时间：2023-05-30 10:06:43
开篇：写作不仅是一种记录，更是一种创造，它让我们能够捕捉那些稍纵即逝的灵感，将它们永久地定格在纸上。下面是小编精心整理的12篇纤维素酶，希望这些内容能成为您创作过程中的良师益友，陪伴您不断探索和进步。
纤维素是烟草中主要的细胞壁物质，其含量高低直接影响烟叶的品质。低等级烟叶由于纤维素含量较高，其烟气会产生强烈的刺激性、呛咳、涩口、枯焦气［1］，因此，测定烟草中的纤维素，对于评价烟叶品质具有重要意义。传统的测定方法主要采用稀酸、稀碱与样品依次共煮后用有机溶剂处理，再经烘干后称重［2-4］，这种方法操作繁琐，费力耗时，且由于操作人员的技术差异会带来很大的误差。近年来，近红外（NIR）光谱分析技术也被用于烟草中纤维素含量的测定［5］，但是因其数据模型的建立需要大量的数据支撑，其应用受到一定的局限。根据纤维素水解后生成葡萄糖的性质，采用酶解纤维素得到葡萄糖［6-7］，然后利用流动分析仪检测还原糖含量［8］，可计算得到纤维素的含量，而且酶水解具有专一性和高效性［9-10］，流动分析仪在行业内的应用也比较广泛，因此，建立测定烟草中纤维素含量的流动分析法，可为评价烟叶的品质提供技术支持。
1材料与方法
1.1材料、试剂与仪器2009年初烤烟叶样品17个（川渝中烟工业公司提供）。冰醋酸、柠檬酸、柠檬酸三钠（AR，重庆川东化工有限公司化学试剂厂）；葡萄糖、氯化钙、氢氧化钠（AR，重庆北碚化学试剂厂）；纤维素酶（BR，活力>15000DU，国药集团化学试剂有限公司）；聚乙氧基月桂醚、对羟基苯甲酸酰肼（AR，荷兰Skalar公司）。SkalarSan++流动分析仪（荷兰Skalar公司）；AX504分析天平（感量：0.0001g，瑞士MettlerToledo公司）；恒温摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）；循环水真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；G3玻璃砂心漏斗（长春市玻璃仪器厂）。
1.2样品处理和分析准确称取0.25g40目烟粉，置于100mL锥形瓶中，加入25mL5%醋酸溶液，摇床振荡萃取30min，萃取出样品本身含有的水溶性糖［8］，用G3漏斗过滤，滤渣用蒸馏水冲洗3次，每次50mL；将滤渣转移到100mL锥形瓶中，加入60mL含有0.25g纤维素酶的柠檬酸/柠檬酸三钠缓冲溶液（pH4.7）［7，11］，然后放入37℃恒温摇床水解24h；水解结束后将样品冷却至室温，过滤，用蒸馏水将滤液定容至100mL，利用流动分析仪测定样品液中的葡萄糖，测得葡萄糖含量乘以转换系数0.9（由纤维素水解方程式计算得到）即得纤维素含量。
2结果与讨论
2.1酶解条件的选择
2.1.1缓冲溶液用量对纤维素水解的影响准确称取0.25g烟粉样品5份，按照1.2的方法除水溶性糖，然后分别加入固定纤维素酶量（0.25g纤维素酶）的缓冲溶液40，50，60，70，80mL，在固定温度（37℃）条件下水解24h，纤维素含量的测定结果如图1所示。由图1可知，随着缓冲液体积的增大，纤维素测定量也逐渐升高，当缓冲溶液用量为60mL时，达到最高值，说明此时纤维素水解完全；当缓冲溶液用量大于60mL后，纤维素测定量逐渐降低，这可能是由于缓冲溶液用量过大，导致了酶浓度降低，酶不能与底物充分接触，从而使酶解效果变差。因此，选择缓冲液用量为60mL。
2.1.2酶用量对纤维素水解的影响在缓冲液用量为60mL、其他条件不变的情况下，分别考察酶用量为0.05，0.10，0.15，0.20和0.25g时的酶解效果，结果如图2所示。由图2可知，当酶用量为0.20g时，纤维素测定量最高，考虑到生物酶较容易部分失活，为保证纤维素水解完全，所以确定酶用量为0.25g。
2.1.3温度对纤维素水解的影响在缓冲液用量为60mL和酶用量为0.25g的情况下，分别考察纤维素在30，35，40，45和50℃下的水解效果，结果如图3所示。由图3可知，当温度<35℃时，纤维素水解不完全，测定量较低；当温度>40℃时，纤维素测定量降低，这可能是因为温度过高导致酶失活，使纤维素水解不完全；较适宜的水解温度为35~40℃，实验选择37℃。
2.1.4时间对纤维素水解的影响在缓冲液用量为60mL、酶用量为0.25g和水解温度为37℃的情况下，分别水解20，22，24，26和28h，结果（图4）表明，24h后，纤维素水解完全，所以确定水解时间为24h。
2.2工作曲线与检测限准确称取2.2009g葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL，摇匀，得标准储备液。移取1，2，3，4，5mL标准储备液，分别用蒸馏水稀释并定容至100mL，摇匀，即得葡萄糖系列标准溶液，浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8和1.0mg/mL，相当于纤维素0.18，0.36，0.54，0.72，0.90mg/mL。用流动分析仪测定标准溶液中的葡萄糖含量，并对电信号响应值Y（峰高，DU），与其浓度X（纤维素含量，mg/mL）进行线性回归分析，得其工作曲线回归方程为：Y=15893.3X+2117.5，r=0.9998。可以看出，纤维素在0.18~0.90mg/mL浓度范围内，工作曲线线性良好，适合于定量分析。通过测定空白试样，测得纤维素的检测限［12］为0.11mg/mL。
2.3精密度和回收率采用本方法对烟草样品的纤维素分别测定6次，测定量分别为125.8，120.7，126.9，127.3，126.2和125.1mg/g，相对标准偏差（RSD）为2.40%，说明本方法的重复性较好。在脱糖烟草样品中加入葡萄糖，测定其回收率，结果如表1所示。纤维素的回收率为96.7%~103.8%，说明本方法的准确性较高。
2.4与经典方法［3］比较分别用本方法和经典方法测定16个烟草样品的纤维素含量，结果如表2所示。通过对两组数据进行配对样品t检验，发现二者无显著性差异，说明该方法适合于烟草中纤维素含量的检测。
关键词 米曲霉；固态发酵；纤维素酶活
中图分类号 S147.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）08-0197-02
Abstract The culture conditions affected the production of cellulose enzyme by Aspergillus oryzae，such as carbon source，nitrogen source，initial pH，water content，culture temperature，culture time，etc.The results showed that when the carbon source was bran，nitrogen source was powder of bean cake，initial pH value was 6.5，moisture content was 50%，culture temperature was 30 ℃，training time was 60 h，the cellulose enzyme activity produced by Aspergillus oryzae was the highest.
Key words Aspergillus oryzae；solid-state fermentation；cellulose enzyme activity
我国农作物秸秆的利用率普遍很低，多数作物秸秆都作焚烧处理，对环境的污染很大。作物秸秆中含有丰富的有机质、氮、磷、钾等作物生长所需的营养元素，如果能得到合理的利用，将会为人类带来巨大的收益。作物秸秆的处理方式有物理、化学、生物方法，其中生物降解具有污染少、能耗低等优点[1]。作物秸秆中含有丰富的纤维素，纤维素在纤维素酶的作用下可以水解生成单糖被作物和微生物利用，但纤维素不易被降解，几十年来，人们对于纤维素的预处理及酶水解过程进行了大量研究，其中纤维素酶的使用大大提高了纤维素的降解率[2]。
米曲霉属半知菌亚门丝孢纲丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种。米曲霉（Aspergillus oryzae）是纤维素酶的主要生产菌种之一。工业用米曲霉菌种所产的酶系较多、酶系组成较复杂[3]，国内对该菌株的相关研究并不多，对其酶系在工业发酵过程中受到的影响因素及其作用机理并不十分了解，从而导致在工业生产过程中不能够十分精确地控制米曲霉的产酶过程，限制了这一传统的食用菌株在工业应用领域的进一步拓展[4]。本试验对米曲霉M1102产纤维素酶在固体发酵过程中所受的影响及活性变化进行了研究，以期为米曲霉产纤维素酶的工业化生产提供相关的理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 菌种。米曲霉菌株M1102，来自中国菌种保藏中心。
1.1.2 培养基与主要试剂。斜面培养基：土豆培养基（PDA）；液体种子培养基：豆饼粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，蔗糖10 g/L，MgSO4 0.3 g/L，K2HPO4 0.3 g/L，调节pH值至7.0；营养盐溶液：NaCl 2 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、CaCO3 0.5 g/L、MgSO4 0.5 g/L，调节 pH值至7.0；固体培养基：木质纤维素培养基；主要试剂：麸皮、稻壳粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖、豆饼粉、干酪素、蛋白胨、硫酸铵、尿素。
1.1.3 仪器设备。酒精灯、接种环、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、pH测定仪、紫外分光光度计、水浴锅、恒温培养箱、电子天平、控温摇床。
1.2 试验方法
1.2.1 培养方法。一是米曲霉种子液制备：将米曲霉接种于PDA斜面上进行活化，用接种环挑取一环接种于250 mL三角瓶的种子液中，装液量为50 mL，30 ℃，180 r/min，培养24 h。二是固体培养：在250 mL三角瓶中加入10 g风干后过筛的木质纤维原料和5 mL营养盐溶液，拌匀，121 ℃灭菌30 min，冷却后将种子液以3%的接种量接种于固体培养基中，32 ℃下培养60 h，测定其产纤维素酶活[5]。粗酶液的制备：每1g固态培养物加入磷酸缓冲溶液5.0 mL（pH值 7.2），室温下浸提1 h，10 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。
1.2.2 培养条件的优化。一是碳源对纤维素酶活的影响：分别用3%含量的麸皮、稻壳粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖作为培养基的碳源，其他成分同初始培养基，培养结束后测定其纤维素酶含量[6]。二是氮源对纤维素酶活的影响：分别以2%的豆饼粉、干酪素、蛋白胨、硫酸铵、尿素作为培养基的氮源，其他成分同初始培养基，培养结束后测定培养基中纤维素酶含量[6]。三是发酵条件优化：采用优化后的最佳发酵培养基，在固定其他发酵条件的基础上，逐一对发酵培养的初始pH值、培养基含水量、培养时间、发酵温度等培养条件进行优化。
1.2.3 纤维素酶活的测定方法。采用GB-羧甲基纤维素法（CMC法）。
2 结果与分析
2.1 培养基碳源对纤维素酶活力的影响
酶诱导物和酶蛋白质前体同时对纤维素酶的合成有调控作用，酶诱导物一般为可利用的碳源，纤维素作为酶诱导物对纤维素酶的产生有重要作用。从图1可以看出，在培养基其他基础营养成分不变的前提下，改变碳源含量后，米曲霉产纤维素酶活发生显著变化，其中碳源为麸皮时纤维素酶活最高；稻壳粉和玉米芯粉次之，为最高酶活的72%和68%；玉米粉和蔗糖为最高酶活的60%和37%；碳源为葡萄糖时纤维素酶活最低，仅为最高酶活的30%。当碳源中纤维素含量丰富时，米曲霉产纤维素酶活力高，这是由于纤维素作为酶诱导物能刺激纤维素酶的产生，将其分解为可利用的单糖，而葡萄糖和蔗糖作为碳源时，米曲霉能直接利用其作为碳源，所以抑制了纤维素酶的产生。
2.2 培养基氮源对纤维素酶活力影响
氮源是酶蛋白质前体的主要来源，因此氮源的类型和性质同样会影响纤维素酶的合成和分泌。选择不同氮源作为单一氮源进行发酵试验，来考察其对米曲霉产酶的影响。
从图2可以看出，在试验选用的5种有机和无机氮源中，以豆饼粉作为氮源时米曲霉所产纤维素酶活性最高；干酪素和蛋白胨次之，纤维素酶活是豆饼粉作为单一氮源时活性的96%和81%；当分别以硫酸铵和尿素为单一氮源时，米曲霉所产纤维素酶活性仅为最高酶活性的70%和68%。由此表明，有机氮源对纤维素酶活的影响大于无机氮源，这可能与有机氮源中营养成分含量多元化有关。
2.3 培养基初始pH值对纤维素酶活力的影响
微生物在生长繁殖和代谢过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累，导致培养基pH值发生变化，而培养基初始pH值不仅影响微生物的生长繁殖，且对其产酶情况有显著的影响。在优化培养基碳氮源基础上，调节初始pH值为4.0～9.0来考察米曲霉产酶活性的变化。从图3 可以看出，米曲霉产生纤维素酶的最佳初始pH 值为6.0～7.5，当培养基初始pH值为5.5，米曲霉仍能产生相对于最高活性 72%的纤维素酶；而当培养基初始pH值调至8.0 时，米曲霉产生纤维素酶活性则迅速下降至最高酶活性的34%。试验表明米曲霉产纤维素酶的pH值适应范围较宽，但过酸或过碱的环境不利于纤维素酶的生产。这可能是由于过酸或过碱的环境不利于米曲霉生长或破坏了纤维素酶活力。
2.4 培养基含水量对纤维素酶活力的影响
水分是微生物生长代谢的重要物质，在固体发酵中，水分对微生物活性有重要影响。从图4可以看出，随着培养基中含水量的增加，米曲霉产纤维素酶活呈现先增高后降低的趋势，当培养基含水量为50%时，纤维素酶活最高。所以含水量过高或过低都会抑制米曲霉生长，这可能是由于低水分使米曲霉培养基中的营养物质溶解性降低，抑制了米曲霉生长；当水分含量过高时，培养基过于黏稠，破坏了培养基的多孔结构，降低了其透气性，而米曲霉是耗氧微生物，低氧环境不利于其生长。
2.5 培养温度对纤维素酶活力的影响
微生物最适宜的温度范围一般为16～30 ℃，最高温度在37～43 ℃，温度过高或过低均不利于米曲霉生长。从图5可以看出，在30～35 ℃时，纤维素酶活最高，温度过低或过高都会降低纤维素酶活。这是由于，当温度过低时，米曲霉生
长缓慢导致产生纤维素酶少，而且低温环境会降低酶活力；当温度过高时，米曲霉会由于高温而出现老化现象，抑制了纤维素酶产生，并且高温容易使纤维素酶失活。
2.6 培养时间对纤维素酶活力的影响
微生物处于不同的生长期时，其相应的生长代谢机理也不同。从图6可以看出，随着培养时间的延长，米曲霉产纤维素酶活呈先升高后降低的趋势。当培养至60 h时，纤维素
酶活最高。这是由于培养初期米曲霉处于繁殖阶段，产生孢子数量有限，故分泌的纤维素酶少；而在培养后期，由于米曲霉出现老化，导致纤维素酶分泌量减少。
3 结论
本试验研究了米曲霉菌株M1102在不同固体发酵条件下产纤维素酶的变化。结果表明：当碳源为麸皮，氮源为豆饼粉，初始pH值为6.5，含水量为50%，培养温度为30 ℃，培养时间为60 h时，米曲霉产纤维素酶活力最高。为了深入了解米曲霉固体发酵产纤维素酶的影响因素，还需要对纤维素酶的生产条件和作用机理做更深一步的研究。
4 参考文献
[1] 袁喜庆.秸秆生物降解技术的效应[J].现代农业科技，2011（4）：261.
