时间：2023-05-30 09:26:50
开篇：写作不仅是一种记录，更是一种创造，它让我们能够捕捉那些稍纵即逝的灵感，将它们永久地定格在纸上。下面是小编精心整理的12篇基因编辑，希望这些内容能成为您创作过程中的良师益友，陪伴您不断探索和进步。
很多人担忧，基因编辑技术的过快发展会让人类社会陷入伦理难题。不过，估计很少有人料到，它竟然登上了“大规模杀伤性与扩散性武器”威胁清单。 被列为大规模杀伤性武器
在近期的美国情报界年度全球威胁评估报告中，基因编辑被列为潜在的大规模杀伤性武器之一。该报告称：“这种有双向用途的技术分布广泛、成本较低、发展迅速，任何蓄意或无意地误用，都可能引发国家安全问题或严重的经济问题。”
美方情报人员产生这种担忧的主要原因是，生物技术属于一种“双向用途”技术，可以作为正常的科学发展也可以作为武器使用。该报告还指出了一些新的发现――“在经济全球化的背景下，找到具有相关专业知识和技术的人员也变得更加容易。” 存在危害人类的可能性
所谓基因编辑，就是将苷酸序列进行删除和插入等操作，使人们可以依照自己的意愿改写遗传密码。例如，可以通过改变人类胚胎的基因，修复其中的致病部分，并使“优质基因”得以遗传。这样，意味着阿尔茨海默综合征、唐氏综合征等家族遗传疾病存在彻底根除的可能。
长期以来，只能通过物理和化学诱变、同源重组等方式来实现基因编辑。 这些方法要么编辑位置随机，要么需要花费大量人力物力进行操作，但CRISPR/Cas9技术的出现，使得科技人员能够方便而精确地对DNA和苷酸序列进行编辑，不仅操作更为简单，成本也极低：应用者只需花60美元便可以在网上买到其中最基本的材料。有科学家担心基因编辑技术会被用于研发“杀手蚊子”，或者制造可以大面积摧毁主要农作物的瘟疫，甚至研制可以剪断人体DNA的病毒。
“基因编辑的诞生打破了传统的、天然的、缓慢的遗传及变异和进化的过程。因此，适当利用对人类进步和文明有好处，但不当利用确实存在用来制造危害人类的病毒或病菌的可能。”中华医学会智库专家、免疫学博士钱勇表示。 目前阶段有点“危言耸听”
虽然如此，把基因编辑技术列入大规模杀伤性武器威胁清单还是令一些科学家大跌眼镜。
中科院植物研究所植物分子生理学实验室主任刘春明说：“这是一个正常的过程，新技术出现时人们总会有很多担心，常常是经过一段时间以后，人们会冷静下来，真正知道它是否具有潜在的破坏性。”
清华大学生命科学学院博士生导师郗乔然认为，目前基因编辑技术的使用仍局限于实验室中。“现在把基因编辑列入大规模杀伤性武器威胁清单，就这一技术目前的发展阶段来看，我个人认为有点危言耸听。”她补充说，尽管不排除未来这种技术发展到一定程度后会出现人们所担心的情况。（据科技日报、第一财经日报）
农业时代的开启
“遗传”，听起来是个人人都能理解的名词。中国人说“种瓜得瓜，种豆得豆”，英美人说“like father like son”。这些俗语里反映的生物代际之间的相似性，就是遗传。先人们大概早就发现，不管是动物还是植物，不管是生物的外形、行为，还是性格，这些性状都能在一代代的繁衍中顽强地延续和保留下来。
实际上，早在人类文明开始之前，人类就已经充分―尽管也许是下意识―观察到了遗传现象的存在，甚至已经开始利用遗传规律改善自己的生活了。
现代人类的祖先可以追本溯源到数百万年前的非洲大陆。在两百多万年的无尽岁月里，先祖们在非洲大陆上采集植物果实、捕获动物，过着靠天吃饭、随遇而安的日子。人类文明的曙光出现在距今十几二十万年前。那时，现代人的直系祖先―人属智人种―出现在非洲大陆，并且很快一批批地走出非洲，在全世界的各个大陆和主要岛屿上开枝散叶，也把采集和狩猎的固有天性带到了世界各地。在那个时候，还压根看不出我们这些身材矮小、面相平凡的先祖会在日后成为整个地球的主宰。
然而，就像突然拥有了某种未知的魔力一般，差不多从一万年前开始，在世界各地快乐采集和狩猎的智人先祖们，几乎在一眨眼间就改变了赖以生存的生活方式。这些变化开启了农业时代，也最终催生了今天建立在发电机、汽车、互联网和生物技术基础上的全新人类社会。而这一切变化的开端，就是祖先们对于遗传规律的利用。
在贾雷德・戴蒙德的名著《枪炮、病菌与钢铁》中对此有着生动详尽的讨论。就在人类先祖走出非洲的必经之路上，地中海东岸生长着繁茂的野生小麦，它们的种子富含蛋白质和淀粉。不难想象，当生活在中东新月沃地的人类先祖们在偶然间发现这种植物后，一定会如获至宝地将它们作为日常采集和储藏的对象。对于先祖们来说，这和他们数百万年来在非洲大陆的日常采集工作并无分别。
但是如果先祖们想要把这些野生小麦挖出来，为他们提供稳定的食物来源，就会遇到一些棘手的问题。野生小麦的麦穗会在成熟后自动从麦秆上脱落，将种子尽力播撒到周围的泥土里。这是这些禾本科植物赖以生存繁衍的性状之一，但这也使得人类先祖想要大规模收获小麦种子变得非常困难。后来，在某个不知名的具体年代，生活在中东地区的远古居民们无意间发现了一些遗传变异小麦。这些小麦的麦穗即便成熟以后，也不会自动脱落。
泛生子的概念
从理性高度思考遗传本质
很容易想象，如果这些变异小麦出现在野外，我们只有死路一条。因为它们完全无法通过脱落的麦穗散播自己的后代。但这些变异植株对于我们的先祖们来说却无比珍贵，因为这样的遗传突变小麦会大大方便他们在固定时间大批收割麦穗、储存麦粒！更要紧的是，先祖们一定也在无意间发现了遗传的秘密―种瓜得瓜，种豆得豆，因此这些仿佛是上天赐予般的神奇的小麦种子，也将会顽强地保留这种对人类先祖而言―而不是对小麦自身，极其有利的性状。所以我们可以想象，先祖们可能会将这些奇怪的植物小心移植到村庄周围，用心呵护，直到收获第一批成熟的种子。这些种子将成为下一年扩大种植的基础。就这样，伴随着一代代人类先祖们的细心发现、栽培和收获，符合人类需要的优良性状被保留了下来，一直保留到今天。这些无意间发现的遗传突变小麦，可能标志着人类农业社会的开端。
最早从理性高度思考遗传本质的，是同样生活在地中海边的古希腊人。在古希腊哲学家德谟克利特和希波克拉底看来，遗传现象必然有着现实的物质基础，不需要用虚无缥缈的神来解释。在他们的想象里，遗传的本质是一种叫作“泛生子”的微小颗粒。这种肉眼不可见的颗粒，在先辈的体内无处不在，忠实记录了先辈从形态到性格的各种性状，并且会在过程中进入后者体内。以泛生子颗粒承载的信息为蓝图，子代得以表现出对先辈们的忠实模仿。
必须承认，泛生子的概念本身，其实并没有解决任何实际问题。或者刻薄点说，这只是把人们习以为常的遗传现象用一个听起来晦涩难懂的名词概括了出来而已。但是这个从现象到概念绝非毫无用处。至少，借用这个概念，人们可以把许多看起来很不一样的现象联系起来。
例如，无性生殖―微小的细菌和酵母能够一分为二产生两个后代；有性生殖―雌雄家畜后会产生出一群嗷嗷待哺的小崽儿；甚至还包括果树的嫁接―为什么果树嫁接后的果实会带有接穗和砧木的共同特征，不就是因为泛生子颗粒能够从砧木毫无障碍地流动到接穗里面去，和接穗的泛生子合二为一嘛。
因此，这个生命力顽强的概念从古希腊时期一直流传到了近代。甚至在19世纪中期，在达尔文创立进化论，为地球生命和人类的起源找到科学解释的时候，他仍然借用泛生子的概念作为自然选择理论的遗传基础。
进化论遭到的批评
宗教人士的攻击与严肃的科学批评
在达尔文看来，一个生物个体的所有器官、组织乃至细胞，都碛凶约鹤ㄊ舻姆荷子颗粒。手的泛生子记录着每个动物的手掌大小、宽窄、掌纹乃至毛发的生长位置，眼睛的泛生子当然少不了记录眼睛的大小、虹膜的颜色等。在的过程中，来自父母双方的泛生子融合在一起，共同决定了后代们五花八门的遗传性状。
更要紧的是，泛生子携带的生命蓝图一旦出错，就会导致后代遗传性状的“突变”，而这些突变，就是达尔文进化论中自然选择和适者生存的物质基础。正是因为有突变，一代代生物个体才会具有微小但能够稳定遗传的差异，而这些遗传差异影响着生物个体在环境中生存和繁衍的能力，并最终导致适者生存。
达尔文的进化论在诞生后遭到了猛烈攻击，特别是在宗教界人士和虔诚的信徒们看来，达尔文的学说亵渎了人类万物之灵的神圣性，也把传说中按照自己的模样造人的上帝置于可有可无的尴尬地位。但很少有人知道的是，进化论同样遭遇了严肃的科学批评。热力学创始人之一、物理学家开尔文勋爵当时估算出地球的年龄至多不会超过一亿年，而这点时间远远不够积累出达尔文进化所需要的五花八门的遗传突变（当然，后来人们意识到地球的年龄远大于此）。
古生物学家们对此发出了诘难，按照进化论，地球上必然存在许许多多物种之间的中间形态，但是它们的化石又在哪里呢？有一个批评可能是最致命的，因为它声称发现了进化论和遗传融合理论的深刻矛盾，换句话说就是，达尔文辛辛苦苦为进化论找到的遗传基础，可能根本不支持进化论的声明！这一批评来自苏格兰工程师、爱丁堡大学教授亨利・弗莱明・詹金。他评论说，按照达尔文的进化论，生物的遗传物质需要经历漫长、微小的突变过程，才能产生足够显著的形状变化，最终造就地球上千万种五花八门的物种。
新书速递
冷暴力
作者：[法国]玛丽-弗朗斯・伊里戈扬
出版社：后浪丨北京联合出版公司
出版日期：2017年6月
定价：38.00元
本书首次提出了“精神虐待”这一概念，它广泛发生在婚姻、家庭和职场中，施虐者通过拒言语歪曲、讽刺、嘲笑、轻蔑、否定人格等常用手段来欺凌、控制受虐者，使这种关系持续下去，让受虐者无法逃脱。
日本新中产阶级
作者：[美国]傅高义
出版社：上海译文出版社
出版日期：2017年5月
定价：60.00元
傅高义在学术生涯之初被斥为“乡下人”后，意识到一个社会学家如果从未在另一种文化中生活过，何谈理解本国社会？1958年至1960年，他来到东京市郊展开田野研究，描写日本社会快速变迁之际的“新中产阶级”―工薪族和他们的家庭。此书是他的成名作。
外婆的道歉信
作者：[瑞典]弗雷德里克・巴克曼
出版社：天津人民出版社
出版日期：2017年5月
基因剪刀修饰细胞
一岁的蕾拉・理查兹患有复发性急性淋巴细胞白血病，是一种难以治愈的白血病。尽管药物化疗能治愈一些白血病，但化疗对于复发性急性淋巴细胞白血病还是束手无策。此前，蕾拉已经接受过化疗，但效果不佳，只能用姑息疗法维持生命。在走投无路之时，大奥德蒙街医院向蕾拉的父母提议可以试用新的基因疗法，而且，这种疗法已经在小鼠身上进行过试验，效果较好。
为了挽救女儿的生命，蕾拉的父母同意了。蕾拉的父母热衷于尝试新疗法，蕾拉的妈妈莉莎说：“我们不想接受姑息治疗，所以我们要求医生为我们的女儿尝试任何治疗，哪怕是以前没有尝试过的。”而且，治疗方案也经过了医学伦理委员会批准，并且由掌握这一特定基因修饰方式的法国Cellectis生物科技公司提供经过基因修饰的T细胞。
