时间：2023-05-30 09:48:36
摘要：新型免疫抑制剂麦考酚酸酯(mycophenolatemofetil,MMF)是麦考酚酸(mycophenolicacid,MPA)的2-乙基酯类衍生物，在体内脱酯化后形成具有免疫抑制活性的代谢产物MPA，后者通过抑制鸟嘌呤的合成，选择性阻断T和B淋巴细胞的增殖，对移植排异和自身免疫性疾病均有显著疗效。临床上已应用于器官移植和自身免疫性疾病，且副作用少，显示了良好的应用前景。本文对其作用机制、药物动力学及临床应用等方面进行了综述。
中图分类号：R979.5文献标识码：A
文章编号：1007-7669(2000)01-0051-03
尽管器官移植已经取得了较大的进步，移植排异反应仍然是一个主要问题；临床上许多自身免疫性疾病的治疗，也主要有赖于免疫抑制剂的使用。但目前使用的免疫抑制剂仍没有达到高效和安全的要求。新型免疫抑制剂麦考酚酸酯(mycophenolatemofetil,MMF)以其独特的免疫抑制作用和安全性而倍受关注，目前已应用于心、肾移植排异［1］和免疫性疾病如狼疮性肾炎［2］、血管炎［3］等的治疗，本文就该药的研究现状介绍如下。
作用机制MMF口服后在体内迅速水解为具有免疫抑制作用的活性代谢产物麦考酚酸(mycophenolicacid,MPA),后者可逆性地抑制鸟嘌呤核苷酸经典合成途径(denuvopathway)中的一种限速酶即次黄嘌呤核苷酸经典合成途径（denuvopathway）中的一种限速酶即次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)，对鸟嘌呤核苷酸合成的另外一条途径即补救途径(salvagepathway)无影响［4］。IMPDH受抑制后导致鸟嘌呤核苷酸的减少，进而阻断DNA和RNA的合成。淋巴细胞主要依赖经典途径合成嘌呤核苷酸，而中性粒细胞却同时可通过经典和补救途径合成，故MPA对淋巴细胞更具有特异性，即MPA可选择性作用于增殖性T和B淋巴细胞。MPA对激活的淋巴细胞产生的IMPDH同形物的抑制作用几乎是其他细胞产生的同形物的5倍［5］。在兔和狗模型中，全血IMPDH活性与MPA浓度呈负相关，给予单剂量MPA后，IMPDH活性受抑制的时间比MPA持续在血中可测出的时间要长得多［6，7］。在鼠实验中，给单剂量MPA可抑制三磷酸鸟苷(GTP)合成达24h［8］。
但MPA除作用于IMPDH外，可能还存在其他机制。如MPA对培养的人动脉平滑肌细胞增生有抑制作用，有利于改善与慢性排异有关的移植物动脉硬化。另外，实验研究显示，在有丝分裂激活的细胞，MPA使白介素-3(IL-3)的产生受到抑制。在超抗原激活的外周血单核细胞中，MPA可抑制多种细胞因子［9］，而后者在免疫反应中起重要作用。MPA还可抑制白细胞内糖蛋白的合成，如果粘附分子发生改变，后者可能在这些细胞的免疫应答中起重要作用。
尽管MPA有多种作用，目前认为MPA作用于IMPDH，导致鸟嘌呤核苷酸减少是最主要的。
药物动力学MMF是MPA的2-乙基酯类衍生物，口服后迅速被肠道吸收，经肠壁、肝脏及其他组织脱酯化，迅速转化为有活性作用的MPA。正常人口服MMF后，其血浓度不能被测出；静脉注射MMF后，测定其T(1)/(2)少于2min［10］。从原药裂解出来后，MPA先快速降解后较慢被清除。静注或口服8～12h后，MPA浓度有轻度回升，此现象与肠肝循环有关［10］。Sugioka等［11］的实验研究显示：MMF在人工消化液中是稳定的。在小白鼠的组织液和血浆中，MMF迅速水解成MPA。在不同器官组织中MMF转变成MPA的速率依次是肝脏＞肾脏＞血浆＞小肠上皮细胞。静注MMF16.7mg.kg-1后，其最终(转变为MPA后)T(1)/(2)为(4.7±0.3)h,AUC为(48±6)μg.h.mL-1，而十二指肠灌注MMF16.7mg.kg-1后，T(1)/(2)为(3.9±1.0)h,AUC为(38±8)μg.h.mL-1。MPA在肝脏转变成无活性的麦考酚酸葡糖苷酸(MPAG)，再由肾脏排泄［4］。口服或静注MMF1h后，MPAG的浓度已高于MPA［10］。对肾移植后急性排异病人使用MMF(3g.d-1)后的药物动力学进行研究，发现MPAG有蓄积，而MPA则无。随着肾功能的恢复，MPA浓度也逐渐下降。MPAG并能部分被血液透析清除。
【关键词】 姜黄素; NF-?资B; 胰岛素; 抵抗 )
Abstract: 【Objective】 To investigate inhibitory effect of curcumin and its mechanism on insulin resistance. 【Methods】 Curcumin co-operated high fat diets were tested for the effect of curcumin on obesity induced insulin resistance in rodent model. Transcription factor I and circulating cytokines were also detected after curcumin treatment. 【Results】 (1) Curcumin inhibited TNF?琢-stimulated NF-?资B activation in Fao cells. (2)The fasting plasma glucose level was not obviously decreased after the treatment of curcumin, but the level of fasting insulin decreased by about 30%. Furthermore, the level of glucose tolerance curve dropped significantly. (3) The level of TNF?琢[(34.5±3.4)pg/mL vs (31.3±1.1) pg/mL] in circulation was not obviously changed, but the level of IL-1?茁 [(33.9±3.2) pg/mL vs (15.6±1.1) pg/mL] and IL-6 [(72.1±9.8) pg/mL vs (47.2±5.3) pg/mL] was suppressed dramatically. (4) IRS-1 tyrosine phosphorylation levels stimulated by insulin obviously increased, but the phosphorylation level of insulin receptor did not change. Being parallel with tyrosine phosphorylation levels of IRS-1, the phosphorylation levels of P85 and AKT increased accordingly. Significantly improved insulin sensitivity was observed in groups with curcumin. 【Conclusion】 Curcumin inhibits NF-?资B dependent inflammatory pathway and reverses obesity-induced insulin resistance.
Key words: curcumin, NF-?资B, insulin, resistance
姜黄(Curcuma longa L.)是常用中药,临床上用于活血、行气、通经、止痛。姜黄素(curcumin)是一种黄色色素,从姜黄中提取得到的主要有效成分。近年来,大量研究发现它具有免疫调节、抗氧化、抗炎及抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等生理和药理作用[1-4]。在实验室资料中姜黄素是良好的免疫调节剂,并有结果提示姜黄素可以抑制宿主抗移植物反应,而且提高受体动物的存活率[5,6]。在实验研究中,炎症又与胰岛素抵抗密切相关[7,8]。炎症被证实是代谢综合征的共同土壤,联想到许多抗炎药物如阿司匹林可以逆转胰岛素抵抗,本文尝试利用姜黄素治疗肥胖合并极度胰岛素抵抗的炎症模型,并对姜黄素逆转胰岛素抵抗的机制作初步探讨。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 姜黄素 购于印度亚洲公司(纯度99%)。
1.1.2 动物 Obob雄性小鼠16只,8周龄、空腹体质量(33~38 g),购自南京国家模式动物中心,用含脂肪6.4%的标准饲料饲养,实验前1周纪录小鼠的饲料摄取、空腹血糖、空腹胰岛素水平及体量等。
1.1.3 FAO细胞 购自 The American Type Culture Collection(ATCC)。
1.1.4 试剂 IR、IRS-1、AKT、P85 多克隆抗体由Steven Shoelson实验室(Joslin Diabetes Center, Harvard)提供。FBS TNF?琢、胰岛素购自Sigma, St. Louis USA, I-?资B?琢 抗体,IKK?酌抗体,购于 Santa Cruz, CA, GST-I-?资B(1-54) 底物由Boston Biologicals, Wellesley, MA合成。
1.2 方 法
1.2.1 体外细胞实验 FAO细胞使用培养液 DMEM(购自 Gibco公司),细胞置于37 ℃,5%CO2的培养箱中培养。在10 cm 培养皿用10 mL DMEM+10%FBS含有高浓度葡萄糖(25 mmol/L)的培养液中培养至80%重叠率,经5 mL 0.1%BSA孵育16 h后接受不同浓度(0~40 umol/L)的姜黄素预处理,然后接受鼠TNF?琢 10 nmol/L刺激处理,于20 min后用预冷的PBS终止,并收集细胞,用于制作蛋白匀浆,备用, I-?资B?琢的水平用免疫印迹的灰度表示。NF-?资B的活性用20 min内试验细胞和对照细胞I-?资B?琢灰度差值表示。
1.2.2 动物实验 利用食物参入法制成含2%姜黄素的颗粒饲料(Lab Diets, 5008),低温保存。动物饲养环境为中央通气,层流环境,恒温(23 ℃)、恒湿,12 h明暗光照循环,24 h随意饮食环境. 动物购入后第5天开始接受口服葡萄糖耐量试验,并留取空腹血浆作血浆胰岛素水平,和其它循环因子的检查。在验证空腹血糖和胰岛素水平后动物被随机分成两组,并接受姜黄素治疗,对照组用颗粒饲料5008作为对照。每天记录动物的摄食量,每3周测量空腹血糖并留取空腹血浆1次, 第6周空腹状态下进行第2次口服葡萄糖耐量试验,并留取空腹血浆。试验后继续接受姜黄素治疗,第7周于空腹状态下接受5 U/kg胰岛素富强注射,注射后5 min整,用断颈法迅速处死动物, 留取肝脏经液氮过渡后在-80 ℃低温冰箱保存,作胰岛素信号分析之用。血浆多种循环炎症细胞因子的检查用Linco Research 的Luminex 试剂盒并采用Luminex 200 监测结果。
1.2.3 免疫印迹 细胞或组织裂解液(30 mmol/L Hepes, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, pH 7.4。蛋白酶抑制剂由1 mmol/L PMSF, 3 ?滋mol/L aprotinin, 5 ?滋mol/L pepstatin, 10 ?滋mol/L leupeptin, 25 mmol/L Benzamidin, 2 mmol/L Na-vanadate, 5 mmol/L ?茁-glycerolphosphate, 10 mmol/L NaF, 1 mmol/L Ammonium Molybdate, 30 mmol/L tetrasodium pyrophosphate, 5 mmol/L EGTA)裂解细胞, SDS-聚丙烯酰胺凝胶(6%),蛋白加热变性后每孔加30 ?滋g, 电转移仪将蛋白转到PVDF膜。5%脱脂奶粉TBS-T缓冲液洗膜,加一抗, 4 ℃孵育过夜,TBS-T缓冲液洗膜,加过氧化物酶标记的IgG 抗体(购自Amersham USA),室温1 h,TBS-T缓冲液洗膜,加ECL 1 min,暗室显影2~3 min后冲洗胶片。凝胶成像分析系统摄像。
1.2.4 统计学分析 采用t检验。
2 结 果
2. 1 姜黄素抑制NF-?资B的量效和时效关系
Fao细胞在10 cm2 培养皿用10 mL在10% FBS+DMEM含有高浓度葡萄糖的培养液中培养至80%重叠,经5 mL 0.1% BSA孵育16 h后接受姜黄素预处理:剂量关系用梯度浓度如图1所示,时效曲线用30 μmol/L。预处理后接受鼠TNF 10 nmol/L刺激处理,于20 min后用预冷的FBS终止,并收集细胞,用于制作蛋白匀浆。用免疫印迹检测匀浆内I-?资?注?琢的水平。如图1A所示:20 μmol/L姜黄素20 min预处理能够抑制TNF刺激的I?资?注?琢的降解。从姜黄素的时效关系图1B可见,姜黄素有效剂量30 μmol/L对NF-κB的抑制作用在30~60 min时最强。