[2] 汤鸣强，郑 挺，曾小芳，等.酿造酱油米曲霉产中性蛋白酶提取与酶学性质研究[J].中国调味品，2008（348）：38-40.
[3] 高晓梅，李杨，刘晓辉，等.固态发酵法生产大豆多肽的初步研究[J].山东农业科学，2014（7）：78-81.
[4] 孙春华，燕磊，常维山，等.不同碳源和氮源对米曲霉产酶影响的研究[J].西南农业学报，2007，20（5）：986-990.
1.1葡萄糖内切酶
该酶作用于纤维素分子内的非结晶区，随机水解β-1，4-糖甘键，截短长链纤维素分子，产生许多带有非还原性末端的小分子纤维素，但不能单独作用于结晶的纤维素。同时它也能水解小分子的纤维寡糖。
1.2葡萄糖外切酶
这类酶作用于纤维素分子的末端，依次切下纤维素分子中的纤维二糖，可作用于纤维素分子内的结晶区、无定形区和羧甲基纤维素。
1.3β-葡萄糖苷酶
也称纤维二糖酶，是一种可将纤维二糖、纤维三糖和纤维六糖等水解为葡萄糖的非专一性酶；在水解过程中低聚糖对外切酶和内切酶的产物产生抑制作用，这种酶的存在可以显著降低抑制作用，提高水解效率。
2食品工业纤维素酶的来源
纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、动物体、微生物（细菌、放线菌、真菌、酵母）等都能产生纤维素酶。由于动物体和放线菌的纤维素酶产量极低，所以很少研究。细菌所产生的酶是胞内酶，或者吸附在菌壁上，很少能分泌到细胞外，提取纯化的难度大。而且产量也不高，主要是中性和碱性的葡萄糖内切酶。因其多数对结晶纤维素没有活性，所以主要用于棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中，在食品工业中应用也较少[4]。目前，报道较多的是真菌，其产生的纤维素酶通常是胞外酶，酶一般被分泌到培养基中，用过滤和离心等方法就可较容易地得到无细胞酶制品。丝状真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物，其中木霉纤维素酶产量高、酶系全，故而被广泛应用，尤其是里氏木霉、绿色木霉的研究较多。
2.1产纤维素酶里氏木霉的研究进展
由于里氏木霉产纤维素酶量高、稳定性好、适应性强，便于生产和管理，因此具有突出的研究和利用价值。目前，在菌株选育上普遍采用人工诱变和基因工程改造两种方案获得高效分解纤维素的菌株。诱变的方法一般是传统的物理诱变(紫外线)和化学诱变(亚硝基胍)。IKEM等以里氏木霉ATCC66589为出发菌株，经紫外线诱变，获得两株突变菌株M2-1和M3-1。其滤纸酶活分别达到257U和281U。张素敏等利用紫外线诱变里氏木霉T306，得到突变菌株的CMCA活力达到64.2U/mL[5]。在化学诱变剂中，烷化剂可与巯基、氨基和羧基等直接反应，故更易诱发基因突变。DURANDH等用亚硝基胍诱变里氏木霉QM9414，得到一株稳定性较好的突变菌株CL847，FPA酶活最高达到5.2U/mL，较出发菌株提高了4倍[6]。也有紫外线与亚硝酸钠、亚硝基胍等化学试剂复合诱变的研究，取得了较好的效果。这些研究对里氏木霉高产纤维素酶菌株的选育及其工业化应用具有显著意义。基因工程改造可以从不同产纤维素酶菌株中筛选出比活力高、酶学性质稳定的基因重组在一起并高效表达，具有定向性，是选育出高产纤维素酶菌株的有效途径。目前已成功在里氏木霉中克隆表达的基因有纤维二糖酶基因、celEn、pBGL1、af211、Neg[7]。
2.2产纤维素酶绿色木霉的研究进展
绿色木霉酶活较大，是目前公认较好的纤维素酶生产菌。目前的研究主要集中于绿色木霉产纤维素酶生产工艺的研究。陈莉等采用固态发酵方法研究了不同条件对其产纤维素酶活的影响。得出绿色木霉固态产酶发酵的最优条件是培养温度30℃，培养时间5d，接种量5%，含水量250%。在实际发酵过程中，不同的酶组分达到最大酶活的时间也有不同，例如FPA酶活在发酵2d后达到最高值,Cx酶活在发酵3d后达到最高值。以蛋白胨为唯一氮源时，纤维素酶活力最高，以尿素为唯一氮源时，纤维素酶活力最低。绿色木霉分泌的酶系偏酸性,发酵液初始pH值为4.5时，FPA酶活和Cx酶活都出现最高值。因此在实际应用中也可以根据需要来调整不同酶组分的含量，以及合适的氮源，适宜的pH值等[8-9]。黄发等人对绿色木霉产β-葡聚糖酶的工艺条件研究也得出了类似的结果[10]。
3纤维素酶在食品工业的应用
3.1在果蔬加工中的应用
在果蔬的加工过程中,为了使得植物组织快速软化和膨润,常常采用加热蒸煮或酸碱处理等方法。这样一来就使得蔬菜、果实的香味和维生素等损失很大。通过使用纤维素酶来进行蔬菜的软化可以避免这一缺点。除此以外,通过采用纤维素酶对蔬菜和果实进行分解,可以使加工的果酱口感增加;还可以用纤维素酶来分解蘑菇,制造一种很好的调味料;在糖果品加工工艺中也可以采用纤维素酶来缩短砂糖进入果实当中的时间，以更快地达到浸透效果[11]。朱莉莉等研究了羊栖菜汁浸提工艺条件,通过研究最适范围各个单因素发现，在复合酶酶解提取羊栖菜汁的最佳浸提方案中,添加纤维素酶与果胶酶配比3:2可以大大提高浸提率[12]。
3.2在大豆加工中的应用
纤维素酶用于对大豆的处理,可以促使其大豆快速脱皮,与此同时,由于纤维素酶可以破坏其细胞壁,从而使得包含在细胞中的油脂和蛋白质完全的分离开来,导致大豆和豆饼中提取优质的水溶性蛋白质和油脂的得率明显增加，不但降低了生产成本，而且还显著地缩短了生产时间,更是提高了生产产品的品质。
3.3在茶叶加工中的应用
随着茶饮料工业的快速发展，茶水饮料生产的方式渐渐地由最初饮料厂的全程生产方式向由原料厂商只是生产茶浓缩汁这一方式过度,这就使得我国的茶叶浓缩汁、速溶茶等生产发展快速。随着近现代生物技术的快速发展,外源的生物酶在茶叶提取、加工中得到充分的应用。酶法提取的原理为利用其纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等水解酶分解茶叶的细胞壁,使得细胞结构破坏,导致茶叶中的有效成分快速扩散与浸出,有利于提高固形物的溶出和浸提率。在茶叶提取生产的过程中，纤维素酶可以提升其可溶性糖类的含量以及水浸出物得率，并且还可以促进氨基酸、茶多酚、咖啡碱等物质的溶出，有利于释放出芳香性物质，有显著的增香效果[13]。
4纤维素酶在酿造、发酵工业中的应用
4.1在酱油、食醋酿造中的应用
酱油酿造主要是利用蛋白酶及淀粉酶等酶类对原料进行相应的酶解，而在该过程中如果添加使用纤维素酶，就可以使大豆等原料的细胞膜软化、膨胀等细胞破坏作用更加明显，使得包藏在细胞中的碳水化合物、蛋白质等顺利释放，从而缩短酿造时间，并且可以显著提高产率及品质，使酱油中的还原糖和色度明显增加，风味得到明显改善[14]。在食醋酿造过程中，通过纤维素酶与糖化酶混合使用，可以显著提升原料利用率及出品率。郝建新等以绿原酸为评价指标，进行了添加纤维素酶发酵醋的工艺研究。结果发现，利用纤维素酶等酶后，得到的发酵醋色泽澄清，并具备醋特有的香气，口感也很柔和，而且具有比较好的体外抗氧化的效果[15]。
4.2在啤酒加工过程中的应用
把纤维素酶利用在啤酒工业的麦芽生产当中，可以增加麦粒等的溶解性，减少糖化液中R-葡萄糖的含量，明显提高过滤性能。张麟等对啤酒糟进行了研究，发现预处理过程中添加纤维素酶水解比只用机械处理得到的可溶性糖含量有明显提高[16]。
4.3在饮料中的应用
冯丹等用新鲜的豆渣为原材料，利用纤维素酶对原料进行酶解，可以获得其水溶性膳食纤维等提取液，添加辅料可混合调配成一类酸甜适口，体系均一，滋味纯正，并且具有一定保健功能的膳食纤维类饮料。且研究发现其具有较好的稳定性[17]。
4.4在酒精发酵中的应用
通过在原料中添加纤维素酶来酿酒，可以增加出酒量，节约粮食20%左右，而且酿出的酒酒味醇香，杂醇油含量低。尤其是白酒当中，添加纤维素酶以后，可以同时将淀粉和纤维素转化为可发酵性的糖，再经过酵母分解而全部转化为酒精，提高出酒率且酒的品质纯正。在实际生产中应用纤维素酶，不仅可以提高发酵产率，而且能够显著缩短发酵时间[1]。此外，利用纤维素酶水解木质素生产乙醇用于化工、能源等方面对于目前的全球资源短缺现状的缓解也具有重要意义。
5纤维素酶在纤维废渣回收利用方面的应用
利用其纤维素酶或微生物,把农副产品、城市废料中的纤维素进一步转化成为酒精、葡萄糖和单细胞蛋白质等产品,这对于开辟食品工业的原材料来源、提供新型能源和变废为宝等方面具有十分重要的价值和意义。例如纤维素酶应用于动物饲料的添加剂、纺织、造纸、医药保健、石油开采、新型能源、环保等领域都具有很大的潜力。
6展望
关键词：纤维素分解菌；发酵条件；纤维素酶；酶活力
中图分类号：TQ920．1 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2012）06－1232-02
Research on the Optimum Fermentation Conditions of High-Yield Cellulolytic
Enzymes Strain ZJW-6
TANG Rui
（Department of Biology and Chemistry， Xingtai University， Xingtai 054001， Hebei， China）
Abstract： The optimum fermentation conditions of high－yield cellulolytic enzymes strain ZJW－6 were studied in this paper． The strain was cultured under different liquid fermentation conditions and enzymes activity of bacteria suspension was determined using DNS method． The results showed that the optimum fermentation conditions of ZJW－6 was as follows： peptone and （NH4）2SO4 as nitrogen source， shaking for 48h at 30℃ and pH 6．
Key words： cellulose－decomposing microorganisms； fermentation conditions； cellulose； enzyme activity
纤维素酶是指能降解纤维素生成纤维素二糖和葡萄糖等小分子物质的一组酶的总称。随着人们对纤维素酶研究的深入，纤维素酶在食品、饲料、环境保护、能源和资源开发等各个领域中发挥着越来越大的作用，因而引起了全世界的关注，其研究也取得了很大进展。但是纤维素酶的生产仍然存在着酶活力低、生产周期长等问题，大大限制了其大规模工业化生产［1］。对高产纤维素酶菌株ZJW－6采用单因素试验法进行不同条件下的液体发酵培养，使用DNS法对发酵后的菌悬液进行酶活力测定从而获得最优发酵条件，旨在为其工业化发酵生产打下基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌种 菌种为邢台学院生物化学系微生物实验室筛选并保存的产纤维素酶菌株。
1．1．2 培养基 液体培养基：羧甲基纤维素钠10.0 g／L，蛋白胨10.0 g／L，磷酸二氢钾1.0 g／L，硫酸铵0．2 g／L，氯化钠10.0 g／L，去离子水1 000 mL，pH 7.0［2］。
1．2 方法
1．2．1 待测酶液的制备 将各种不同培养条件下的单因素限制性的液体发酵菌悬液倒入离心管中，3 000 r／min离心15 min，取上清液作为待测粗酶液。
