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开篇：写作不仅是一种记录，更是一种创造，它让我们能够捕捉那些稍纵即逝的灵感，将它们永久地定格在纸上。下面是小编精心整理的12篇巨噬细胞，希望这些内容能成为您创作过程中的良师益友，陪伴您不断探索和进步。
巨噬细胞活化综合征(macrophage activation syndrome,MAS)是儿童慢性风湿性疾病的严重并发症,临床主要表现为持续发热,淋巴结及肝脾肿大,全血细胞减少,严重肝功能损害,凝血障碍及神经系统受累等多脏器病变,骨髓细胞学显示有分化良好的巨噬细胞吞噬血细胞现象[1]。1985年Hadchouel等[2]。第一次报道了soJIA患儿病程中出现类似MAS的临床表现,提示可能与大量异常活化的非肿瘤性巨噬细胞所致的噬血细胞现象相关。1993年Stephan等[3]首次提出了MAS的概念,他们发现这些患者存在单核巨噬细胞活化,临床表现与噬血性淋巴组织细胞增生症(HLH)相似。随后MAS这个概念逐渐被风湿病学界认识和接受,关于MAS的报道也逐渐增多,近年来其他风湿性疾病如系统性红斑狼疮、皮肌炎、川崎病、渗出性多形性红斑等[4]也有合并MAS的报道。现就巨噬细胞活化综合征近年来的研究进展做一综述。
1 MAS的流行病学特点
MAS是风湿性疾病少见的并发症,目前尚无确切的关于MAS发病率的统计数据。随着MAS研究的不断深入,MAS的报道越来越多。胡坚等[5,6]对幼年特发性关节炎(juvenileidiopathic arthritis,JIA)并发MAS的个案报道是国内最早的文献资料,随后人们开始关注到MAS在幼年特发性关节炎全身型(soJIA)中并不少见[7-9]。Sawhne等[10]。报道103例全身型JIA患者中有7例合并MAS。Emmennegger等[11]。对反应性HLH患者进行同顾性研究发现约1/3的HLH患者满足JIA的诊断标准。目前认为MAS男女发病率没有明显差异,没有种族易感性,任何年龄均可发病,以儿童发病多见,并且大部分MAS患者存在有基础病。
2 MAS的诱发因素
MAS发病确切的诱因尚不明确,可能与原发病活动、药物作用、感染等有关。任何感染均可诱发MAS,包括病毒、细菌、真菌及寄生虫等感染。EB病毒是诱发MAS最常见的感染因素,单纯疱疹病毒和巨细胞病毒等也被认为是引起MAS常见的诱因。近10年的文献资料显示在治疗soJIA过程中某些药物可能引发MAS,这些药物包括NSAIID类药物(阿司匹林、布洛芬等)、病情改善药物(金制剂、甲氨蝶呤等)、免疫抑制剂(如环磷酰胺)[13]和生物制剂(如TNF拮抗剂依那西普)[14、15]等。
3 MAS的发病机制
MAS确切发病机制目前尚不完全清楚,大部分关于MAS发病机制的假说都源于HLH。近年来研究发现,MAS的发病机制可能与穿孔素(perforin)基因异常表达和自然杀伤细胞(NK细胞)功能紊乱引发机体内细胞因子所致的瀑布反应有关[10-16]。穿孔素基因突变导致穿孔素蛋白表达减少[17],穿孔素蛋白是淋巴细胞、巨噬细胞和骨髓的前体细胞表达的一种蛋白质,它的主要作用是在细胞溶解过程中在细胞膜上形成小孔,引起靶细胞溶解。新近的研究也显示多次发生MAS的soJIA患者,大部分穿孔素蛋白表达降低。曾华松等口朝对7例So-JIA并发MAS患者的研究发现,穿孔素A91V基因均为野生型,未发现有突变基因,未发现广东地区汉族So-JIA并MAS患儿与穿孔素A91V基因多态性有关,考虑可能与个体特异体质有关。NK细胞在感染早期具有清除感染原作用,soJIA患者合并MAS中,NK细胞的数量和功能均降低。姚翠婵等[20]报道10例soJIA病情反复难治者,发现9例患儿外周血NK细胞CDl6+56+比率降低,这些患儿并发MAS机会明显增加,这也是soJIA患者容易并发MAS的原因[21]。当NK细胞功能下降,机体清除外来感染原能力降低,引起抗原驱动下T淋巴细胞持久激活和巨噬细胞活化因子大量产生,导致巨噬细胞过度活化释放大量炎症细胞因子(如IL-1、IL-6、TNF-α及干扰素α),即细胞因子瀑布,从而引起强烈自身免疫损伤[22],出现各种临床症状及实验室改变。对soJIA患儿检测其NK细胞功能及穿孔素蛋白表达水平,也许有助于预测MAS的发生。
4 组织病理学特征
MAS的组织病理学主要表现为T淋巴细胞及活化的巨噬细胞浸润。在骨髓及淋巴结中出现巨噬细胞噬血现象,浸润也可出现在其他组织和脏器。1988年,Reiner等[23]对MAS患者的尸解研究发现巨噬细胞浸润可出现在心脏、肝脏、胰腺、肾上腺及脑膜等。Billiau等[24]。报道了5例MAS患儿肝活检病理结果显示活化的CD8、T细胞和噬血细胞增生都参与了发病。
5 临床特征与实验室改变
5.1各系统临床表现MAS主要并发于soJIA,多数发生于疾病活动期,少数也可发生在疾病的静止期,个别病例甚至作为soJIA的首发症状[25]。MAS的起病非常急骤,进展迅速,其临床主要表现为多脏器受累症状,甚至出现多脏器功能障碍或衰竭。重症者预后差,病死率高。
发热常常是MAS的首发症状,主要表现为高热持续不退,多为稽留热,有时为弛张热。
肝脏受累在MAS中非常常见,表现为肝功能急剧减退甚至衰竭,出现恶心、呕吐、黄疸、出血倾向及肝酶短期内迅速升高,伴有肝脾进行性增大。