2. 2 姜黄素以逆转肥胖小鼠的胰岛素抵抗
经过6周姜黄素的治疗,小鼠的空腹血糖水平没有明显下降,但空腹胰岛素的水平下降约30%(图2),口服葡萄糖耐量曲线的水平也明显下降(图2A),曲线下面积的比较有明显差异(P< 0.01)。由空腹血糖和胰岛素水平计算的HOMA指数[用FBS(mmol/L) ×胰岛素(mmol/L)/22.5 计算]也呈明显降低(P< 0.05,图2C),提示小鼠对胰岛素抵抗的水平得到明显改善。
2. 3 姜黄素对循环细胞因子的影响
Obob 小鼠治疗6周后的空腹血浆用Linco Research Luminex 试剂盒同时检测细胞因子IL-1?茁,IL-6 和 TNF?琢的水平。如图3所示:尽管循环胰岛素的水平明显下降,但TNF?琢 [(34.5±3.4)pg/mL vs (31.3±1.1) pg/mL]水平没有明显改变,与之对应,循环中IL-1?茁[(33.9±3.2)pg/mL vs (15.6±1.1) pg/mL] 和IL-6 [(72.1±9.8)pg/mL vs (47.2±5.3) pg/mL]水平明显被抑制(P< 0.05)。
2. 4 姜黄素为胰岛素信号的增效剂
经胰岛素刺激的肝脏组织在液氮下作粉碎并以1% Triton X100 RAPA(含有全部蛋白酶抑制剂,和蛋白磷酸酶抑制剂)缓冲液在冰点匀浆。经全速4 ℃离心30 min取上清液(1 mg 蛋白质)作IRS-1和 IR联合免疫沉淀。经上样缓冲液释放的沉淀目标蛋白质经6%的SDS-PAGE 分离,转移到PVDF膜上。用4G10、P85、 AKT抗体作免疫印迹。如图4所示:胰岛素刺激的IRS-1酪氨酸的磷酸化水平明显升高, 而胰岛素受体的磷酸化水平没有明显改变。与IRS-1酪氨酸的磷酸化水平平行,P85的磷酸化水平也明显升高,AKT的磷酸化的水平也明显升高。
3 讨 论
胰岛素抵抗(IR)及胰岛?茁细胞功能减退是2型糖尿病发病机理的重要环节[9],目前被认为是一个慢性非特异性炎症过程,胰岛素对胰岛素敏感组织作用的缺陷(肝脏、脂肪组织、骨骼肌)会导致慢性、低水平炎症状态的恶化,任何与慢性炎症有关的过程都会削弱胰岛素的作用,作为恶性循环,胰岛素抵抗又会使炎症恶化[10]。在抗炎药物对胰岛素抵抗有逆转作用的报道之后, 我们探索新的抗炎药物对胰岛素抵抗的治疗作用, 姜黄素是继阿司匹林后又一个具有类似协同作用的活性成分[11]。在姜黄素治疗6周后,尽管治疗组和对照组的体重没有明显改善,但小鼠空腹血糖的水平明显下降,而且胰岛素的水平也明显降低,提示胰岛素的敏感性明显升高,葡萄糖耐量曲线在治疗后也明显改善,说明小鼠整体对葡萄糖的处理能力明显升高,即obob 小鼠的胰岛素抵抗的水平得到明显改善。这些都进一步说明姜黄素治疗改善肥胖诱导的胰岛素抵抗。
研究证实NF-?资B是启动和控制炎症的主要核转录因子,在非激活条件下,NF-?资B和胞浆内一种被称为NF-?资B的抑制物(I-?资B)的蛋白质结合处于无功能状态。我们利用胰岛素敏感组织来源的细胞系FAO,验证了姜黄素能够抑制TNF?琢刺激的I?资B?琢的降解,继而抑制NF-?资B的活性, 我们推测在高度肥胖NF-?资B高度激活的肥胖小鼠obob 体内,姜黄素可能具有更加明显的改善代谢的作用。
在NF-?资B激活的模型上我们证实炎症激发的高水平循环细胞因子是系统性胰岛素抵抗的原因。采用细胞因子的中和抗体可以逆转胰岛素抵抗,在NF-?资B抑制型模型,胰岛素敏感性升高,而且循环中细胞因子的水平较低。在肥胖发生过程中,NF-?资B 活性与动物的体重呈正相关。Obob 小鼠的肝脏,脂肪以及淋巴组织中NF-?资B的活性水平升高,循环细胞因子的水平增高,这些都说明炎症介质与胰岛素抵抗的关系。经姜黄素治疗的肥胖动物循环中细胞因子IL-1, IL-6水平均明显下降,由于IL-1和IL-6是NF-?资B活性调控的重要因子,因此,我们认为姜黄素在胞浆内有多个作用靶点,通过对上述细胞因子的抑制作用,影响NF-?资B 的活性,继而达到逆转胰岛素抵抗和改善胰岛素敏感性的作用。在肝脏组织的胰岛素信号检测中,胰岛素刺激的IRS-1 酪氨酸磷酸化的水平明显升高,AKT的活性也明显增强。这些结果都进一步说明肥胖小鼠胰岛素的敏感性在治疗后得到了改善,姜黄素能提高obob小鼠胰岛素的敏感性,姜黄素作为一个免疫调节剂用于抑制免疫排斥的同时,对系统性炎症也有抑制作用,可能是通过抑制NF-?资B来改善胰岛素敏感性的。
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【摘要】 目的 研究免疫抑制剂对小鼠腹腔巨噬细胞(Macrophage ，M)的损伤作用机制。方法 以小鼠腹腔巨噬细胞为对象，采用小鼠尾静脉注射地塞米松0.15mg/只，环磷酰胺2.0mg/只，小鼠腹腔巨噬细胞培养，检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能及腹腔灌洗液中NO2-/NO3-浓度并用形态学方法观察比较免疫抑制剂对小鼠腹腔巨噬细胞的损伤特点。结果 地塞米松和环磷酰胺均能抑制巨噬细胞功能，与对照组比，细胞吞噬功能均显著下降（P<0.01），DEX组腹腔灌洗液中NO2-/NO3-浓度显著升高，Cy组不升高。VitC为自由基链反应阻断剂，阻断过氧化链式反应可减轻损伤，可使DEX组细胞吞噬功能获得部分恢复。结论 推测环磷酰胺对腹腔巨噬细胞损伤是以直接损伤染色体而DEX以氧化损伤为主。
【关键词】 地塞米松 环磷酰胺 巨噬细胞
The effect of dexamethasone and cyclphosphamide on peritoneal macrophage of mice
【Abstract】 Objective We investigated demage mechanism of peritoneal macrophage(M) induced by injection of dexamethasone and cyclophosphamide in mice.Methods The immune function by determining the phagocytic function and structure of the macrophagocytes of the abdominal cavities of mice in vitro. The phagocytosis of peritoneal macrophages was evaluated by chicken erythrocytes method; Observed the concentratuon of NO-2/NO-3 in the peritoneal lavage fluid.Results Dexamethasone and cyclophosphamide induced the apoptosis of peritoneal macrophage and concomitant decrease of phagocytosis(vs control group，P<0.01)， the concentratuon of NO-2/NO-3 in the peritoneal lavage fluid significantly increased after dexamethasone injection;VitC(inhibitor of iNOS and inhibitor of reactive oxygen species) prevented the apoptosis of peritoneal macrophage and reduced the concentration of NO-2/NO-3 in the peritoneal lavage fluid after the effect of dexamethasone.Conclusion These evidences support that NO and active oxygen species may be involved in the apoptosis process of peritoneal peritoneal macrophage induced by dexamethasone in mice.
【Key words】 dexamethasone cyclophosphamide macrophage
地塞米松和环磷酰胺在临床肿瘤的治疗中是常用的药物，在杀伤肿瘤细胞的同时又会引起免疫系统损伤，而影响治疗效果。巨噬细胞(macrophage，M)是机体免疫体系中重要的免疫效应细胞，具有非特异性直接清除各种异物，杀伤病原体和肿瘤细胞的功能，并具有抗原提呈作用。本实验选用小鼠腹腔巨噬细胞进一步探讨在整体条件下地塞米松和环磷酰胺对免疫功能影响的机制。
1 材料和方法
1.1 实验分组及动物处理 昆明种雄性小鼠，日龄55～58天。60只分为5组：正常对照组；DEX组：腹腔注射地塞米松（Dexa）150μg/只，每日1次，连续注射3次；Cy组：腹腔注射环磷酰胺（Cy）1.5mg/只，每日1次，连续注射3次；VitC+DEX组：与DEX组同时注射；VitC+Cy组：与Cy同时注射；给药第2天上述小鼠腹腔注射2%无菌淀粉1ml。
1.2 腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定 于第4天取各组6只，小鼠腹腔注射5%鸡红细胞1ml，30min后，引颈处死小鼠，腹腔注射D-HanKs 1ml，轻轻按揉腹壁1min，吸出腹腔液滴片。置37°C湿盒孵育30min后，用PBS冲洗，去除未贴壁M?和游离鸡红细胞，1：1丙酮-甲醇固定7～8min，自然晾干。有姬母萨-瑞士染液进行染色，油镜下计数M和M吞噬CRBC数。用下列公式计算吞噬百分率和吞噬指数：吞噬百分率（%）=吞噬鸡红细胞的M/100个M（吞和未吞的）×100% 吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/100个M。
1.3 细胞涂片Giemsa染色 各组小鼠第4天引颈处死，腹腔注射D-Hanks液5ml，吸出腹腔液4℃ 500r/min，去上清与PBS制成细胞悬液，调细胞为1×106个/ml，100μl涂片，凉干后甲醇固定，晾干Giemsa染色，普通光镜下观察细胞形态变化。
1.4 腹腔巨噬细胞NO检测 NO2-/NO3-的测定按NO试剂盒（酶法）说明书操作，最后测定500nm吸光度值。NO2-/NO-3（μmol/L）=（样品管吸光度?空白管吸光度）/（标准吸光度?空白管吸光度）。
2 实验结果
所有数据均采用单因素方差分析法进行统计学分析，并采用Student-NK检验法进一步检验。腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定结果见表1。DEX和Cy注射组小鼠M的吞噬百分率和吞噬指数均明显降低，与生理盐水对照组比较具有高度统计学意义（P<0.01）;VitC+DEX组M的吞噬百分率和吞噬指数比DEX组有显著提高（P<0.01）；VitC+Cy组M的吞噬百分率和吞噬指数较Cy组差异无显著性（P>0.05）。形态学变化可见：DEX组和Cy组较对照组出现明显形态变化细胞变小，染色质凝聚，细胞质浓缩，可见凋亡小体。
腹腔巨噬细胞NO检测结果见图1：小鼠腹腔灌洗液中NO浓度测定显示：与对照组比，DEX组NO2-/NO-3浓度显著上升（P<0.01），而VitC能部分逆转NO浓度（P<0.01），但对Cy组无明显改善（P>0.05）。
表1 腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定结果
注：①与对照组比较，P<0.01;②与对照组比较，P<0.01;③与DEX组比较，P<0.01；④与Cy组比较，P>0.05
图1 腹腔巨噬细胞NO检测结果注：①与对照组比较，P＜0.01;②与DEX组比较，P＜0.01，③与DEX组比较，P＜0.01;④与Cy组比较，P＞0.05
3 讨论