1．2．2 纤维素酶活力的测定 参照文献［3］和文献［4］使用DNS法测定酶活力。将在40 ℃、pH 4．6条件下，1 min分解羧甲基纤维素钠产生相当于1 μg同葡萄糖的还原糖量所需的酶量，规定为一个酶活力单位。
1．2．3 发酵条件优化研究［5，6］ 分别取ZJW－6的菌悬液1 mL加入到含有等量培养基的试管中，在不同时间、不同培养方式、不同培养温度、不同初始pH的条件下培养，测其酶活力。
2 结果与分析
2．1 不同培养时间对纤维素酶活力的影响
菌株ZJW－6不同培养时间所产纤维素酶的活力见图1。从图1可以看出，在培养48 h以前酶活力显著提高，48~72 h酶活力显著下降，在培养72 h以后酶活力虽有上升，但增幅较小，可见培养48 h为其最适发酵培养时间。
2．2 不同培养方式对纤维素酶活力的影响
菌株ZJW－6不同培养方式所产纤维素酶的活力测定结果见表1。从表1可以看出，静置培养4 d酶活力为118 U／mL，振荡培养4 d酶活力达138 U／mL，明显高于静置培养。可见振荡条件下培养对菌株ZJW－6产纤维素酶有利。
2．3 不同培养温度对纤维素酶活力的影响
菌株ZJW－6不同培养温度所产纤维素酶的活力测定结果见图2。从图2可以看出，在26~28 ℃条件下培养，酶活力有所提高，当达到30 ℃时酶活力明显提高，到了32 ℃时酶活力又显著降低，可见菌株ZJW－6产酶的最适培养温度为30 ℃。
2．4 不同培养基初始pH对纤维素酶活力的影响
菌株ZJW－6在不同培养基初始pH条件下所产纤维素酶的活力测定结果见图3。从图3可以看出，在培养基初始pH由5变为6时酶活力显著提高，在培养基初始pH大于6以后酶活力又逐渐下降，表明培养基初始pH 6是其最适产酶pH。
3 小结与讨论
综合试验中最适培养基和最优发酵条件的结果，得出菌株ZJW－6产纤维素酶的最优发酵条件为在蛋白胨+（NH4）2SO4的氮源培养基上，30 ℃、培养基初始pH 6、振荡培养48 h。
试验充分说明了产纤维素酶菌株在不同的培养条件下产纤维素酶的能力明显不同，对其最优发酵条件进行研究很有必要。国内外对于产纤维素酶菌株发酵条件优化的研究比较少，迟乃玉等［7］对纤维素酶高产菌株97－B最优发酵条件进行了研究，陈亮等［8］对低温纤维素酶菌株CNY086进行了选育及发酵培养基的优化研究，徐长安等［4］筛选得到一株海洋芽孢杆菌B09并对其进行了发酵条件优化研究。因为产纤维素酶菌株的产酶能力受多种因素的影响，因此不同的菌株，不同的培养条件，不同的培养基配方都还有很大的研究空间，需要进一步研究。
参考文献：
［1］ 武秀琴．纤维素酶及其应用［J］．微生物学杂志，2009，29（2）：89－92．
［2］ 崔 琰，陈红谩，尚宏丽，等．中性纤维素酶产生菌的筛选及其培养基的优化和酶学性质研究［J］．浙江农业科学，2006（2）：214－217．
［3］ 杨 洁，阿力木，李福成．饲用纤维素酶活力测定方法的改进［J］．新疆大学学报（自然科学版），2005，22（3）：322－324．
［4］ 徐长安，罗秀针，张怡评，等．一株海洋芽孢杆菌B09的筛选及其发酵条件优化研究［J］．海洋通报，2009，28（5）：74－78．
［5］ 黎海彬，李 琳，黄日波，等． 纤维素酶产生菌的筛选及产酶条件［J］．华南理工大学学报（自然科学版），2003，31（3）：45－48．
［6］ 张洪斌，陈贤东，胡雪琴，等．一株里氏木霉产纤维素酶发酵条件的研究［J］．食品科学，2008，29（11）：375－378．
[关键词] 青蒿素；纤维素酶；提取
[中图分类号] R965.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）08（c）-0014-03
青蒿素（artemisinin，C15H22O5）是治疗疟疾的特效药，具有速效、高效和低毒等抗疟性能[1]。目前，青蒿素主要从黄花蒿（Artemisia annua L.）中提取[2]。近年来，用于天然产物提取的新技术如微波技术、酶技术等迅速涌现，并取得显著的成效[3]。酶技术具有反应效率高、条件温和、专一性强和有效成分破坏少等优点[4]，受到广泛关注。
我国是黄花蒿的主产国，将酶技术应用于青蒿素的提取过程，对提高提取效率、充分利用资源有重要意义。本研究对纤维素酶辅助提取青蒿素的条件进行研究，分析各因素对提取率的影响，并采用正交实验的方法对酶辅助提取工艺进行优化，为纤维素酶在青蒿素提取工艺中的应用提供参考。
1材料与方法
1.1 材料
青蒿药材购于广州市清平中药材市场（生产批号120711），经鉴定为菊科植物黄花蒿的干燥地上部分，药材经粉碎后过40目筛备用。纤维素酶Cellulase T4（来源于绿色木霉Trichoderma viride，生产批号20120922）购自天野酶制剂（上海）有限公司。青蒿素标准品（生产批号A2118）购自百灵威科技有限公司，无水乙醇、95%乙醇、氢氧化钠、乙酸、乙酸钠等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂公司。
1.2 仪器设备
FW135型中药粉碎机，SHA-2型恒温水浴振荡器，HH-4型恒温水浴锅，752型紫外可见分光光度计，SHZ-D型循环水真空泵。
1.3 方法
1.3.1纤维素酶辅助提取青蒿素的方法
称取1 g粉碎后的青蒿样品置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液，先常温下浸泡10 min，再加入一定量的纤维素酶，然后在一定温度下水浴振荡进行酶反应。酶反应结束后，抽滤，将滤饼置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml 无水乙醇，在45℃下水浴振荡1 h，抽滤，取滤液测定青蒿素含量。
1.3.2青蒿素含量的测定方法
青蒿素仅在紫外区203 nm处有较弱的末端吸收，但与碱反应后，生成一化合物Q292，该物质在292 nm处有最大吸收，可用紫外分光光度法检测[5]。取样品溶液0.5 ml加入95%乙醇4.5 ml，再加入0.2% NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加热30 min，取出快速冷却，在292 nm处测定吸光值，每组测定3个平行样品，取平均值。根据标准曲线换算出青蒿素含量。
2结果
2.1青蒿素含量测定的标准曲线
精确称取青蒿素标准样品10 mg，溶于95%的乙醇溶液，定容至100 ml容量瓶中，配制成0.1 g/L的标准溶液。分别取标准溶液0、1、2、3、4、5 ml，加95%的乙醇溶液至5 ml，再加入0.2%NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加热30 min，取出快速冷却，在292 nm处测定吸光值，每组取3个平行样品，取平均值。以青蒿素样品浓度x（g/L）为横坐标，292 nm吸光值y为纵坐标作图，结果见图1。在292 nm下，青蒿素浓度在0～1 g/L的范围内，与吸光值呈良好的线性关系，表明测定方法准确可靠。
2.2 不同酶反应时间对青蒿素提取的影响
按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纤维素酶，在45℃下水浴振荡反应，酶反应缓冲液pH值为4.5，反应时间分别为1、2、3、4、5 h，测定酶辅助提取后样品青蒿素含量。以不加入纤维素酶进行提取的样品中青蒿素含量为100%进行对照，结果见图2。随着时间的延长，青蒿素的提取率逐渐增加，在3 h左右达到最大值，再延长提取酶反应的时间，青蒿素的提取率基本不变。
2.3 不同加酶量对青蒿素提取的影响
按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中分别加入0.1、0.2、0.3、0.4g纤维素酶，在45℃下水浴振荡反应，酶反应缓冲液pH值为4.5，反应时间1 h，测定酶辅助提取后样品青蒿素含量。以不加入纤维素酶进行提取的样品中青蒿素含量为100%进行对照，结果见图3。随着酶添加量的增加，青蒿素的提取率逐渐增加，当加入0.3 g的纤维素酶时，达到最大值，再增加酶用量，青蒿素的提取率基本不变。
2.4 不同酶反应温度对青蒿素提取的影响
按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纤维素酶，分别在40、45、50、55℃下水浴振荡反应，酶反应缓冲液pH值为4.5，反应时间为1 h，测定酶辅助提取后样品青蒿素含量。以不加入纤维素酶进行提取的样品中青蒿素含量为100%进行对照，结果见图4。随着温度的增加，青蒿素的提取率呈现先增加后减小的趋势，在酶反应温度为45℃时达到最大值。
2.5不同酶反应pH值对青蒿素提取的影响
按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纤维素酶，在45℃下水浴振荡反应，酶反应缓冲液pH值分别为4.0、4.5、5.0和5.5，反应时间为1 h，测定酶辅助提取后样品青蒿素含量。以不加入纤维素酶进行提取的样品中青蒿素含量为100%进行对照，结果如图5。酶反应的pH值对青蒿素的提取率基本无影响，在pH值为4.5时，青蒿素提取率达到最大值。
2.6 纤维素酶辅助提取青蒿素工艺条件的优化
在纤维素酶辅助提取青蒿素的过程中，酶反应时间、酶的添加量和酶反应温度对青蒿素的提取影响较大，而酶反应过程中缓冲液的pH值对青蒿素的提取基本无影响。因此，选取酶反应时间、酶添加量和反应温度作为主要影响条件，利用试验设计软件Design expert 7.5作三因素两水平正交实验L4（23），正交实验水平见表1。
按照软件设计的正交实验表中各因素水平，开展实验，然后对试验结果进行分析。正交实验表和结果分析见表2。对实验结果进行极差分析表明：酶辅助提取反应各条件对提取率的影响试验中，酶反应时间（A）的最优值为水平1，酶添加量（B）的最优值为水平2，温度（C）的最优值为水平2，实验中各因素对辅助提取反应的影响顺序为：酶反应时间>酶添加量>温度。
利用Design expert7.5对实验结果进行方差分析，方差分析结果见表3。方差分析结果表明：在P
3讨论
黄花蒿为菊科艾属一年生草本植物，在我国各地均有分布[6]。青蒿素是从黄花蒿干燥地上部分分离提取得到的一种新型化合物，其具有含过氧基团的倍半萜内酯结构，与已知抗疟药物化学结构完全不同[7]，被世界卫生组织称为“唯一有效的疟疾治疗药物”。由于青蒿素的化学合成尚未显示出商业可行性，目前商用的青蒿素主要通过植物提取[8]。工业化提取青蒿素中应用范围最广的是有机溶剂提取法，但存在提取效率低、提取率不高、溶剂消耗大和安全隐患等问题[3]。
天然产物的有效成分主要存在细胞质中，细胞壁的阻碍影响了提取率。纤维素酶是最常见的破壁酶，它可作用于天然产物纤维素为主的细胞壁，破坏细胞壁的致密结构，增加细胞内活性成分的溶出量，提高提取率[9]。纤维素酶Cellulase T4来源于绿色木霉，本实验结果表明，纤维素酶能够有效降解青蒿植物的细胞壁，增加青蒿素的提取率。不同的纤维素酶有不同的最佳反应条件，常见的影响因素有温度、pH、酶的用量、激活剂和抑制剂等[10]。本文单因素及正交实验结果表明Cellulase T4水解青蒿植物细胞壁的最佳条件为酶反应时间为2 h，酶添加量为0.30 g，反应温度为45 ℃，酶反应pH值4.5。在最优条件下，纤维素酶辅助提取青蒿素较未使用酶辅助的提取方法，提取率提高了1.96倍。本实验为纤维素酶在青蒿素提取方面的应用提供了理论指导，为酶技术在中药制药方面的研究和应用开拓了更为广阔的空间。
[参考文献]
[1] 赵兵，王玉春，欧阳藩.青蒿素生物合成机理研究现状[J].广西植物，1999，19（2）：154-158.