MAS最具有鉴别诊断意义的临床表现是中枢神经系统受累和出血顺向[26]。中枢神经系统受累表现为一系列中枢神经功能障碍,包括嗜睡、烦躁、定向力障碍、头痛、抽搐甚至昏迷等,部分患者出现颈项强直、肌张力异常(增高或降低),颅神经麻痹、失明、共济失调及偏瘫也不少见。出血倾向以皮肤黏膜出血为主要表现,类似于DIC,是MAS患者中最突出的异常表现,主要是凝血功能障碍所致,轻者表现为皮肤黏膜瘀点及瘀斑,较重的可有暴发性紫癜,鼻衄、消化道出血,甚至出现弥漫性血管内凝血(DIC)。
其他系统受累现象相对较少见。呼吸系统受累可出现呼吸衰竭,甚至急性呼吸窘迫综合征。肾脏受累表现为血尿,蛋白尿,少尿及无尿,部分患儿可以出现。肾功能衰竭。心脏受累表现包括心包炎、心肌炎,心力衰竭及心律失常等。以上器官受累一经发生往往提示多脏器功能受累,预后不良,曾华松等[19]报道提示MOt-的发生是MAS预后差的指征。
5.2 实验室改变MAS患者血象改变主要表现为白细胞、红细胞和血小板一系或者一系以上降低。肝酶升高如ALT、AST、LDH及GGT增高。胆红素轻度升高,以直接胆红素升高为主。血脂包括甘油三酯可以增高,低白蛋白血症,血氨水平多正常或轻度增高,血钠下降等。凝血功能异常可有PT及APTT延长,纤维蛋白原降低,FDP增高,D-二聚体升高,V因子轻度下降,维生素K依赖凝血因子缺乏等。血沉(ESR)降低是MAS特征性实验室改变。血清铁蛋白的明显升高也是MAS特征性改变之一。骨髓细胞学表现为反应性组织细胞增生,无恶性细胞浸润,极期可见吞噬红细胞、白细胞和血小板的吞噬性组织细胞。骨髓、淋巴结及肝脏活检可见分化良好的极度增生活跃吞噬了血细胞的吞噬细胞[24]。
6 诊断标准与鉴别诊断
6.1 诊断标准MAS目前尚无统一的诊断标准。2005年,Ravelli等[26]根据流行病学研究资料,提出了全身型JIA合并MAS的诊断指南,见表1。
表1SOJIA合并MAS的参考诊断指标(2005年)
临床标准
(1)CNS功能障碍(易激惹、定向力障碍、嗜睡、头痛、抽搐、昏迷)
(2)出血表现(紫癜、易出血、黏膜出血)
(3)肝睥增大(肋缘下≥3 cm)
实验室标准
(1)血小板≤262×109/L
(2)谷草转氨酶>59 U/L
(3)白细胞≤4.O×109/L
(4)纤维蛋白原降低(≤2.5 g/L)
组织学标准
骨髓有巨噬细胞吞噬血细胞的证据
诊断原则:诊断MAS需要任何2个或以上的实验室标准,3个或以上的临床和(或)实验室标准。骨髓中发现吞噬血细胞,仅仅是对于可疑病例才必须具备。
建议:上述诊断指标仅用于活动性s0JRA合并MAS,实验室检查值仅作为参考。
6.2 鉴别诊断诊断MAS必须排除其他疾病,如感染性疾病(如败血症、EB病毒感染),恶性疾病(如白血病、淋巴瘤及恶性组织细胞病),瑞氏综合症,以及药物副作用等。近年来人们认识到MAS与HLH的关系非常密切,临床上难以鉴别。HLH是组织细胞增生症的一种类型,是以表型良性分化的单核细胞聚集为特征的疾病谱。HLH分为两类,一类为原发性(家族性),是常染色体隐性遗传病,多散发;另一类为继发性(反应性),又分为感染相关性和肿瘤相关性HLH,多在儿童期发病,往往有明确诱发因素,比如EB病毒或巨细胞病毒感染。MAS的临床表现及组织病理特点与HLH非常相似,但有其特殊性。2004年,国际组织细胞协会将。MAS做为独立疾病单独列出,分类在继发性HLH中,特别强调与其他HIJH在治疗方案上的不同。2005年,美国血液病协会也将其单独描述,提出MAS与HLH的密切关系,强调HLH的诊断标准和治疗方案不一定符合MAS,提示了MAS的特殊性。虽然HLH及MAS两者的关系尚不清楚,在学术界上尚有争议,但随着对该病认识的不断深入,越来越多的学者认为MAS是属于组织细胞疾病范畴的风湿病相关性HLH[25-28]。
7 治 疗
MAS是全身型JIA一种严重并发症,有很高的病死率,做到早期诊断、早期治疗至关重要,可以极大的改善预后,已往报道病例多数在短期内临床治愈。目前常用的治疗方法包括一般治疗及特殊药物治疗。
7.1 一般治疗针对MAS发病的不同诱因,存在感染时进行抗感染治疗,及时停用可疑药物,针对患儿脏器功能状态做相应的呼吸循环支持等治疗。
7.2 药物治疗主要包括肾上腺皮质激素及环孢素A。轻症患儿口服泼尼松1～2mg/(Kg.d),症状体征及实验室指标好转后缓慢减量。重症患儿常常需要大剂量甲泼尼松龙冲击疗法,剂量为15～30mg/(Kg.d),最大剂量为lg/d,连续使用3～5天,之后改为口服维持,可降低巨噬细胞活化复发。环孢素A对一些巨噬细胞活化的疾病如HLH有明显效果[32,33],但其明确的免疫学机制并不十分确切。常用剂量为2～8mg/Kg.d,急性期应静脉用药,病情控制后改为口服治疗。此外,使用环孢菌素A还能避免肾上腺皮质激素的过度使用。用药期间应定期监测血药浓度及肾功能,据此调整治疗剂量。细胞因子拮抗剂如TNF受体拮抗剂依那西普(Etancerept)和LT拮抗剂阿那白滞素(Anakinra)也有一定疗效,但易致感染发生,用药前应明确有无感染存在。静脉输注丙种球蛋白(IVIG)、免疫抑制剂(如环磷酰胺等)、化疗药物(如VPl6)以及血浆置换治疗因疗效不确切,目前使用较少。新近开展的自体干细胞移植可能为MAS的治疗带来新的希望。
8 展 望