由于蕾拉患复发性急性淋巴细胞白血病，体内正常的免疫T细胞已经很少，因此需要利用他人（供体）捐赠的健康T细胞。在利用之前，要对供体T细胞进行基因修饰，即用一种基因剪刀――转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）向健康的供体T细胞添加新的基因，将它们武装起来对抗白血病。
TALEN是一种可靶向修饰特异基因序列的酶，它借助于TAL效应子（一种由植物细菌分泌的天然蛋白）来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计来识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALEN。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质（基因）。此前，TALEN的特异性切割活性在酵母、拟南芥、水稻、果蝇及斑马鱼等多个动植物体系和体外培养细胞中得到验证。
利用TALEN对供体T细胞中的特定基因进行切割后会呈现两种效应。一是治疗白血病的药物不能损伤和杀灭基因修饰的T细胞，二是这种被修饰的T细胞被重新编程，因此，输入蕾拉的体内只是去杀灭其体内病变的白细胞。这种被修饰的T细胞称为UCART19细胞。
UCART19细胞由Cellectis公司研发，大奥德蒙街医院的研究人员通过静脉注射，用10分钟的时间把1毫升的UCART19细胞注入了蕾拉的血流中。然后对蕾拉进行隔离，让她不受感染，因为蕾拉的免疫系统非常虚弱。几周后，蕾拉体内的白血病细胞就明显消失。
然而，这并非是治疗的结束。输入的UCART19细胞只是杀灭了蕾拉体内的白血病细胞，下一步还需要接受骨髓移植来重建蕾拉被治疗摧毁的整个造血和免疫系统。不过，经检查，蕾拉的骨髓细胞是健康的，血细胞计数也在恢复正常。未来就是要找到一位配型相同的供者，由其提供健康的骨髓，移植到蕾拉体内以重建蕾拉的造血系统和免疫系统。所以，仅从蕾拉是白血病基因疗法世界第一例看，也不过是基因剪刀治疗白血病的第一步成功，或成功了一半，即把患者体内的白血病细胞清除掉。
多种基因剪刀治疗多种疾病
在利用UCART19细胞治疗白血病之前，采用另一种基因剪刀――锌指核酸酶（ZFN）治疗艾滋病也获得了初步成功。
ZFN又名锌指蛋白核酸酶，并非自然存在，而是一种人工改造的核酸内切酶，由一个DNA识别区域和一个非特异性核酸内切酶构成，其中DNA识别区域有特异性，在DNA特定位点结合，而非特异性核酸内切酶有剪切功能，两者结合可在DNA特定位点进行定点切割。
美国加利福尼亚州Sangamo生物科学公司用ZFN对供体T细胞进行基因修饰，对T细胞上一个基因删除和灭活，这个基因编码的蛋白就是艾滋病病毒（HIV）进入T细胞的结合靶分子，即T细胞受体CCR5δ32。ZFN修饰CCR5δ32基因可使其缩短，并导致其有名无实，HIV就难以识别这个T细胞的蛋白分子（大门），从而无法入侵T细胞，由此可以治疗艾滋病。
2014年，Sangamo公司的费奥多・乌尔诺夫研究小组对12名艾滋病患者试验，输入经过基因编辑的健康供者的T细胞，有效地抑制了HIV入侵T细胞，有6名患者停止服用抗HIV的药物，说明这种基因编辑疗法初步体现了效果。由于有了初步结果，现在Sangamo公司正在扩大试验，对70多名艾滋病患者试验这种基因编辑疗法。
受到这种基因编辑疗法治疗结果的鼓舞，Sangamo公司还在扩大基因疗法的战场。2015年10月，乌尔诺夫研究小组报告了他们用ZFN对猴子试验治疗血友病的结果。研究人员对15只猴子注射携带编码ZFN基因和凝血IX因子基因的病毒，以治疗血友病。白蛋白是肝脏大量合成的血液蛋白，ZFN能切割基因组中编码白蛋白的基因，并将一个健康的凝血IX因子基因导入基因组中。结果发现，猴子肝脏开始制造更多凝血IX因子，血液中凝血IX因子增加10%。
乌尔诺夫认为，利用ZFN和TALEN基因剪刀可以治疗多种疾病。例如，白蛋白基因类似人类基因组的一个USB接口，在这个位置也可利用ZFN或TALEN基因剪刀插入其他基因以治疗疾病。
不过，Sangamo公司利用基因剪刀治疗血友病还未取得美国食品与药物管理局（FDA）的许可证。2015年9月美国国立卫生研究院（NIH）一个委员会同意开展基因编辑治疗的临床研究，并可能对凝血IX因子基因治疗开绿灯。现在Sangamo公司已经向FDA提出申请，如果获得FDA批准，临床试验可望在2016年展开。
无论是利用ZFN，还是TALEN基因剪刀治疗疾病，目前还只是在对T细胞的某种基因进行编辑、删除以治疗疾病，是一种间接的基因疗法。更为直接的用基因剪刀切除致病基因的疗法也在试验之中，这就是名为CRISPRCas的基因剪刀。
CRISPR的全称是，成簇的规律性间隔短回文重复序列，Cas则是指与CRISPR相关的基因。CRISPRCas技术是继ZFN、胚胎干细胞（ES）打靶和TALEN等基因编辑技术后用于定点剪切、敲除特定基因的第四种方法，不仅可以用于治疗疾病，还可能修改胚胎，创造新的物种，甚至创造“超人”。
现在，CRISPRCas治疗疾病的一个试验是治疗β地中海贫血。美国加州大学旧金山分校的简悦威教授及其同事在2014年8月5日的《基因组研究》发表文章称，他们尝试用CRISPRCas治疗β地中海贫血获得初步成功。β地中海贫血是由HBB基因突变引起的，会造成严重的血红蛋白缺乏。全球每10万人中有1人受到这种疾病的影响，目前还没有能够治愈β地中海贫血的办法。
研究人员先将β地中海贫血患者的皮肤细胞（成纤维细胞）转变为诱导的多能干细胞（iPSC），然后利用CRISPRCas编辑技术来纠正HBB特殊位点的DNA序列，即切割双链DNA中HBB突变位点。然后，细胞自身会通过同源重组用正确的核苷酸序列修复DNA。经过基因校正HBB突变之后的诱导的多能干细胞没有检测到脱靶效应，细胞保持着完全的多能性，核型也很正常。
之后，研究人员把这些诱导的多能干细胞分化为红细胞，结果红细胞的HBB表达恢复正常。不过，要将CRISPRCas编辑技术真正用于临床治疗β地中海贫血，还有较长的路要走。
一、CRISPR的发展历程
1985年，日本大阪大学学者发表碱性磷酸酶基因的研究性篇论文，该发现涉及编码基因附近存在的小的DN段.之后有三个独立的生物信息学团队作出报告，他们的研究均暗示CRISPR在微生物免疫中有可能发挥了作用，他们在报告中指出了间隔区DNA与噬菌体的基因序列通常高度匹配.2007年，科学家通过研究发现，添加或删除和噬菌体DNA相匹配的间隔区DNA会改变嗜热链球菌对噬菌体攻击的抵抗力，这是对间隔区DNA功能的巨大突破.2011年科研工作者开始尝试解析各种与CRISPR相关的蛋白质的功能，最终分离出了Cas9蛋白质的CRISPR系统，这一发现为研究间隔区DNA如何在细菌的免疫防御中发挥了关键作用.2013年初，《Science》杂志公布了两项最新研究成果，首次证明了Cas9 核酸酶可以对小鼠和人类细胞进行有效的编辑，是更为安全的哺乳动物细胞基因组编辑的新方法.如今，科研工作者能够通过设计gRNA，靶向包括果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠和人类等在内的许多物种的基因组中的几乎任何碱基序列，实现真正的基因工程的遗传编辑.
CRISPR系统从初发现到2013年的系统建立实现了在多个物种中的应用，并将在更多的物种中得到应用.
二、CRISPR的工作原理
虽然科学家到目前为止还没有完成弄清楚CRISPR-Cas/Cas9 系统的详细作用机制， 但已基本明确了该系统的作用过程.目前大家比较公认的该系统的作用机制大体可分为以下3个不同的阶段，如图2.
噬菌体侵入宿主时，首先产生编码蛋白，这个过程由Cas/Cas9基因完成.编码蛋白产生后靶向调节间隔序列.此后，基因组中被靶向的间隔序列被剪切，整合到宿主基因组的5′端.短的参入间隔序列被转录为crRNAs.最后，在CAS蛋白复合物的参与下，靶向干扰噬菌体的基因组序列.
三、Cas9的应用优势
虽然CRISPR/Cas9被发现的历史并不长，但其在工业和学术领域方面的应用已经非常的广泛.
首先，CRISPR/Cas9的特性被用于不同菌株分类.由于Cas9蛋白的来源是细菌来源，所以要使得Cas9蛋白在不同动物细胞核内高效转运，需要在蛋白上添加真核细胞的核定位序列.科学家通过改造Cas9使得多系统都能够进行CRISPR/Cas9应用.
此外，相比于遗传学中常用的ZFN和TALEN两种人工核酸酶，CRISPR/Cas9凭借其可以造成特异性的单链切口，激活细胞的同源重组机制的特点因而具有极大的优势.同时，对CRISPR/Cas9进行多个位点修饰方法，实现大片段缺失的突变改造机制.这就为困扰人类多年的遗传疾病的治疗带来了一线曙光.通过科学家的努力，CRISPR/Cas9系统已经能够精确编辑小鼠和大鼠基因组特定的基因位点，目前已经成功应用于大小鼠基因的敲除和过表达的模型制备.Cas9在科研工作中的突破性贡献，为无数科学工作者提供了敲除的平台以便更好的研究.
教科书上已经对1997年体细胞克隆多利羊的报道做出了“突破性进展”的评述.然而转基因动植物由于技术和舆论压力仍然不为所有人接受.而如果充分利用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术，则有可能使这一局面得到改观.比如有科研小组利用CRISPR/Cas9系统定点修饰猪等家畜的基因组，通过CRISPR/Cas9修饰影响家畜生产的基因单核苷酸多态性，从而可以提高猪肉瘦肉率、绵羊肌肉含量等.此外，CRISPR/Cas9在干细胞研究中也有着应用.
四、Cas9获得的荣誉
新技术CRISPR/Cas9，被称为“DNA 剪刀”或“基因剪刀”.这项科研的重要意义在于可以为人类的健康谋福祉.自 2012年6月首度亮相之后，获得了许多科学家的认可，在数个国际会议上备受推崇，为基因治疗和遗传疾病的研究拓展了思路，提供了全新的治疗策略.众所周知，人类有许多疾病，例如镰刀型细胞贫血症、糖尿病、爱滋病、抑郁症等，都与基因有关.人们广泛利用 Cas9技术，从基因的源头上探究这些疾病发病的根源，尝试找出新的标靶药物，达到治愈疾病的目的.新技术CRISPR/Cas9甚至还可以应用于改造酵母菌，让其来生产生物燃料，从而缓解人类的能源危机；应用于改造小麦，使其能抵抗害虫和干旱天气，缓解人类的粮食危机.美国著名教授 Jonathan Weissman 称：“ CRISPR/Cas9技术彻底改变游戏规则，现在我们可随意启动或关闭遗传因子.”