[2] 钱国平.黄花蒿中提取与纯化青蒿素的研究[D].杭州：浙江大学，2007.
[3] 陈秋实，陈孟兰，范晶.青蒿素提取研究进展[J].武汉工程学院院报，2007，3（2）：120-125.
[4] 何玉娟.黄花蒿植物中青蒿素的提取分离过程研究[D].天津：天津大学，2004.
[5] 李春莉，王莎莉，王亚平，等.紫外分光光度法测定青蒿素的含量[J].重庆医科大学学报，2007，32（4）：413-415.
[6] 张小波，郭兰萍，黄璐琦.我国黄花蒿中青蒿素含量的气候适宜性等级划分[J].药学学报，2011，46（4）：472-478.
[7] 张凤杰，刘祝祥，陈功锡.青蒿药用成分提取方法及检测技术研究进展[J].吉首大学学报（自然科学版），2010，31（4）：103-107.
[8] 刘春朝，王玉春，欧阳藩，等.青蒿素研究进展[J].化学进展，1999，11（1）：41-48.
[9] 张巾英，张明春.应用纤维素酶提取中草药有效成分的研究进展[J].上海中医药杂志，2007，41（1）：79-81.
关键词 稻草秸秆；固态发酵；纤维素酶
中图分类号 TQ929 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2011）12-0049-03
纤维素是可再生能源物质，总产量占地球植物干重的1/3～1/2，植物纤维素因其含量丰富及巨大的潜在利用价值而被认为是一种极有开发前景的原料。因此，纤维素的分解利用对于解决未来的能源危机与环境问题具有十分重大的意义。利用纤维素酶将植物纤维原料水解是合理利用可再生资源的一条有效途径，其关键环节是纤维素酶的生产。纤维素酶在食品、饲料、农副产品加工、印染纺织、制浆造纸、石油开采和资源再生等方面具有广泛的用途和应用前景[1]。
高成本、低收益是限制纤维素酶在工业应用中的主要问题，研究人员在利用廉价的基质进行纤维素酶生产方面做了大量的研究工作，在把注意力放在选育高效降解纤维素的微生物的同时，也十分关注如何改善发酵的过程。固态发酵与液态发酵相比，具有设备投资少、生产成本低等特点。因此，固态发酵技术在纤维素酶生产方面已引起了广泛的重视[2]。该文对绿色木霉-M1固态发酵产纤维素酶的条件进行了优化，对绿色木霉-M1的产酶曲线进行了科学研究，以期为进一步利用廉价基质生产纤维素酶奠定坚实的基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 原料。氨化预处理稻草粉，麸皮（市售）。
1.1.2 菌种。绿色木霉-M1菌株（实验室保存）。
1.1.3 培养基。具体种类如下：①斜面培养基。即PDA培养基。液态种子培养基：马铃薯汁，2%葡萄糖，pH值自然，121 ℃灭菌20 min。②固态发酵产酶基础培养基。稻草粉7 g，麸皮3 g，（NH4）2SO4 0.2 g，水20 mL，pH值自然，121 ℃灭菌50 min。
1.1.4 试剂。盐酸、硫酸、氨水、氢氧化钠、3，5－二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、苯酚、硫酸铵、尿素、蛋白胨、硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、无水葡萄糖等试剂均为国产分析纯。
1.1.5 仪器与设备。电热鼓风干燥箱、电子天平、离心机、分光光度计、高压蒸汽灭菌锅、生化培养箱、恒温振荡器、水浴锅、超净工作台等。
1.2 试验方法
1.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制。准确称取100.0 mg分析纯无水葡萄糖（预先在105 ℃烘干至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100 mL容量瓶中，再定容至刻度，摇匀，浓度为1 mg/mL。取8支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL葡萄糖标准溶液，加入2.5 mL DNS试剂混合均匀，在沸水浴中加热5 min，取出后立即用流水冷却到室温，定容至25 mL，摇匀。于520 nm波长处测定OD值，以OD值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线，标准曲线方程为y=0.832 x+0.000 3，R2=0.999 5。葡萄糖标准曲线如图1所示。
1.2.2 DNS试剂配制。称取200 g酒石酸钾钠，溶于一定量水中，加热溶解，添加10.0 g 3，5-二硝基水杨酸、10.0 g氢氧化钠，溶解后加入2 g苯酚、0.5 g无水亚硫酸钠，全部加热溶解后，冷却至室温，定容至1 000 mL。用前一周配制。
1.2.3 固态发酵产酶培养方法。将绿色木霉-M1接种于PDA斜面活化，用接种环挑取一环接种于装有30 mL液态种子培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃ 150 r/min摇床培养72 h；然后接种于装有固态发酵产酶基础培养基的250 mL三角瓶中，混匀后于试验要求的条件下静置培养。
1.2.4 粗酶液的制备。称取1 g发酵后的鲜曲，加10 mL蒸馏水，搅拌，于40 ℃水浴中保温45 min，用脱脂棉过滤，3 000 r/min离心10 min，取上清液即为粗酶液。另取一定量发酵后的鲜曲，80 ℃烘干至恒重，测定水分含量。
1.2.5 FPA、CMC酶活力的测定[3-4]。酶活力单位规定：以每克干物质1 min水解生成1 mg葡萄糖的酶量为1个国际单位（IU，简写为U）[5]。
1.2.6 单因素试验。根据相关文献报道和前期试验，影响绿色木霉-M1固态发酵产纤维素酶的主要因素有稻草和麸皮比例、氮源浓度、料液比、培养温度等，分别对这些影响因素进行单因素试验。
1.2.7 正交试验。在单因素试验基础上进行正交试验，对绿色木霉-M1固态发酵产纤维素酶的条件进行优化，具体设计见表1。
2 结果与分析
2.1 稻草粉和麸皮比例对酶活的影响
改变固态发酵产酶基础培养基中稻草粉和麸皮的比例进行试验，接种10%的液态种子，混匀后于28 ℃静置培养4 d后测酶活，结果见图2。
可以看出，当固态发酵培养基中麸皮含量增大时，固态发酵后所得粗酶液的FPA和CMC酶活逐渐增大，当稻草粉和麸皮比例为7∶3时，FPA和CMC酶活均达到最大。随着麸皮含量继续增加，培养基蓬松程度降低，减少了通气量，影响产酶，FPA和CMC酶活呈下降趋势。
2.2 氮源浓度对酶活的影响
改变固态发酵产酶基础培养基中氮源的浓度，接种10%的液态种子，混匀后于28 ℃静置培养4 d后测酶活，结果如图3。
可以看出，随着氮源浓度的增大，发酵后所得粗酶液的酶活也逐渐增大，但当加入氮源的浓度超过2.0%时，所得粗酶液的酶活缓慢下降。氮源浓度过低，不能满足菌体生长，氮源浓度过大，对产酶有一定的抑制作用。
2.3 料液比对酶活的影响
改变固态发酵产酶基础培养基中的料液比，接种10%的液态种子，28 ℃静置培养4 d后测酶活，结果见图4。
可以看出，水分含量过低时，菌体生长得不到充足的水分，不利于菌体的生长，发酵后所得粗酶液的酶活较低；水分含量过高时，影响氧的传送，会抑制菌体生长，因而粗酶液的酶活也较低。当料液比为1∶2.5时，固态发酵所得粗酶液的酶活最大。
2.4 培养温度对酶活的影响
以固态发酵产酶基础培养基为产酶培养基，接种10%的液态种子，摇匀后分别置于24、26、28、30、32 ℃静置培养4 d后测酶活，结果见图5。
可以看出，温度过低不利于菌体的生长，温度过高也会限制菌体的生长。培养温度为28 ℃时，所得粗酶液的酶活最高。
2.5 正交试验结果
根据正交试验表的设计方案，改变固态发酵产酶基础培养基的组成和培养条件，接种10%的液态种子，摇匀后静置培养4 d测酶活，结果见表2。
由表2可知，绿色木霉-M1固态发酵产FPA酶的较优条件为D2A2B3C3，即培养温度28 ℃，稻草和麸皮比例为7∶3，氮源浓度为2.5%，料液比为1∶3；绿色木霉-M1固态发酵产CMC酶的较优条件为D2C2B1A1，即培养温度28℃，料液比为1∶2.5，氮源浓度1.5%，稻草和麸皮比例为8∶2。综合考虑FPA和CMC酶活2个指标，绿色木霉-M1固态发酵产纤维素酶的较优条件为D2C2B1A2，即培养温度28℃，料液比为1∶2.5，氮源浓度1.5%，稻草和麸皮比例为7∶3。
2.6 培养时间与酶活的关系
根据正交试验结果，对于固态发酵产酶基础培养基，设定如下条件培养：温度28 ℃，料液比为1∶2.5，氮源浓度1.5%，稻草和麸皮比例为7∶3，液态种子接种量为10%的液态种子，pH值自然。从培养0 h开始，每隔12 h测定FPA和CMC酶活，培养时间与酶活的关系见图6。
由于麸皮中含有多种维生素和微生物所必须的生长因子，在发酵开始的0～60 h，绿色木霉-M1利用麸皮产生纤维素酶，60 h后麸皮中的营养物质几乎被消耗殆尽，绿色木霉-M1开始利用稻草粉产生纤维素酶，由于从利用麸皮到利用稻草粉之间需要适应的过程，因而在60～72 h内纤维素酶的活力下降，绿色木霉-M1适应在稻草粉上生长后，纤维素酶的活力又开始上升，在108 h时酶活力达到最大值。随着生长时间的延长，一方面，酶解产物对纤维素酶产生了抑制作用；另一方面，由于菌体逐渐衰老，导致酶活力开始下降。
3 结论
对绿色木霉-M1固态发酵产纤维素酶的条件进行了研究，结果表明：绿色木霉-M1固态发酵产纤维素酶的较优条件为培养温度28 ℃，料液比1∶2.5，氮源浓度1.5%，稻草和麸皮比例为7∶3。绿色木霉-M1在固态发酵产纤维素酶的0～60 h，利用麸皮产生纤维素酶，60 h后麸皮中的营养物质被利用完，开始利用稻草粉产生纤维素酶，在60～72 h内纤维素酶酶活下降，72 h后，纤维素酶酶活又开始上升，在108 h酶活力最高。纤维素是地球上数量最大的可再生资源，其生物转化与利用对解决当前世界面临的能源危机、粮食短缺和环境污染等问题具有非常重要的意义，随着研究工作的不断深入开展，纤维素酶的应用领域将越来越广。
4 参考文献
[1] KANG S W，PARK Y S，LEE J S，et al.Production of cellulases and hemicellulases by Aspergillus niger KK2 from lignocellulosic biomass[J]. Bioresource Technology，2004，91（2）：153-156.
[2] CHAHAL P S，CHAHAL D S，LEG B B.Production of cellulose in solid-state fermentation with Trichoderma reesei MCG 80 on wheat straw[J].Applied biochemistry and biotechnology，1996：57-58，433-442.
[3] HARDIN M T，MITCHELL D A，HOWES T.Approach to designing rota-ting drum bioreactors for solid-state fermentation on the basis of dimens-ionless design factors[J].Biotechnology and Bioengineering，2000，67（3）：274-282.
【关键词】 黄柏 小檗碱 纤维素酶 超声波
Extraction Study of Berberine from Cortex Phellodendri by Ultrasonic Wave- Cellulase
XU Yan，LIU Shaoxia，SUN Juan
School of Bioscience and Technology，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161， China
Abstract：ObjectiveTo study the application effect on extraction of berberine from Cortex phellodendri by ultrasonic wave- cellulase.MethodsBased on the single factors test and orthogonal test the effect of different factors on extraction of berberine from Cortex phellodendri by ultrasonic wave-cellulase was studied，and extracting conditions was optimized.ResultsThe best extraction condition was that time was 2.5 h， the power of ultrasonic wave was 80 ℃ ， the volume of cellulase was 25 ml， temperature was 60 ℃.ConclusionThe berberine of Cortex Phellodendri is extracted by Ultrasonic wave-Cellulase ，which can save time and enhance extract-efficiency， save organic solvent and reduce the use of energy .