巨噬细胞是机体免疫体系中重要的免疫效应细胞，本实验选用腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的方法来观察免疫抑制剂对巨噬细胞的影响。结果可见，免疫抑制剂可显著抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力；VitC能明显改善地塞米松对巨噬细胞的影响。文献报道抗氧化剂VitC通过清除氧自由基和降低脂质过氧化提高机体免疫功能［1～3］。机体氧化-抗氧化的平衡对维持正常的免疫功能具有重要的作用，它影响到免疫细胞膜磷脂、细胞内蛋白、核酸的完整性和免疫信号的传导及基因表达。免疫细胞由于其细胞膜磷脂含有较高的不饱和脂肪酸，因此对氧应激非常敏感［4］。已有实验证明VitC有很强的抗氧化作用，注射VitC可明显减弱DEX对小鼠巨噬细胞吞噬功能的抑制作用，分析DEX对巨噬细胞的免疫抑制作用可能与其氧化损伤有关。文献报道［5］抗氧化剂维生素C通过抑制DEX诱导的淋巴细胞凋亡增强淋巴细胞的增殖能力，VitC具有抗氧化作用，提示通过抗氧化促进细胞增殖，抑制DEX诱导的淋巴细胞的凋亡。巨噬细胞具有非特异性直接清除各种异物，杀伤病原体和肿瘤细胞的功能［6］。静止的巨噬细胞胞体小，细胞活性低，吞噬功能弱。当巨噬细胞被激活后，细胞胞体变大、表面突起增多，细胞内有完整的细胞器，且溶酶体、线粒体增多，细胞吞噬功能增强。本实验结果显示，VitC改善巨噬细胞吞噬功能，形态学观察发现，VitC处理的M细胞表面突起增多，细胞伸展率提高并能对抗DEX引起的细胞变小，伸展性差，细胞聚集成团现象。有研究报道DEX可降低M的吞噬作用［7，8］，Grasso等［9］研究发现DEX与M体外共同孵育可抑制M细胞吞噬功能，但培养液中一旦去除DEX，M吞噬功能很快便得到恢复。DEX具有诱导免疫细胞凋亡的作用［10］。M凋亡的机制十分复杂，近年的研究发现许多因素与M凋亡有关。巨噬细胞受到刺激或进行吞噬作用后，发生呼吸暴发，可产生大量的活性氧及NO等活性物质［11］。是巨噬细胞在肿瘤免疫中发挥独特作用的基础，一定浓度的NO又是M凋亡信息传递通路中的关键环节，通过调控巨噬细胞自身凋亡保持巨噬细胞数量恒定［12］。有研究报道凋亡时活性氧和NO或减少或增多［13］，机制尚不清。本实验结果提示DEX诱导巨噬细胞凋亡与NO生成增多有关。NO是一种自由基气体，其不成对电子在氮原子上，为氮自由基参与细胞内和线粒体内的链式反应，VitC为自由基链反应阻断剂，减轻损伤，能部分抑制巨噬细胞凋亡，细胞吞噬机能也获得部分恢复，以DEX组较显著。本实验提示VitC以抗氧化与抑制DEX诱导的M凋亡有关。推测环磷酰胺诱导腹腔巨噬细胞凋亡是以直接损伤染色体而DEX以氧化损伤为主，VitC以抗氧化作用而减轻DEX诱导的M凋亡。
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【关键词】系统性红斑狼疮肾炎；霉酚酸脂；泼尼松；临床疗效
【中图分类号】R3 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2015）06-0024-01
系统性红斑狼疮肾炎（英文缩写SLE）为临床上比较常见的自身免疫性病症，可累及身体多个器官和系统[1]。本文从我院2011年1月至2015年6月间收治的系统性红斑狼疮性肾炎患者中抽取40例作为临床研究对象，主要探讨了激素免疫抑制剂联合治疗系统性红斑狼疮性肾炎的临床效果。现将具体研究过程及主要研究结果报道如下。
1.资料与方法
1.1 一般资料
本次研究从我院2011年1月至2015年6月间收治的系统性红斑狼疮性肾炎患者中抽取40例进行临床观察和研究，所有患者均通过病理学检查、症状和体征观察确诊。其中，肾病综合征患者14例，急性肾炎患者5例，慢性肾炎21例。采取自愿原则，将患者平分为实验组与对照组，各36例。实验组中，男3例，女17例，年龄18～60岁，平均年龄为（38.52±7.26）岁，病程2个月～9年，平均病程为（3.23±1.80）年；对照组中男5例，女15例，年龄22～62岁，平均年龄为（37.25±7.45）岁，病程4个月～10年，平均病程为（3.52±1.19）年。将两组的疾病类型、病程、性别构成以及年龄等一般资料作比较，无统计学意义，有可比性（P>0.05）。
1.2 治疗方法
对照组采用常规疗法：给予泼尼松口服治疗。初始剂量为1.0～1.5mg/kg，连续服用2～3个月后，逐月减少5mg剂量，直至减为25～30mg时，继续服用2个月。之后继续逐月减少5mg剂量，减至15mg/d时以该剂量维持治疗[2]。环磷酰胺用药剂量为10～12mg/kg，与0.9%的氯化钠溶液均匀混合后，静脉滴注给药，连续滴注1h以上，持续治疗2d，每隔1个月冲击1次，前后总共治疗6次，之后改为每隔3个月冲击1次，持续治疗1年。
实验组采取激素免疫抑制剂联合疗法，泼尼松的用法同对照组。根据患者的SLE病理学分型，霉酚酸脂的初始剂量控制在0.5～1.0mg/kg，具体用法与环磷酰胺相同。病情较严重者连续治疗3d后，将剂量改为0.3mg/kg维持治疗，其余患者连续治疗3d后，改用0.15mg/kg的剂量维持治疗，所有患者均持续治疗1年。
1.3 疗效判断标准
①临床缓解率：统计全部患者的具体治疗效果，具体判断标准如下。完全缓解：24h的尿蛋白定量
1.4 统计学方法
针对上述基础性数据，采用SPSS 16.0软件进行统计分析，运用百分比表示计数资料，统计方法以 χ2检验为主，对比以P
2 结果
将两组的具体治疗效果及不良反应情况作比较。
具体情况如下：实验组中，完全缓解12例，基本缓解7例，未缓解1例，临床缓解率为95.0%；对照组中，完全缓解8例，基本缓解6例，未缓解6例，临床缓解率为70.0%；实验组的临床缓解率要显著高于对照组，χ2=4.33，其对比差异具有统计学意义（P
3 讨论
SLE主要累及的器官和系统包括中枢神经系统、皮肤、关节、肾脏以及浆膜，其中，以肾脏受累及的概率最高[3]。若未及时得到治疗，随着疾病进展可能会致使肾功能下降、肾功能不全，严重者甚至会发生肾衰竭而死亡。现阶段，临床治疗SLE的基本原则是在激素治疗的基础上加用免疫制剂，环磷酰胺属于细胞毒性药物，将其用于临床治疗虽然也能取得较好的疗效，但大剂量环磷酰胺可引起胃肠道反应、骨髓抑制以及畸形、肝功能受损等不良反应。本研究结果中，实验组的主要不良反应发生率为5.0%，要显著低于对照组，证实了联用泼尼松与环磷酰胺治疗的方式可引起较为严重的不良反应，而以霉酚酸脂替代，则可降低环磷酰胺的副作用，减少不良反应。同时，研究结果呈现，实验组的临床缓解率达到了95.0%，要显著高于对照组，表明联合应用泼尼松和霉酚酸脂，有助于减轻患者的临床症状和体征，其疗效更佳。霉酚酸脂为新型异唑类免疫制剂，内服后可转化成活性代谢物，有效抑制RNA与DNA合成，对核苷酸合成产生干扰，同时还对T、B淋巴细胞有选择性抑制作用，进而减低抗体，充分发挥免疫抑制效果。综合上述研究和分析，对于系统性红斑狼疮性肾炎，在常规激素治疗的同时，加用霉酚酸脂这类新型免疫抑制剂，可以降低药物毒性作用，有效缓解患者的临床症状，提高临床疗效，可将其作为红斑狼疮性肾炎治疗的成功经验来予以推广。
参考文献：
[1]崔莉，郭红琴.激素免疫抑制剂联合治疗系统性红斑狼疮性肾炎的护理[J].当代医学，2011，30（12）： 125-126.
[关键词]肾病综合症;红皮病;环孢素;免疫抑制剂;免疫功能; 肾功能;肝功能
[中图分类号]R979.5[文献标识码]A [文章编号] 1005-0515（2010）-11-272-01
1 一般资料
我在临床中仅使用环孢素A治疗过此3例患者。1例慢性肾小球肾炎患者有20+年病史，期间有7年左右基本未发病，我接收前已发病5年，尿蛋白+++或++++、CR150umol/l,BUN9.0mmol/l,TG3.14umol/l,TC6.7umol/l,总蛋白58g/l,球蛋白18.6g/l,尿酸456umol/l,在此前曾间断使用过环磷酰胺注射液，不规范地服用过强的松片。患者表现出的症状：乏力，面浮肿，双下肢浮肿，睡眠差，活动后喘粗。第二例肾小球肾炎患者半年前由云南省第一人民医院确诊，此患者尿蛋白++++以上，尿素氮9.1mmol/l,肌酐121umol/l,胆固醇4.8mmol/l,甘油三酯2.81mmol/l,高密度脂蛋白2.3mmol/l,低密度脂蛋白3.1mmol/l血压150/80mmHg,面部轻度满月脸，双下肢轻度水肿，少气懒言。此2例患者使用常规剂量组环孢素A5mg(kg.d),强的松片为甲基强的松龙片，开始剂量为60mg/d,逐渐减量，环孢素A4周后减半，维持服3月，使甲基强的松减量1月减到30mg，30mg坚持服3月后减到20mg,20mg服1年以上，第2年服10mg/d,复查尿蛋白，连续3次以上阴性酌情改为隔日顿服20mg，第3年服10mg/d,5年后停药。第三例红皮病患者症状表现：反复出现双侧下肢皮肤红斑，瘙痒，脱屑，部分起黑，质硬，上肢及胸背部散在红色疹块，有片状皮屑。上下肢皮肤底色呈红色或暗红色，下肢轻度浮肿。住院检查肝肾功，血脂有轻度异常，GGT78U/L.TG3.1umol/L.HDL-CH2.14mmol/L.LDL-C4.32mmol/L.RBC6.5X10.HGB184X10g/L.尿常规;阴性。免疫学检查;IgG.IgM偏低
2 方法
前两例肾炎患者均使用常规剂量环孢素A5mgkg.d,强的松剂量初始由60mg递减，环孢素A4周后减半，1月后再减半，维持至3月停药；使得甲基强的松量1月之内减至30mg，30mg坚持服3月后减至20mg口服1年以上后缓慢减量；红皮病患者加用环孢素A小剂量3mg/kg.d,口服20天后减半，持续1月半停用环孢素。强的松先用强化注射甲基强的松龙针80mg/d,3天减半，40mg持续静滴10天改为口服甲基强的松片20mg/d,持续20天后减为10mg/d,口服3月停药。
3结果
两例肾炎患者服药期间检测肝肾功.尿蛋白，甘油三脂.胆固醇等，尿蛋白1月后降为++或+-，ALT60`80U/L.AST50`90U/L总蛋白61g/L白蛋白37g/L，血肌酐100~110umol/L.尿素氮7.1~8.6mmol/L. LDL-CH3.1umol/L 甘油三酯2.8umol/L胆固醇5.05umol/L;环孢素药停用3月复查ALT.AST均降到40u/L以下，肌酐80~90umol/L.尿素氮7.0mmol/L随访三年尿蛋白未增加，肝肾功能无异常。红皮病患者ALT88u/L.AST108u/LGGT71u/L,也有一定程度升高，血肌酐.尿素氮变化不明显，甘油三脂2.41umol/L.HDL-CH3.85mmol/L.LDL-CH2.32mmol/L,血常规检测HGB156*10g/L.RBC4.7*10/L;此患者1月后上下肢皮肤红斑明显消失，瘙痒也基本消失，两月后皮肤由暗红转淡基本接近正常肤色。3月后复查肝肾功基本恢复正常，随访1年皮肤无复发。
4 讨论
肾小球内大量免疫复合物的沉积会损伤肾小球毛细血管内皮 , 引起凝血 , 进一步导致肾小球硬化,因此有效地清除免疫复合物 , 保持肾脏的正常血液循环,是减缓肾小球损伤、治愈肾病的根本。肾脏微循环的改善、血流量的增加促进了组织的修复与再生。激活损残存肾单位进行工作。
环孢素A作为新一代细胞免疫抑制剂是目前用来治疗肾炎的一种新药。它的作用机理与机体白细胞介素--2的释放减少有关，白细胞介素--2是辅T细胞释放的一种淋巴因子，又是B细胞的刺激因子。使用环孢素A后，辅T细胞被抑制，白细胞介素--2的合成与释放减少，肾小球肾炎症便会减轻[3]。
环孢菌素 A是一种强效的免疫抑制剂，可逆地特异作用于淋巴细胞，环孢菌素 A为11个氨基酸组成的环状多肽。本品是一种强效的免疫抑制剂，可逆地特异作用于淋巴细胞。动物实验表明环孢素可延长同种异体器官(皮肤、心脏、肾脏、胰脏、骨髓、小 肠和肺)移植的存活时间，抑制细胞介导免疫反应（包括同种异体免疫反应、迟发性皮肤过敏反应、实验性变应性脑脊髓炎、弗氏佐剂性关节炎、移植物抗宿主反应和依赖T-细胞的抗体生成)。本品尚能抑制淋巴因子(包括ⅠL-2)的合成和 释放、阻断淋巴细胞生长周期中的G0期和G1早期阶段。本品不抑制红细胞生成，亦不影响吞噬细胞功能。使用本品患者与使用其他免疫抑制剂患者相比感染发生率较低。[1]
其免疫抑制作用机制：环孢素A与T淋巴细胞膜上的高亲和力受体蛋白结合，并被弥散通过细胞膜，在分子水平上干扰转录因子IL-2助催化剂的结合，抑制IL-2RNA的转录，进而抑制IL-2的生成及受体的表达，使毒T细胞的聚集作用减弱，从而减少其他细胞因子的产生与聚集使炎症反应减轻或消失，其非免疫介导的机制为减少肾血流量，降低肾小球的滤过率。[3]
环孢素A在体内可与神经经钙蛋白的结合，阻断其生物功能，使细胞内钙依赖性信息通道传导受阻，抑制T细胞活化过程，从而发挥其免疫抑制作用。
环孢素主要在肝脏进行代谢，它可干扰肝微粒体的膜蛋白功能，影响包括线粒体在内的生物膜的稳定性及渗透性，破坏膜的完整性，扰乱mRNA的生成，影响DNA及核糖体的合成，通过改变膜的渗透性及Na+-K+-ATP酶的活性，导致蛋白及胆汁合成、运输、分泌的功能障碍[2]。长期服用可致低蛋白、高胆红素血症，ALT升高，出现类似急性肝炎或梗阻性黄疸的症状，严重者可有进行性黄疸，肝性脑病和亚急性肝坏死现象，并在短期内死亡。肝毒性常与环孢素的肾毒性相互协同加重肾脏损害[2]。有关其肾毒性的报道越来越多，且报道指毒性反应的强度与环孢素的剂量呈正相关[2]。目前环孢素可引起肾血管收缩，血管阻力增加（尤以入球小动脉明显）、肾血流灌注量减少，从而导致肾功能障碍。
环孢素A是目前应用广泛的免疫抑制剂。环孢素A有11个氨基酸组成的环形多肽，是从土壤霉菌中分离出来的一种强效选择高免疫抑制剂广泛用于器官移植及免疫性疾病的治疗，近年来已被广泛用于治疗难治性肾病综合症和其他肾脏疾病，对激素依赖型或经常反复发作的微小病变型肾病有效，激素治疗出现较重的副作用或并发症时，可以选用环孢素A。肾炎的肾功能恶化较快者亦可用此药，对部分传统免疫抑制剂治疗抵抗、依赖、甚至无效的肾病综合症患者，环孢素仍然有效。
所以 临床上使用环孢素时一定要及时检测肝肾功、血脂、血常规。对于严重肝肾功能受损一定要慎用，及时调整用量或停药。
参考文献
[1] 环孢素的药理作用[J].药理学，2001.