关键词：反义RNA；RNA干扰；ZFN；TALEN；CRISPR-Cas系统
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）08-1405-08
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.08.002
Research Progress on Loss of Gene Function Technologies
NING Hui-yua，b，LIU Caia，b，ZOU Hua-wena，b
（a.College of Agriculture；b.Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）
Abstract： Loss of gene function technology is one of the most important and efficient methods to study gene function at present. Now main widely used loss of gene function technologies are anti-sense RNA， RNA interference，ZFN，TALEN，CRISPR-Cas nucleases technology and so on. Those technologies aim to inhibiting or turning off the expression of the target gene， researching the change of the biological phenotype， and thus their related functions were speculated. In the practical studies， loss of gene function is always along with gene overexpression， providing the most direct evidence for gene function research， which was widely used in biology， medicine， agriculture and other fields. This paper systematically introduces the developing history， technological principles and application of some common loss of gene function technologies， and the protest of their future research and application is introduced.
Key words： anti-sense RNA； RNA interference； ZFN； TALEN； CRISPR-Cas nucleases
20世o50年代DNA双螺旋结构的发现，标志着人们对生命科学的研究进入了分子生物学时代。随着后基因组时代的到来，基因组学的研究重心从揭示生命的所有遗传信息结构、组成等转移到对功能的研究上。除了传统的转基因（基因过量表达）外，定向抑制或完全消除特定基因的表达也是目前研究基因生物学功能的重要手段。因此，出现了反义RNA、RNA干扰等技术。随着研究技术手段的发展，近年来又兴起了ZFN技术、TALEN技术、CRISPR-Cas系统等基因功能修饰技术。这些技术不断被发现及应用，极大地促进了生物学研究的发展。本研究主要对基因功能缺失技术发展历程、技术原理及应用等方面进行概述。
1 反义RNA技术
反义RNA是指与靶RNA（多为mRNA）具有互补序列的RNA分子，它通过与靶RNA进行碱基互补配对的结合方式影响mRNA的后续翻译过程。反义RNA最早在原核生物E.coli的产肠杆菌素的Col E1质粒中发现[1]。随后发现在真核生物中也存在天然的反义RNA，特别是发现了人工构建的反义寡核苷酸在真核生物中具有生物学效应以来，反义RNA技术已成为一种直接有效的人为控制基因表达的方法，并且倍受生物学界关注。
1.1 反义RNA作用机理
反义RNA主要通过与靶RNA以碱基互补配对的方式结合，参与基因表达调控。其作用机理为：①在DNA复制水平上。反义RNA通过与DNA复制时的起始引物RNA结合，阻止RNA引物与模板DNA的结合，抑制DNA的复制。②在转录水平上。反义RNA可以直接与mRNA5′端互补，阻止转录。③在翻译水平上。反义RNA通过与mRNA上的特定序列互补配对而结合。结合位置包括起始密码子AUG、靶mRNA的非编码区、原核生物的SD序列以及真核生物的mRNA5′端，从而直接或间接地抑制mRNA的翻译[2]。
1.2 反义RNA技术的应用
目前，反义RNA技术作为一种重要的基因调控手段，在植物、病毒、细菌中得到广泛应用。在植物中最显著的应用是果实成熟的控制。科学家通过控制乙烯合成途径中的关键酶来限制乙烯的合成，从而达到控制果实成熟的目的[3]。Oeller等[4]利用反义RNA技术抑制ACC合成酶的活性，使果实内的乙烯含量被抑制了99.5%。这为果实的贮藏、加工、运输等提供了新方法。
反义RNA技术在植物抗病方面也得到了很好的应用。植物病毒是影响植物生长的重要因素之一。由于DNA病毒和RNA病毒在复制和表达的过程中都要经历RNA生物合成阶段，这为利用反义RNA技术进行抗病毒研究提供了理论依据。Nelson等[5]利用TMV 5′端的基因片段作为目的基因，成功构建了反义基因并获得了表达反义基因的转基因烟草植株。试验结果表明，病毒RNA和后代病毒的合成被抑制了25～50倍，病毒侵染症状大量减少甚至消失，并且该抗病毒性状可稳定遗传。
由于抗生素的滥用，细菌的耐药性越来越强。为了能够快速、简便获得新的抗菌药物，反义RNA技术被应用到药物筛选模型上。2006年科学家在金黄色葡萄球菌体内诱导表达出了针对单功能脂肪酸合成酶FabF的反义RNA，并构建了反义工程菌。研究发现，构建的反义工程菌对FabF（Fatty acidbiosynthesis geneF）的特异性抑制剂非常敏感，通过药物筛选获得了能够有效抑制MRSA（Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus）和VRE（Vancomycin-Resistant Enterococci）的新型抗生素平板霉素[6]。因此，可利用反义RNA技术寻找新型抗生素解决细菌耐药性的问题。
1.3 反义RNA技术的优缺点
随着研究的不断深入，人们对反义RNA技术也有了比较成熟的认识。与传统的基因敲除技术相比，反义RNA技术具有许多的优越性。①反义RNA技术操作较简单，适用范围广泛。通过靶mRNA的序列就可以合成所需的反义RNA，可用多个反义RNA同时阻断多个基因的表达。②特异性强[7]。反义RNA技术可以有选择性的迅速抑制目的基因的表达。该技术不会对蛋白质产生完全抑制，从而能避免致死突变，对细胞的正常生长影响较小。③安全性高[8]。导入细胞的反义RNA不能被翻译产生蛋白质，因此该技术在基因工程上的应用具有很大的安全性。
众多的因素限制了反义RNA的发展。主要包括：①成本较高。②靶基因定位困难。由于高等生物的基因组复杂，对特殊基因的靶向定位很困难。③使用效率问题。反义RNA的碱基序列、含量、靶序列结合部位和浓度等都会影响其使用效率[9]。
2 RNA干扰技术
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指与靶mRNA存在同源互补序列的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）在细胞内特异性地降解靶mRNA的一种基因转录后沉默现象[10]。这一现象在自然界中广泛存在，是生物体在进化过程中形成的一种进化上保守的用来抵御外来基因或外来病毒侵犯的防御机制。
1990年Napoli等[11]将查尔酮合成酶CHS基因转入到牵牛花中，试图获得开出深紫色花朵的牵牛花，结果却得到了白色和斑片状花朵，即转入的CHS基因和与该基因同源的色素基因的表达均受到抑制，将这种现象称为转录后基因沉默 （Post-transcriptional gene silencing）或者共抑制（Co-suppression）。1994年Cogoni等[12]分别将外源基因albino-1和albino-3转入粗糙脉孢菌（Neurospora）中，也出现了与植物共抑制相同的转录后基因沉默现象，将其称为基因压制（Gene quelling）现象。1995年Guo等[13]发现将秀丽新小杆线虫（Caenorhabditis elegans）par-1基因的正义链RNA和反义链RNA分别注射到线虫体内均会抑制par-1基因的表达，但当时的理论无法解释这一现象。直到1998年Fire等[10]才解释了这一现象，即RNAi是由于dsRNA引起的转录后序列特异性基因沉默，并将其命名为基因沉默（Gene silencing）。
2.1 RNA干_作用机理
RNA干扰作用机理可分为3个过程：siRNA的形成、靶mRNA的降解、RNAi的形成。①siRNA的形成[14]。细胞质中的内源性或外源性的长dsRNA首先与Dicer酶结合，形成Dicer-dsRNA复合物，在Dicer酶的RNase的作用下，长dsRNA被特异性地裂解为21～23 nt siRNA。其5′端为磷酸基，3′端为羟基且含有2个突出的黏性末端。②靶mRNA的降解。siRNA在解旋酶的作用下解链，形成正义链和反义链，其中的反义链可指导形成RNA诱导的沉默复合体（RISC）[15]。在siRNA的引导下，RISC通过碱基互补配对的方式识别具有同源序列的靶mRNA并进行剪切，其剪切位点为与siRNA反义链互补的第1个核苷酸下游的11或12个核苷酸处，然后降解靶mRNA。③RNAi的形成。在RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）的作用下，以靶mRNA为模板，siRNA为引物，合成dsRNA。合成的dsRNA在Diser酶的作用下，又产生新的siRNA，如此循环多次，可以使RNAi的作用进一步放大。因此，少量的siRNA可以产生高效的基因沉默效应[16]。研究还发现siRNA除了能导致转录后基因沉默，还可指导DNA甲基化酶与DNA的特定部位结合，引发该特定部位DNA中的胞嘧啶甲基化，导致转录水平的基因沉默[17]。
2.2 RNA干扰技术的应用
虽然人们对RNA干扰的研究只有短短的十几年时间，但发展却极为迅速，在生物医学等领域得到广泛应用。①疾病治疗上的应用。RNA干扰作为一种基因敲除技术，在肿瘤、病毒感染、遗传病治疗方面得到了广泛应用。An等[18]利用RNA干扰技术构建了卵巢癌OVCAR3细胞IGF-IR基因的siRNA表达质粒，通过脂质体法转染到人的卵巢癌OVCAR3细胞中，研究发现IGF-IR基因的siRNA能显著抑制其mRNA及蛋白质的表达，并且还能抑制OVCAR3细胞的增殖。RNA干扰技术为疾病在基因领域的治疗提供了新方法。②作为基因研究的新工具。由于RNA干扰能特异性的抑制目的基因的表达，根据其表型等的改变可以分析基因的功能，因此是研究基因功能的一种有效的手段[19]。Yu等[20]通过构建cyclin D1基因的siRNA表达质粒，研究cyclin D1基因对疤痕疙瘩成纤维细胞的细胞增殖和细胞周期的变化。③RNA干扰技术还被广泛应用于信号传导通路的研究。通过和传统的缺失突变技术结合，RNA干扰技术可以很容易确定复杂信号传导途径中不同基因的上下游关系[21]。Jin等[22]利用RNAi技术发现argonaute-1在FMRP参与神经元发育和突触生长过程中起重要作用，证明FMRP能调节信号通路。④药物的开发与应用。RNA干扰可作为寻找和鉴定新药物靶标的工具。利用RNA干扰技术可以明显缩短从鉴定到认识药物靶基因功能的时间，有助于药物开发过程中对已知靶基因功能的高通量分析[23]。Duff等[24]利用RNA干扰技术能降低蛋白转移酶9（PCSK9）的表达量，研究发现PCSK9表达量的降低能明显降低小鼠血清胆固醇水平，说明沉默PCSK9可成为治疗高胆固醇的药物靶点。
2.3 RNA干扰技术的优缺点
RNA干扰技术具有以下特点：①高效性。RNAi存在级联放大效应。siRNA在Diser酶的作用下，以靶mRNA为模板可以产生新的siRNA，如此循环多次，可以使RNA干扰的作用进一步放大。因此，少量的siRNA可以产生高效的基因沉默效应。②特异性。siRNA与靶mRNA通过碱基互补配对原则进行结合，只特异性的诱导靶mRNA的降解。研究表明，即使是一个碱基的错配，也会影响靶mRNA沉默效率[25]。对mRNA前体几乎没有影响，以内含子或启动子构成的dsRNA也不产生RNA干扰现象。③可传播和可遗传性。RNA干扰效应可以在不同细胞间进行传递，并且可以传递到下一代。Fire等[10]通过将dsRNA注射到线虫体内，发现dsRNA可以扩散到其他细胞中，并且在下一代也表现出了RNA干扰现象。
目前，对RNA干扰的研究仍处于初级阶段，还有许多问题亟待解决。主要包括：①存在脱靶现象。siRNA可以引起一些非靶基因的非特异性沉默或表达上调，抑制细胞的正常生长。②稳定性差。siRNA导入受体细胞后RNA干扰效应持续数天后便会消失。③载体的安全性问题。在临床应用上，载体作为外来抗原可激活机体的免疫应答，使载体失活，甚至可能对机体造成严重的不良后果[26]。
3 锌指核酸酶（ZFN）技术
1983年，锌指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）首次在非洲蛙蟾转录因子IIIA中被发现。随着研究的不断深入，人们对ZFP有了进一步的了解。1996年Kim等[27]将锌指结构域与IIs型限制性核酸内切酶FokⅠ的切割结构域融合，获得了具有识别特性的人工合成的核酸内切酶。随后，Bibikova等[28]利用ZFN技术对爪蟾的卵母细胞开展外源DNA修复试验，并取得成功。Bibikova等[29]又利用ZFN技术成功敲除了果蝇的一个内源基因。ZFN技术的应用实现了对基因的高效定点修饰，对研究基因的功能具有重要意义。