Key words：Cortex Phellodendri; Berberine; Cellulase; Ultrasonic wave
黄柏是芸香科植物黄皮树或黄檗的干燥树皮，黄柏具有抗病原微生物、抗溃疡、降压、抗心律失常等药理作用。临床常用于治疗中耳炎、皮肤感染、烧伤、慢性前列腺炎、急性细菌性痢疾、急性胃肠炎等病症［1］。经实验证明小檗碱是其主要成分之一。本实验主要利用正交设计研究纤维素酶、超声波对黄柏中小檗碱提取量的影响。
1 材料与仪器
1.1 材料
黄柏购自沈阳东北大药房，纤维素酶由沈阳农业大学生物工程实验室自制。所用试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器
722-型光栅分光光度计（山东高密彩虹分析仪器有限公司），KQ3200DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) 。
2 方法与结果
2.1 纤维素酶活力的测定
2.1.1 酶液配制准确称取500 mg纤维素酶，溶解后定容至100 ml容量瓶中，此酶液浓度为5 mg/ml。
2.1.2 葡萄糖标准溶液的配制准确称取100 mg分析纯无水葡萄糖，用蒸馏水溶解后，转移至100 ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀。
2.1.3 葡萄糖标准曲线的制作取8支20 ml刻度试管标号后按表1加入各试剂。表1 葡萄糖标准曲线的制作（略）
将上述溶液混匀后，在沸水浴中煮沸5 min，冷却后定容至20 ml，摇匀。将分光光度计调零，在540 nm下测其A值。以每个试管中葡萄糖毫克数为横坐标，以对应的A值为纵坐标，绘制标准曲线。
2.1.4 样品测定取4支20 ml刻度试管，分别依次加入0.5 ml 0.05M柠檬酸缓冲液（pH 4.5），向各试管中加入0.5 ml酶液，在其中一支试管内立即加入1.5 ml 3，5二硝基水杨酸终止酶作用，作为空白与另3支试管一起在50 ℃水浴锅中保温1 h。取出后在后3支试管中加入3，5二硝基水杨酸，然后一起在沸水中煮沸5 min，冷却后定容至20 ml。以空白液调零。在540 nm下比色，由标准曲线查出所测A值对应的葡萄糖生成量。以上述条件，每小时由底物产生1 μmol葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活单位。
2.1.5 滤纸酶活力计算滤纸酶活力（U/g） 依据公式：滤纸酶活力（U/g）=葡萄糖生成量（mg）×酶液定容总体积×5.56/［反应液中酶液加入量（ml）×样品重（g）×时间（h）］，1 mg葡萄糖换算成μmol：1 000 μg/180 μg=5.56 μmol，经实验测得，纤维素酶作用后，3个试管的A值为0.013，0.011，0.012。取其平均值为0.012，通过葡萄糖标准曲线查得葡萄糖生成量为0.123 mg带入公式得： 滤纸酶活力=547.104 U/g
2.2 小檗碱的提取及标准曲线的绘制
2.2.1 粗提将黄柏5 g碎成粉状，置烧杯中，加入1/10量的生石灰细粉，加水溶胀30 min后，再加入30倍量水浸泡24 h后纱布过滤，再用10 %的盐酸将滤液pH值调至2～3，然后加入滤液体积10 %的NaCl，放置过夜后抽滤，得到盐酸小檗碱的粗提物，此时还含有杂质。将盐酸小檗碱的粗提物用热水溶解并趁热抽滤，滤液冷却静止1 h抽滤得到盐酸小檗碱与掌叶防己碱等的混合物，至此黄柏的粗提完毕［2］。
2.2.2 盐酸小檗碱标准曲线的绘制精密称取盐酸小檗碱纯品10 mg，置50 ml容量瓶中，加95 %的乙醇溶解并定容至刻度，作为盐酸小檗碱标准溶液。精密称取此液0.2，0.4，0.8，1.6，2.0 ml于50 ml容量瓶中，继续加95 %乙醇至刻度并在348 nm下测定吸光度值，
y=0.805 5x-0.009 7。
2.3 纤维素酶-超声波对盐酸小檗碱提取率的影响取两组黄柏各5 g，粉碎。在一组样品中加入150 ml石灰水，在另一组中加入130 ml石灰水和20 ml浓度为5 mg/ml的酶液。第一组样品浸泡24 h后双层纱布过滤，第二组样品在60 ℃，功率为60 %的超声波清洗器里超声清洗90 min后双层纱布过滤，两组滤液用10 %的盐酸调pH 2～3，最后加入滤液体积10%的NaCl，放置过夜，抽滤，得两组盐酸小檗碱样品。用乙醇溶解并分别定容至50 ml，在348 nm下分别测其吸光度值，并在盐酸小檗碱标准曲线上查出各自的盐酸小檗碱。
2.4 提取条件的单因素考察
2.4.1 水浴温度对提取效果的影响
称取干燥的黄柏粗粉5 g左右，分别于 20，40，60，80，100 ℃时加入20 ml酶液，作用1.5 h，结果在60℃时提取量比较高。
2.4.2 水浴时间的确定
称取干燥的黄柏粗粉5 g左右，于 60 ℃时加入20 ml酶液，分别作用0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，结果水浴1.5 h时提取量比较高。表2 纤维素酶-超声波对盐酸小檗碱提取率的影响（略）
2.4.3 加酶量的确定称取干燥的黄柏粗粉5 g左右，于 60℃时加入酶液10，15，20，25，30 ml，分别作用1.5 h，结果加酶量为25 ml时提取量比较高。
2.4.4 超声功率的确定称取干燥的黄柏粗粉5 g左右，于 60℃时加入酶液20 ml，超声时间1.5 h，超升功率分别为40 %，50%，60 %，70 %，80 %，结果超声功率范围为60 %时，提取量比较高。
2.5 正交实验设计根据黄柏中盐酸小檗碱的提取条件，选定加酶量、温度、时间、超声功率4个因素，以L9（34）正交实验设计系统进行实验。因素水平见表3，正交表见表4。表3 因素及水平（略）表4 正交实验（略）
以上分析可以得出结论:各因素对实验指标(含量)的影响按大小次序来说应当是C(水浴时间)、D(超声功率)、A(加酶量)、B(水浴温度)，最好的实验方案应当是C3A2D3B2，即水浴时间2.5 h， 超声功率 80 %， 加酶 25 ml， 水浴温度 60℃。
2.6 利用薄层色谱法检测纤维素酶、超声波对盐酸小檗碱成分的影响制备硅胶薄层板一块，取盐酸小檗碱标准样品、未用纤维素酶提取的盐酸小檗碱样品、用纤维素酶提取的盐酸小檗碱样品和用纤维素酶-超声波提取的盐酸小檗碱样品各0.5μl，点样。按CHCl3∶MeOH∶冰HAC=7∶1∶2的比例配制展开剂，将点样后的薄层板放入层析缸中，待展开至规定距离时取出晾干。在可见与紫外灯下观察，未用纤维素酶提取的盐酸小檗碱样品、用纤维素酶提取的盐酸小檗碱样品和用纤维素酶-超声波提取的盐酸小檗碱样品薄层色谱图相同。说明，用纤维素酶提取的盐酸小檗碱的成分无变化。
3 讨论
3.1 为什么纤维素酶不会影响盐酸小檗碱的成分纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称。纤维素酶只是破坏黄柏细胞的细胞壁，其细胞内部物质并不含有纤维素类物质，因此纤维素酶对其内容物的成分没有任何影响。所以，提取出来的盐酸小檗碱的成分并不会变化。
3.2 为什么超声提取会使黄柏中小檗碱的提取量增加且不影响其成分超声提取法是基于超声波的空化作用来加速物质分子运动的频率和速度、增加溶剂穿透能力，以提高药物溶出速度和溶出次数，从而有利于植物有效成分的浸出提取，而它的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，有利于中药中绝大部分有效成分的提取。超声提取还避免了高温加热对有效成分的破坏。
【参考文献】
关键词：姜黄色素；酶辅助水提法；酶解温度
中图分类号 S632.5 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）24-99-02
姜黄（Curcuma）属姜科植物，又名色姜黄、子姜黄、宝鼎香，其味辛苦而性寒，入肝、胆、脾、胃经。其盛产于我国南方，主要作为中药材使用或作为天然色素原料出口。姜黄作为药食两用材料，还具有通经行气、活血降压、驱寒消炎等效能[1]。
从植物姜黄的根茎中提取的姜黄色素，是一种食用天然黄色素。姜黄色素具有良好的染着性和分散性，其染色力大于其作用，是国内外允许使用的重要的天然食用色素之一[2]，并具有热稳定性好、着色力强、色泽鲜艳等特点，在食品行业中被广泛用作天然着色剂[3]，目前已被广泛应用于饮料、果酒、糖果、糕点、罐头、果汁及烹饪菜肴中。
本文通过对酶量及酶解温度的优化，确定水酶法从姜黄中提取姜黄色素的工艺参数。
1 材料与方法
1.1 试验材料 姜黄：购于临安康锐大药房；盐酸、氢氧化钠：均为分析纯；蒸馏水：自制；纤维素酶（80 000U）：为张家港金源牌产品；果胶酶（30 000U）：为无锡市雪梅酶制剂科技有限公司生产。
1.2 试验研究基本内容 （1）单一酶用量的确定；（2）酶复合用量配比的确定；（3）酶解温度的确定。
2 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 最适果胶酶用量的确定 由图1可以看出：当果胶酶量小于4%时，随着果胶酶量的增加，吸光度值变化较大；当果胶酶量超过4%后，吸光度值变化较小。在酶促反应中，酶浓度越高水解越完全，但浓度过高吸光值增加反而不明显。综合考虑酶制剂成本，所以选择4%的果胶酶加量。
2.1.2 最适纤维素酶用量的确定 由图2可以看出：当纤维素酶量小于0.4%时，随着纤维素酶量的增加，吸光度值变化较大；当纤维素酶量超过0.4%后，吸光度值变化较小。在酶促反应中，酶浓度越高姜黄水解越完全，但浓度过高吸光值增加反而不明显，综合考虑酶制剂成本，所以选择0.4%的纤维素酶加量。
图1 果胶酶用量对吸光值的影响
图2 纤维素酶用量对吸光值的影响
2.1.3 最适复合酶量的确定 由图3可以看出：当复合酶量小于3% 时，随着复合酶量的增加，吸光度值变化较大；当复合酶量超过3%后，吸光度值曲线逐渐趋于水平。在酶促反应中，酶浓度越高反应速度越快，但过高速度增加反而不明显。综合考虑酶制剂成本，所以选择3%的复合酶量。
图3 复合酶用量对吸光值的影响
2.1.4 最适酶解温度的确定 由图4可以看出：（下转108页）（上接99页）在反应的初始阶段，随着温度的升高吸光值在增大，但超过50℃后，吸光值反而下降。低于50℃酶活不能充分发挥，酶反应速度过低导致色素不能充分溶出。在此温度范围内，温度升高可提高反应速度。超过此温度酶逐渐失活，减少了参与反应的分子数，反应速度逐渐降低。由此酶解的最佳温度为50℃。
图4 酶解温度对吸光值的影响
3 结论
本试验采用酶辅助水提法提取姜黄色素的最佳工艺参数是：纤维素酶用量为0.4%，果胶酶用量为4%，复合酶用量为3%，酶解温度为50℃。
参考文献
[1]杨云，冯卫生.中药化学成分提取分离手册[M].北京：中国中医药出版社，1998.
[2]杨军君，李湘洲，旷春桃，等.超声-微波协同提取姜黄色素的研究[J].中国调品，2009，（5）：114.
【摘要】 目的：确定杜仲中多糖的酶法提取工艺。方法：用正交试验的方法分别研究果胶酶、中性蛋白酶和纤维素酶对杜仲多糖提取率的影响。结果：果胶酶增加多糖提取率效果最为显著，其最佳提取条件是：酶加量0.10mg/L，酶处理温度50℃，酶处理时间3h。其次是中性蛋白酶，纤维素酶的效果最差。结论：果胶酶可明显增加杜仲多糖的提取率。
【关键词】 杜仲；杜仲多糖；聚半乳糖醛酸酶；纤维素酶；正交试验
【ABSTRACT】 Objective:To study the effect of extraction rate from Eucommia ulmoides oliv polysaccharide by enzyme.Methods:It was investigated by orthogonal experiment design L9(34) on the influence of the extraction rate of Eucommia ulmoides oliv polysaccharide、neutral protein enzyme and cellulose enzyme.Results:The effectiveness of enzyme was the best.The optimal condition of extraction was when enzyme was as much as 10%，and 50℃ heat preservation up to 1h.The second was neutral protein enzyme，The cellulose enzyme was the last.Conclusion:The enzyme can increase the extraction rate of Eucommia ulmoides oliv polysaccharide.