[2] 吴闯.环孢素肾毒性的药物防护[J].中国药房，2004,14（1）：372-373.
关键词 窄谱中波紫外线 免疫抑制剂 寻常型银屑病
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2011.23.118
银屑病是一种常见、多发的慢性炎症型皮肤病，治疗手段丰富多样，但缺乏一种安全且疗效确切的治疗方法［1］。甲氨蝶呤(MTX)是最早应用于银屑病的细胞毒免疫抑制剂药物，对各型银屑病均有效，但长期用药可造成肝脏纤维化，故应严格控制药物用量。窄谱中波紫外线(NB-UVB)穿透性较弱、不易灼伤皮肤，已成为银屑病治疗的一种重要方法，但长期的NB-UVB照射会增加发生非黑素性皮肤肿瘤的危险［2］。因此，为了探讨窄谱中波紫外线(NB-UVB)联合免疫抑制剂(MTX)治疗寻常型银屑病的疗效与安全性，现将近年来收治的银屑病患者临床资料分析总结如下。
资料与方法
一般资料：2006年1月～2009年9月收治寻常型稳定期银屑病患者120例，其中男79例，女41例；年龄18～69岁，平均384岁；病程15～26年，平均136年。根据随机观察表将患者分为3组，A组40例患者采用MTX单一治疗；B组40例患者采用NB-UVB+外用药治疗；C组40例患者采用NB-UVB+MTX治疗。3组性别、年龄、病程等一般资料经统计学分析，差异无显著性(P＞005)，具有可比性。
纳入标准：所有病例均符合纳入标准，符合寻常型稳定期银屑病诊断标准，年龄18～70岁。一般情况良好，无肝肾功能不良，无治疗药物禁忌证，无紫外线治疗禁忌证者。近2个月来未有任何银屑病治疗史者。知情同意，志愿受试。获得知情同意书过程应符合临床实验方案规定。
排除标准：年龄70周岁，妊娠或哺乳期妇女。具有严重的原发性心、肝、肺、肾、血液或影响其生存的严重疾病；肾功能异常；尿蛋白＞+，镜下尿红细胞＞+(尿Hb不作为判断指标)；ALT＞2N(N为正常值上限)；有临床意义的心电图异常；血白细胞总数＜30×109/L。由于智力或行为障碍不能给予充分知情同意者。怀疑或确有酒精、药物滥用病史。根据研究者的判断、具有降低入组可能性或使入组复杂化的其他病变，如工作环境经常变动等易造成失访的情况。过敏体质，如对两种或以上药物或食物过敏史者；或已知对本药成分过敏者。正在参加其他药物临床试验的患者。
中途退出标准：治疗过程中发现不符合入选标准者；治疗过程中不能密切配合，不按规定时间和疗程用药者；自行应用对试验治疗有影响药物的受试者；因严重不良事件，必须停止试验者；因其他原因(中途失访、患者要求退出研究、并发其他疾病、死亡等)而中断治疗者；因与药物有关的不良反应而退出研究的病人应随访1周，以确定最后的结果。
治疗方法：A组40例患者采用MTX片单一治疗；25mg/片，每周3次5mg，每12小时口服1次，每周同一时间服用，总疗程为12周。B组40例患者采用NB-UVB联合外用药治疗；采用德国沃曼UV-100L紫外线光疗仪，辐射强度852mW/cm，峰值波长313nm，最大照射剂量25J/cm，进行全身照射，根据患者的皮肤类型，初次照射剂量为NB-UVB最小红斑剂量的50%，即03～05J/cm。无或轻度红斑者以后每次增加01J/cm，出现明显红斑(肉眼可辩)者不增加照射量；中、重度红斑者减少前次剂量的20%，出现痛性红斑者停止光疗。要求每周照射2次，连续治疗15～20次，外用药采用01%维A酸乳膏，用法每晚临睡前外用患处1次，总疗程为12周。C组40例患者采用NB-UVB联合MTX治疗；MTX5mg，每周3次，每12小时口服1次，每周同一时间服用；NB-UVB方法同B组，总疗程为12周。治疗前后对所有患者进行PASI体检。
疗效评价：根据银屑病皮损面积及红斑、浸润、鳞屑的严重程度评分标准，对所有患者治疗前及治疗结束时进行银屑病皮损程度(PASI)评分［3］。PASI评分测定方法：首先计算体表面积，头部(Ah)、上肢(Au)、躯干(At)、下肢(Al)分别占总体表面积的10%、20%、30%和40%，各受累面积(Ah、Au、At、Al)根据其所占百分比为0～6级：0级无皮损，1级＜10%，2级10%～30%，3级30%～50%，4级50%～70%，5级70%～90%，6级90%～100%。根据皮损红斑(E)、浸润(I)、脱屑(D)，在上述各部位的严重程度不同的分别按5级记分：0级无皮损、1级轻度，2级中度，3级重度，4级极重度。计算公式为PASI=01Ah(Eh+Ih+Dh)+02Au(Eu+Iu+Du)+03At(Et+It+Dt)+04AI(EI+II+DI)PASI。评分以01个单位累积量从0～720不等，分数越高表示病情越重。基本治愈为PASI积分下降≥90%，显效为PASI积分下降60%～89%，有效为PASI积分下降25%～59%，无效为PASI积分下降＜25%。
机体安全性评估方法：用药前(第0天)和用药期满3个月及第12个月接受检查，包括血尿常规、肝脏彩超、肝肾功能检查、C3、C4(每次大约需要抽血5～8ml)。
结 果
3组中途退出原因分析：治疗过程中，3组均有部分病例按标准剔除。A组40例患者有2例患者在用药1个月内退出，均为治疗过程中不能密切配合，不按规定时间和疗程用药者。B组40例患者有3例患者在用药1个月内退出，1例为意外死亡中断治疗，1例为治疗过程中发现不符合入选标准，1例为治疗过程中不能密切配合，不按规定时间和疗程用药。C组40例患者有3例患者在用药1个月内退出，3例均为治疗过程中不能密切配合，不按规定时间和疗程用药者。
3组第1个月临床疗效比较分析：1个月给药后A组与B组的临床疗效经X2检验，差异无显著性(X2=321，P＞005)；B组与C组的临床疗效经X2检验，差异无显著性(X2=064，P＞005)；A组与C组的临床疗效经X2检验，差异有显著性(X2=655，P＜005)。3组PASI指数下降速度C组＞B组＞A组，有差异。结果见表1。
3组第3个月临床疗效比较分析：3个月给药后A组与B组的临床疗效经X2检验，差异有显著性(X2=606，P＜005)；B组与C组的临床疗效经X2检验，差异无显著性(X2=051，P＞005)；A组与C组的临床疗效经X2检验，差异有显著性(X2=1145，P＜001)。3组PASI指数下降速度C组＞B组＞A组，有差异。结果见表2。
3组第6个月临床疗效比较分析：6个月后A组与B组的临床疗效经X2检验，差异无显著性(X2=226，P＞005)；B组与C组的临床疗效经X2检验，差异无显著性(X2=052，P＞005)；A组与C组的临床疗效经X2检验，差异有显著性(X2=490，P＜005)。皮疹停药(即3个月)后复发(PASI指数上升)C慢于B与A，而B与A无差异。结果见表3。
3组第12个月临床疗效比较分析：12个月后A组与B组的临床疗效经X2检验，差异无显著性(X2=163，P＞005)；B组与C组的临床疗效经X2检验，差异无显著性(X2=136，P＞005)；A组与C组的临床疗效经X2检验，差异有显著性(X2=588，P＜005)；皮疹停药(即3个月)后复发(PASI指数上升)C慢于B与A，而B与A无差异。结果见表4。
3组用药安全性分析：A组38例患者在治疗4周左右有7例出现转氨酶升高，2例出现血常规异常，不良反应发生率为237%。B组37例患者有7例患者出现不同程度的皮肤瘙痒、干燥与轻度皮肤色素沉着，经减量照射和外涂润肤剂后症状缓解和消失，5例出现痛性红斑，未出现水疱，其余患者无不良症状，不良反应发生率为324%。C组37例患者有4例患者出现不同程度的皮肤瘙痒、干燥与轻度皮肤色素沉着，经减量照射和外涂润肤剂后症状缓解和消失，6例出现转氨酶升高，不良反应发生率为270%。所有不良反应均较轻微，未影响继续治疗。A组与B组的不良反应发生情况经X2检验，差异无显著性(X2=071，P＞005)；B组与C组的不良反应发生情况经X2检验，差异无显著性(X2=026，P＞005)；A组与C组的不良反应发生情况经X2检验，差异无显著性(X2=011，P＞005)。由此可见，3组的不良反应比较差异无显著性，但A组与C组发生转氨酶升高的患者与B组比较差异有显著性。结果见表5。
[关键词] 雷帕霉素；免疫抑制剂；抗肿瘤
[中图分类号] R979.5 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）20-21-03
传统的免疫抑制剂如硫唑嘌呤（AZA）、环孢素（CsA）等在临床上得到广泛应用，但其过敏反应、肝肾毒性、骨髓抑制等副反应屡见不鲜，尤其会带来一个严重的并发症，那就是增加肿瘤风险，Guba等[1]动物实验发现，环孢素A可诱发小鼠原发和转移性肿瘤发生，新型免疫抑制剂雷帕霉素免疫效应是环孢素10倍以上，而且还具备抗肿瘤效应，免疫抑制剂量（1.5mg/kg）的雷帕霉素（Rapamycin，RAPA）可以使小鼠肝脏原发与转移性肿瘤的体积缩小70%，使鼻咽部肿瘤的体积缩小87%，可显著延长带瘤小鼠的生存周期。它的双重功效不仅可以使其单独针对性应用于临床，还可以应用于需免疫抑制和抗肿瘤联合治疗的交叉领域。
1 雷帕霉素
RAPA是Vezina和She gal从加拿大Rapa Nui岛的土壤中分离的一种具有抗真菌作用的三烯大环内酯类化合物，分子式为C51H79NO13，化学结构与同类免疫抑制剂他克莫司（FK506）相似，为白色或微黄色固体结晶，熔点为183～185℃，亲脂性，易溶于甲醇、丙酮、氯仿、乙醇等有机溶剂，几乎不溶于乙醚和水。最初被研究作为低毒性的抗真菌药物，从1977年发现其具有免疫抑制作用，1989年把RAPA首次作为治疗器官移植排斥反应药物，近年又发现其具有抗肿瘤的作用，其独特的双效性使其具有广阔的临床开发应用前景。
2 雷帕霉素的作用机制
2.1 雷帕霉素的免疫抑制机制
（1）雷帕霉素通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，将免疫细胞（T细胞和B细胞）滞留于G1/S期，阻止免疫细胞进入S期及抑制DNA的合成，从而抑制免疫细胞的生长、增殖[2]。（2）雷帕霉素抑制IL-2以及其他的免疫分子的合成，从而抑制机体免疫功能的发挥[3-4]。（3）抑制IgG和供者特异性抗体（细胞毒抗体）产生。
2.2 雷帕霉素的抗肿瘤机制
（1）雷帕霉素通过雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路抑制细胞从G1到S期的细胞周期的转换，将细胞滞留于G1期，使细胞不能进行DNA复制，不能进行正常的细胞分裂[5]。（2）雷帕霉素可调控肿瘤细胞自噬、改变肿瘤生长微环境，进而诱导肿瘤细胞凋亡[6-8]。（3）雷帕霉素能够抑制新生血管生成和肿瘤侵袭，抑制血管内皮生长因子（VEGF）诱导的血管内皮增殖[9-10]。（4）雷帕霉素能够影响肿瘤细胞对能量的合成和利用[11]。