MAS是全身型JIA一种严重并发症,在临床上并不少见,早期诊断和早期治疗对其预后至关重要。虽然广大儿科医师已逐渐认识到MAS的重要性,但目前国内外尚没有关于soJIA合并MAS发病率的确切资料,对其发病机制也尚不清楚。因此,有必要开展前瞻性的多中心、大样本流行病学调查,以了解soJIA合并MAS的发病率;相信随着分子生物学和免疫学等现代医学的飞速发展,人们对MAS病因和发病机制的认识会不断清晰,对制订MAS的诊断标准将会更加科学合理;干细胞技术的出现和发展,将给MAS根治带来无限的希望。
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【摘要】
目的： 检测小鼠腹腔巨噬细胞TLRs表达情况及糖皮质激素甲基强的松龙对TLRs mRNA表达的影响. 方法： 应用RTPCR检测正常小鼠腹腔巨噬细胞TLR113的表达；并以甲基强地松龙为免疫抑制剂，诱导小鼠免疫抑制后检测腹腔巨噬细胞TLRs mRNA表达变化. 结果： 已发现的TLR113在正常小鼠腹腔巨噬细胞均有表达；小鼠腹腔巨噬细胞经糖皮质激素处理后，部分TLRs在mRNA水平上可被上调. 结论： Toll样受体是抗真菌先天免疫的重要组成部分. 甲基强的松龙对巨噬细胞有毒性作用，甲基强的松龙注射后可导致小鼠腹腔巨噬细胞明显减少.
【关键词】 小鼠；泼尼松龙；免疫抑制法；Toll样受体
【Abstract】 AIM: To test the expression of tolllike receptor 113 (TLR113) mRNA in the peritoneal macrophages of normal mice and the change of TLRs mRNA expression in peritoneal macrophages of immunosuppressed mice. METHODS: The expression of TLR113 mRNA in the peritoneal macrophages of normal mice was determined by RTPCR technique. Immunosuppressed mice were induced by intraperitoneal injections of prednisolone. The expression of TLRs mRNA in the peritoneal macrophages of immunosuppressed mice was tested with RTPCR. RESULTS: All thirteen of the TLRs reported to date were present in the macrophages of normal mice. Some of TLRs were upregulated in mRNA level when the mice were treated with glucocorticoids. CONCLUSION: TLRs are important component parts of innate immunity to fungal infections. Prednisolone has a toxic effect to macrophages and decreases the peritoneal macrophages of the mice.
【Keywords】 mice; prednisolone; immunosuppression; tolllike receptor
0引言
Toll受体在果蝇的发育和抗真菌免疫中具有显著作用. 实验证实TLRs(tolllike receptors)表达异常会使免疫炎症反应不能正常发生，降低机体对病原微生物的清除能力［1］. 糖皮质激素(glucocorticoids， GC)可有效控制炎症和抑制免疫反应［2］. 近20年来，由于应用糖皮质激素而致机体免疫机能低下的患者患侵袭性曲霉菌病日趋增多. 体内外实验显示糖皮质激素在免疫和炎症应答中有促进和抑制作用，甚至出现双向作用［3］. 为了解糖皮质激素对TLRs表达的影响，我们以甲基强地松龙为免疫抑制剂，在诱导小鼠免疫抑制后检测腹腔巨噬细胞TLRs mRNA的表达情况.
1材料和方法
1.1材料
Balb/c小鼠24只，雌性，6～8周龄，体质量20～25g（第四军医大学实验动物中心）. 总RNA提取试剂TRIZOL Reagent（Gibco公司），MMLV Reverse Transcriptase 和Reverse Transcription System(Promega 公司)，Taq DNA聚合酶和dNTPs(TaKaRa公司)，不完全RPMI1640( Life Technology公司)，甲基强的松龙，40 mg/支(比利时法玛西亚普强公司).
1.2方法
1.2.1糖皮质激素诱导小鼠免疫抑制及腹腔巨噬细胞计数
将免疫抑制组小鼠12只皮下注射甲基强的松龙100 mg/kg·d， 共3 d. 正常对照组小鼠12只皮下注射同体积注射用水. 第4日脱颈处死小鼠，浸泡于750 mL/L 乙醇1 min，剪开腹部皮肤，暴露腹部，用注射器吸取5 mL无血清RPMI1640培养液注入腹腔，轻揉腹腔1～2 min，用吸管吸取腹腔巨噬细胞悬液，移入离心管中计数.