【KEY WORDS】 Eucommia Ulmoides Oliv，EUCOMMAN，Polygalacturonase，Cellulase，Orthogonal Test
杜仲（Eucommia ulmoides oliv）是我国名贵的滋补药材，具有降血压、降血脂、降血糖、抗菌消炎、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗肿瘤等作用；含有苯丙素类、环烯醚萜类、黄酮类、多糖类等多种物质，杜仲多糖是一类天然的免疫增强剂，通过提高机体免疫力起到抗癌、抗肿瘤作用[1]。目前提取杜仲多糖主要是用水提醇沉法[2]和酸碱提取法，用水提取法时，多糖的得率较低，后处理过程较为繁琐，而酸碱提取法又容易使多糖水解，破坏其活性结构，有关酶法提取杜仲多糖的研究报道少见。本文参照有关文献[3，4]，探讨了果胶酶、中性蛋白酶和纤维素酶提取杜仲多糖的最佳条件，为杜仲的进一步开发提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器 UV754紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；XJ80离心机（江苏医疗器械厂）；RE52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。
1.1.2 试剂 杜仲购于本院中医门诊部（于硅胶干燥器中干燥两天后备用）；果胶酶、中性蛋白酶、纤维素酶（Fluka公司产品）；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 多糖的提取方法 选取酶加量、酶处理温度和酶处理时间三个因素。采用L9(34)正交设计表，以多糖的提取率为指标，作正交试验。正交试验因素水平见表1。表1 L9(34)正交试验因素水平表
因素水平酶加量
（mg/L）酶处理温度（℃）果胶酶中性蛋白酶纤维素酶酶处理时间
（h）10.03455535120.07506040230.105565453
称取杜仲0.5g于烧杯中，加入50倍量水，沸水浸提2h，离心取上清液，浓缩，定容后测定多糖含量，以该提取率为100%作对照，另称取杜仲0.5g于烧杯中，加入10倍量水，按正交试验设计，加入酶。酶解后，再加入20倍水，沸水浸提2h，离心取上清液，定容后测定多糖含量，每个提取平行做3次。
1.2.2 多糖测定方法 采用苯酚—硫酸法测定总糖含量，采用3，5二硝基水杨酸法测定还原性糖含量。总糖含量减去还原糖含量即为多糖含量。
2009年6月刘晓河等：酶法提取杜仲多糖的工艺研究第3期2009年6月河北北方学院学报（医学版）第3期表2 果胶酶提取杜仲多糖的正交试验结果分析表3 中性蛋白酶提取杜仲多糖的正交试验结果分析
2 结果
按1.2.1多糖的提取方法进行提取，再按1.2.2多糖的测定方法测定多糖含量。以不加酶时多糖的提取率为100%作对照。加入酶后增加的多糖提取率见表2、表3和表4。表4 纤维素酶提取杜仲多糖的正交试验结果分析
酶法提取杜仲多糖的试验结果表明，果胶酶增加多糖提取率的效果最明显，最高处理组比对照组高4.1倍(见表2第8组），纤维素酶效果最差。三种酶提取杜仲多糖的关键因子与最佳提取条件见表5。表5 三种酶提取杜仲多糖的关键因子与最佳提取条件
3 讨论
酶法可明显增加杜仲多糖的提取率，这可能是因为杜仲中除了含有多糖外，还含有纤维素、杜仲胶、蛋白质等物质。这些物质酶解后，有利于多糖类物质的释放，其中果胶酶增加杜仲多糖提取率的效果最为显著，而纤维素酶的效果最差。这主要是因为纤维素酶虽然提高了总糖的提取率，同时，使杜仲中的纤维素水解，更增加了还原糖的浸提率，导致多糖的提取率下降。
参考文献
1 管淑玉，苏薇薇．杜仲化学成分与药理研究进展[J]．中药材，2003，26（2）：124129
2 刘军海，任惠兰，段玉兰，等．杜仲叶多糖提取工艺研究[J]．食品科学，2007，28（7）：264267
关键词 烟草；烟杆；纤维素酶；协同降解作用
中图分类号 Q93 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）11-0225-03
Abstract In order to reuse the waste tobacco stalk，several microbial strains can use waste tobacco rod high-temperature aerobic composting were screened，preliminary detection of several decomposed strains was conducted，and the further testing for strains synergistic effect of the combination and proportion was carried out.The results showed that three groups of degradation of tobacco stalk cellulose strains can grow in the culture medium which with tobacco stems as the sole source of nutrition，and has strong cellulose degradation ability，number of strains were H2568，B1，M1.Synergistic test indicated when biomass ratios of H2568，B1，M1 with 1.0∶1.0∶1.5，combination with the strongest degradation of the cigarette rod ability，the degradation rate of cellulose，hemicellulose degradation rate，lignin degradation rate reached 56%，70%，33%，the highest fiber prime enzyme activity reached 625.44 U/mL.
Key words tobacco；tobacco stalk；cellulase；synergistic degradation
烟草不仅是一种极具经济价值的作物，而且也是具有科研价值的一年生模式植物[1]。我国的烟草种植量和生产量稳居世界首位，在烟草采收和运输的过程中，大量的烟杆会被放弃或焚烧，即污染环境又造成资源浪费[2-3]。如何再充分利用这些废弃烟杆，成为目前迫切需要研究解决的课题。杨政明[4]、詹其厚[5]、张从军[6]等利用烟杆中含有大量的氮、磷、钾及微量元素的特性，利用废弃烟草生产有机复合肥分别在核桃、夏玉米、水稻上施用取得了较好的肥效，并使农作物产量显著增加。但是又因烟杆中含有77.4%纤维素和半纤维素、18.63%木质素[7]，显著高于禾本科作物秸秆中木质素含量，因此其难以被充分利用[8]。张楠[8]、周熠[9]对烟杆中纤维素进行了降解并取得了不错的效果，但纤维素的降解率不到40%，理论上还有一定的提升空间。因此，本研究通过组合高效的好氧纤维素、半纤维素、木质素降解组合菌群，考察其对烟杆的降解效果并优化其组合比例，以便开发能够利用废弃烟杆制作高温好氧堆肥的高效微生物菌剂[10]。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本试验所有烟杆由中南烟草试验站提供。培养基：细菌培养基为0.5% NaCl，0.5%牛肉膏，1%蛋白胨，蒸馏水100 mL，pH=7；真菌培养基为综合PDA琼脂培养基（20%马铃薯提取液，2%葡萄糖，0.3% KH2PO4，0.15% MgSO4・7H2O，0.02%维生素B1，蒸馏水100 mL，pH=7）。烟杆选择培养基为10%烟杆，蒸馏水100 mL，琼脂粉2.0%，调pH值至7。烟杆液体发酵培养基为10%烟杆，蒸馏水100 mL，调pH值至7。
1.2 试验方法
1.2.1 菌种初步筛选。从土壤、腐熟的烟杆、刚屠宰的牛的胃部以及实验室现有的纤维素降解菌中筛选能降解烟杆的菌种。将各菌株分别接种1环到2种种子液培养基扩大培养，培养温度分别为25、37 ℃，摇床转速为180 r/min，发酵24 h后，各取种子液0.1 mL涂布在烟杆选择培养基上，分别在25、37 ℃培养，3 d后观察菌种生长情况。选择能在烟杆选择培养基上生长的菌种进行下一步烟杆液体发酵试验。
1.2.2 不同菌株烟杆液体发酵试验。将各菌株种子液以10%的接种量接种到烟杆液体发酵培养基培养，发酵10 d后以4 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL适量稀释，用DNS法测定还原糖，选取还原糖含量较高的菌株进行下一步试验。
1.2.3 各菌拮抗性试验。将活力较高的菌株进行两两拮抗性试验，利用抑菌圈法在蛋白胨、牛肉膏培养基（37 ℃）和PDA培养基（25 ℃）上培养24 h后，观察菌株相互拮抗的情况。
1.2.4 不同组合菌烟杆液态发酵试验。将无明显拮抗性作用的菌株做三菌种组合和四菌种组合发酵试验，把混合种子液于37 ℃、180 r/min扩大培养24 h，按接种量10%的烟杆液体发酵15 d，测定发酵液中纤维素、半纤维素、木质素降解率，选出降解效率较高的4组菌种进行下一步试验。
1.2.5 组合菌酶活力与发酵时间的关系。将选取的最佳组合菌在37 ℃、180 r/min条件下进行烟杆液体发酵15 d，间隔测定发酵过程中的纤维素酶活力。
1.2.6 组合菌酶活力与发酵温度的关系。将选取的最佳组合菌分别在40、50、60 ℃及其他条件不变的条件下发酵11 d，测定纤维素酶活力，判断所选组合菌是否具有耐高温性。
1.3 分析方法
1.3.1 纤维素、半纤维素、木质素定量分析方法。通过测定还原糖的增加量可以初步挑选出更能高效降解烟杆的菌种，但是为了更详细地了解烟杆中主要成分的降解情况[11]，下一步试验以纤维素、半纤维素、木质素的降解率为主要试验指标[12]。图1为纤维素、半纤维素、木质素定量分析方法。
1.3.2 纤维素酶活性测定方法。取10 mL发酵液用离心机4 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL稀释25倍制成待测酶液。取4支25 mL刻度具塞试管（2支平行管、1支空白管）。分别向所有管中加入CMC-Na溶液2.00 mL，再加入稀释好的待测酶液0.50 mL（空白管不加），用漩涡混匀器混匀，盖塞。（50.0+0.1）℃水浴30 min后，加入DNS试剂3.0 mL，于空白管中加入待测酶液0.50 mL，摇匀。沸水浴10 min后，迅速冷却至室温，用水定容至25 mL，以空白管调仪器零点，在分光光度计波长540 nm下，用10 mm比色杯分别测量样品管中样液的吸光度，取平均值。通过用线性回归方程求出纤维素酶活[13]。
2 结果与分析
2.1 烟杆化学组成分析
首先对提供的样品进行了部分化学组成的检测，尤其是对于纤维素类的物质成分进行了定量分析。在提供的烟杆样品中，总纤维素含量达到77.44%，木素含量大约为18.63%，果胶含量为3.89%，苯-醇溶出物含量为3.21%，另外还有5%左右的灰分。可见，烟杆中含有丰富的纤维素类物质资源，如果能够对这些纤维素降解后加以利用，完全可以提高烟杆废弃物的利用价值。
2.2 纤维素菌的筛选
在筛选出来的微生物中有11组菌种能利用烟杆生长，将其分别编号为H2568、H1249、H1348、H1764、H4479、B1、M1、N1、Y1、Y2、Y3。进行下一步烟杆液体发酵试验以确定所需纤维素菌。
2.3 纤维素菌的确定
初步筛选的11组菌株在降解烟杆多糖生成还原糖的能力上差异较为显著。从图2可以看出，这些微生物生成还原糖的量从高到低的顺序依次为B1、M1、H2568、N1、H1249、H1348、Y3、H1764、H4479、Y2、Y1。选取其中降解能力最强的5株菌H1249、H2568、B1、M1、N1，作为下一步菌种协同降解作用的基础进行拮抗试验。
2.4 不同菌种拮抗结果
有很多试验研究表明，复合菌群较单一菌的降解能力强，特别是针对纤维素、木质素等需多种酶协同降解的物质，不同菌种组合起来可以起到补充和加强分解的作用。但在同一生长环境下，不同菌株之间产生拮抗性作用会抑制其自身生长和产酶活力。利用菌株之间不相容性，进行拮抗性试验，从表1可以看出：H1249与B1拮抗，选取相对降解能力更强的B1。得到所需的4株无明显拮抗性的菌株H2568、B1、M1、N1，可用于下一步菌种组合研究。
2.5 半纤维素、木质素和纤维素的降解情况
在多菌株协同降解试验中发现H2568、B1和M1这3种菌种以等量进行组合时能够取得较好的降解效果（图3），纤维素、半纤维素、木质素的降解率分别达到了47%、63%、26%。因此，对烟杆纤维素降解效果最为理想的协同菌群组合确定为H2568+B1+M1。
2.6 组合菌酶活力与发酵时间的关系
将上述试验中确定的最佳组合菌H2568-B1-M1烟杆液体发酵15 d[14]，观察其发酵过程中酶活力的变化情况（图4），发酵第11天时，发酵体系中纤维素酶的活力最高，达到625.44 U/mL，随后酶活力开始逐步降低。
2.7 组合菌酶活力与发酵温度的关系
高温对菌株的生长与产酶不利，但由于现阶段烟杆大多处理方式为堆肥，那么固态发酵所需升温过程不能避免，因此需要筛选出的组合菌能够耐高温来适应固态堆肥。从图5可以看出，在发酵11 d后，H2568-B1-M1的纤维素酶活不可避免的受到高温影响，但是即使在60 ℃下仍能达到250.47 U/mL。组合菌耐高温试验证明了H2568-B1-M1能长期保持较高的纤维素酶活力且耐高温。
2.8 菌量比例对协同降解作用的影响
确定H2568、B1与M1为最佳的菌种组合后，对其接种时的比例进行优化试验。从图6可以看出，H2568、B1与M1以1.0∶1.0∶1.5的比例组成烟杆发酵种子液时，取得了最佳效果。其纤维素降解率、半纤维素降解率、木质素降解率分别达到56%、70%、33%，较1.0∶1.0∶1.0配比时的降解能力显著提升。
3 结论与讨论
烟叶产量的增加同时产生了大量的废弃烟杆。由于烟杆不易腐烂也不能直接用于肥田，因而绝大部分都是作为废弃物被丢弃或焚烧，这不仅不同程度地污染了当地的生活生产环境，也造成了资源的浪费。经试验证明通过微生物发酵将烟杆中的大分子物质降解，将纤维素、半纤维素、木质素降解为小分子的单糖，使卷烟制造产生的废弃物转化为农业生产中急需的有机肥，具备广阔的生产应用前景。而烟杆中有机质的降解依赖于微生物是否产生多种酶系和产各种酶系活力的强弱。基于纤维素酶的复杂性，大量试验证明，复合菌液体发酵产纤维素酶活力高于单菌株，在同一生长环境下，相互依赖，共同生长，达到良好的协调作用。因此，筛选出无明显拮抗、耐高温、长时间具备高酶活且能高效降解烟杆的组合菌是试验的基础。在自然环境中常见的纤维素分解细菌大多为食纤维菌属、生孢食纤维菌属、多囊菌属、镰状纤维菌属与纤维弧菌属。具有很强的纤维素分解能力的真菌主要有木霉、镰刀霉、青霉、曲霉、毛霉、葡萄孢霉等属的菌种。本试验前期筛选了多种能降解纤维素的细菌、真菌用于进一步测试它们对烟杆的降解能力。因此，确定最佳的降解烟杆组合菌是为下一步研究提供了根本的基础。本试验中纤维素酶活力和还原糖的生成量能说明菌种自身降解能力的强弱，从另一角度总纤维素、半纤维素、木质素的变化情况反映了组合菌的降解效率。H2568-B1-M1以1.0∶1.0∶1.5的比例进行烟杆液体发酵，11 d后其纤维素降解率、半纤维素降解率、木质素降解率分别达到56%、70%、33%，说明经H2568-B1-M1产生多种酶系，促进了有机质的降解，对烟杆的降解取得了较显著效果，进一步提高纤维素酶活力，增加还原糖的生成量，提高纤维素、半纤维素、木质素的降解率，为进一步进行烟杆固体发酵奠定基础。
4 参考文献
[1] 刘国顺.烟草栽培学[M].北京：中国农业出版社，2003：67.