3 雷帕霉素与疾病治疗
3.1 免疫抑制效应在疾病治疗中的应用
雷帕霉素作为免疫抑制剂，以前一直以对同种抗原的无反应性、逆转进行性排斥反应、消除加速型排斥反应、与其他免疫抑制剂的协同作用等优点广泛用于风湿免疫性疾病和器官移植术后，随着研究的进一步深入和临床实验的逐步展开，其强效、全面而且肾毒性小等亮点将更好地服务于临床。
目前在临床上，风湿免疫性疾病的治疗主要以预防和控制病情为主，现阶段不管是非甾类抗炎药、传统免疫抑制剂、糖皮质激素、生物制剂等均不甚理想，存在较大的毒副作用，因此，雷帕霉素的出现为风湿免疫性疾病的治疗提供了新的选择。类风湿关节炎（RA）是一种慢性、侵蚀关节使关节受损的自身性免疫性炎症疾病， 滑膜炎是类风湿关节炎的主要症状，如不及时治疗最终会导致关节畸形以及影响关节的功能。有研究[12] 表明滑膜细胞能分泌大量促炎症细胞因子并且释放出多种基质金属蛋白酶，进而会发生滑膜炎，导致关节炎症。Cejka等[13]研究发现， 雷帕霉素具有减少滑膜破骨细胞形成，保护关节避免骨骼侵蚀和软骨损失的作用。进一步研究[14] 表明可能是由于雷帕霉素抑制mTOR信号通路，导致IL-2表达下调，使得T细胞停滞在的G1/S期， T细胞增殖受到抑制，抑制自身的免疫反应所致。同时其控制免疫因子释放、逆转肾小球肥大、抑制纤维化等独特性质在肾病治疗中也得到越来越多的关注。
3.2 抗肿瘤效应在疾病治疗中的应用
肿瘤是危害人类生命和健康的重大疾病，它是环境（化学、物理、生物因素）和基因相互作用的结果，其发生、发展机制极其复杂，目前随着肿瘤患者的日趋增多，放化疗等传统性治疗手段面对这一全球性课题时已捉襟见肘，尤其是中晚期肿瘤转移患者，放化疗带来的身体伤害和高危风险让我们迫切地去追逐一种更高效、更缓和的先进治疗方法，由此，包括mTOR受体抑制剂雷帕霉素在内的靶向生物制剂应运而生，为我们提供了新的方向。
在许多肿瘤细胞系和动物模型中，雷帕霉素具有时间和浓度依赖性的抗肿瘤效应，例如：肺类癌是一组发生于胃肠道和其他器官嗜铬细胞的新生物，其临床、组织化学和生化特征可因其部位不同而异，具有神经内分泌功能，Anagnostou等[15]研究说明了肺类癌是种mTOR高表达的肿瘤；Moreno等[16]用雷帕霉素处理了类癌细胞系BON1以及NCI-H727之后，发现两个细胞系的增殖活性受到明显抑制。白血病是一类常见的造血干细胞异常的恶性克隆性血液肿瘤疾病，目前对于白血病发病机制的研究是个热点问题，新近研究显示：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路调控失常与白血病发病存在相关性，在多种白血病中有PI3K/Akt/mTOR信号通路组成性激活，其过度活化已成为大部分急性髓系白血病（AML）原始细胞存活的必需条件，余在慢性粒细胞性白血病（CML）细胞、B淋巴细胞性白血病（B-ALL） 细胞中也均呈现PI3K/Akt/mTOR信号通路过度活化。目前，RAPA在白血病中的抗肿瘤作用已被证实[17]，RAPA及类似物作为VEGF等血管生成相关因子抑制剂而控制白血病细胞进展的效果得到肯定[18]。近年实验中，雷帕霉素在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌等多种肿瘤系中的抗肿瘤效应被逐渐挖掘，其临床试验也随之逐步开展，其中一项临床试验[19] 就肯定了雷帕霉素单药治疗晚期肝癌的疗效：选取21例肝细胞肝癌和9例胆管细胞肝癌患者，每天单独给予雷帕霉素，控制其血药浓度在4～15ng/mL之间，疗程后用影像学评估治疗效果，结果肝细胞肝癌患者中1例获得部分缓解，5例得到3个月稳定期，中位生存期延长至6.5个月，胆管细胞肝癌中3例获得疾病稳定，中位生存期达到7个月，初步证实了雷帕霉素可以改善该类病人的预后。进一步实验还发现雷帕霉素可与其他抗肿瘤药物产生协同作用，其中Hosono[20]研究发现，雷帕霉素可以提高激素受体（-）、Her2（+）的乳腺癌细胞系对5-氟尿嘧啶的敏感性。当然雷帕霉素的抗肿瘤效应还需大量临床实验来进一步证实，因此，雷帕霉素及其衍生物的抗肿瘤谱及其敏感性和耐药性的分子标志物的筛选、副反应监测及处理、临床药效评估及与其他药物联合作用效果的深入探讨都将是今后研究的着重点。
3.3 免疫抑制效应和抗肿瘤效应在疾病治疗中的同时应用
传统免疫抑制剂在抑制免疫功能的同时，已被证实还可能增加肿瘤发生和复发转移的风险，如肝癌后肝移植术后患者长期使用免疫抑制剂，降低了其机体整体免疫力，预防术后肿瘤复发和转移问题成为焦点。Srinath等[21]对符合米兰标准的227例肝癌肝移植患者进行了一项回顾性病例对照研究，两组患者：106例使用他克莫司及霉酚酸酯，121例使用RAPA。结果显示RAPA组患者的无瘤生存率明显高于他克莫司组，且其1、3、5年生存率（94%、85%、80%）明显高于他克莫司组（79%、66%、59%），差异有统计学意义，而两组的不良反应发生率没有统计学差异。提示肝癌肝移植术后患者使用RAPA 可以抑制肿瘤复发，提高其无瘤生存率及生存率，且不增加不良反应发生率。目前治疗白血病最有效方法是进行造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT），术后我们都会使用免疫抑制剂来抗排斥反应，这样就对肿瘤的控制能力下降，因此移植术后肿瘤复发和感染时常发生，临床上急需找到一种既能有效抑制机体的免疫功能又能抑制肿瘤的药物，有研究证明RAPA能较好的解决这个问题。作为一种具有免疫抑制和肿瘤抑制双重效应的药物，RAPA为使用免疫抑制剂后预防肿瘤发生和复发带来曙光，其在这一交叉领域中必然会扮演越来越重要的角色。
4 结论
近年来，雷帕霉素在临床多种疾病中的疗效得到广泛研究，作为一种新型免疫抑制剂，基于其免疫抑制功效强大，而且目前尚未发现明显毒副反应等优点，其在风湿免疫系统性疾病、心血管系统疾病、神经性疾病、器官移植术后降低免疫排斥以及对肾脏功能的修复等多类疾病治疗中均具有良好的效果。同时越来越多的研究表明， 雷帕霉素在肿瘤综合治疗中发挥的抗肿瘤效应得到肯定，它为研发新型靶向抗肿瘤药物提供新的思路，甚至可能改善基因耐药患者的药物敏感性。目前雷帕霉素作为一种既有免疫抑制作用又能抗肿瘤的双效药物在临床应用研究中仍处于初级阶段，还有很多有待解决的问题，如雷帕霉素应用中可能出现的高脂血症、易感染、肝功能损伤、稳定性和溶解性差等缺点，随着研究进展，相信这些问题将会逐渐克服。mTOR信号通路与多种疾病具有直接或间接的联系，雷帕霉素要与mTOR通路发生特异性结合才能充分发挥作用，因此，深入研究雷帕霉素与mTOR信号通路关联的分子机制、进一步探讨mTOR信号通路是否同其他通路具有协同作用将为雷帕霉素更好地应用于临床提供理论基础，推动临床靶向分子治疗的进展。
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【关键词】尿酸钠；；弗氏佐剂；体液免疫应答；天花粉蛋白；酶联免疫吸附测定
明矾在一定pH条件下产生氢氧化铝胶体吸附抗原而产生佐剂效应。明矾佐剂一般用于肌肉注射，皮下注射容易引起肉芽肿和脓肿，其机理未知，近期报告明矾佐剂通过诱导产生尿酸而起作用。本文研究尿酸钠作为佐剂对蛋白质性抗原天花粉蛋白（trichosanthin，TCS）免疫小鼠时诱发的特异性抗体应答的影响，从而了解尿酸钠对体液免疫应答的影响。
天花粉蛋白（trichosanthin，TCS）是中草药天花粉的有效成分， 存在于栝楼的块根中。天花粉作为中草药，14世纪主要用于妇科疾病的治疗。70年代，中科院上海细胞所提取出有效的活性成分-TCS。此后，药理学的研究发现，它是一类核糖体抑制蛋白，并有抑制免疫反应的作用，而且可以抑制HIV病毒在其感染的淋巴细胞和单核细胞中的复制，制止HIV病毒在患者体内的扩散，90年代初，曾将TCS试用于艾滋病的一期和二期临床治疗，但由于天花粉蛋白的强过敏原性，对艾滋病患者的肝脏损伤很大，并引起了高烧、虚弱、炎症等一系列副作用，因而停止实验。但作为抗肿瘤药物的研究一直在进行。
本研究中，以TCS作为抗原，与尿酸钠、完全弗氏佐剂一起免疫小鼠，评价尿酸钠对抗体应答（即体液免疫应答）的影响。选择TCS作为抗原的理由是该蛋白免疫原性强，单独免疫即可诱发较强的特异性抗体应答，从而便于评价佐剂的效应。
一、实验材料
（一）实验动物
6～8 周龄、SPF级雌性BALB/c小鼠， 体重19～22g， 购于南方医科大学实验动物中心。
（二）主要试剂和仪器
弗氏完全佐剂，明矾， 尿酸钠（uric acid sodium salt， UANa），邻苯二胺（o-phenylenediamine，OPD），PBS-T（phosphate buffered saline-tween 20）等购自美国Sigma公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（horseradish peroxidase-gimmunoglobulin G，HRP-IgG），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）RPMI-1640/DMEM干粉 等购自美国Invitrogen/Gibco公司；天花粉蛋白（trichosanthin，TCS）上海金山制药厂生产；低温离心机：Megafuge 1.0R型，德国Herculeus公司；酶标仪：680型，美国Bio-Rad公司 ；96 孔聚苯乙烯酶标板，丹麦Nunc 公司；自动酶标仪美国Hyperion 公司。
二、实验方法
（一）免疫佐剂的制备
尿酸钠悬浮液的制备，称取尿酸钠晶体，研磨为粉末后悬于生理盐水，加热搅拌，直到形成均质悬浮液，终浓度为2.5 μg/μL灭菌备用。采用注射器双推的方法，在注射器内反复双推，充分将弗氏完全佐剂与天花粉蛋白混合直至形成均质的乳浊液，用以免疫小鼠制备抗体。
（二）鼠的免疫和抗血清的制备
BALB/c小鼠随机分为以下3组（每组5只）：（1）弗氏完全佐剂组（10 μg TCS+ 100μL CFA）；（2）尿酸钠佐剂组（10 μg TCS+200 μg UANa）；（3）生理盐水对照组（10 μg TCS）。抗原和佐剂充分混合，免疫途径为背部皮下多点注射，每点50 μL共200 μL注射，初次免疫2 w之后以相同的剂量和途径进行加强免疫，10 d后剪尾取血约200 μL血样于37 ℃静置1 h，4 ℃过夜，第二天3000 r/min离心30 min，取上清即为免疫抗血清，-20 ℃保存备用。
