵回收率为78.0%～104.0%，相对标准偏差为3.2%～7.6%；5种氨基甲酸酯类农药回收为82.0%～108.0%，相对标准偏差在5.4%～9.8%。吡虫啉、多菌灵和5种氨基甲酸酯类农药样品中的最低检出浓度分别为2.0、2.0、5.0 μg/kg。
彭媛芳等[3]建立了高效液相色谱法测定猪、牛、羊、鸡法人肝脏和鸡肉组织中的辛硫磷残留量的检测方法。样品经乙酸乙酯提取，经C18固相萃取柱净化，80%乙腈―水溶液定容，以65%乙腈―水溶液为流动相，经高效液相色谱仪测定，外标法定量。结果表明：辛硫磷标准溶液在50～2 000 μg/L范围内呈良好的线性关系，R2均为0.999 9，方法检出限为10 μg/kg，最低定量限为20 μg/kg，在20、50、100 μg/kg添加水平上，辛硫磷的回收率为70%～120%，批内批间RSD均小于20%。该残留检测技术具有简便、灵敏、定性定量准确、可靠的优点，满足动物性食品安全检测的要求。
2.2 液相色谱检测技术在兽药残留检测中的应用
随着人们生活水平的日益提高，传统的饮食原料需求正在从植物性食品向动物源食品转变。然而，动物性食品原料也已经受到了兽药残留的影响，慢慢成为全世界关注的另外一个焦点。但由于部分人员对药物使用出现了偏差，致使滥用兽药现象日益突出。
高广慧等[4]建立高效液相色谱法测定牛、羊肉中土霉素、四环素和金霉素残留量的检测方法。采用甲醇提取，用甲醇饱和的正己烷去除脂溶性杂质，用5%高氯酸沉淀蛋白。采用C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.01 mol/L磷酸二氢钠（含0.5%磷酸）溶液―乙腈=81∶19（体积比），检测波长为350 nm。霉素、四环素和金霉素的分离度好，土霉素、四环素和金霉素的提取回收率分别为80.7%、78.6%和80.4%（n=9）。本方法操作简单，结果准确，可以有效地控制牛、羊肉中土霉素、四环素和金霉素残留量。
高月明等[5]将水产品样品中残留的孔雀石绿用硼氢化钾还原为其代谢产物隐色孔雀石绿，经前处理试剂盒提取，固相萃取柱净化、反向色谱柱分离，用液相色谱仪荧光检测器检测。方法的回收率在84.5%～92.1%，相对标准偏差4.09%～5.26%，检出限为0.5 μg/kg。结果表明：该方法检测孔雀石绿前处理过程简单，灵敏度高，能快速对大量样品进行定量分析。
余 晓等[6]建立高效液相色谱法测定鱼、虾和鸡肉中的呋喃唑酮残留量的方法。色谱条件为Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱，流动相乙腈―0.1%磷酸水溶液（30∶70，V∶V），流速1.0mL/min，检测波长365 nm，柱温25 ℃。结果表明，呋喃唑酮标准溶液在0.2～5.0 ng范围内与峰面积呈良好的线性关系，检出限为0.2 μg/kg。样品平均加标回收率为97.7%～102.9%，RSD为1.1%～1.5%（n=6）。该方法简单、快速、灵敏度高、重复性好，适用于鱼、虾和鸡肉中的呋喃唑酮残留量的分析。
3 结语
目前，世界各国对输入本国的农产品的质量要求极为苛刻，药物残留已经成为影响我国对外贸易的最大隐患。就我们国家目前的检测技术力量和装备而言，液相色谱检测技术已经成为我国比较普及的一种新型技术，也是当前一种主流的分析方法，该方法的灵敏度好、速度快、范围广、效率高，正在农产品质量安全检测中发挥着难以取代的作用，依然将是我们国家政府部门对药物残留监测的重要手段。
4 参考文献
[1] 田宏哲，赵瑛博，周艳明.高效液相色谱-质谱法测定牛奶中6种氨基甲酸酯农药残留[J].食品科学，2011，32（1）：187-190.
[2] 刘谦，颜红.蔬菜、水果中的吡虫啉、多菌灵和5种氨基甲酸酯类农药残留测定[J].农药科学与管理，2013，34（2）：24-28.
[3] 彭媛芳，高迎春，陈玲，等.高效液相色谱法测定动物性食品中辛硫磷残留量的研究[J].中国兽药杂质，2011，45（7）：26-29.