1.2.2细胞总RNA的提取
收集腹腔巨噬细胞悬液，2000 g离心10 min，弃上清，RPMI1640洗涤1次. 用TRIZOL Reagent一步法提取巨噬细胞总RNA.
1.2.3TLR1~13 PCR引物
根据GenBank公布的TLR1～13（除TLR10）已知序列设计引物，由上海生工生物工程技术服务公司合成（表1）. 表1基因名称和序列（略）
1.2.4RTPCR扩增TLR1～13基因及内参照βactin基因按照说明书，以Random Primers为引物，将从小鼠腹腔巨噬细胞中提取的总RNA逆转录合成cDNA. 分别用TLR及内参照βactin两组引物进行PCR扩增，反应条件为：95℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30s，循环32次，延伸7 min.
1.2.5扩增产物检测取10 μL PCR产物，15 g/L 琼脂糖凝胶电泳40 min，随后在凝胶成像系统中分析电泳带的吸光度值. TLRs的相对含量为TLRs与内参βactin吸光度比值表示.
统计学处理：实验结果以x±s表示，两组间差异比较用t检验，多组间比较采用KruskalWallis H检验.
2结果
2.1小鼠腹腔巨噬细胞数量变化将甲基强的松龙注射后，小鼠腹腔巨噬细胞数量由（6.3±1.8）×106/只降至（3.2±0.6）×106/只，前后比较有统计学差异（P
2.2TLR113在正常小鼠腹腔巨噬细胞的表达经RTPCR检测，TLR113在小鼠腹腔巨噬细胞均有表达(图1).
2.3免疫抑制状态下小鼠腹腔巨噬细胞TLRs的表达变化糖皮质激素可上调巨噬细胞上部分TLRs mRNA表达(图1)，包括TLR2，3，4，5，6，8. 表达量增加约1.2～2.0倍(表2). 若
3讨论
TLRs在不同组织细胞的表达各异 ，可分为广泛表达、限制性表达或特异性表达［4］，如TLR1分布于各类免疫细胞，TLR2，4，5只在髓源性细胞表达，TLR3则主要表达于树突状细胞. 小鼠腹腔巨噬细胞为常驻巨噬细胞，是防御病原微生物入侵的第一道防线. Muzio 等［5］研究显示， 单核/巨噬细胞在发育成熟的不同阶段表达大多数TLRs，但不表达TLR3. 我们的结果证明TLR113在小鼠腹腔巨噬细胞均有表达，包括TLR3. 当局部受到细菌、真菌及病毒感染时，巨噬细胞上的TLRs可识别不同的病原体相关分子模式如细菌脂肽、dsRNA，LPS和细菌鞭毛等并被活化，提供迅速而有效的先天免疫应答并启动获得性免疫应答.
多种病原微生物成分或细胞因子可上调或下调TLRs表达，如LPS可诱导TLR2，TLR4及TLR9的表达，IL6可使TLR7的表达明显升高，INFγ可上调TLR9的表达. Renshaw等［6］研究证实，老龄小鼠的脾细胞和腹腔巨噬细胞TLR1～9的表达显著减少，且TLRs功能下降，这可能部分解释老年人对各种病原菌感染的易感性增加. 糖皮质激素是广泛应用的抗炎剂，其抗炎效应的发挥是通过下调依赖NFκB的大量炎症应答相关基因的转录，而TLRs的上调可诱导NFκB的活化［7］. 研究发现，大剂量应用糖皮质激素是机会性真菌易感的主要危险因素之一，理论上推测糖皮质激素可能下调TLRs表达. 我们的结果显示，甲基强的松龙在mRNA水平上调巨噬细胞部分TLRs表达，其调节机制还不十分清楚. Homma等［8］研究了地塞米松对呼吸道上皮细胞TLRs家族成员表达的调节，发现地塞米松可上调TLR2～6的表达，与我们的研究结果相一致. Shuto等［7］研究证实，地塞米松协同增强非典型流感嗜血杆菌诱导的TLR2上调，是通过p38MAPK信号途径的负调节. Franchimont等［9］将地塞米松加入LPS刺激的全血细胞培养中，发现地塞米松可增加IL10的分泌，而降低TNFα的分泌，证明了糖皮质激素可强烈抑制Th1细胞促炎因子的分泌，而对Th2细胞抗炎因子的分泌有正调节作用. 糖皮质激素对巨噬细胞部分TLRs有上调作用，免疫功能低下患者易发生机会性感染，但究竟是通过对Toll样受体信号通路中哪些环节的抑制而发挥作用的？糖皮质激素上调部分TLRs表达的准确分子机制是什么？这将有待于进一步研究.
以往研究认为，糖皮质激素可明显改变单核巨噬细胞的功能，能抑制巨噬细胞的吞噬和加工处理抗原功能，阻止单核细胞分化为巨噬细胞. 我们在实验中观察到糖皮质激素甲基强的松龙对巨噬细胞的毒性作用，甲基强的松龙注射后可导致小鼠腹腔巨噬细胞明显减少，RAW264.7细胞经甲基强的松龙作用后细胞生长受到抑制甚至死亡. 尚未见文献报道糖皮质激素对巨噬细胞的直接毒性作用，甲基强的松龙抑制巨噬细胞生长或诱导死亡可能是免疫抑制小鼠对烟曲霉菌易感的机制之一.