按常规ELISA的方法测定抗血清的效价。参照文献[4]，方法简述如下：96孔板以每孔100 μL抗原TCS（5 μg/mL）于4 ℃包被过夜，PBS-T洗后，每孔加入含有5 %脱脂奶粉的PBS-T（phosphate buffered saline-tween 20）封闭液200 μL，37 ℃湿盒温育1 h。PBS-T洗后，各孔分别加入100 μL按1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：51200稀释的抗血清，阴性对照血清（同批NaCl免疫的小鼠血清）稀释方法相同，37 ℃湿盒温育1 h，用PBS-T洗后，每孔加入1：4000稀释的HRP-IgG，100 μL，37 ℃湿盒温育1 h，洗后每孔加入OPD显色液显色，加入终止液 2 mol/L H2SO4，Bio-Rad 680型酶标仪测定490 nm光吸收值。结果判定以（OD值-空白对照） / （阴性对照-空白对照） 大于2为阳性，小于1.5为阴性，介于2和1.5之间为可疑。
（三）统计学处理
结果以均数±标准差（x ± s ） 表示，数据以非配对t检验进行分析，以P
三、结果
以弗氏完全佐剂免疫小鼠的抗血清为阳性对照，检测尿酸钠对小鼠体液免疫应答的影响，结果见图 1和表 1。与单独以TCS免疫诱导的特异性抗体水平相比，尿酸钠为佐剂组TCS诱导的IgG效价明显降低（* P
四、讨论
为了探讨尿酸钠对体液免疫应答的影响，以天花粉蛋白（TCS）为免疫原，在小鼠体液免疫实验中分析了尿酸钠佐剂对特异性抗体应答的作用。研究结果显示，弗氏佐剂能极大地增强TCS特异性抗体应答，而尿酸钠对血清IgG的效价不但没有促进，反而有明显的抑制作用。这一结果提示，尿酸钠对体液免疫作用是抑制性的，但其中的原因尚不清楚。
实验结果表明，尿酸钠不能增强Th2型免疫反应。有研究表明，若同时在实验动物体内注射尿酸和抗原物质时，可诱导出强烈的CD8+ T细胞免疫反应，说明尿酸钠对Th1型免疫应答有促进作用。体外实验发现，尿酸能促进了DC分泌IL-12p70，促进IL-12p70 mRNA的表达。IL-12是DC分泌的重要免疫调节分子，可特异性促进Th1细胞分化而抑制Th2细胞分化，从而诱导特异的Th1细胞免疫应答。这些研究与我们的结果一致，并在一定程度上解释了尿酸钠抑制TCS诱发的抗体应答的原因。
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关键词：实验性变态反应性脑脊髓炎；雷公藤内酯醇；可溶性白介素2受体
中图分类号：R744.5 文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2007)07－1394－03
临床上对多发性硬化(multiple sclerosis，MS)主要采用抑制免疫治疗，但由于免疫抑制剂副作用大，治疗后复发率高，因此MS的临床治疗效果不佳。实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)因与MS有共同的免疫及病理特征，故公认为研究MS的理想动物模型。应用中药多靶点作用抑制免疫反应也是一种特异的免疫治疗手段，国内多采用有免疫抑制、抗炎作用的中药或其制剂干预EAE来研究其发病机制。雷公藤内酯醇(Triptolide，Tri)对EAE的研究国内外报道少。本实验旨在探讨Tri对EAE大鼠外周血SIL－2R表达的影响，为Tri临床治疗MS提供试验依据。
1 材料与方法
1．1实验动物与分组
Wistar大鼠38只，雌性，6－8周，体重(200±20)g，购自第三军医大学大坪医院动物中心，清洁级，动物中心许可证号：SCXK(渝)20020003。豚鼠6只雌雄不拘，体重450－500g，购于遵义医学院实验动物中心。大鼠随机分为：正常组，生理盐水和福氏完全佐剂(complete freund's adjuvant,CFA)对照组(NS/CFA组)，左旋咪唑对照组(levamisole，LMS)，Tri对照组，低剂量Tri组(LTri组)，高剂量Tri组(HTri组)，每组5只；模型组8只。
1．2 主要药物及试剂
雷公藤内酯醇由福建省医学科学研究所提供；福氏完全佐剂和左旋咪唑均购自Sigma公司；SIL－2R检测试剂盒购自晶美生物工程(北京)公司。
1．3 动物模型制作
动物适应性喂养1周，采用笔者以往报道的方法制作模型。即将豚鼠脊髓与等体积NS研匀，反复多次冰冻，研磨，制成无黏性匀浆，与等体积CFA混合抽打成油包水样乳剂。模型组和治疗组每只大鼠双后足掌皮下和尾近端注入0.4mL和0.1mL乳剂。注入后即刻、24、48h腹腔注射LMS10mg/kg。在免疫同时及每间隔24h连续16天经腹腔注射2％丙二醇溶解的Tri0.2mg/(kg・d)(LTri组)和0.4me/(kg・d)(HTri组)。NS/CFA组、LMS和Tri对照组分别注入等量NS/CFA、LMS和Tri，用法同模型组。
1．3．1 临床表现将注射日定为第0天，出现临床症状开始评分，2次/日。每组大鼠每日临床积分值由当日该组大鼠临床积分总和除以该组大鼠数目获得。各组大鼠临床总积分均值，均指在出现临床症状到第16天。按Koh报道的评分标准记录：无症状为0分，尾部远端肌张力丧失为0.25分，全尾张力丧失为0.5分，共济失调步态为1.0分，单后肢麻痹为2.0分，双后肢麻痹为3.0分。
1．3．2 取材所有大鼠于免疫后第16天，10％水合氯醛麻醉后心内取血3mL，离心留取血清－20℃待检，用NS及pH7.4的4％甲醛灌注固定，冠状切取大脑视交叉、小脑皮层、脑干、颈膨大、胸髓和腰膨大等部位组织，石蜡包埋，制成5μ.m厚脑和脊髓切片，进行HE染色、Loyez氏髓鞘染色。
1．3．3 SIL－2R检测采用ELISA法，在遵义医学院免疫学教研室检测，检测过程严格按说明书操作。
1．4 统计学方法
数据以均数(x)±标准差(s)表示，输入SPSS12.0软件包进行统计学处理。
2 结 果
2．1 临床表现
正常组、NS/CFA组、Tri对照组、LMS组和HTri组均未出现症状，临床评分均为0分，但LMS组有少食、萎靡、活动度差等。LTfi组于第14天出现症状，临床评分为(O.34±0.24)分；模型组于第13天出现症状，临床评分为(3.27±1.70)分，明显高于HTri和LTfi组(P＜0.01)。
2．2 病理改变
正常组、NS/CFA组、Tri组、LMS对照组和HTfi组HE染色及Loyez氏髓鞘染色未见异常。模型组HE染色见脑和脊髓白质内小血管周围有大量淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润，形成“袖套”样改变，有胶质细胞结节形成；Loyez氏髓鞘染色见髓鞘结构疏松、部分髓鞘脱失。LTri组HE染色见脑和脊髓白质内小血管周围亦有淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润，但较模型组明显减少；loyez氏髓鞘染色见部分髓鞘脱失。
2．3 Tri对SIL－2R的影响
3 讨 论
EAE发病机制主要是免疫损伤，研究发现，在EAE和MS的发病中细胞因子对疾病的预后产生决定性影响，Th1表型的细胞因子如IL－2、IL－12、TNF－α、IFN－γ正向调节细胞免疫，使病情加重，而Th2表型的细胞因子-IL－10、转移生长因子－β、IL－4负向调节细胞免疫，使病情缓解。在IL－2存在的情况下，MBP特异性Th细胞产生，针对MBP的特异性和非特异性免疫反应起动，介导免疫反应和免疫病理损伤。对EAE的发生，IL－2发挥关键作用。
近年研究认为，在某些诱因的作用下，自身髓鞘成分MBP被免疫系统识别，抗原提呈细胞捕捉和处理抗原，分泌IL－1，Th1细胞接受抗原信息，表达IL－2受体，分泌IL－2；T细胞本身还可通过自身分泌的细胞因子调节作用，如T细胞产生的IL－2反过来刺激T细胞本身IL－2受体表达和进一步分泌IL－2。鉴于在EAE对照组动物以及非中枢神经组织中很难检测到IL－2，但可以通过检测外周血清中SIL－2R表达的水平来反应IL－2。
IL－2和IL－2R系统在淋巴细胞活化增殖过程中居于举足轻重的地位，因此监测IL－2R的变化对自身免疫病MS辅助诊断、病情转归及预后判断有重要的参考价值，本实验通过检测EAE大鼠外周血清中SIL－2R发现：模型组SIL－2R为(52.84±3.98)mg/mL，较正常组、NS/CFA和Tfi对照组明显增高，有统计学意义。SIL－2R表达增高对EAE的发生和发展起着重要作用。
Tri是雷公藤二萜化合物中免疫抑制作用最强的单体，具有免疫抑制、抗炎等作用，广泛用于治疗多种自身免疫性疾病及移植排异反应。邹小明等，研究结果：不同浓度的Tfi对ConA诱导的小鼠脾脏淋巴细胞合成和分泌IL－2的功能没有明显的影响，但Tri对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞表面IL－2R表达却有明显的抑制，随着Tfi浓度的增加，小鼠脾脏淋巴细胞中IL－2R+细胞数呈递减趋势，Tri发挥抗排斥效应，主要是通过抑制IL－2R的表达，从而使IL－2与IL－2R的相互作用受到影响，最终抑制了淋巴细胞增殖。本实验应用Tri干预EAE发现：高剂量Tri治疗组未出现症状，HE染色和Loyez氏髓鞘染色无异常，其外周血清SIL－2R表达水平较模型组和低剂量Tri组明显降低，差异有显著性；低剂量组出现症状日期比模型组延迟、临床症状轻、病情没有进展。
【关键词】天疱疮；免疫球蛋白；糖皮质激素；免疫抑制剂；护理
重症天疱疮是自身免疫性疾病，多数患者需要长期使用糖皮质激素和免疫抑制剂治疗。糖皮质激素因用量大、时间长，易引起水电解质紊乱或严重的不良反应，甚至导致死亡[1］。有报道将免疫球蛋白用于治疗自身免疫性皮肤病[2］。本科2005-2009年收治重症天疱疮36例，予糖皮质激素联合免疫抑制剂大剂量免疫球蛋白治疗，并辅以精心的护理，效果较好，现将护理体会报告如下。
1资料与方法
1.1一般资料:36例重症天疱疮均为本科住院病例，均经组织病理和免疫病理检查确诊。临床表现为全身散在分布密集红斑和水疱，出现糜烂、渗出和结痂，全身弥漫性潮红、水疱、渗出、脱屑和结痂，皮损面积大于体表面积的70％。其中男23例，女13例；年龄37～79岁，其中48～79岁32例。并发中、重度高血压、糖尿病和胃溃疡等严重内科疾病者除外。