[4] 高广慧，李阳，孙晓娟，等.HPLC法测定牛羊肉中土霉素、四环素、金霉素残留量[J].食品研究与开发，2013，34（16）：94-96.
【关键词】色谱;联用技术;抗生素;杂质
【Abstract】Objective The effect of the application of Modern Chromatography and combined technology in the analysis of the impurities in antibiotic drugs is analyzed.Method Using high phase liquid chromatography， the four stage of the flight time of the two groups was analyzed by the method of flight time of 9 rods， and the impurities were analyzed. The results showed that 3 impurities were divided into 1 groups： two，， 1 and 6.Result A total of 10 impurities were analyzed， and 3 were polymer impurities， which were divided into two groups of 1， 1 and 6 of the polymer.Conclusion High phase liquid chromatography and four bar flying time mass spectrometry were used to analyze the qualitative analysis of the raw materials， and the more impurity types could be detected， which could be used to provide a reference for controlling the impurity content of the polymer.
【Key words】Chromatography;Combined technology;antibiotic;impurity
羧苄西林钠是广谱青霉素类抗生素，羧苄西林钠主要通过抑制细胞壁合成发挥杀菌作用，具有无臭无味、对热不稳定和吸湿性强的特点。羧苄西林钠的过敏作用是的广大医学工作者关注的重点，也是世界性医学难题[1]。多数研究报道羧苄西林钠产生过敏的主要原因在于高分子聚合物杂质多，β―内酰胺换和原料在生产、存储和使用环节都可能混入杂质，形成二聚体、三聚体和四聚体等高聚物。因本文采用高相液相色谱―四级杆飞行时间质谱联用法分析羧苄西林钠原料药中的杂质成分，为生产、存储和使用羧苄西林钠提供指导，减少不良反应，提高药物的安全性。现报告如下：
1.实验部分
1.1实验试剂和仪器
实验试剂包括羧苄西林钠、乙腈、醋酸铵、水，羧苄西林钠由石药集团中诺药业（石家庄）有限公司生产，批准文号国药准字H13021987;乙腈及醋酸铵均为HPLC级;水由Millipore Milli-Q Gradient A10纯水仪制备。高效液相色谱仪为Agilent 1290型，四级杆飞行时间质谱联用仪为Agilent 6530型。
1.2实验条件
（1）HPLC-MS条件 使用色谱柱Agilent Poroshell EC C18柱（2.7μm，3.0mm×150mm），流动相A为5 mmol/L醋酸铵水溶液，流动相B为5 mmol/L醋酸铵乙腈溶液，柱温为35℃，波长254mm，流速0.3mL/min，进样量8μL，梯度洗脱时间分为0～21min，具体梯度脱洗时间见表1。电子喷雾离子源，采集模式为正离子模式，干燥气温度和气流速度分为为350℃和8L/min，雾化压力为45psi，传输电压120V，质子范围 50～1500m/z。
表1 梯度洗脱时间
1.3试品溶液制备
使用精密仪器称取适量羧苄西林钠，加入适量水，将羧苄西林钠稀释为1mg/mL溶液作为试品溶液。
2.结果
共分析出10个杂质，3个为聚合物杂质，分为二聚体1个、三聚体1个和6―氨基青霉烷酸与羧苄西林开环物的聚合物1个。
3.结果分析
羧苄西林钠的分子式为C17H16N2O6SNa2，工业生产中采用6―氨基青霉烷酸（6―APA）和苯丙二酸复合而成[2]。由于实验研究均认为杂质是导致羧苄西林钠产生过敏、神经系统反应、高钠和低钾血症、急性代谢性酸中毒、念珠菌二重感染的主要原因[3]，因此许多国家都非常重视分析羧苄西林钠的杂质成分，为指导生产、存储和使用羧苄西林钠过程减少杂质形成提供参考。