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关键词：巨噬细胞；鱼红细胞；实验方法；吞噬
中图分类号 G642.0 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）23-17-02
高等动物体内的巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞等多具有吞噬功能，均由骨髓干细胞分化而来，是机体非特异性免疫功能的重要组成部分。当病原微生物或其他异物侵入机体时，由于巨噬细胞具有趋化性，便向异物处聚集，巨噬细胞可将之内吞入胞质，形成吞噬泡，然后在胞内与溶酶体融合，将异物消化分解，这在机体非特异性免疫中具有重要意义。静息的巨噬细胞吞噬功能低下，只有活化状态下的巨噬细胞才具有较强的吞噬能力。现在所用细胞实验教材[1-4]所编列吞噬实验大多用鸡红细胞、羊红细胞、墨水、杆菌[5]、荧光微球等作为吞噬物，本文首次使用鱼血细胞作为吞噬物，对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬效果进行了探索和研究，以期避免使用家禽作为实验材料，并进一步完善了实验方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 鱼血红细胞稀释液的制备 从市场上购买鲫鱼，用注射器尾静脉采血，或解剖后从鱼血窦或心脏抽取鱼血。抽取的鱼血，不添加抗凝剂，直接用无血清L15培养基（Gibco，invitrogen Corporation），稀释10倍。配成10%鱼血红细胞悬液备用。
1.1.2 3%可溶性淀粉溶液的制备 称取可溶性淀粉3g，溶于100mL生理盐水中，混匀后121℃高压灭菌20min备用。
1.2 方法
1.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的诱导 在实验前3d，连续3d定时给小鼠腹腔注射3%淀粉液。注射部位在腹部中央，持针以45°斜角刺入，注意勿伤及内脏或注入肠内，注射后揉动腹部，分散淀粉粒，并观察注射后动物状态，以免小鼠死亡。
1.2.2 鱼红细胞的注射及腹腔液的收集 实验时，小鼠腹腔注射10%鱼红细胞悬液1mL，轻按小鼠腹部，使悬液分散。60min后，用颈椎脱臼法处死小鼠。将小鼠腹面朝上，于腹部中央用有齿尖镊夹起皮肤层，用剪刀剪一环口，撕开腹部皮肤，充分暴露腹膜。此时，向腹腔注射1mL生理盐水，并轻揉腹部片刻。随后用剪刀剪开腹膜成一纵形口，用镊子将两边皮肤夹起来，以防腹腔液流出。把内脏推向一侧后，可用不装针头的注射器或吸管吸取腹腔液，小心操作，以免腹腔内血管破裂，吸取到小鼠腹腔外周血细胞。
1.2.3 制片及染色方法 取腹腔液滴于洁净的载玻片上，按血涂片制备法制备细胞涂片。空气干燥后，载片放入100%甲醇液的固定缸中固定5min。固定后的载片，采用扣染法，即用牙签架起载片，细胞面朝下反扣在玻板上，用Giemsa染色液（Giemsa原液1份，0.075mol/L磷酸缓冲液9份）染色载片，染色时间为20min。染色完成后，揭起载片，用滴管吸取蒸馏水轻缓冲洗载片，洗去多余的染液。
1.2.4 显微观察及吞噬百分率和吞噬指数的计算 载片空气干燥后，在OLympus BX41显微镜下观察，用DP70摄像头进行显微拍摄，并用IPP5.0软件进行显微照片标尺标记。40倍物镜下已能观察到游离的鱼红细胞及吞噬鱼红细胞的巨噬细胞。实验共用小鼠5只，实验过程中未出现死亡，每只小鼠制备5片涂片。每片随机观察数个视野，记录100个吞噬细胞的吞噬结果，计算吞噬百分率、吞噬指数。吞噬百分率（%）=吞噬鱼红细胞的巨噬细胞数/计数的总巨噬细胞数（吞噬及未吞噬的）×100。吞噬指数=巨噬细胞中所吞噬的鱼红细胞数/计数的总巨噬细胞数。
2 实验结果
2.1 巨噬细胞吞噬状态 在普通光学显微镜下，可清晰观察到主要的三类细胞，鱼红细胞、未吞噬鱼红细胞的巨噬细胞（图1中1）及吞噬一个或数个鱼红细胞的巨噬细胞（图1中2～4）。鲫鱼红细胞多为长椭圆形，核常位于细胞中部，胞核染为深紫色。巨噬细胞大多呈不规则形状，胞体表面不光滑，常有突触，细胞核较大，呈肾形、圆形或其他不规则形状，染为紫红色。巨噬细胞吞噬鱼红细胞，常能观察到以下几种吞噬状态：巨噬细胞内鱼红细胞膜仍完整；巨噬细胞内鱼红细胞膜不完整或破裂；巨噬细胞内具有一个或数个大小不等的鱼红细胞细胞核；还可观察到巨噬细胞膜凹陷，鱼红细胞紧贴在凹陷处正在被吞噬。图1显示激活状态的巨噬细胞及多种吞噬鱼红细胞的状态。
2.2 吞噬率和吞噬指数 实验测得小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鱼红细胞的吞噬率为25.0%，吞噬指数为0.31。与鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数相近[6-7]。
3 讨论