1.2治疗方法:予静滴甲泼尼龙或地塞米松，均8～20 mg/d，同时口服甲氨喋呤2～5mg/d 或静脉冲击环磷酰胺10～15mg／（kg·d），1次/w，免疫球蛋白0.4 g/(kg·d)，连用3～5天，病情平稳或好转后停用免疫球蛋白，再根据病情改善情况逐渐减少糖皮质激素用量。
1.3护理方法
1.3.1皮损护理：用连柏煎剂1 000mL（自制，组分：黄连、黄柏、地肤子、蛇床子和马齿苋，加入50L温度为 38℃～40℃的水中，浸泡20min，1次/d）清除结痂和污秽。水疱予无菌低位抽吸，保留水疱的表皮，以保护创面，水疱充盈后，多次重复抽吸，水疱破溃处，表皮松解，不可清除松解的表皮，保持清洁，予0.1％利凡诺湿敷20min，2次/d，再用白炽灯照射渗出部位，每创面10min，距离30cm，防止烫伤，2次/d，保持皮损干燥。夜间用无菌甘草油纱贴敷创面上，并用支被架支起盖被。当皮损逐渐干燥结痂后，外涂红霉素软膏，每2小时翻身1次，避免局部皮损长期受压和渗出增加。油腻性结痂外涂无菌油剂浸泡，待自行脱落，不可强行剥离。间擦部位腋下、颈前部、腹股沟由于皮损互相摩擦，不能暴露，故不易愈合，给予双上肢或双下肢外展位，颈后垫小软枕使颈部后曲，充分暴露皮损。
1.3.2黏膜护理
①口腔护理：口腔黏膜损害可引起疼痛，伴进食困难，进食后予漱口液(地塞米松注射液l0mg、0．1％利多卡因注射液0.1g、庆大霉素注射液l6万u加人生理盐水500 mL) 漱口，可减轻进食时口腔黏膜的疼痛，加速黏膜的恢复，抑制细菌生长。预防念珠菌生长，采用0．15％碳酸氢钠液每2小时交替漱口1次，并予生理盐水棉球口腔护理2次/d，唇部结痂清除后外涂红霉素软膏，口腔护理时应注意观察溃疡的部位、面积、深度及有无念珠菌感染［3］，口腔念珠菌感染者皮损外涂制霉菌素。
②外阴护理：外阴部皮损每日予1∶5 000高锰酸钾溶液坐浴30min后，0.1％利凡诺湿敷2次，便后用33℃～36℃温开水清洗外阴，保持清洁、干燥、通风。并观察水肿后黏膜脱落和溃疡深度，有无念珠菌感染等。
1.3.3治疗中的护理：密切观察和记录病情变化情况和药物不良反应，包括新发水疱的数量、部位和性质，原有水疱及渗出的变化，是否感染为脓疱，为医生调整用药剂量提供依据。糖皮质激素是目前治疗天疱疮的首选药，与环磷酰胺联用可提高疗效，但是长期服用糖皮质激素会出现消化道症状，大便隐血阳性，因此要观察大便颜色，每隔3～7天查大便隐血。出现鼻出血时，轻症者予01.％盐酸肾上腺素棉球填塞，出血较多予膨胀海绵或碘仿纱条局部定位压迫，并监测血压、血糖，加强巡视，了解患者睡眠状态，有无精神兴奋、失眠、幻觉、幻视，有无腹胀、乏力， 防止低钾、低钙。静滴环磷酰胺时需大量饮水，每天饮水2 500-3 000mL，必要时记录排尿情况，有无血尿等；有无出现骨髓毒性：如白细胞减少、贫血和血小板减少等。中医认为本病急性期辨证以脾虚湿盛为本，湿热、毒热、血热为其标；根据该原则，急性期应清热除湿、清热解毒、凉血解毒上［4］；口服中药煎剂治以泻心凉血、清脾除湿、活血化瘀为法，用清脾除湿饮加减内服。早饭前、晚饭后30min，热开晾凉后服用。人体对免疫球蛋白的耐受性较好，不良反应包括：头痛、肌痛、面红、恶心、血压变化和心动过速，常在应用免疫球蛋白后1小时内发生，宜视患者不良反应程度停止或减慢输注免疫球蛋白速度。
1.3.4心理护理：患者大部分皮肤黏膜破溃，且病情易反复，经久不愈，皮损疼痛，经济负担较重，会出现悲观、沮丧烦和躁等消极情绪，护士应尊重和关心患者，建立良好的护患关系，主动与患者交谈，缩短护－患距离，增加信任感。解除解除患者顾虑，使其树立信心，积极配合治疗及护理。
1.3.5饮食护理：患者皮损面积大，渗液多，机体消耗较大，宜给予营养丰富的高蛋白、高维生素饮食，伴口腔病变者，鼓励其进冷流质或软烂饮食，如鱼汤、蔬菜汁、水果汁、牛奶、豆制品、鸡蛋糕、瘦肉粥等，避免进食粗糙纤维及尖硬的食物，忌食辛辣、过酸、过甜等刺激性食物，可少食多餐［5］。病情好转时可以逐渐进易消化、质软的食物。进食困难时由静脉补充营养，以保持机体的营养需要和水、电解质平衡。多食薏苡仁、山药、绿豆、红枣以祛湿健脾，清热生津祛燥。
1.3.6保护性隔离：对病人实施保护性隔离，住单间，避免与带状疱疹等病毒性疾病同居一室，因患者长期大量应用糖皮质激素和免疫抑制剂，免疫力低下。保持病室空气新鲜，每日用1 000 mg／L(0．02％)的含氯清洁消毒液擦拭地面和桌面，紫外线床单位消毒2次/d，并每日更换无菌床单、被套、病号服。渗出较多时，随时更换，病室温度24℃ ～26℃为宜。保护好患者的浅静脉，扎止血带时，应垫上纱布或包扎在患者的衣服上，固定输液敷贴时，应避免固定至水疱上。
1.3.7出院指导：天疱疮患者好转或治愈出院后，多数需继续口服糖皮质激素和免疫抑制剂，应指导患者严格按医嘱用药，不可擅自停药或减量，定期随访。
1.4疗效判定标准[8]治愈：皮损全部消退或原有糜烂面干燥结痂，无新皮损出现；显效：皮损消退>70% ，或原有糜烂面基本干燥；有效：皮损消退70%-30% ，或有个别新皮损出现；无效：皮损消退70%所需时间。
2结果
36例患者均未发生皮肤继发感染；无外阴念珠菌感染；2例出现口腔念珠菌感染，对症护理后，一周后治愈；治疗8～12天后，糜烂面干燥，11～18天后可见红色新生表皮，21～24天后逐渐恢复为正常皮肤。复查IgG和C3均正常。住院时间19～28天，平均住院日23天，36例患者全部治愈出院。大剂量免疫球蛋白联合糖皮质激素和免疫抑制剂辅以皮肤护理，有效控制皮肤感染；间擦部位暴露辅以白炽灯照射，加速皮损干燥；口腔护理、外阴护理防止念珠菌感染；饮食护理补充大量渗出丢失的蛋白质；及时监测体温、血压、血糖的变化为治疗提供依据；保护性隔离减少交叉感染的机会。
3结论
大剂量免疫球蛋白联合冲击治疗重症天疱疮的护理关键是皮肤护理，防止皮肤感染，保持皮损局部干燥，给予恰当的外用药物，及时发现血压、血糖升高等糖皮质激素和免疫抑制剂的副作用，可以加速治愈，减少并发症。
4讨论
苏海丹等[6]29例皮质类固醇加环磷酰胺冲击治疗寻常型天疱疮的观察及护理，住院时间29～102d，平均住院时间65.5d；褚利娟[7]68例寻常型天疱疮护理体会，采用免疫抑制剂和糖皮质激素，平均住院时间28天。在治疗重症天疱疮的过程中，予糖皮质激素和免疫抑制剂治疗的同时，若早期联合应用大剂量免疫球蛋白，与单纯应用糖皮质激素和免疫抑制剂治疗相比较，平均起效时间、皮损明显消退时间以及住院时间明显缩短[8]，显示免疫球蛋白能迅速抑制免疫性损伤，辅以有效的护理措施：皮肤护理、黏膜护理、饮食护理、心理护理、保护性隔离和出院指导，皮损渗出明显减少，皮损恢复加速，缩短病程和住院时间，减轻了糖皮质激素的用量及不良反应本研究中未见静滴大剂量免疫球蛋白后出现不良反应，这可能与联合应用糖皮质激素有关[8]。虽然免疫球蛋白价格较贵，但是治疗重症自身免疫性疾病时效果较好，改善天疱疮患者的长期预后。
参考文献
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【关键词】 中药免疫调节剂;，小鼠;，脾淋巴细胞转化;，含药血清
[摘 要] 目的: 探讨中药免疫调节剂对正常小鼠及环磷酰胺(Cy)所致免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响。方法: 以Cy诱导建立免疫抑制小鼠模型， 给正常小鼠和免疫抑制小鼠饮服中药及生理盐水， 采用MTT法检测淋巴细胞的增殖反应情况。结果: 试验各组小鼠脾细胞在48 h培养时间内淋巴细胞转化率与各组含药血清加入到正常小鼠脾细胞反应体系中， 在相同培养时间内的淋巴细胞转化率呈高度正相关。表现为: 在机体正常条件下， 两个中药组与正常组之间差异无统计学意义（P>0.05）， 但均高于Cy组（P
[关键词]中药免疫调节剂; 小鼠; 脾淋巴细胞转化; 含药血清
目前， 国内外在中药免疫调节剂的研究开发方面， 研究单味药和其所含的单体成分（最多的是多糖， 其次为有机酸、 甙类、 生物碱、 黄酮等）占多数[1-3]， 复方研究较少且不深入。但是， 正是复方制剂的复杂成分才获得了单味药和单体成分所不具备的药效整体性和协同互补作用， 使疗效增强、 毒副作用减少， 在实际应用中更具优势。为此， 我们根据中药方剂的组成原则， 结合现代药理学研究成果， 以具有免疫调节作用的经典方剂“玉屏风散”为对照， 通过体外筛选、 毒性测定， 最后由黄芪、 茯苓、 白术、 甘草、 防风、 桔梗6味药组成了复方中药免疫调节剂， 并用MTT法探讨了该中药免疫调节剂对正常小鼠及Cy所致免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 RPMI1640培养基（Gibco公司）; MTT（四甲基偶氮唑盐， Amresco公司）， 以pH7.2的 RPMI1640培养液制成5 g/L溶液; PHA（Sigma公司）， 以pH7.2的RPMI1640培养液制成200 mg/L溶液; 小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司， 批号: 051215); 环磷酰胺（Cy， 上海华联制药有限公司， 批号: 050306）; 中药免疫调节剂（ZY）: 黄芪、 茯苓、 白术、 防风、 甘草、 桔梗组成复方免疫调节剂， 采用自动循环煎药机提取浓缩， 按照生药量计算使终浓度为300 g/L， 购自山东泰安工商联医药商行。玉屏风散（YPF）: 选自《中国兽药典》; MC0175型CO2恒温培养箱（日本SANYO）; COIC3168型倒置相差显微镜（重庆光学仪器厂）; 2010型BLOCELLHT系列酶标仪（郑州博塞生物工程有限责任公司）; SWCJIF型超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）; 96孔细胞培养板（Becton Dickinson， USA）; 6周龄昆明种小鼠72只， 质量18～20 g， 雌雄各半， 购自山东米歇尔生物制品有限公司动物饲养中心， 实验动物生产许可证号: 20030011。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及处理方法 将72只小鼠随机分为6组: 第1组为正常对照组， 定量给水给料; 第2组为Cy对照组， 于试验的第4天注射Cy， 按50 mg/kg， 连续7 d; 第3、 4组为中药免疫调节剂组（简称中药组）， 小鼠给药方式采取饮水给药， 1次/d， 按体表面积折算动物的等效剂量的2倍给药， 12 mL/(d・鼠)， 连续15 d; 第5、 6组为玉屏风散组， 12 mL/(d・鼠)。其中第3、 5组只给药不注射Cy， 第4、 6组给药并于第4天饮完药1 h后注射Cy（剂量、 疗程同第2组）。