目前英国药典[4]采用HPLC梯度洗脱系统测定羧苄西林钠的杂质成分，研究结果显示该检测方法检测出8个杂质的结构式，但是未对相对保留时间做出规定，也没有其它杂质对照品，因而色谱系统无法对杂质峰值进行指认;HPLC梯度洗脱系统测定时间达1h，测试时间长。此外，HPLC梯度洗脱系统无法检出致敏性高聚物杂质。其它相关研究[5-7]分别将反相高效液相色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法、反相高效液相色谱―凝胶色谱串联法、高效毛细管电泳法等多种分析方法用于羧苄西林钠的杂质成分分析，以上方法均存在不同程度分析效果不佳、分离杂质类型少的缺点。而羧苄西林钠的杂质属于高聚物杂质，对分析效果的要求更高[8]。因此，本研究采用高相液相色谱―四级杆飞行时间质谱联用法分析羧苄西林钠原料药。
对羧苄西林钠的主成分分析发现，主成分液相色谱图呈两个色谱峰，两色谱峰[M+H]+均为379.0956，结合主成分二级质谱图特点，色谱峰分别为羧苄西林R、S差异构体，既色谱系统可有效分离该两种立体异构体。同时，羧苄西林钠6―位侧链上的手性碳原子相连的氢原子的活性较强，易发生差相异构。但是立体化学异构体对疗效的影响作用极小，因而可判定为有效成分。
关键词：HPLC；红花微乳；羟基红花黄色素A
中图分类号：R284.1文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0495-02
Determination of Carthamus Tinctorious-containing Microemulsion by HPLC
JI Xinyan1,2，LIU Yaming2，FENG Qianjin2，ZHAO Junyun1，CHANG Ruihua2，FENG Wenquan2，LIANG Hongjuan2
(1.Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；
2.Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030024，Shanxi，China)
Abstract:Objective：To establish a method for the determination of hydroxyl safflor yellow A(HSYA) in Carthamus tinctorious-containing microemulsion．Method：The HPLC was used with Diamonsil C18(2) column(50mm×4.6mm，5μm),detection wavelength at 402nm, mobile phase methanol-water(pH3.3) 30∶70, flow rate:0.8mL/min. Results：HSYA has good linear relationship between 0.3128～3.128μg, r=0.9990,the recovery of HSYA was 99.93% and RSD was 1.86%(n=6). Conclusion：The method is simple, sensitive and reliable to carry out to control the assay of Carthamus tinctorious-containing microemulsion transdermal delivery system.
Key words:HPLC；Carthamus tinctorious-containing microemulsion；hydroxyl safflor yellow A
收稿日期：2011-10-27
基金项目：国家科技攻关计划资助项目（2004BA721A46）；山西省科技厅资助项目（2011091014）
作者简介：季新燕（1977-），女，山西长治人，博士研究生，研究方向：中西医结合基础。
通讯作者：刘亚明（1957-），男，山西临县人，教授，博士研究生导师，研究方向：中药方剂学与中药制剂新技术。红花为菊科植物红花(Carthamus tinctorious L．)的干燥花，为中药活血化瘀药，常用于治疗跌打扭伤、活血止痛，主要药效成分羟基红花黄色素(hydroxyl safflor yellow A，HSYA )具有抗炎镇痛的作用，能增大毛细血管的直径和开放数[1]。有临床实践报道，红花利多卡因醇、红花冰片等均有较好的抗炎镇痛作用[2-3]，目前尚无成熟制剂上市，且使用样品量不确切，临床应用推广不方便等，本实验室以微乳为药物载体，将其制备成外用制剂，为更好地研究红花微乳透皮和质量的控制, 建立了高效液相色谱法（HPLC）监控主要药理活性成分羟基红花黄色素A的含量,本方法简单易行,重复性好,准确可靠。
1仪器与药品
戴安summitP680高效液相色谱仪,summitP680A低压四元泵,PDA-100二极管阵列检测器，ASI-100自动进样器,summit柱温箱，Chromeleon色谱工作站；紫外扫描分光光度计（Cary 50，Varian）。