3.1 ZFN的结构及作用机理
ZFN是由锌指蛋白（ZFP）结构域和核酸内切酶（FokⅠ）的切割结构域两部分组成[27]。ZFP结构域主要负责识别并特异结合靶DNA序列。FokⅠ的切割结构域主要负责切割靶DNA。
ZFP结构域一般是由3～6个Cys2-His2型的锌指结构域串联组成，多个锌指结构的串联不仅可识别较长的靶DNA序列，还可以增加其修饰的特异性。每个锌指折叠成α-β-β（C端-N端）型的二级结构[30]，其中的α螺旋可插入到DNA双螺旋的大沟，α螺旋中的-1～+6位的7个氨基酸残基（+4位通常为亮氨酸残基）决定了对靶DNA识别的特异性[31]。每个锌指蛋白可识别并结合一个三联体密码（图1a）[32]。
FokⅠ是海床黄杆菌（Flavobacterium okeanokoites）表达的一种限制性内切酶，通过与ZFP的C端融合形成ZFN单体。FokⅠ的切割结构域必须形成二聚体才能发挥内切酶活性[33]。因此，在切割靶位点时，2个ZFN单体按照一定的距离和方向同各自的靶DNA链特异结合，2个FokⅠ切割结构域恰好可形成有活性的二聚体，在2个结合位点的间隔区（Spacer，通常为5～7 bp）切割DNA产生DSB切口。细胞再通过非同源性末端接合（NHEJ）或同源重组（HR）等方式对基因进行修复，改变靶DNA序列，从而达到基因敲除的目的[34]（图1b）。构建能特异性识别靶DNA的ZFP结构域是ZFN技术的关键。因此，只需根据目的基因设计出锌指结构域，再与FokⅠ融合形成ZFNs。然后将融合的ZFNs通^电穿孔、转染及病毒运输等方式导入细胞核中完成对靶基因敲除。
3.2 ZFN技术的应用
ZFN作为一种靶向修饰技术，可以精确地修饰基因及其周围调控元件，在生物体基因组改造与基因功能研究等方面得到广泛应用。ZFN已经成功应用于线虫、大鼠、小鼠、中国仓鼠、果蝇、海胆、斑马鱼、家蚕、植物、猪及人类iPS细胞和ES细胞中[35]。主要包括以下两方面：①对动植物基因组的靶向修饰。Bibikova等[29]利用ZFN技术对果蝇X性染色体的yellow基因进行定点修饰，结果发现50%的雄性果蝇发生颜色的改变。Zhang等[36]设计了针对敲除拟南芥ADH1和TT4基因的ZFN，通过雌激素诱导启动子表达，研究发现T1代分别有7%和16%的植物含有体细胞突变，并且能稳定遗传给后代。②疾病的治疗。Li等[37]利用ZFN技术治愈了血友病B型小鼠，这为以后利用ZFN技术治疗基因疾病提供了新的有效手段。
3.3 ZFN技术的优缺点
ZFN作为第一代人工核酸内切酶技术，打破了只能通过同源重组的方式对基因组进行改造的观念。ZFN技术的优点包括：①与传统的方法相比较，ZFN技术提高了基因组的编辑效率，操作简单，可以快速敲除目的基因。②能够广泛地应用于各种生物，并诱导靶位点进行定点突变。
ZFN技术也存在着许多的局限性：①存在脱靶现象。由于ZFN对靶位点进行切割时容易脱靶，导致细胞代谢紊乱，从而对细胞产生毒副作用。②存在上下文依赖效应[38]。ZFN在识别靶DNA位点时，识别靶DNA的重复氨基酸之间会相互作用，导致识别的特异性发生改变，即识别靶DNA的特异性不高，影响基因打靶的效果。③成本高。由于ZFN的特异性不高，很难设计出高特异性的锌指组合，目前该技术一直被生物公司垄断。
4 转录激活子样效应物核酸酶（TALEN）技术
1989年一类可以使植物患病的转录激活子样效应蛋白TALE（Transcription activator-like effector）在黄单胞杆菌（Xanthomonas）中分离得到[39]。2007年Kay等[40]发现一种TALE蛋白（AvrBs3）可以被黄单胞杆菌注入到宿主细胞内，然后进入宿主细胞核，与宿主upa20基因的启动子结合，激活宿主upa20基因的表达。2009年Moscou等[41]发现了TALE蛋白特异结合宿主基因启动子的机制。随着对TALE蛋白的深入了解，科学家发现TALE蛋白可以补足第一代人工合成的核酸内切酶（ZFN）技术的许多缺陷。2010年Christian等[42]首次报道了人工构建的TALEN技术。2011年Li等[43]用AvrXa7和PthXo1中天然存在的TALE重复序列进行了类似的试验，发现FokⅠ结构域连接到TALE结构域的C端的切割效果好于连接到N端。2012年Deng等[44]通过解析TALE蛋白的晶体结构，清晰揭示了TALE蛋白结合DNA的作用机制，为以后更好改造和应用TALEN打下了基础。
4.1 TALEN的结构及作用机理
TALEN是由TALE结构域和核酸内切酶（FokⅠ）的切割结构域两部分组成[45]。与ZFN技术原理类似，TALE结构域主要负责识别并特异结合靶DNA序列，FokⅠ的切割结构域主要负责切割靶DNA。
TALE蛋白是由N端的具有分泌信号功能的易位结构域（Translocation domain，TD）、中部DNA特异识别结合域、C端核定位信号（Nuclear localization signal，NLS）和转录激活结构域（Activation domain，AD）4部分构成。其中，中部DNA特异识别结合域是由一系列数目不定的串联重复单元组成。每个重复单元通常由34个氨基酸组成[46]，其中32个氨基酸是高度保守的，只有12位和13位上的氨基酸是可变化的，这2个氨基酸又被称为重复可变双残基（Repeat variable diresidue，RVD）。每个重复单元只识别1个核苷酸，其识别的特异性由RVD决定，并且RVD可与4种碱基有特定的配对关系，即NI特异识别A，HD特异识别C，NG特异识别T，NH特异识别G，NN对应G或A[41，46]。研究发现，第12位氨基酸主要起稳定RVD环的功能，第13位氨基酸是真正识别特异碱基的氨基酸，决定识别的特异性[44，47]（图2a）。
FokⅠ与TALE的C端融合形成TALEN。对靶DNA进行切割时，FokⅠ也需要形成二聚体发挥切割作用，当两个TALEN分别结合到各自的靶DNA序列上时，2个FokⅠ会在靶DNA序列的间隔区（Spacer，14～18 bp）处形成二聚体[48]，并对靶DNA进行切割，形成DSB切口，进而引发细胞内的NHEJ和HR修复机制，导致基因沉默（图2b）。总之，通过构建不同的TALE就可实现对不同靶DNA的切割。
4.2 TALEN技术的应用
TALEN技术的发明使得基因组编辑效率明显提高，因此，在人、小鼠、大鼠、斑马鱼、水稻、拟南芥等物种中得到广泛应用。①遗传病治疗方面的应用。科研人员利用TALEN技术对来源β-地中海贫血病人的非整合型iPSCs进行珠蛋白基因HBB修复，研究发现细胞在修复过程中没有产生TALEN引发的脱靶突变并且这些修复好的iPSCs具有多能性及正常核型，表明这种方法可作为一种治疗地中海贫血疾病的有效途径[50]。②生物模型的构建。2014年中国科学家利用TALEN技术成功的敲除了食蟹猴基因。首次用该技术成功构建了非人类灵长类动物模型[51]。③新品种的培育。Li等[52]利用TALEN技术剔除掉了水稻基因组中对水稻白叶枯病敏感基因Os11N3，获得了稳定遗传的抗病水稻新品种。这也显示出了TALEN技术介导的基因定点修饰在作物遗传育种中具有广阔的应用前景。
4.3 TALEN技术的优缺点
作为第二代人工合成的核酸内切酶技术，与ZFN技术相比，TALEN技术具有明显的优势。①与ZFN技术相比，TALEN筛选更为简便，它不需要复杂的筛选过程，只需要简单的分子克隆技术就可以获得高效的TALEN。②脱靶现象减少，降低了对细胞的毒性。③切割位点的特异性强。
TALEN技术虽然有很多优点，但也存在许多不足。主要包括：①TALE蛋白较大，并且序列重复性很强，构建表达载体较为复杂[53]。一般由生物公司合成，r格较贵。②仍然存在脱靶现象。③一对TALEN只能对一个靶基因进行修饰。当对多个基因同时进行编辑时，需要共转染多个TALEN载体，这样会导致转染效率下降，很难获得所需的阳性细胞[54]。
5 CRISPR-Cas核酸酶（CRISPR-Cas RGNs）技术
1987年Ishino等[55]首先在大肠杆菌的碱性磷酸酶基因下游发现了成簇的短间隔重复序列，但该序列当时没有引起人们的足够重视。随着研究的不断深入，发现大约40%的细菌和90%的古生菌都存在这种成簇的短间隔重复序列。2002年这种成簇的短间隔重复序列被命名为串联间隔短回文重复序列[56，57]（Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR）。此外，在CRISPR位点附近还存在着多个与CRISPR相关的Cas（CRISPR-associated genes）基因。随后的研究又发现，CRISPR中的间隔序列与质粒或噬菌体等外源DNA序列高度同源。当病毒入侵宿主细胞时，细菌和古细菌中的CRISPR序列就能够引导CRISPR相关（CRISPR-associated，Cas）蛋白使外源DNA降解，从而起到免疫保护的作用[58]。
5.1 CRISPR-Cas系统的结构及作用机理
CRISPR-Cas系统主要是由CRISPR序列元件和Cas基因家族蛋白组成[59]。目前，CRISPR-Cas系统一般被分为3种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系统在介导靶DNA双链降解时需要多种Cas蛋白的参与，而Ⅱ型CRISPR-Cas系统只需要Cas9就可完成对靶DNA双链的切割[60]。通过比较，Ⅱ型CRISPR-Cas系统更为简便，更适合应用于基因编辑。目前，CRISPR-Cas技术主要是Cas9系统的应用，本研究将对CRISPR-Cas9系统进行阐述。
CRISPR序列元件主要是由一个前导序列（Leader）、多个重复序列（Repeats）及多个间隔序列（Spacers）组成，其中重复序列和间隔序列以相互交替的方式连接（图3）。前导序列是一段富含AT，长度为550 bp的不保守序列，位于CRISPR的上游，可启动CRISPR序列转录；重复序列是一组长度为23～50 bp，平均长度为31 bp的高度保守的短小序列；间隔序列为来源于噬菌体、质粒等的平均长度为36 bp的外源基因片段即原间隔序列（Protospacers）[61]。Cas9是一个多结构域蛋白，主要由α-螺旋组成的识别区（REC）、位于蛋白中间位置的HNH核酸酶结构域、 位于氨基末端的RuvC-like结构域以及位于C端的PAM结合区组成[62]。
CRISPR-Cas9系统[63]的作用机理可分为3个阶段：①可变间隔序列的获得[64]。CRISPR-Cas9系统能够识别外源核酸中的特殊片段，该特殊片段中存在原型间隔序列毗邻基序（Protospacer-associated motif，PAM），并将PAM旁的原型间隔序列加工整合入自身基因组中的CRISPR序列中。②crRNA（CRISPR-derived RNA）的形成[60]。在前导序列的启动下CRISPR转录产生前体CRISPR RNA（pre-CRISPR RNA，pre-crRNA），随后CRISPR转录产生的tracrRNA（trans- activating crRNA）与pre-crRNA形成RNA异二聚体，在Cas蛋白的作用下，pre-crRNA被加工成crRNA。③对外源DNA的切割[64]。成熟的crRNA、tracrRNA及Cas9结合形成一个三元的沉默复合物。而后在crRNA的引导下由Cas9蛋白对目的基因进行切割。在切割时Cas9蛋白的HNH能够特异性识别与crRNA互补配对的模板链并对其切割，切割位点位于PAM上游3 nt处；RuvC-1ike参与另一条链特定位点的切割，切割位点位于PAM上游3～8 nt处（NGG位点）[65]。Cas9蛋白对外源DNA进行切割后也会产生DSB切口，并通过NHEJ和HR的方式进行修复[66]（图4）。因此，通过设计不同的crRNA可以使CRISPR-Cas9剪切不同的DNA序列。Jinek等[67]将成熟的crRNA和tracrRNA这两种RNA构建成一个向导RNA（single-guide RNA，sgRNA）与Cas9融合，发现由sgRNA和Cas9蛋白构成的新CRISPR-Cas系统仍可对目的基因进行切割。所以，可将CRISPR-Cas9系统简化成Cas9蛋白与sgRNA。
5.2 CRISPR-Cas系统的应用
目前，CRISPR-Cas系统的应用仍处在初级阶段，但在基因功能的研究、模式生物的构建、遗传育种等方面得到广泛应用。①在基因功能研究中的应用。与传统的基因敲除技术相比，CRISPR-Cas系统能够对多种细胞及生物体的目的基因进行高效快速的敲除，是研究基因功能的重要工具。Shalem等[68]构建了一个含有65 000种sgRNA的文库，这些sgRNA可以靶向人类基因组中18 080种基因，几乎涵盖了每个已知的基因。并将编码这些sgRNA的基因和编码Cas9蛋白的基因一起转运到人类细胞中，从而筛选出具有特定功能的基因。②动物模型的构建。2013年Wang等[69]在小鼠的胚胎干细胞中使用CRISPR-Cas9系统，对Tet1、Tet2、Tet3、Sry和Uty-8这5个基因进行同时编辑，产生了基因敲除新个体。这为研究基因家族成员的功能相关性提供新方法。③新品种的改良与培育方面的应用。Shan等[70]利用CRISPR-Cas9技术去掉了一个小麦基因，得到了耐白粉病的小麦新品种。还利用CRISPR-Cas9技术定点突变了水稻和小麦两种作物的OsPDS和TaMLO基因，发现原生质体中基因突变效率为14.5%～38.0%，水稻转基因植物中突变效率4.0%～9.4%，并且在T0代获得了水稻纯合PDS突变体，呈现预期的白化和矮小表型。
5.3 CRISPR-Cas系统的优缺点
作为第三代人工合成的核酸酶，与ZFN技术和TALEN技术相比具有明显的优势。主要表现在：①CRISPR-Cas系统的切割能力更强。CRISPR-Cas系统可以切割一些ZFN和TALEN不能接近的位点[71]。②操作更为简便，试验周期更短，成本更低。突变不同的靶位点只需设计与靶位点互补的sgRNA，然后将sgRNA克隆到表达质粒上即可。③CRISPR-Cas系统可以同时对多个靶基因进行定点修饰，因此大大提高了修饰效率。
CRISPR-Cas系统的应用仍处于初级阶段，存在许多不足：①5′-GN19NGG-3′的结构有时会出现限制性，会对靶位点以外的序列进行编辑，产生多余的DNA突变[72]。②CRISPR-Cas系统识别靶序列的长度较短，不能根据需求进行调节。③仍存在脱靶现象。