1.2.2 含药血清的制备 采用摘眼球法在最后一次给药1 h后（采血前先禁食12 h）采血。血液置于1 mL离心管内， 静置2 h， 3000 r/min离心20 min， 无菌分离血清， 56℃水浴30 min灭活后， 置4℃冰箱保存， 24 h内使用。
1.2.3 小鼠脾淋巴细胞的制备 各组小鼠无菌取脾脏， 在冷Hank’s液中将脾组织制备成单个脾细胞悬液， 1500 r/min离心10 min， 弃上清液， 加入6 mL 8.3 mL/L TrisNH4Cl， 37℃水浴5 min使红细胞裂解后1500 r/min离心10 min， 弃上清液， 加入适量Hank’s缓冲液吹洗3次， 每次1500 r/min离心10 min， 弃上清液， 用不含血清的RPMI1640培养液调整细胞密度至5×109/L， 并用台盼蓝染色检测细胞活力>95%。
1.2.4 脾淋巴细胞增殖反应的测定
1.2.4.1 含药血清对正常小鼠脾淋巴细胞转化的影响 当血清浓度为50 mL/L时， 在96孔细胞培养板上， 每孔加入50 μL 5×109/L小鼠脾淋巴细胞， 45 μL不含血清的RPMI1640及5 μL含药血清; 当血清浓度为100 mL/L时， 在96孔细胞培养板上， 加入50 μL5×109/L小鼠脾淋巴细胞， 40 μL不含血清的RPMI1640液及10 μL含药血清。每组血清设4个重复孔， 并与同等浓度的小牛血清RPIM1640液作比较， 同时设培养液空白对照。
1.2.4.2 各试验组小鼠脾细胞的淋巴细胞转化试验 在96孔细胞培养板上， 每孔加入用含100 mL/L小牛血清RPMI1640稀释的5×109/L小鼠脾淋巴细胞95 μL， A、 B、 C、 D4横排各孔均加入不含血清的RPMI1640液5 μL， E、 F、 G、 H4横排各孔均加入200 mg/L的PHA 5 μL， 每组细胞设4个重复孔， 并用含100 mL/L小牛血清的RPMI1640作空白对照。上述细胞均置37℃、 50 mL/L CO2及饱和湿度下培养44 h， 各孔加5 g/L的MTT 10 μL， 继续培养4 h后， 加入SDSDMF溶解液50 μL， 30 min后用酶标仪测A570， 结果用刺激指数（SI）表示: SI＝试验孔A均值/对照孔A均值×100%。
1.2.5 数据处理 应用统计软件SPSS10.0进行分析， 所有数据用均值±标准差（x±s）表示。
2 结果
2.1 各组小鼠脾淋巴细胞转化结果 Cy对照组小鼠脾淋巴细胞转化的A570值明显低于正常对照组， 有统计学差异（P0.05）; 而Cy+中药免疫调节剂组和Cy+玉屏风散组小鼠脾淋巴细胞转化的A570值明显高于正常对照组（P
表1 各组小鼠脾淋巴细胞转化结果（略）
注: 同一列数值标有相同字母者之间无统计学意义; 标有不同字母者之间有统计学差异(P
下表同.
表2 含药血清对小鼠脾淋巴细胞转化的影响（略）
2.2 含药血清对小鼠脾淋巴细胞转化的影响 在健康小鼠脾淋巴细胞的转化试验中， 无论加入浓度为50 mL/L还是100 mL/L的各试验组血清， Cy+中药组及Cy+玉屏风散组A570值明显高于其他组（P
3 讨论
目前， 检测淋巴细胞转化最常用的方法是同位素掺入法和MTT法， 实验证明两种方法具有显著的相关性[4]。本试验中选用MTT法研究中药免疫调节剂对小鼠细胞免疫功能影响。多次重复试验结果表明， 在对试验各影响因素进行充分优化的基础上， MTT法的确简便实用， 重复性好。“玉屏风散”为扶正固表的经典方剂， 近年来大量的体内外研究表明其对免疫系统存在着较为广泛的影响[5]。玉屏风散含药血清具有明显活化小鼠白细胞和腹腔巨噬细胞作用， 对脾淋巴细胞增殖、 IL2产生有促进作用， 对NK细胞的活性有明显的增强作用[6]; 因此我们的试验选用“玉屏风散”为对照方剂。本试验中采用了各组小鼠脾细胞直接做淋巴细胞转化试验以及把各组含药血清加到淋巴细胞转化反应体系中两种不同的研究方法， 其结果一致表明: 玉屏风散和中药免疫调节剂对正常小鼠脾淋巴细胞转化均未出现明显的促进作用， 而对免疫抑制小鼠却效果明显， 且以中药免疫调节剂作用更好。血清药理试验还表明， 50 mL/L、 100 mL/L两种含药血清浓度对脾淋巴细胞的增值均有促进作用， 经统计学分析， 50 mL/L的血清浓度效果优于100 mL/L的血清浓度。由此我们可以认为， 在机体处于免疫抑制的状态下， 中药对免疫系统能更好的发挥其正向调节作用， 促进淋巴细胞增殖， 增强机体免疫力。 有试验表明， 鳖血提取物、 玉屏风散和四君子汤对免疫功能低下的小鼠的促进作用明显高于正常小鼠[7， 8]。分析其原因， 我们认为可能是由于免疫抑制剂环磷酰胺毒副作用较小， 在环磷酰胺作用下淋巴细胞未分裂也未凋亡， 当应用中药免疫调节剂解除其抑制作用后， 中药成分影响了免疫抑制小鼠的神经、 内分泌功能， 从而改变了神经－内分泌－免疫调节网络平衡， 使得免疫抑制小鼠对药物的反应性高于正常对照组， 造成短时间内免疫细胞超常分裂的结果。中药血清药理学研究方法针对中药及其复方成分的复杂性， 以及中药汤剂及粗提物的体外试验受到其电解质、 渗透压等多种因素的影响， 以动物含药血清代替中药煎剂或粗提物进行体外试验， 比较接近于动物体内环境， 增加了中药体外试验的真实性、 可信性和科学性。但目前该方法还有许多影响因素尚未规范， 因此对于任何一个试验都有必要尽可能细致地探讨其每一个影响因素，特别是象给药量、 采血时间点、 血清添加浓度等因素。试验中我们的采血时间设在给药后1 h， 是根据时效关系的预试验确定的。在预试验中， 对Cy所致免疫抑制小鼠给药后15、 30、 60、 90、 120、 180、 240 min共7个时间点分别采血分离血清， 用于淋巴细胞转化率的测定， 结果给药后30～120 min采集的血清与对照组比， 均能显著促进小鼠淋巴细胞的转化， 以给药后60 min采集的血清效果最好， 故正式试验时我们的采血时间设在给药后1 h。其他几种处理方式的选择依据: ①小鼠的给药方式不采用传统的灌胃法， 而是采用在干渴状态下饮水的方式， 不但能减少应激， 不会对消化道造成损伤， 而且能大大减少人力和给药操作时间。预先摸索小鼠的全天饮水量， 然后在干渴的状态下给药， 小鼠饮完药液一段时间后再适量补充清水。试验表明， 这种给药方式是可行的， 尤其适合于异味不太大的补养药。②Cy的注射剂量按50 mg/kg是根据周华等[9]的试验结果， 用50 mg/kg的剂量不但可以成功造模， 还可以充分体现出作用温和的中药复方对免疫抑制动物体液免疫的促进活性。本试验证明， 该剂量可以充分体现中药复方对免疫抑制动物的体液免疫功能（另文报道）和细胞免疫活性的影响。③为使细胞生存条件尽可能完全一致， 培养过程中也不发生改变， 应用不含血清的RPMI1640液溶解MTT和PHA， 可促进细胞对MTT和PHA的吸收， 增加结晶的产生和减少孵育时间。
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关键词：IgA肾病；免疫抑制剂；临床效果
IgA肾病属于免疫复合物引起的肾小球疾病，机体产生大量在IgA抗体沉积于肾小球系膜区。患者主要表现出反复发作的肉眼血尿、少尿与蛋白尿、高血压、贫血等症状，对患者的生活质量产生很大的影响，因此寻找有效的治疗方法十分重要[1]。来氟米特属于新型的免疫抑制剂之一，在多种自身免疫性疾病的治疗中发挥出积极的作用，取得了令人满意的效果。临床应用氟米特免疫抑制剂治疗IgA肾病疗效显著，且不良反应轻，本文选择于2010年11月-2013年3月在我院接受治疗的IgA肾病41例作为研究对象，旨在探讨分析应用免疫抑制剂治疗IgA肾病的临床效果，具体信息如下。
1 一般资料与方法
1.1一般资料 研究对象均通过肾活检病理与临床症状确诊为IgA肾病。对照组中男性11例，女性10例；年龄介于19-59岁之间，平均年龄（39.7±5.6）岁；患病时间介于6个月-5年，平均（2.1±1.0）年；观察组中男性10例，女性11例；年龄介于17-61岁之间，平均年龄（38.8±5.9）岁；患病时间介于5个月-5.2年，平均（2.2±1.2）年；患者均不同程度存在反复发作的肉眼血尿、少尿与蛋白尿、高血压、贫血等症状表现。两组患者在性别、年龄、病情等一般资料上比较差异不显著（P>0.05），具有可比性。
1.2 治疗方法 对照组给予激素类药物与降压等常规质量，观察组患者在上述治疗基础上服用来氟米特免疫抑制剂进行治疗，具体治疗如下：对照组患者口服泼尼松（由西安利君制药有限责任公司提供，国药准字H61023180）30 mg/d，并且进行改善肾脏微循环与降压的治疗。观察组患者同时予以来氟米特（由福建汇天生物药业有限公司提供，国药准字H20050175）治疗，治疗前3d予以50mg/d的剂量，接下来剂量控制在20-30mg/d，治疗4周观察疗效[2]。
1.3 指标观察 主要观察两组患者治疗前后血清肌酐（Scr）、血压（BP）、尿红细胞相位计数、24h尿蛋白定量的变化情况，并做好对比分析工作。
1.4 统计学分析 采用SPSS13.0统计学软件，计数资料采用X2检验，P
2 结果
2.1治疗结果显示两组患者的血清肌酐（Scr）、血压（BP）、尿红细胞相位计数、24h尿蛋白定量等指标较治疗前均有不同程度的改善，但是观察组的改善幅度更为显著，两组比较差异显著（P
2.2但是观察组患者存在肠胃道不适、皮疹、白细胞降低以及脱发等一系列不良反应，但是症状轻微、持续时间短，无需停药或者减少药物剂量症状自行消退。
3 讨论
IgA肾病属于自身免疫性疾病之一，是指肾小球系膜区以 IgA或 IgA沉积为主，伴或不伴有其他免疫球蛋白在肾小球系膜区沉积的原发性肾小球病。患者会存在高血压、血尿、浮肿等症状，对患者日常起居生活造成极大的影响，因此及时有效的治疗十分必要[3]。
本次研究结果显示观察组患者经治疗后，在Scr、BP、尿红细胞相位计数、24h尿蛋白定量等指标方面明显优于对照组，差异显著（P
综上所述，应用来氟米特免疫抑制剂治疗IgA肾病临床效果显著，且安全性较好，临床意义显著，值得临床推广应用治疗。
参考文献
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