[2] 董二慧，谭红，包娜，等.我国烟叶中烟碱的研究现状[J].广州化工，2012，40（15）：33-35.
[3] 张承龙.烟杆的资源化利用技术现状[J].云南环境科学，2002，21（3）：56-57.
[4] 杨政明，尚海丽.烟草废弃物生产新型生物有机肥、有机无机复混肥对核桃生长的影响[J].云南农业科技，2012（6）：4-6.
[5] 詹其厚，马友华，汪建飞，等.烟草废弃物有机复混肥在夏玉米上的施用效果研究[J].安徽农学通报，2012，18（12）：109.
[6] 张从军，王德生，邹长明.烟草有机复混肥在水稻上的施用效果[J].安徽农学通报，2012，18（15）：83-84.
[7] VARGAS-GARCIA M C，SUAREZ-ESTRELLA F，LOPEZ M J，et al.Effect of inoculation in composting processes：Modifications in lignocellulosic fraction[J].Waste Management，2007，27：1099-1108.
[8] 张楠，刘东阳，杨兴明，等.2010.分解纤维素的高温真菌筛选及其对烟杆的降解效果[J].环境科学学报，2010，30（3）：549-555.
[9] 周熠，冯波，林元山，等.烟杆鸡粪堆肥发酵生物菌肥工艺研究[J].现代农业科技，2014，18（3）：208.
[10] 迟建国.白腐菌对烟叶木质素含量的影响[J].贵州农业科学，2013（7）：138-139.
[11] 范鹏程，田静，黄静美，等.花生壳中纤维素和木质素含量的测定方法[J].重庆科技学院学报（自然科学版），2008（5）：64-65.
[12] 王玉万，徐文玉.木质纤维素固体基质发酵物中半纤维素、纤维素和木素的定量分析程序[J].微生物学通报，1987（2）：81-84.
关键词：艾比湖；纤维素降解菌；酶活；Bacillus aquimaris菌株
中图分类号：S182
文献标识码：A 文章编号：16749944（2017）10011304
1 引言
新疆艾比湖湿地国家级自然保护区是中国内陆荒漠物种最为丰富的区域之一，由于其特殊的地理位置，使得该地形成了沼泽、滩涂、盐湖、沙漠、石漠、砾漠、盐漠等多种土壤类型。依此而生的土壤微生物资源经历了长期的进化演变，成为我国干旱区重要的种质基因库，具有典型性和较高的保护价值[1]。纤维素是地球上最丰富的碳质资源之一，由于难以被大量分解利用，而被人们大量堆积或燃烧，从而对环境造成极大的污染和资源浪费。如果能通过纤维素水解酶转化利用，必将产生很好的经济和社会效益[2]。纤维素酶是由一系列酶系组成，滤纸是纯纤维素材料，其聚合度和结晶度都比较适中，降解滤纸的滤纸酶（FPase）活性所代表的是纤维素酶的总活力，体现了纤维素酶系内的协同能力。滤纸酶活力的测定主要依据纤维素酶水解滤纸产生还原糖的数量[3]。研究中试图通过分离和筛选具有较高纤维素酶活性的菌株，为开发具有应用前景的工业菌种做出贡献。
2 材料与方法
2.1 供试土壤
试验土壤采自新疆北部艾比湖湿地国家级自然保护区内的芦苇地和红柳地。采取距表层0～20 cm土壤约200 g，去除土壤中可见的动植物残体和石子，用自封袋封装带回实验室，过2 mm筛，立即进行筛菌测酶活。
2.2 实验方法
2.2.1 纤维素降解菌筛选
称取1.0 g 土样到10 mL离心管中，加入无菌水9.0 mL 和几粒无菌钢珠，经高速振荡混匀后静置，取上清液1 mL稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五个浓度梯度。取100 μL涂布于培养基上，30℃ 恒温倒置培养24 h后，用牙签挑取形态有差异的单菌落，接种到固体平板培养基上，用于纯化后测序鉴定。
另取上清液1 mL加入液体培养基中，恒温摇床120转/min，30℃富集三代后，划线接种在固体培养基上，24 h后，用牙签挑取形态有差异的单菌落（产外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶的菌落有透明水解圈，产β-葡萄糖苷酶的菌落周围有黑圈），接种到固体平板培养基上，用于纯化后测序鉴定。
注意：液体培养基不加显色剂和琼脂。
2.2.2 纤维素酶活测定
（1）滤纸酶（FPase）。取100±0.5 mg滤纸与1 mL菌液于10 mL比色管中，加入pH值为4.8，0.1 mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液l mL，50℃水浴酶解反应1 h后取出，迅速冷却至室温。
（2）内切β-1.4-葡聚糖酶（CMCase）。取2 mL CMC-Na溶液与1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反应1 h后取出，迅速冷却至室温。
（3）外切β-1.4-葡聚糖酶（Avicelase）。取2 mL微晶纤维素溶液与1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反应1 h后取出，迅速冷却至室温。
（4）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）。取2 mL水杨苷溶液与1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反应1 h后取出，迅速冷却至室温[4]。
酶促反应结束之后，立即加入0.8 mL DNS 试剂，沸水浴5 min之后取出，迅速冷却至室温，用水定容10 mL。在530 nm波长处测定吸光度OD 值，对照葡萄糖标准曲线计算葡萄糖量P。以高温灭活的粗酶液为对照组。
葡萄糖标准曲线绘制：取10 mL比色管6支，加入1.0 mg/mL的葡萄糖标准溶液0.0、0.16、0.32、0.48、0.64、0.8 mL，加蒸馏水0.8、0.64、0.48、0.32、0.16、0.0 mL，加DNS试剂0.8 mL，混匀后煮沸5 min，取出立即用冷水冷却，用水定容至10 mL，摇匀，530 nm测吸光度OD值，以OD值为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。
酶活定义：底物在一定反应条件（pH值为4.8，50℃，恒温l h）下，与1 mL粗酶液反应1 min生成1 μg葡萄糖为1个酶活单位（U/mL）。
计算：酶活力（U/mL）=P×K×1000/时间*体积，其中K为稀释倍数。
2.3 稻荽理
利用Excel 2003，Origin 8.0和SPSS 17.0对数据进行统计、分析及绘图。重复性实验结果用平均值±标准误表示。
3 结果与分析
3.1 菌株的筛选结果
采用3种培养基和常规的分离技术对土样中的纤维素降解菌进行初步筛选，分离。然后对分离的细菌进行16S rRNA测序，获得序列后，在NCBI进行Blast比对，经过比对的结果如表1。
经过初筛分离纯化后，共得到74株菌，属26个种。筛到的厚壁菌门Firmicutes 芽孢杆菌属Bacillus 细菌最多有14个种。Bacillus是一类好氧或兼性厌氧、能产生抗逆性孢子的杆状细菌。多数为腐生菌，主要分布于土壤、动植物体表及水体中。由于芽孢杆菌属的细菌可以产生多种有用代谢产物，芽孢又是菌体度过不良环境的休眠体，因此，在工、农业生产上有较高的应用价值[5]。例如枯草芽孢杆菌是工业上生产淀粉酶、蛋白酶的主要菌种，苏云金芽孢杆菌用于生产生物农药，巨大芽孢杆菌能提高土壤有效磷的含量等。Bacillus aquimaris能利用羧甲基纤维素钠，水解淀粉，耐盐[6]。Bacillus aryabhattai可以利用纤维二糖，促进植物生长，具有溶磷作用、产植物激素。Bacillus litoralis采自海水淤泥，利用纤维二糖和醋酸纤维素，水解淀粉。Bacillus oceanisediminis具有硝酸盐还原作用，还能利用纤维二糖、醋酸纤维素。Bacillus firmus能富集铬、砷，或用于生物修复[7]。Bacillus vietnamensis中等耐盐、产氧化酶，抗溶菌酶（区别于B.firmus）。可在pH值为4.5和9.0的环境生长，不同于B.aquimaris。Altererythrobacter xinjiangensis能水解酪蛋白和纤维素，可利用葡聚糖。Arthrobacter nicotianae降解尼古丁，脱硫，聚磷。Planococcus rifietoensis产纤维素酶、脱氨酶，促进植物生长（固氮，溶磷作用，产吲哚乙酸）[8]。Microbacterium amylolyticum有一定聚乙烯降解作用。Streptomyces coelicoflavus能降解纤维素，还原硝酸盐[9]。
3.2 纤维素酶酶活测定
选取其中水解圈较大的8株菌进行纤维素酶活测定（表2）。分别测定了滤纸酶（FPase）、内切葡聚糖酶（CMCase）、外切葡聚糖酶（Avicelase）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）的酶活。
由图1可知，菌株13C12、03C5、05B2的滤纸酶活显著高于其它，其中13C12的酶活最高达21.4 U/mL。菌株MZ2、03C9、13C3的酶活次之，约为3.2 U/mL。菌株132和13A4的滤纸酶活最低。
4 结论与讨论
（1）经过初筛分离纯化后，共得纤维素降解菌到74株菌，属26个种。筛到的厚壁菌门Firmicutes 芽孢杆菌属Bacillus 细菌最多，有14个种。
（2）菌株13C12的纤维素酶活最高。滤纸酶（FPase）活为21.4 U/mL，内切葡聚糖酶酶活达37.4 U/mL，外切葡聚糖酶（Avicelase）为19.2 U/mL，β-葡萄糖苷酶酶活为24.6 U/mL。
（3）接种量的多少会影响产纤维素酶菌株在发酵液中的生长、代谢和繁殖速度。选择较大的接种量可以缩短发酵液内菌体密度达到高峰的时间，有利于产物的形成以及培养基质的利用，并减小被杂菌污染的概率。然而接种量过大则会导致发酵液中溶氧不足，限制a物的合成，菌体易老化；接种量过小则会延长发酵周期，影响产率。
（4）由于许多土壤细菌生活力较差，样本采集回来后应尽快筛菌，否则，搁置时间过长会严重影响筛菌的效率和成功率。此外，土壤细菌大多数不可培养，通过传统筛菌方法筛到的菌落有限，所以探寻新的实验方法具有重要意义。
致谢：中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室周杰民博士对本实验方案设计过程中的支持；感谢新疆生产建设兵团第五师农科所的工作人员在采样过程中的帮助。
参考文献：
[1]
Ma M， Wang X， Veroustraete F， et al. Change in area of Ebinur Lake during the 1998-2005 period[J]. International Journal of Remote Sensing， 2007， 28（24）：5523～5533.
[2]Ding S Y， Xu Q， Crowley M， et al. A biophysical perspective on the cellulosome： new opportunities for biomass conversion.[J]. Current Opinion in Biotechnology， 2008， 19（3）：218～227.