6 展望
基因功能缺失技术已经在生物学各个领域得到广泛应用，成为了研究基因的主要方法。随着基因功能缺失技术的不断更新，已从反义RNA技术发展到了CRISPR-Cas技术，并且其应用范围越来越广泛，对目的基因的编辑效率越来越高，操作越来越简便。目前基因功能缺失技g仍存在许多不足，限制了其发展。随着研究的不断深入与发展，基因功能缺失技术必将得到不断改进和完善，也一定会对基因功能方面的研究做出更大的贡献。
参考文献：
[1] SIMONS R W. Naturally occurring antisense RNA control-a brief review[J].Gene，1988，72（1-2）：35-44.
[2] 宫 明，宫 锋.反义RNA调控的不同方式[J].生命的化学（中国生物化学会讯），1996，16（4）：17-18.
[3] TU H Y，LIU Y F. The mechanism of antisense RNA and its application in the plant gene engineering[J].Biomagnetism，2005，5（2）：32-34.
[4] OELLER P W，LU M W，TAYLOR L P，et al.Reversible inhibition of tomato fruit senescence by antisense RNA[J].Science，1991，254（5030）：437-439.
[5] NELSON A，ROTH D A，JOHNSON J D.Tobacco mosaic virus infection of transgenic Nicotiana tabacum plants is inhibited by antisense constructs directed at the 5′ region of viral RNA[J]. Gene，1993，127（2）：227-232.
[6] YOUNG K，JAYASURIYA H，ONDEYKA J G，et al.Discovery of FabH/FabF inhibitors from natural products[J]. Antimicrob Agents Chemother，2006，50（2）：519-526.
[7] 丁月月，李 霜，黄 和.反义RNA技术在丝状真菌代谢工程中的应用[J].生物工程学报，2009，25（9）：1316-1320.
[8] 莫 凡，王传之，朱永智，等.反义RNA在水稻遗传育种研究中的应用[J].广东农业科学，2008（4）：8-9.
[9] 张西锋，沈 伟，潘庆杰，等.反义RNA技术原理及其在疾病治疗中的应用[J].莱阳农学院学报，2004，21（1）：20-22，33.
[10] FIRE A，XU S，MONTGOMERY M K，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabdit is elegans[J]. Nature，1998，391（6669）：806-811.
[11] NAPOLI C，LEMIEUX C，JORGENSEN R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans.[J]. Plant Cell，1990，2（4）：279-289.
[12] COGONI C，ROMANO N，MACINO G.Suppression of gene expression by homologous transgenes[J]. Antonie Van Leeuwenhoek，1994，65（3）：205-209.
[13] GUO S，KEMPHUES K J. Par-1， a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos， encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed[J].Cell，1995，81（4）：611-620.
[14] BERNSTEIN E，CAUDY A A，HAMMOND S M，et al.Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference[J].Nature，2001，409（6818）：363-366.
[15] SONTHEIMER E J. Assembly and function of RNA silencing complexes[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2005，6（2）：127-138.
[16] ZAMORE P D. RNA interference： Listening to the sound of silence[J]. Nat Struct Biol，2001，8（9）：746-750.
[17] DOGINI D B，AVANSINI S H，VIEIRA A S，et al.The new world of RNAs[J].Genet Mol Biol，2014，37（1）：285-293.
[18] AN Y，CAI Y，GUAN Y，et al. Inhibitory effect of small interfering RNA targeting insulin-like growth factor-I receptor in ovarian cancer OVCAR3 cells[J].Cancer Biother Radiopharm，2010，25（5）：545-552.
[19] 毛颖波，薛学义，陈晓亚.植物小RNAcRNA干扰：生物学功能与应用前景[J].中国科学（生命科学），2009，39（1）：31-43.
[20] YU D M，HAO L J，WANG D Y，et al. Influence of RNA interference mediated cyclinD1 gene silencing on the proliferation and G1 phase regulators of fibroblasts derived from keloid[J]. Prog Biochem Bio-phys，2008，35（2）：159-169.
[21] 袁成良，金晓岚.RNA干扰原理及应用研究进展[J].西部医学，2009（4）：664-666.
[22] JIN P，ZARNESCU D S，CEMAN S，et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway[J].Nat Neurosci，2004，7（2）：113-117.
[23] MAKIMURA H，MIZUNO T M，MASTAITIS J W，et al. Reducing hypothalamic AGRP by RNA interference increases metabolic rate and decreases body weight without influencing food intake[J]. BMC Neurosci，2002（3）：18.
[24] DUFF C J，HOOPPER N M.PCSK9：An emerging target for treatment of hypercholesterolemia[J]. Expert Opin Ther Targets，2011，15（2）：157-168.
[25] MCMANUS M T，SHARP P A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs[J]. Nat Rev Genet，2002，3（10）：737-747.
[26] 张巧丽，黄金昶.RNAi技术及其在肿瘤学应用方面的研究进展[J].中国临床医生杂志，2015，43（1）：14-17.
[27] KIM Y G，CHA J，CHANDRASEGARAN S. Hybrid restriction enzymes： Zinc finger fusions to Fok I cleavage domain[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1996，93（3）：1156-1160.
[28] BIBIKOVA M，CARROLL D，SEGAL D J，et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases[J].Mol Cell Biol，2001，21（1）：289-297.
[29] BIBIKOVA M，GOLIC M，GOLIC K G，et al. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases[J].Genetics，2002，161（3）：1169-1175.
[30] WOLFE S A，NEKLUDOVA L，PABO C O. DNA recognition by Cys2His2 zinc finger proteins[J].Annu Rev Biophys Biomol Struct，2000，29：183-212.
[31] PABO C O，PEISACH E，GRANT R A. Design and selection of novel Cys2His2 zinc finger proteins[J].Annu Rev Biochem，2001，70：313-340.
[32] HAUSCHILD Q J，PETERSEN B，COST G J，et al. Gene knockout and knockin by zinc-finger nucleases： Current status and perspectives[J]. Cell Mol Life Sci，2013，70（16）：2969-2983.
[33] PALPANT N J，DUDZINSKI D. Zinc-finger nucleases：Looking toward translation[J].Gene Ther，2013，20（2）：121-127.
[34] 白雪，孙其信，李海峰.基因修饰技术研究进展[J].生物工程学报，2015，31（8）：1162-1174.
[35] URNOV F D，REBAR E J，HOLMES M C，et al. Genome editing with engineered zinc finger nucleases[J]. Nat Rev Genet，2010，11（9）：636-646.
[36] ZHANG F，MAEDER M L，UNGER W E，et al.High frequency targeted mutagenesis in Arabidopsis thaliana using zinc finger nucleases[J].Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（26）：12028-12033.
[37] LI H，HAURIGOT V，DOYON Y，et al. In vivo genome editing restores hemostasis in a mouse model of haemophilia[J].Nature，2011，475（7355）：217-221.
[38] SANDER J D，DAHLBORG E J，GOODWIN M J，et al. Selection-free zinc-finger-nuclease engineering by context-dependent assembly（CoDA）[J].Nat Methods，2011，8（1）：67-69.
[39] BONAS U，STALL R E，STASKAWICZ B. Genetic and structural characterization of the avirulence gene avrBs3 from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria[J].Mol Gen Genet，1989， 218（1）：127-136.
[40] KAY S，HAHN S，MAROIS E，et al. A bacterial effector acts as a plant transcription factor and induces a cell size regulator[J].Science，2007，318（5850）：648-651.
[41] MOSCOU M J，BOGDANOVE A J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors[J].Science，2009，326（5959）：1501.
[42] CHRISTIAN M，CERMAK T，DOYLE E L，et al.Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases[J].Genetics，2010，186（2）：757-761.
[43] LI T，HUANG S，JIANG W Z，et al. TAL nucleases （TALNs）：Hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain[J].Nucleic Acids Research，2011，39（1）：359-372.
[44] DENG D，YAN C，PAN X，et al.Structural basis for sequence-specific recognition of DNA by TAL effectors[J].Science，2012，335（6069）：720-723.