羟基红花黄色素A标准品溶液（浓度为0.1564mg/mL,山西太原华卫药业提供），甲醇，磷酸为色谱纯;水为超纯水;其余为分析纯，红花水提液（山西太原华卫药业提供），红花微乳（实验室自制，批号分别为：101220,110320,110504）。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱：Diamonsil钻石C18(2)5μm，250mm×4.6 mm；流动相：甲醇-0.4%的磷酸水溶液（三乙胺调至pH=3.30）为30∶70；检测波长：402nm；柱温：室温。流速0.8mL/min。在此色谱条件下，羟基红花黄色素A的保留时间约6.9min。
2.2对照品溶液制备精密称取羟基红花黄色素A对照品适量，用25%甲醇制成0.0156mg/mL的对照品溶液。
2.3供试品溶液制备精密吸取复方红花微乳1.0mL，用25%甲醇定容于10mL容量瓶中，摇匀，用0.45μm滤膜滤过作为样品溶液。
2.4线性考察精密称取105℃干燥至恒重的羟基红花黄色素A对照品，加25%甲醇制备得质量浓度为0.1564mg/mL贮备液，分别取2、5、10、15、20μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定羟基红花黄色素A的峰面积。以羟基红花黄色素A对照品进样量X(ug)为横坐标，以羟基红花黄色素A的峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程：Y=3×106 X +316152,r=0.9990（n=5）；结果表明：羟基红花黄色素A在0.3128～3.128μg质量范围内线性关系良好。
2.5阴性对照试验精密吸取取不含红花水提液的空白微乳0.1mL，依照2.3项下操作，结果显示空白微乳对羟基红花黄色素A的测定不产生干扰，说明复方红花微乳的辅料不影响测定，结果见图1。
2.6精密度试验吸取2.2项下对照品溶液，依法测定，记录连续6次的峰面积，并计算其RSD为1.89%，表明精密度良好。
2.7稳定性试验取2.2项下对照品溶液，每隔2h进样1次，每次10μL，考察峰面积的变化，试验表明在8h内稳定性良好，RSD为1.63%。
2.8重复性试验取同一批号（110504）的红花微乳原液自制样品5份，精密吸取1mL，用甲醇定容至10mL，依法测定，每次10μL，计算得平均含量，RSD为2.03%。
2.9加样回收率取同一批号（110504）含羟基红花黄色素A复方红花微乳样品溶液，精密吸取复方红花微乳0.5mL，于10mL容量瓶中，同时精密加入一定浓度的对照品（0.1564mg/mL）溶液各0.5mL，然后用甲醇定容至10mL，精密吸取该样品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，依法测定计算结果见表1。
表1加样回收率测定结果（n=6）
样品量
(mg)加入量
(mg)测得量
(mg)回收率
(%)平均回收率
(%)RSD
(%)0.06150.07820.1366597.820.06150.07820.1391599.610.06150.07820.135997.280.06150.07820.1405100.570.06150.07820.139699.930.06150.07820.1378598.6898.981.292.10样品的测定取3个不同批号的红花微乳原液自制样品1mL，用甲醇定容至10mL，取羟基红花黄色素A对照品溶液（0.1564mg/mL），分别进样10μL，依法测定，得到羟基红花黄色素A对照品溶液峰面积积分值，用外标法计算3批红花微乳样品中羟基红花黄色素A的含量，结果见表2。
表23批样品含量测定结果（n=3）
样品批号HYSAmg/mLRSD%1105020.10571105030.131.141105040.123ABC
A -HYSA对照品B样品C空白微乳（阴性）
图1羟基红花黄色素A(HYSA)的HPLC图3讨论
近年来对红花提取物及羟基红花黄色素A的高效液相色谱法分析方法的报道不少[4-8]，总起来有约17种，但是存在着磷酸或冰醋酸的量较多，流动相酸度较高，对于分离的色谱柱来说，填料容易变脆,易于溶解,柱压也会逐渐升高,色谱柱的寿命缩短；或者有些柱效低、分离度差、峰拖尾严重不适于含量测定如甲醇-0.4%磷酸水溶液等。在本实验中，用三乙胺调节流动相pH值后，分离效果增强，出峰时间缩短，在线性范围内，羟基红花黄色素A的峰型良好，没有拖尾现象，适用于红花微乳的含量测定。
参考文献
［1］舒畅，张延英，蔺兴遥，等.红花凝胶剂抗炎镇痛作用的实验研究[J].中国实验方剂学杂志，2009，15(1)：72-73.
[2]韦玉芳，谢红，卢泳堂，等.利多卡因红花醇液外涂减轻病人静脉穿刺疼痛的临床研究[J]中医药临床杂志，2006，18（4）：399-400.
[3]韦红梅.红花冰片湿敷降低七叶皂苷钠致静脉炎的效果观察［J］.内科，2008，3（1）：148-149.
[4]郝少君，李军，李献玉.高效液相色谱法测定莪红片制剂中羟基红花黄色A的含量 [J].药学学报，2010(6)：531-532.
[5]王永新，徐荣，白方.高效液相色谱法测定红花散瘀胶囊中羟基红花黄色素A的含量[J].中国实验方剂学杂志，2007,13（1）：12-13.
[6]张丽，张颖，宋洪涛. HPLC法测定舒胸制剂中羟基红花黄色素A的含量 [J].药学学报，2008 24(1)：56，66，76.