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验是生物科学及医学专业本科层次细胞生物学课程开设的实验必修项目。近年来，由于禽流感[8]的流行，细胞生物学教学实验室通过多次试验、反复摸索和研究“小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验”这一实验内容，在传统方法的基础上不断改进。主要的改进有以下3个方面：一是采用小鼠实验前连续3d定时免疫，有效增加了腹腔内处于激活状态的巨噬细胞数量。二是取鱼血红细胞作为吞噬物，且所取鱼血不用添加抗凝剂，直接用不加血清的L15细胞培养液来稀释血细胞，实验效果明显，完全符合实验要求。三是染色方法的好坏直接关系到对实验结果的观察，本实验应用Giemsa染色扣染法，巨噬细胞及鱼红细胞染色均清晰，细胞的形态结构更加明显，能有效地分辨各类细胞的细胞核、细胞浆及吞噬鱼红细胞的各种状态。此实验方法已用于我院本科生实验教学，师生们普遍认为实验结果便于学生观察和计数，有助于学生对吞噬细胞吞噬作用的理解和掌握，提高教学效果。
综上所述，采用鱼血细胞作为吞噬物，实验结果明显，吞噬率及吞噬指数均高于或接近于鸡红细胞的数据，并进一步完善了实验方法，实验结果更直观与清晰。同时巨噬细胞吞噬实验常用于免疫增强药物活性的测定，其中以体内法最能反应实际吞噬能力，这一方法常用鸡红细胞来进行测定，是否也可用便于取材的鱼红细胞来测定，值得进一步实验和探讨。
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泸州医学院附属医院整形烧伤科，四川泸州646000
[摘要] 中性粒细胞、巨噬细胞在整个烧伤免疫过程中起者重要作用。所以弄清严重烧伤后中性粒细胞、巨噬细胞的功能变化及其所带来的影响对预防烧伤后并发脓毒血症、多器官功能衰竭显得尤为重要。现将严重烧伤后中性粒细胞、巨噬细胞的功能变化及其影响作一综述。
关键词 烧伤；中性粒细胞；巨噬细胞
[中图分类号] R644.02[文献标识码] A[文章编号] 1674-0742（2014）04（b）－0195-02
[作者简介]赖晓敏（1987.7-），男，四川人，硕士， 主要从实整形烧伤工作。
严重烧伤后并发脓毒血症、多器官功能衰竭是目前烧伤重要的死亡原因之一，其病情发展快，死亡率极高。是目前烧伤治疗所面临的一个巨大挑战[1-3]。究其本质是有炎症因子所介导的全身炎症反应综合征（SIRS）。而中性粒细胞（Polymorphonuclear neutrophils，PMN）、巨噬细胞（Macrophages，m）在整个过程中起着重要作用。所以弄清严重烧伤后PMN、巨噬细胞的功能变化及其所带来的影响对预防烧伤后并发脓毒血症、多器官功能衰竭显得尤为重要。现将严重烧伤后PMN、巨噬细胞的功能变化及其影响作一综述。
1中性粒细胞的生理特点和功能
PMN是外周血含量最多的白细胞，具有变形、游走、趋化、吞噬和分泌等特性。①PMN能伸出伪足做变形运动，通过这种运动，PMN得以穿过毛细血管壁。②渗出到血管外的PMN可以借助变形运动在组织内游走。③在趋化因子的作用下PMN可以朝向某些特定的化学物质运动。这些趋化因子包括两大类：外源性趋化因子和内源性趋化因子。外源性趋化因子包括：可溶性细菌产物（含有N-甲酰基蛋氨酸末端的多肽）。内源性趋化因子包括：补体成分（如C5a）、白三烯、细胞因子（IL18）等。④PMN到达炎症病灶后，通过其细胞质内的嗜天青颗粒和特异性颗粒所含有的水解酶、中性蛋白酶、MPO、阳离子蛋白、溶酶菌乳贴蛋白及碱性磷酸酶将细菌杀灭。⑤PMN在趋化、吞噬过程中还可释放溶酶体酶、活性氧自由基、前列腺素，白三烯等损伤内皮细胞和组织，加重原有的损伤。
2巨噬细胞的生理特点和功能
巨噬细胞是由未发育成熟的单核细胞迁入组织中继续发育而成的具有吞噬和免疫功能的细胞。其细胞体积较大，可达60~80 μm，溶酶体颗粒和线粒体数目增多。因此，巨噬细胞的吞噬能力强，可吞噬更多更大的细菌和颗粒。①免疫功能：巨噬细胞能合成和释放多种细胞因子，包括CSF、白细胞介素（IL-1、IL-3、IL-6、IL-18），肿瘤坏死因子、干扰素等。有研究表明，巨噬细胞可提高HLADR-CD86 等抗原提呈分子的表达，释放单核细胞趋化因子MCP-1，TNF -a等多种炎症因子，诱导和活化其他炎性细胞，在炎症反应中起着重要作用[4]。②吞噬功能：能够吞噬病原体和坏死细胞，有助于启动康复过程。巨噬细胞吞噬病原体和坏死细胞的过程包括识别、吞入、杀伤和降解。巨噬细胞通过细胞表面的非特异性受体吞噬病原菌和坏死细胞。巨噬细胞是通过介导吞噬的相关受体与微生物表面接触，从而启动复杂的信号通道，通过细胞骨架的重排和膜的输送介导对微生物细胞吞噬效应[5-6]。当病原菌进入吞噬溶酶体后可被依赖和非依赖氧途径杀伤和降解。
3严重烧伤后中性粒细胞功能的变化及其影响
PMN在整个炎症反应发生过程中起着重要作用，严重烧伤后PMN不仅可以穿过血管壁聚集到损伤区域， 吞噬异物、杀灭细菌[7]，还可直接释放炎症介质，且与内皮细胞黏附后可造成自身组织损伤[8]。①严重烧伤后PMN延迟凋亡。有研究表明[9-12]，严重烧伤后PMN的凋亡发生延迟，而延迟凋亡的PMN可发生继发性坏死，释放大量炎性物质，导致炎症反应的扩大，促发全身炎症反应综合征（SIRS），导致局部和全身的组织损伤甚至脏器的损伤。②PMN的趋化功能改变。PMN趋化因子包括：病原菌、补体C3a、C5a、C、纤维蛋白降解产物、纤维肽B和血管舒缓素等。严重烧伤后，PMN的趋化性立即增加，主要是因为不耐热刺激活动的增加，然后其趋化性逐渐减弱。而PMN趋化性减弱的时间出现越早，其持续时间将越长。