[45] 周 维，付喜爱，张德显，等.基因敲除技术的研究进展[J].中国兽医杂志，2015，51（3）：67-69.
[46] BOCH J，SCHOLZE H，SEBASTIAN S，et al.Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors[J].Science，2009，326（5959）：1509-1512.
[47] MAK A N，BRADLEY P，CERNADAS R A，et al. The crystal structure of TAL effector PthXo1 bound to its DNA target[J]. Science，2012，335（6069）：716-719.
[48] MILLER J C，TAN S，QIAO G，et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing[J]. Nat Biotechnol，2011， 29（2）：143-148.
[49] JOUNG J K，SANDER J D. TALENs： A widely applicable technology for targeted genome editing[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2012，14（1）：49-55.
[50] MA N，LIAO B，ZHANG H，et al. TALEN-mediated gene correction in integration-free β-thalassemia iPSCs[J]. J Biol Chem，2013，288（48）：34671-34679.
[51] LIU H，CHEN Y，NIU Y，et al. TALEN-mediated gene mutagenesis in rhesus and cynomolgus monkeys[J].Cell Stem Cell，2014，14（3）：323C328.
[52] LI T，LIU B，SPALDING M H，et al. High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice[J].Nat Biotechnol，2012，30（5）：390-392.
[53] 纹埃高彩霞.植物基因组编辑及衍生技术最新研究进展[J].遗传，2015，37（10）：953-973.
[54] 李 东，左其生，张亚妮，等.基因组编辑技术的研究进展[J].畜牧与兽医，2015（7）：124-129.
[55] ISHINO Y，SHINAGAWA H，MAKINO K，et al. Nucleotide sequence of the iap gene， responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli， and identification of the gene product[J].J Bacteriol，1987，169（12）：5429-5433.
[56] MOJICA F J M，D？EZ-VILLASE？mOR C，SORIA E，et al. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea，Bacteria and mitochondria[J].Mol Microbiol，2000，36（1）：244-246.
[57] JANSEN R，EMBDEN J D，GAASTRA W，et al.Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J].Mol Microbiol，2002，43（6）：1565-1575.
[58] 黄 蕾，王雅洁，陈 实.非编码RNA编辑技术研究进展[J].中国细胞生物学学报，2015，37（7）：1036-1045.
[59] w 欣，胡 军.CRISPR/Cas基因编辑系统及其在植物中的研究进展[J].中国农学通报，2015，31（12）：187-192.
[60] DELTCHEVA E，CHYLINSKI K，SHARMA C M，et al.CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III[J].Nature，2011，471（7340）：602-607.
[61] MARRAFFINI L A，SONTHEIMER E J.CRISPR interference： RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea[J].Nat Rev Genet，2010，11（3）：181-190.
[62] NISHIMASU H，RAN F A，HSU P，et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA[J].Cell，2014，156（5）：935-949.
[63] 倪培凌，刘 畅，陈凌懿.DNA剪刀――TALEN和CRISPR/Cas[J].中国细胞生物学学报，2014，36（1）：5-11.
[64] 刘思也，夏海滨.一种新的由CRISPR/Cas系统介导的基因组靶向修饰技术[J].中国生物工程杂志，2013，33（10）：117-123.
[65] FRIEDLAND A E，TZUR Y B，ESVELT K M，et al.Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system[J]. Nat Methods，2013，10（8）：741-743.
[66] WIEDENHEFT B，STERNBERG S H，DOUDNA J A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea[J].Nature，2012，482（7385）：331-338.
[67] JINEK M，CHYLINSKI K，FONFARA I，et al.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J].Science，2012，337（6096）：816-821.
[68] SHALEM O，SANJANA N E，HARTENIAN E，et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells[J].Science，2014，343（6166）：84-87.
[69] WANG H，YANG H，SHIVALILA C S，et al.One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J].Cell，2013，153（4）：910-918.
[70] SHAN Q，WANG Y，LI J，et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system[J].Nat Biotechnol，2013，31（8）：686-688.
一个国际研究小组在了解酶如何“编辑”基因方面取得了重要进展：观察到了一类被称为CRISPR的酶绑定并改变DNA（脱氧核糖核酸）结构的过程。这项发表于5月美国《国家科学院学报》上的研究成果有望为纠正人类的遗传疾病铺平道路。
CRISPR意即“成簇的规律间隔的短回文重复”，在20世纪80年代才首次为人们所认知。到目前为止，已发现40%已测序细菌和90%已测序古细菌的基因组存在这种重复序列，而且细菌已开发出一套可以探测和切断外来DNA的免疫策略。其机理大致如此：CRISPR序列与很多病毒、噬菌体或者质粒的DNA序列同源，受到攻击的细菌会以相匹配的DNA为目标进行自然防御。它们所采用的手段，就是利用一种名为Cas9的内切酶，裂解外来DNA。
基因工程师们意识到，如果将细菌的CRISPR-Cas9系统插入其它生物体细胞，它们也能够对目标DNA进行切割。就在去年，这一革命性的基因编辑技术收获了一系列成果：多个研究团队已经成功对人体、小鼠、斑马鱼、大米、小麦等细胞中的基因进行删除、添加、激活或抑制等操作，从而证明该技术的广泛适用性。
不过，人类基因组有30亿个碱基对，要准确锁定某个目标DNA，工作量大致相当于从一套23卷的《百科全书》中找出一个拼错的单词。因此，研究人员为Cas9这把“基因剪刀”找了一个与目标基因匹配的RNA（核糖核酸）作为“导航仪”。在这个靶向过程中，Cas9拉开DNA链，并插入RNA，使之形成了一个被称为R环的特定序列结构。
在最新研究中，英国布里斯托尔大学和立陶宛生物技术研究所的科学家使用经过特别改装的显微镜对R环模型进行了检测。显微镜下的单个DNA分子被磁场拉伸着，通过改变DNA受到的扭力，他们能够直接观测由单个CRISPR酶介导R环形成的过程。这使得这个过程中以前不为人知的一些步骤毕现无疑，也让研究人员能够探讨DNA碱基对序列对R环形成的影响。
布里斯托尔大学生物化学系教授马克・斯兹克泽尔昆说：“我们进行的单分子实验加深了有关DNA序列对R环形成的影响的认识。这将有助于未来合理地重新设计CRISPR酶，以提高其精确度，将脱靶效应（即在不需要的地方引起基因变异）降至最低。这对我们最终利用这些工具来纠正患者的遗传疾病至关重要。”
在西方神话中，诺亚建造了一艘方舟，带着各种牲畜、鸟类等，躲避了大洪水，安然渡过“世界末日”。
一粒种子、一个细胞、一管血液、一口唾沫、一段脱氧核糖核酸、一条数据……这些不起眼的“现在”可能是构建未来生物科技和产业的砖石。在现实世界中，美国、欧盟和日本都拥有世界级基因库，由此掌握生命经济时代的战略性资源。
如今，在深圳开始运营的国家基因库带着“留存现在、缔造未来”的使命诞生。中国将拥有这样一艘“诺亚方舟”，承载人类及其他生物的遗传样本和密码。
国家基因库里有什么？
在基因时代，这样的未来可期：到医院看病，只需自己的基因作为“身份证”和病历；想“返老还童”，保存完好的干细胞就能轻松搞定；憨态可掬的大熊猫不再稀奇，就在你家庭院里懒洋洋地打盹；远古的恐龙、猛犸象不只活在特效里，它们在博物馆奇妙之夜真实复活……
通向这样的未来，需要一些坚实的“砖石”――生物样本和数据。这正是我国唯一一座国家基因库的定位：有效保护、开发、利用遗传资源，提高我国生命科学研究和生物产业发展水平，维护国家生物信息安全，助力全球生命科学发展。
2011年，国家发改委等4部委批复同意深圳依托华大基因研究院组建国家基因库。
国家基因库位于深圳市大鹏新区观音山脚下，一期占地面积4.75万平方米。这里几乎与外界隔离，恍若世外桃源。走进建在层层梯田之上、室内绿意盎然的建筑，从一层上三层，依次会看到庞大的高通量基因测序房、超级计算房以及冷冻资源房。
“三库两平台”，是国家基因库主任梅永红描述基因库内容时使用频次最高的一个概念。
据梅永红介绍，与美国、欧盟、日本其他三大世界级的基因库不同，中国国家基因库不仅仅是数据库，而是国际上现有的各类生物样本库、数据库、生物多样性库、疾病库等的综合升级版。除了“干库”（即基因、蛋白、分子、影像等多组生物信息数据库）、“湿库”（多样性生物样本和物种遗传资源库）之外，国家基因库还引入了“活库”，即生物活体库，包括动物资源、植物资源、微生物资源和海洋资源等。
不妨把它想象成这样一个载体：它是人类博物馆、植物园、动物园、海洋馆、微生物馆的集合，这里存储的将不仅是一个个标本原型和实物，还有一粒种子、一个细胞、一管血液、一口唾沫、一段脱氧核糖核酸、一条数据……
“两平台”指的是数字化平台和合成与编辑平台。“三库两平台”的建设，最终为的是解决生命数据的“存、读、懂、写、用”5个作用。
“通俗地说，就是我们要把全球的生物资源都收集起来，用测序仪读取万物的遗传数据，用超级计算机算出结果，用合成与编辑平台写出生命代码，最后用来为人类服务。”梅永红说。
目前，国家基因库已存储多种生物资源样本1000万份；初步建立基因信息数据和生物样本采集、存储、管理相关标准和技术规范，深圳市地方标准5项，申请国际、国内标准10项，申请国内外专利46项，出版基因资源专著8本。目前已开展国际/国家重点科研项目20余项，合作项目共140余篇，其中在《自然》《科学》《细胞》等知名科研杂志上30余篇。