[3]Dashtban M， Maki M， Leung K T， et al. Cellulase activities in biomass conversion： measurement methods and comparison[J]. Critical Reviews in Biotechnology， 2010， 30（4）：302.
[4]Maki M L， Broere M， Leung K T， et al. Characterization of some efficient cellulase producing bacteria isolated from paper mill sludges and organic fertilizers[J]. International Journal of Biochemistry & Molecular Biology， 2011， 2（2）：146～154.
[5]谢长校. Bacillus Ligniniphilus L1降解木质素机理的初步研究[D].镇江：江苏大学，2016.
[6]Trivedi N， Gupta V， Kumar M， et al. Solvent tolerant marine bacterium Bacillus aquimaris secreting organic solvent stable alkaline cellulase[J]. Chemosphere， 2011， 83（5）：706～712.
关键词：纤维素乙醇；木质纤维素；产业化；生物精炼；乙醇联产
Abstrct：With the energy crisis and environmental problems? becoming increasingly prominent， world energy development is entering a new period .That is， the world is experiencing the revolution that the energy? is being restructured from fossil energy consumption to focusing mainly on the renewable energy revolution. Cellulose ethanol is been the best alternative liquid fuel and industrial biotechnology research focuses on ecological benefits. In this paper， the authors summarize the status of cellulose ethanol at home and abroad， and analyz the impact? factors? affecting cellulose ethanol industry development and the development trend of the cellulose ethanol industry .
Key words：Cellulose ethanol ;lignocellulose; industrialization ;bio-refining ;co-production of ethanol
0引 言
能源问题是当今世界各国都面临的关系国家安全和经济社会可持续发展的中心议题，已经成为全球关注的焦点。因此，人们开始把目光转移到有利于社会可持续发展的可再生能源体系。专家认为，生物质资源转化体系是引领第三次世界能源革命的技术平台。在此背景下，燃料乙醇已经被视为替代和节约汽油的最佳燃料，其高效的转换技术和洁净利用日益受到全世界的重视，已经被广泛认为是21世纪发展循环经济的有效途径。
在中国，燃料乙醇的主要原料是玉米和小麦。随着燃料乙醇的快速发展，原料问题日益突出，成为制约燃料乙醇发展的瓶颈；另外，以粮食作物为原料的燃料乙醇产业发展还有可能引发国家粮食安全问题。因此，中国政府提出生物乙醇坚持非粮之路，即“不与人争粮，不与粮争地”。经济分析显示，中国发展纤维素乙醇有更大的优势。木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，也是当前利用率最低的资源，是各国新资源战略的重点。中国可利用的木质纤维素每年在7亿吨左右，这些丰富而廉价的自然资源主要来源于农林业废弃物、工业废弃物和城市废弃物。所以，纤维素乙醇是未来发展的必然方向。
1木质纤维素原料组成及性质
木质纤维素是由纤维素、半纤维素、木质素和少量的可溶性固形物组成。纤维素大分子是由葡萄糖脱水，通过β-1，4葡萄糖苷键连接而成的直链聚合体。在常温下不发生水解，高温下水解也很缓慢。只有在催化剂的作用下，纤维素的水解反应才显著进行。常用的催化剂是无机酸或纤维素酶，由此分别形成了酸水解和酶水解工艺。半纤维素是由不同的多聚糖构成的混合物，这些多聚糖由不同单糖聚合而成，有直链也有支链，上面连接有不同数量的乙酰基和甲基。半纤维素的水解产物主要有己糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、戊糖和阿拉伯糖等几种不同的糖。半纤维素的聚合度较低，相对比较容易降解成单糖。二者的水解机理可以用下列方程式简单地表示：
(C6H10O5)n + nH2OnC6H10O6
(C5H804) n + nH2OnC5H10O5
2国外纤维素乙醇的研究与应用现状
随着现代工业的迅速发展，大规模开发利用作为清洁能源的可再生资源显得日益重要。许多国家都制定了相应的开发研究计划，例如：美国的“能源农场”、巴西的“酒精能源计划”、印度的“绿色能源工程”和日本的“阳光计划”等发展规划。其它诸如丹麦、荷兰、德国等国，多年来一直在进行各自的研究与开发，并形成了各具特色的生物质能源研究与开发体系，拥有各自的技术优势。
自1973年世界石油危机后，巴西就实施了“国家乙醇生产计划”，主要依靠本国丰富的甘蔗资源，积极发展燃料乙醇产业，目前已经发展320多家燃料乙醇生产企业，1400万吨/年的乙醇生产规模。大部分企业实行燃料乙醇和糖联产。美国在燃料乙醇的生产上仍然是世界乙醇生产的领头羊，在将纤维素转化为燃料酒精的研究、生产和应用方面也走在世界的前列。美国加州大学Berkeley分校采用的流程是纤维素水解与发酵同步进行，该工艺以粉碎的玉米芯为原料，再用稀酸水解，将半纤维素水解成木糖等产物。该流程的酸水解是连续进行的，反应器中的纤维原料含量为5%，玉米芯水解率达40%，水解液中糖为2.6%，然后采用多效蒸发器浓缩至糖浓度为11%再进行发酵。美国维吉尼亚州立大学利用80%的浓磷酸循环使用进行木质纤维素“溶解性分离”的研究，然后经纤维素酶水解，得到较纯的葡萄糖，其得率达到35%。瑞典隆德大学Karin Ohgren等研究了将蒸汽爆破预处理后的玉米秸秆进行同步糖化与发酵的工艺研究，试验结果表明，发酵结束后乙醇达到25g/L。
近年，随着纤维乙醇技术的快速发展，一些大公司开始计划建造较大规模的试验性工厂。美国的Gulfoil Chemical公司建成了可处理1t/d纤维废料的中试车间，年产纯乙醇2亿升，乙醇产率为27.7%。加拿大的Iogen生物技术公司，在渥太华开设了以麦秸为原料的3.2万加仑/年纤维素乙醇厂，采用稀酸结合蒸汽气爆预处理半纤维素，随后用纤维素酶水解，分离后的液体进行木糖和葡萄糖联合发酵。经评估，其生产成本比谷物乙醇高出30%～50%。
3国内纤维素乙醇研究与应用现状
我国在纤维素乙醇技术开发上也取得了一些重要进展。浙江大学主持的“利用农业纤维废弃物代替粮食生产酒精”的项目已在河北完成中试生产，以玉米芯为原料，乙醇产率为22.2%（W/W）。南京林业大学建立了玉米秸秆间歇蒸汽爆破预处理、纤维素酶水解和戊糖己糖同步发酵技术制取纤维乙醇的中试装置。水解得率为71.3%，还原糖利用率和乙醇得率分别为87.17%和0.43%。华东理工大学于2005年已建成了纤维乙醇600吨/年的示范性工厂，以废木屑为原料，以稀盐酸水解和氯化亚铁为催化剂的水解工艺以及葡萄糖与木糖的发酵，转化率达到了70%。河南农业大学利用黄胞原毛平革菌和杂色云芝的复合预处理，对选择性降解木质素的能力和规律进行了试验研究。生物降解后原料水解率达到了36.67%。山东大学微生物技术国家重点实验室主要开展“纤维素原料转化乙醇关键技术”研究。对纤维素酶高产菌的筛选和诱变育种、用基因手段提高产酶量或改进酶系组成、纤维素酶生产技术等研究。吉林轻工业设计研究院“玉米秸秆湿氧化预处理生产乙醇”在实验室规模为10L发酵罐条件下，经湿氧化预处理和酶水解后酶解率86.4 %；糖转化为乙醇产率48.2 %。
近年来，以河南天冠集团和中粮集团为代表的几家大型燃料乙醇生产企业，与高校联合进行纤维素乙醇的工业化技术的探索性研发。目前，河南天冠集团将建成300吨/年的乙醇中试生产线，原料转化率超过了16%。中粮集团于2006年在黑龙江肇东启动建设500吨/年纤维素乙醇实验装置。吉林九新实业集团建立了3000吨/年的玉米秸秆生产纤维乙醇示范性工厂。
迄今为止，全世界已经建有几十套纤维质原料经纤维素酶水解成单糖的中试生产线或小试生产线。纤维燃料乙醇在国内外研究正步入一个新的时代，在一些关键技术上取得了重要的进展，并建立了多个示范性工厂。但整体上，由于在纤维素酶生产技术、戊糖己糖发酵菌株构建等方面还没有取得根本性的突破，所以距离纤维素乙醇的产业化还有一定的距离。
4影响纤维乙醇产业化的主要因素
近年来，国内外对利用木质纤维转化乙醇进行了大量的研究， 工艺路线已经打通，但当前要想实现工业化生产，在原料收集、预处理、糖化、发酵和精馏各工艺过程中还存在着制约纤维素乙醇生产的问题，主要表现为以下四个方面
（1）木质纤维素原料分散，季节性强，尤其是农作物秸秆。
（2）木质纤维素预处理技术有待进一步优化和提高。由于天然纤维素原料的结构复杂的特性，使得其纤维素、半纤维素和木质素三者不能有效分离；另外伴随产生一些中间副产物，实验表明，这些物质抑制酵母的生长和代谢，最终影响乙醇产率。
（3）缺乏高效的纤维酶菌株，现有的纤维素酶制剂效果较低，使得酶解糖化经济成本较高，当前生产一吨纤维乙醇需要酶制剂成本在2200～2600元。
（4）缺乏能够同时高效利用戊糖和己糖的发酵菌株。在木质纤维水解中，其中有相当比重的木糖（葡萄糖/木糖约为2）。因此，戊糖的利用是影响纤维乙醇综合成本的关键一项。
5未来纤维素乙醇产业化发展趋势
目前，国外纤维素乙醇产业化的研究已经成为了热潮，正步入一个关键时期，中国在这方面也有良好的基础。为了使纤维素乙醇尽早地实现产业化，除了以上几项关键技术进一步解决好外，还应当借鉴石油化工的经验，坚持走生物精炼和乙醇联产的模式，尽可能地最大提升和拓展底物的各组分的经济价值，也许是促使纤维素乙醇产业化的重要途径。
尽管木质纤维素原料本身非常廉价，但是将其转化成乙醇的工艺过程非常复杂，需要大量的能耗。这主要是由木质纤维素自身的结构特性决定的，而得到的目标产物是经济附加值并不很高的乙醇，致使单位乙醇的经济效益并不具备较强的市场优势。而生物精炼和乙醇联产模式就打破了原来由生物质生产单一产品的观念，实现原料充分利用和产品价值最大化，就是所谓的“吃干榨净”，正如目前的利用粮食生产乙醇一样。例如，利用玉米同时生产燃料乙醇、玉米油、蛋白粉、高果糖浆、蛋白饲料和其他系列产品，这样提升了整个工艺产品的经济附加值，同时取得良好的经济效益和社会效益。同样利用木质纤维素的三大类组分也可以衍生出多种产品。例如：目前，大多的木糖醇厂主要是利用玉米芯中的半纤维素生产木糖醇，结果剩下大量的木糖渣（主要是纤维素和木质素），如果进行联产模式，将剩下的纤维素与木质素进行组分分离，分别生产纤维乙醇和优质燃料或木素磺酸盐，就有可能进一步提升产品的综合效益。
综上所述，中国应该利用纤维素乙醇作为主要的生物能源，加快以纤维素乙醇为核心的综合技术开发，尽早实现其产业化发展的目标。相信经过“十一五”计划的实施，中国在利用纤维素废弃物制取燃料乙醇方面，必将取得更大的进展，为缓解液体燃料短缺、促进环境保护和社会可持续发展等方面发挥重要作用。
参考文献
[1] 杜风光，史吉平，张 龙等.纤维质生产燃料乙醇产业化研究进展.[J]中国麻业科学.2007，（29）72-74.
[2] 孙智谋，蒋 磊，张俊博，等.世界各国木质纤维素原料生物转化燃料乙醇的工业化进程[J].酿酒科技，2007（1），91-94.
[3] Sun Y ，Cheng J.Hydrolysis of lingocellulosic materials for ethanol production[J].Biomass Technology.2002，83:3-9.
[4] Keikhosro Karimi， Mohammad J， Taherzadeh.Conversion? of rice straw to sugars by dilute-acid hydrolysis[J]. Biomass and Bioenergy ， 2006， 30 : 247-253.
[5] Cheung S W，Anderson B C.Laboratory investigation of ethanol production from municipal primary wasterwater solids[J] Bioreource Technology，2003.59：81-96.
[6] 勇强 等.玉米秸秆生物转化制取酒精的中间试验.济南:中国资源生物技术与糖工程学会研讨会论文集.2005.[c]
[7] 宋安东.生物质（秸秆）纤维燃料乙醇生产工艺试验研究[D].郑州:河南农业大学，2003，25-27
[8] Sun Y ，Cheng J.Hydrolysis of lingocellulosic materials for ethanol production [J]. Biomass? technology.? 2002， 83: 3-9.转贴于