有研究表明[13]烧伤后创面应用磺胺嘧啶银的患者，其血清对正常人PMN的趋化性有抑制作用。实验证明，IL-18能够促进PMN的趋化作用[14]。腹腔注射IL-18后，能够增加肠道PMN的浸润，导致肠道组织水肿[15]。③严重烧伤后PMN的吞噬功能明显下降，早期吞噬细胞的吞噬指数和吞噬细胞百分率下降，一周左右恢复。有文献报道[16]大鼠5Gy60Coγ射线全身照射复合15%TBSAⅢ度光辐射烧伤后，PMN的吞噬功能明显降低。④中性粒细胞的杀菌功能改变。当病原菌被PMN吞噬后，主要通过氧依赖过程和氧不依赖过程进行细胞内杀灭细菌。有实验证明[17]烧伤后各种因素均可激活中性粒细胞，如坏死组织、缺血、缺氧、炎症介质和细胞因子等。不但可使PMN生成增加，也使外周血中成熟的PMN游出血管，PMN到达创伤部位可释放出氧自由基、蛋白水解酶等起着杀菌作用，同时也造成组织新的损伤，表现为创面的加深和扩大。
4严重烧伤后巨噬细胞功能的变化及其影响
人体具有免疫功能的细胞主要包括嗜PMN、单核巨噬细胞和淋巴细胞等。其数量和功能与感染密切相关，而在这些免疫细胞中，M发挥着极其重要的作用。烧伤后巨噬细胞活化，分泌能力增强， 大量释放炎症介质，是引起全身炎症反应综合征的原因之一。（1）烧伤后部分巨噬细胞的表型可发生改变。有实验证明：①烧伤后巨噬细胞产生一氧化氮的量增加。Schwacha等[18]证明，烫伤小鼠的脾脏巨噬细胞诱导型一氧化氮合成酶活性增加。②巨噬细胞产生PGE2的量呈明显增加[19]。③烫伤小鼠脾脏巨噬细胞中诱导型环氧化酶2（COX-2）的活性增加[20]。④烧伤后巨噬细胞产生IL-10的量增加。以上均提示烫伤引起了巨噬细胞表型的变化。（2）严重烧伤后M的免疫功能改变：研究表明[21]，烧伤后巨噬细胞被激活，巨噬细胞实现抗原提呈功能的人白细胞DR抗原的表达率明显下降，下降的程度及所持续的时间与烧伤严重程度有关。目前认为：当DR抗原表达率不足30%时，可认为单核细胞免疫麻痹[22]。（3）烧伤后巨噬细胞的吞噬能力增强：实验证明[23]：兔角膜碱烧伤后，腹腔巨噬细胞的体积明显增大，吞噬能力显著增强。在烧伤后9周内，其对异物性细胞的吞噬率及吞噬指数明显高于烧伤前。
5结论
以上研究表明烧伤后PMN、巨噬细胞的功能发生了一系列复杂的变化，其在全身炎症反应综合征，烧伤后并发脓毒血症，多器官功能衰竭中都起着重要作用。弄清其功能的变化及其所带来的影响对预防烧伤后并发脓毒血症、多器官功能衰竭尤为重要。但目前尚缺乏有效控制或恢复烧伤后PMN、巨噬细胞功能的药物或技术手段。一些功能改变的机制尚待进一步研究。
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关键词：氨氯地平；氧化低密度脂蛋白；基质金属蛋白酶-9；稳定斑块
中图分类号：R972 文献标识码：A 文章编号：1672-1349（2012）01-0073-02
冠状动脉粥样硬化斑块由稳定转为不稳定，继而破裂导致血栓形成，是急性冠脉综合征（ACS）最主要的发病机制［1］。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP- 9)是MMPs家族中的重要成员，是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)代谢的关键酶之一,在动脉粥样斑块处的血管重构、斑块的不稳定及破裂诱发的ACS中都起着十分重要的作用［2］。
氨氯地平（Amlodipine）是广泛用于临床的第三代新型长效二氢吡啶类钙通道阻滞剂(calcium channel blockers,CCB)，临床上主要应用于高血压治疗的一线用药。
1 材料与方法
1.1 研究对象 健康成人静脉血液来自山西医科大学第二临床医院体检中心；人淋巴细胞分离液（Lymphocytes Separation Medium1077）为上海华精生物高科技有限公司产品；RPMI-1640培养液；胎牛血清为杭州四季青公司产品；佛波酯购自美国SIGMA公司；氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）为北京协生生物科技有限公司产品；FITC-CD14抗体购自日本Beckman Coulter公司。RNA提取试剂盒（TransZol）购自北京全式金生物技术公司；逆转录-多聚酶联反应（RT-PCR）试剂盒购自北京全式金生物技术公司；引物序列由上海生工生物有限公司合成；酶联免疫（ELISA）试剂盒购自美国R＆D公司；氨氯地平为辉瑞公司馈赠。
1.2 巨噬细胞分离、培养、诱导和鉴定 取肝素抗凝静脉血30 mL分装到10个离心管，用RPMI-1640液稀释1倍并充分混匀，分别缓慢加入等比例淋巴细胞分离液于离心管中，2000 r/min离心20 min后，吸取中间环状云雾状淋巴细胞层，再以3 mLPBS液充分混匀，1 500 r/min离心洗涤2次；用含10%胎牛血清的RPMI-1640各5 mL将细胞吹开混匀，取细胞悬液至培养瓶，每瓶4 mL，于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育，培养至4代后于细胞指数生长期进行诱导转化实验。诱导转化时，以40 ng/mL的PAM无胎牛血清RPMI-1640培养液继续培养48h～72 h，待细胞转化为巨噬细胞后以RPMI-1640培养液洗涤3次，置于10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中继续培养48 h。台盼蓝染色法测定细胞存活率。用特异性荧光素标记的CD14细胞表面抗体行流式细胞术进行单核细胞源性巨噬细胞鉴定。