国家基因库像“生命银行”
“高大上”的国家基因库看似很遥远，但其实跟每个人都息息相关。华大基因董事长汪建说，每个人一生中所有关键阶段的标本都应该永久保存起来：从出生时的干细胞，到20岁时的免疫细胞，到30岁时的生殖细胞……而国家基因库，就是储存这些样本和数据的地方，像我们的“生命银行”。
“这类似于在人生的不同阶段给自己拍照片，如果我们不拍，那就永远拍不到了。”汪建说，“老照片只能拿来做留念，但是我们在不同阶段存进‘生命银行’的年轻样本，却是在我们越老的时候越有用，甚至可能在关键时刻救命。”
存储这些数据到底有什么作用？从数年前开始，汪建就开始有意识地存储自己的健康数据。这样做的结果是，他对自己身体变化状况了如指掌，并且根据这些数据设计自己的饮食、运动和生活节奏，“对抗”衰老。他说，随着国家基因库存储容量的增加，未来将会有更多人可以储存和掌握自己的健康数据，过上更健康的生活。
除了对个人，国家基因库对保护生物多样性也有重要意义。目前，保护人类生存环境，保护物种的多样性已刻不容缓。汪建说，对濒危的生命物种，我们需要尽快地将这些资源存储起来，向子孙后代做一个交代。
生命的“国库”，开放的平台
人类越来越认识到基因资源以及保护地球生物多样性的重要。国际上，挪威斯瓦尔巴全球种子库、美国自然历史博物馆、英国生物样本库等应运而生，尤其是美国、欧洲、日本先后建立了大型基因数据库，这三大库里的生物信息数据几乎涵盖所有已知的脱氧核糖核酸、核糖核酸和蛋白质数据。
国家基因库执行主任徐讯说：“中国亟须这样一个平台，从国家层面对具有中国特色的生物样本和基因数据进行有效保存、管理和合理利用。”
“基因库是生命科学的‘国库’，比银行的金库还要宝贵。”梅永红说，农耕时代的核心资源是耕地，工业时代是能源，而生命科学时代则是基因。基因资源目前已成为重要的国家战略资源，如精准医学很大程度上依赖对基因解读的结果。“未来精准医学方面的发展和竞争，一定程度上是基因资源的获得与解析”。
国家基因库将保持开放姿态。目前，国家基因库已与联合国粮食及农业组织、国际农业研究磋商小组、国际生物及环境样本库协会、挪威斯瓦尔巴全球种子库、美国自然历史博物馆等100多个组织和科研机构建立战略合作关系，在人类健康、生物多样性、生物进化机制等方面开展合作研究。
“在保护种子多样性方面，我们需要在全球范围内互相依靠，携手共进。”挪威斯瓦尔巴全球种子库相关负责人表示，期待未来和中国国家基因库进一步合作，从而在环境变化和人口剧增等国际性挑战下保护种子多样性，“我们所有人都有职责来保护这些养活我们的种子”。
杨柏，资深记者、编辑，综合开发研究院（中国・深圳）客座研究员。香港经济导报执行总编辑，曾任中国青年报贵州记者站站长、深圳报业集团深圳商报《经济望》周刊主编、理论部主任。著有《走进大山》、《迎接挑战》、《横向布局中国》等十余部专著。
贵州大学退休，在深圳养老的钱荫瑜教授，几天前，不辞辛劳，凌晨发来了一个“560亿大数据引爆腾飞”为标题的电子邮件，使我差不多持续了一周，一有空就浏览这方面的信息。毕竟这是近年来贵州发展继两高（高速铁路和高速公路）开建、两股管道天然气在贵阳交汇之后的又一重大事件。这消息造就出的美丽意象，真的像一首贵州山歌唱的那样――“你像天边飞来的彩云”。
对我供职的媒体而言，酝酿制作《大数据中国序幕》专题已是去年的6月初。当时，在北京宽沟一个国际会议的间隙，从中关村请来的北京缔元信公司CEO秦雯给我们进行关于什么是大数据的扫盲。而有趣的是这个时候宏观经济的背景是：中国经济铁定进入了一位数的弱增长，广义货币供应量却在200%于GDP总量时出现了“钱荒”；中美经济进入第五轮战略对话；斯诺登私奔香港，后获准进入了莫斯科，至今还 “生活在别处”，在异国他乡演绎“生命不能承受之轻”的尴尬。
2012年，以全球第一个上市的大数据公司美国Splunk，在纳斯达克上市，以及Bloomreach公司和大数据服务公司Hortonworks9相继获得2500万与7000万美元的风险投资为标志，大数据沿袭新经济的路数从概念进入了激烈的产业创新界面。它对世界的影响也随之超越书本上“千万个‘路人甲’的价值逻辑”，引发了落后国家与地区的追赶，改变了人们一度对互联网经济已走到了历史最高点逐步进入平缓或衰减区间的看法，重燃起了产业投资与竞争的热情。尽管人们对10多年前新经济泡沫破裂记忆犹新。
秦雯说，从搜集和分析数据，即目前开发者们正在做的工作而言，大数据并不是新的技术。但互联网包括移动互联网的发展，使过去的数年内制造的数据超过了人类历史上的数据总量。更重要的是，随着全息摄影技术、传感技术、以及“拓展现实”的谷歌眼镜（同样在2012年问世）这样的新技术的诞生，收集数据的能力变得空前强大。爆炸性增长的数据为更全面和精确地分析数据提供了可能性。从找到工具采集搜集天量数据，到大数据计算应用与价值开发，宣告了一个新时代的来临，也提出了大数据产业基础设施建构的问题。大数据中心的建设成了国家与地区层面的一个竞争焦点。
我明白这个道理是被吸收参与华大基因发展战略规划课题调研时获得的。参加20世纪人类最伟大的三大科技突破之一，绘制人类第一个基因图谱的中国生物科学家们，在完成项目1%的任务后，成功转型成为创新企业家，创办了华大基因研究院与科技公司。在迅速取得全球第一基因测序能力基础上，又配套建设了领先的云计算能力，从而抢位成功，成为排名全球第一的提供动植物基因测序科学服务的大团队公司，建成了国家基因库，在人类知识创新前沿走上了一条产学研大贯穿的发展道路。有人做出比方说，一个人的基因数据，用传统纸张打印，垒起来有地王大厦那么高。仅此一域的一例，即说明信息数据的天量。由此也可见支撑大数据应用，建设基础设施平台，为海量的数据存储、处理和分析提供稳定而高效的资源保障是多么重要的事情。
贵州媒体传播出的关于大数据中心落户贵州的论述，已经从各种角度说明白了大数据落户贵州的合理性，也描述出了贵州大数据产业园区，或一个集成创新的“大数据谷”产业聚集和产业链延伸的内容与前景。如果要“锦上添花”，我只想重提一个20世纪80年代郭凡生的“反梯度理论”观点：落后的西部要发展，决不能简单、消极、被动接受沿海发达地区的产业转移，而是要有勇气建构同时代世界一流水平的发展能力。否则，就永远甩不掉落后的帽子。尽管这样做，挑战甚至大于机遇。
山歌“你像天边飞来的彩云”，后一句是“你是一把登山的云梯”。曾几何时，彩云在天，美在梦里，而“登山云梯”说明产生这首歌的年代，生产力与科技水平远非是我们这个拥有登月工具的时代。也或许我们还要提一嘴斯诺登，他揭示了拥有占据数据比较优势的国家和个人，有滥用数据侵犯别国他人的可能。数据安全成了国家安全的一个核心部件。或许，这是大数据嵌入贵州隐含着深层战略涵义的另一个要点。（责任编辑/吴文仙）
虽然个体化用药是未来的趋势，但它还处于普及阶段，行业对其认知以及法规、标准都不完善。
个体化用药，顾名思义就是根据每个人的基因不同，使用不同的药物和不同的剂量。由于个体间基因的差异，使得个体间的药物反应存在着不同程度的差异。因此在临床中，时常会出现某一药物使用在某些患者身上疗效很好，而使用在另外一些患者身上却并无疗效的现象。
事实上，现代医学已经意识到，基因是我们人体健康的决定性因素，每个人的基因结构不一样，受环境因素影响表达水平也不一样。因此，可以通过基因诊断对每个人实施个体化的诊断和治疗。例如比较乐观的应用场景是，根据基因诊断预测个体未来可能患上的疾病。但由于人类的基因和疾病的关系现在还在逐渐深入研究阶段，这样的场景事实上有些超前，很难做到准确判断并实现民用化。而现阶段比较成熟的应用场景是――个体化用药的基因诊断，这也是美国药品食品监督管理局（FDA）、各种专业协会、医院医师都普遍接受的概念。
个体化用药的基因诊断，是指通过基因检测，能够知道某一药物到底该不该用，到底该用多少剂量，从而减少毒副作用、提高疗效。例如在心血管疾病方面，华法林的效果很好，但它的不良反应却一直是棘手的问题。患者接受大于他们耐受的剂量时就有危机生命的出血风险，剂量过低则有血栓风险，基因检测则可以帮助确定华法林个性化用药的适宜剂量。FDA曾经几次要求厂家更改药品使用说明书，要求注明哪种类型的基因应该用多大剂量。可以说，个体化用药是未来的趋势。
然而，个体化用药从科研成果走向医疗市场，还需要企业开发出面向医疗市场的产品。但作为国内第一家拿到个体化用药诊断试剂批文的企业，我们观察到的现象是，个体化用药还处于普及阶段，行业对它的认知以及法规、标准都不完善。作为企业，我们所能做的事情，是不断教育市场、教育医生。我们从国内外收集大量的资料，编辑成册，原始论文都发给医生，让大家认识到个体化用药这一概念，我们也在呼吁相关部门加强监管。
事实上，欧美十分热衷于个体化用药的概念。FDA已经将“个体化用药”的研究成果转化为临床实践，一些个体化用药检测项目被列为入院病人的常规项目，费用由医疗保险进行承担。我认为，在中国还是需要国家政策的支持，让行业健康有序发展。
In fact， the concept is very popular in the west. FDA had put personalized medicine into practice， and some of the tests have been listed as regular in hospitals and covered by medical insurance. And I think we need more governmental support in China to encourage the healthy development of this industry.
我对个体化用药基因诊断在2014年的发展有以下两点判断：
第一，基因诊断企业从“打混战”转为“正规军”。今年年初，食药监总局、国家卫计委联合发出通知，叫停基因测序临床应用。《通知》指出，基因测序诊断产品（包括基因测序仪及相关诊断试剂和软件）应作为医疗器械管理，并应按照《医疗器械监督管理条例》及相关产品注册的规定申请产品注册；未获准注册的医疗器械产品，不得生产、进口、销售和使用。
这事实上反应出，此前基因诊断企业处于“混战”局面，大家争相上马基因测序临床应用产品，而并没有经过国家的监管和审批。2014年，很多企业将会回过头来纳入国家监管，事实上这将有利于行业的发展。未来拿到批文的企业会越来越多，2014年是基因诊断市场规范之年。
第二，随着基因诊断、个体化用药的前景越来越被认可，将会有越来越多的企业加入到行业中，行业竞争将会加剧，产品种类会越来越多。我担心的是企业之间会打价格战，忽视产品的质量和创新，这对行业发展十分不利。
>> 案例教学法在《生物信息学》本科教学中的应用 师范院校生物信息学教学的现状分析 医学院校生物信息学教学的探究 面向医科院校生物信息学专业的Java教学实践 面向生物信息学本科专业的《遗传学》教学要点及模式探索 离散数学在生物信息学专业本科教学的开展研究 生物信息学中的机器学习 癌症研究的生物信息学资源 生物信息学中的序列比对算法 师范院校生物信息学本科教学改革与实践 生物信息学数据库及运用分析 生物信息学专业MySQL数据库课程教学方法探讨 生物信息学在生物学研究领域的应用 医学院校生物技术专业生物信息学教学探索 生物背景学生的《生物信息学》课程教学思考与探索 师范院校研究生生物信息学教学改革思考 农业院校生物信息学教学模式探索 探讨医学院校生物信息学创新实践能力培养 中医大数据下生物信息学的发展及教育模式浅析 大数据背景下的生物信息学教学探索 常见问题解答 当前所在位置：l）。此外，还有细菌、真菌、植物等分支数据库。该数据库也有搜索引擎，其内容详细的数据记录了DNA、转录产物、蛋白质和基因突变等信息，使用方便，记录系统、完整，是了解基因结构和功能比较理想的数据库[2]。
2.3 miRBase数据库 microRNA是近年来发现的非编码内源性小RNA分子，其功能主要是调节靶基因的转录后水平的表达，是近年来研究的热点领域。miRBase数据库更新快，包含miRNA序列数据、功能注释、靶基因预测等多各方面，是存储miRNA信息最主要的公共数据库之一（http：///）。目前，新版本（Ver.21）收录了223个物种28645个前体miRNA和35 828个成熟miRNA产物，所有数据均可以通过web界面检索，而且通过与TargetScan链接，可以查阅miRNA的潜在的靶基因。
2.4 生物分子信号通路数据库 信号通路一词在高中生物就接触到，到本科阶段的《细胞生物学》课程中得以深入学习。据调查，对于本科生而言，他们对信号通路想理解和认识有限，掌握的信号通路都是不完整的。学生在学习时，可借助信号通路数据库检索的方式，搜索某基因所参与的信号通路，并且可以直观的看到该基因在整个信号通路中的地位和作用。信号通路数据库目前比较常用的是WikiPathways数据库（http：//）。该数据库集成了主要的基因、蛋白质，允许整个研究者更广泛参与[3]。该数据最大的特点是将基因之间的关系以图形方式显示，使学生直观了解所感兴趣的基因是如何参与到信号通路或生化代谢过程的。
3 常用生物信息学软件及在线分析工具
3.1 DNA序列分析软件 在生物科学本科教学过程中，很多课程如《生物化学》《分子生物学》《遗传学》等，都涉及到DNA序列结构、基因突变等知识点，而且学生掌握到的更多都是一种朦朦胧胧，是懂非懂的知识点。因此，在《生物信息学》课堂上，当讲到采用生物信息学软件进行DNA序列分析时，学生产生了浓厚的兴趣。DNA序列分析的软件有很多，如：BioEdit，DNASIS，DNAStar，DNAClub，DNAMan等，相比较可知，就序列分析而言，我们认为DNAStar软件最常用，且操作简单，可视化功能强大，是地方本科院校学生的最佳选择。
DNASTAR是基因组学、结构生物学和分子生物学领域中的一款综合性序列分析工具软件，包含可视化和序列编辑（SeqBuilder），序列组装（SeqMan）、序列比对（MegAlign）、引物设计（PrimerSelect）、蛋白质结构分析（Protean）、基因查找（GeneQuest）和序列编辑（EditSeq）7个模块，可用作DNA和蛋白质序列分析、序列重叠群拼接和基因工程管理等方面，目前，该软件已被90多个国家的制药，生物技术，学术和临床研究人员使用。
3.2 RNA结构分析软件 RNA包含tRNA，mRNA，rRNA和sRNA等多种类型，在蛋白质生物合成过程中起着非常重要的作用。他们的二级结构或高级结构会影响蛋白质合成的效率。因此，对于本科生而言，直观的了解RNA的二级结构，对于掌握理论知识具有重要意义。RNA结构分析的软件有如Mfold、RNAdraw和RNAstructure等多个软件[4-5]。通过比较这些软件获得难易度、优缺点和使用复杂程度，我们发现Mfold已完成多次修订，且实现了网上在线免费试用（http：//unafold.rna.albany.edu/？q=mfold），输出结果灵活多样，结果直观，是本科生用于RNA结构分析的最佳选择。
3.3 序列比对软件（在线工具） 序列比对也称序列比较，通过该操作，可以将两个或多个基因（或蛋白质）序列按照一定的规律排列，使学生直观的观察到序列的变异，从而确定序列之间的相似性或同源性。根据序列多少，可分为双序列比对和多序列比对。序列比对的软件或在线工具也有很多，其中多序列比对软件有Clustal（ClustalX和ClustalW）、GCG、BioEdit、DNAMAN和DNAStar件包中的MegAlign等。在这里，适合本科生教学的软件我们推荐MegAlign和DNAMAN。而两序列比最常用的则是BLAST在线工具（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast），它是NCBI开发的可免费非注册使用的在线工具，可与NCBI的蛋白质数据库和基因数据库链接，也可用于蛋白质和基因序列的同源检索，是本科教学中必须要用到的在线工具。
3.4 系统发育树构建软件 在生物进化过程中，细胞内的生物大分子（蛋白质、核酸）的一级结构的变化会出现变异（进化），而生物大分子进化速率相对恒定，我们可以根据生物大分子的序列信息构建系统发育树，推断生物进化历史。系统发育树构建的软件有MEGA，PHYLIP，DNAMAN等。在分子进化相关的科学研究中，最常用的是MEGA（即Molecular Evolutionary Genetics Analysis），该软件更新快（目前的最新版本为MEGA7.0 http：///），运行速度快，操作简单，结果直观。因此，在本科教学中，我们推荐MEGA软件作为系统发育树构建的软件。
3.5 Expasy工具 ExPASy，即Expert Protein Analysis System，由瑞士生物信息学研究所维护的蛋白组学相关的在线实用分析平台，整合了很多蛋白质数据资源和分析工具（http：///），涉及蛋白分类、蛋白质翻译、结构预测、相似检索、序列比对等。该在线工具可免费试用，是本科教学过程中值得推荐的分析工具。但是，该工具包数据量大，鉴于本科教学学时的限制，在教学过程中不宜细讲，可以引入，让感兴趣的同学自学。
4 结语
随着分子生物学和生物信息学的迅猛发展，生物信息学数据库不断完善，生物分析软件越来越多，且各具特色。考虑到地方本科院校实际情况，我们介绍了以上的生物信息学数据库和分析软件（在线工具），并简单总结了它们适合于地方性高校本科教学的优点，给出了合理选择的参考建议，以期为地方本科院校《生物信息学》教学提供参考。
参考文献
[1]Bethesda（MD）.The NCBI Handbook[Internet]. 2nd edition[M].National Center for Biotechnology Information（US）. 2013.
[2]Yates A，Akanni W，Amode M R，et al. Ensembl 2016[J].Nucleic Acids Res.2016，44（D1）：D710-D716.
[3]Kelder T，van Iersel M P，Hanspers K，et al.WikiPathways：building research communities on biological pathways[J].Nucleic Acids Res. 2012，40（Database issue）：D1301-D1307.
[4]徐思敏.RNA生物信息相关软件概述[J].科技信息：科学教研，2008（14）：398-399.
在美国，转基因作物最早问世于1996年，随后迅速被广泛接受。2013年，从种植面积来看，美国至少95%的甜菜，93%的大豆，90%的棉花和玉米均为转基因品种，这一数据来自美国农业部国家农业统计局。
2015年11月19日，经过全面的科学论证，美国食品与药品监督管理局（FDA）批准了世界上第一种食用转基因动物――AquAdvantage 转基因大西洋鲑鱼（Atlantic salmon），俗称三文鱼。这种转基因三文鱼生长速度约为普通三文鱼的两倍，可节省75%的饲料成本。这是一个标志性的事件，因为这是第一个被批准上市的转基因动物食品，今后可能会有更多的转基因虾、转基因猪、转基因鸡鸭、转基因牛羊……人类的食谱将又一次发生变革。
是福还是祸
也许转基因这个现代工业文明的奇葩会带给人类更多的利益和福祉。三文鱼是鱼油含量丰富的鱼种之一，更廉价的转基因三文鱼将促使人们的食用量增加，这种“白肉”一般认为有益健康;同时猪牛羊肉的消费会减少，而“红肉”新近被世界卫生组织贴上一类“致癌物”的标签。食用转基因三文鱼，据说还可以减少野生三文鱼的捕捞，保护很多濒临灭绝的鱼种。
不过社会上也流传着另一种声音。在美国，30多家机构上书美国政府，反对批准转基因三文鱼，理由之一是这种鱼将带给世界巨大的生态灾难，不仅不能保护野生的三文鱼，还会加速其灭绝。对中国，已经有人说转基因三文鱼卵的最大市场是这里，中国将成为世界上最大的转基因三文鱼养殖基地。一些“有识之士”指出，这是美国佬的又一个阴谋，通过转基因食品，加速人体的衰老，让人不育，造成免疫系统功能紊乱，最终灭绝中华民族。
人吃了这种三文鱼是否安全，是中外消费者最为关心的问题。中国消费者更多关注的是吃这种鱼会不会中毒？能不能致癌？影不影响生宝宝？这一点FDA给出的评判最为肯定：安全，放心吃就是。美国人对此却不那么放心，批评FDA目光短浅，只看短期食用、只局限于三文鱼一种食品的影响，而这还不足以做出安全的结论，敦促国会赋予FDA更大的权利、提供更多的资源，进行全面的评价。就目前FDA的科学评价内容来看，包含不同动物长时间食用、短时间超大剂量、繁殖传代、模拟细胞癌变等多种试验，结果当然是没有不良反应和损害才敢评判为安全。另一方面，也包括转基因三文鱼与野生三文鱼体内各种成分的分析和比较，如蛋白质和脂肪酸等营养成分、各种毒素和过敏原的检测，对比的结果是没有差别。
福兮祸之所倚
这样评判出的安全被一些人认为仅仅是狭义的安全，更广义的安全应该关注由此带来人类食物来源改变的影响。当人们大幅度减少牛排的食用量，改吃三文鱼排，是否一定有益健康？目前尚没有足够的证据。不过的确超出了目前科学家力所能及的范围。
区别于消费高度关注的人体安全问题，业内的科学家们更关注的是生态安全。自然界的长期演变，形成了各种生物之间的稳定秩序，大鱼吃小鱼、小鱼吃虾米……如果这种秩序被破坏，人类会不会大鱼、小鱼、虾米都吃不到，只有转基因三文鱼可吃？还有更离奇的想象，转基因三文鱼与野生的什么鱼杂交出什么超级怪鱼，不仅不给人吃，还吃人。科学家们对这种猜测不屑一顾，认为这只是科幻，毫无根据。但是对生态安全的担心，使FDA一拖再拖，迟迟5年之后才最终确认了评价结论。
祸兮福之所伏
细心揣摩FDA的评价用语，没有证据证明这种鱼不安全，所以转基因三文鱼可以安全食用。为什么不说有充分证据说明人类食用转基因三文鱼安全，没有任何风险？前一种说法是科学用语，因为任何科学判断，不可能给出百分百确定的结论，消费者零风险的期待永远与现实有差距。而现实是，尽管世界上每天都有致死的交通事故发生，但是我们仍旧上街、不断穿越马路。与美国人相比，中国式过马路曾被媒体广为诟病，但是面对转基因食品，中国的消费者应该更为幸运，2015年10月1日实施的新版《食品安全法》有了转基因食品标识的明文规定。美国没有这样的法律规定，若想区别市场上的三文鱼是否为转基因产品，消费者只能根据商家标识的“野生”来判别，而野生的三文鱼比养殖的非转基因三文鱼要贵。相对比，一旦有一天转基因三文鱼进入中国，我们可以摸着口袋根据明确的标识做出选择。（据《健康报》《财新网》） 编辑/吴雨
美国科学家克莱格・文特尔8月20日宣布成功制造出人造细胞“辛西娅”之后，引起全世界的震动。文特尔这个极具争议性的人物也再次来到媒体的聚光灯前。有评论说，如果能够引领一个领域的科学家是大牛或者巨牛的话，他绝对是牛魔王级别的怪兽。
人造生命“辛西娅”问世后，有些科学家认为这种方法并没有前途，因为设计新的有机生物要花费很多年时间。加利福尼亚州拉霍亚市斯克里普斯研究所的生物学家杰拉尔德・乔伊斯说：“这项研究的功能非常强大，能够发行并控制一个基因组的每个基因。字符’，因为这意味着你可以植入不同的基因。”
《人工生命》杂志编辑、美国里德大学哲学家马克・比道说，“辛西娅”的出现在生物学和生物技术的发展是上具有决定性意义。
美国宾西法尼亚大学生物伦理学教授阿瑟・卡普兰对英国《自然――医学》月刊记者说，文特尔及其团队的成就“违反了一个生命本质的基本理念”。
在这一领域工作的一些科学家说，他们担心的是，一旦这些新奇的有机体进入现实世界，人类还缺乏手段来制衡它们可能带来的风险。“按照定义说，它们非常前沿，我们可能无法简单地将它们同某些已知的危险细菌和病菌相提并论。”
在印度海得拉巴成立了细胞和分子生物中心的著名遗传学家P・M・巴尔加瓦也直截了当地表示，虽然文特尔是一名杰出的科学家，但这次他却夸大了自己成就的重要性。巴尔加瓦说：“文特尔的团队从一个细胞中提取出DNA，然后用大量其他物质取而代之。这充其量只能算是多位点基因工程。”
南丹麦大学的斯蒂恩・拉斯马森的看法和巴尔加瓦不谋而合。他在一份公开的声明中说：“在人们了解生命之时，在一个现代细胞中制造一个台成基因组目前具有里程碑式的意义。然而，文特尔团队的这种彻底的基因工程我看来并不能称为合成细胞。”
美国环境组织“地球之友”批评说，合成基因组是一项危险的新技术，“在有效的规章出台之前，文特尔先生应该立即停止进一步的研究。”部分非政府组织认为，即使是用在环境方面(比如人们希望细菌能够用来中和温室气体)，合成细胞的作用也被夸大了。
(据《扬子晚报》)