1.3 试验分组 试验共分5个组。空白对照组，不进行任何干预，仅单独培养单核巨噬细胞24h；ox-LDL对照组，只加入ox-LDL 100 mg/mL孵育24 h；试验三组分别加入100 mg/mL ox-LDL孵育2 h后，再分别加入氨氯地平低剂量0.1 μmol/L;中剂量1.0 μmol/L;高剂量10.0 μmol/L培养24 h。
1.4 半定量RT-PCR检测MMP-9mRNA的表达水平
1.4.1 RNA提取 弃培养瓶中的培养液，每瓶加入1.0mLTrizol，依次加入氯仿、异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤后略晾干，溶于25 μL DEPC中。核酸紫外分析仪检测，根据260/280比值，所有样品A260/A280比值1.9~2.0。并根据260 nm 的吸光度值对样品的总RNA进行初步定量,确定样品中RNA纯度和含量。
1.4.2 反转录反应 反转录反应在20 μL体系中进行：含1 μg RNA，20 mg/L的oligo（dT）引物，1.0 mml/L dNTP，20 U Rnase抑制剂，1×Buffer，200UM-MLV反转录酶。于PCR仪上42 ℃反应1 h，72℃灭活10 min后保存于-20 ℃冰箱中。
1.4.3 PCR扩增反应 MMP-9上游引物序列为：5′-TCCCTGGAGACCTGAGAACC-3′；下游引物序列为：5′-GGCAAGTCTTCCGAGTAGTTT-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循环29次；末次延伸7 min，产物长度为307 bp。B-actin上游引物序列：5′-CCTGAGGCACTCTTCCAG-3′,下游引物序列：5′-TCACACTTCATGATGGA-3′,产物大小100 bp。
1.4.4 凝胶电泳 取PCR产物10 μL在琼脂糖凝胶上电泳，计算机凝胶成像系统扫描拍照，Toptal软件分析灰度值，以各条带与β-actin内参条带灰度比值，代表MMP-9 mRNA转录水平。
1.5 酶联免疫吸附双抗体夹心法测定MMP-9蛋白含量 取六孔培养板上清液进行酶联免疫吸附双抗夹心法（enzyme linked immuno-sorbent assay,ELISA）测定，每组重复6次。
1.6 统计学处理 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，用SPSS 13.0建立数据库,采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。
2 结 果
2.1 ox-LDL诱导的单核巨噬细胞MMP-9 mRNA表达 与空白对照组比较，ox-LDL各组MMP-9 mRNA表达明显增加（P＜0.05）；与ox-LDL对照组比较，不同剂量氨氯地平组MMP-9 mRNA表达明显降低（P＜0.05）；ox-LDL诱导后，不同剂量氨氯地平各组之间比较，随着氨氯地平剂量增加，MMP-9 mRNA表达逐渐降低（P＜0.05）。详见表1。
2.2 ox-LDL诱导的单核巨噬细胞MMP-9蛋白表达 与空白对照组比较，ox-LDL对照组MMP-9蛋白表达明显增加（P＜0.05）；与ox-LDL对照组比较，不同剂量氨氯地平组MMP-9蛋白表达明显降低（P＜0.05）。 ox-LDL诱导后的不同剂量氨氯地平组之间比较，随着氨氯地平剂量增加MMP-9蛋白表达逐渐降低（P＜0.05）。详见表1。
3 讨 论
心血管疾病病理基础是动脉粥样硬化，而血栓的形成与炎症反应在动脉粥样硬化的形成和发展过程中的作用非常重要。冠状动脉粥样硬化斑块由稳定转为不稳定，继而破裂导致血栓形成，是急性冠脉综合征最主要的发病机制［1］。粥样硬化斑块破裂以及血栓介导的急性心肌梗死最重要的决定因素是斑块的组成成分,单核巨噬细胞的聚集，以及合成MMPs的增多和/或内源性基质金属蛋白酶抑制物减少，是造成粥样斑块纤维帽厚度和抗损伤强度降低，斑块稳定性下降的重要因素［3］。
基质金属蛋白酶降解细胞外基质致纤维帽变薄破裂，是急性冠脉综合征临件发生的重要原因,MMP-9是其中重要一员［4］。MMP-9由活化的巨噬细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞等以蛋白酶原前体的形式从细胞内分泌到细胞外，MMP-9的作用底物有明胶、Ⅳ型和Ⅴ型胶原、蛋白聚糖、弹性蛋白。MMP-9活性增强可导致胶原裂解增加［5］。在动脉粥样硬化斑块局部,MMPs主要来源于激活的巨噬细胞和泡沫细胞。近年来有研究发现,在人动脉粥样硬化斑块容易发生破裂的部位(尤其是斑块肩部和脂质核处) ,MMP-1、MMP-2、MMP-9 和MMP-3 活性均有增高［6］。
氧化低密度脂蛋白作为独立的危险因素在动脉粥样硬化的发生发展及急性冠脉综合征形成中占有重要的地位，在动脉粥样硬化中ox-LDL除了直接导致内皮损伤外，还可以引起单核细胞趋化、巨噬细胞源泡沫细胞形成和细胞毒性产生 ,并且可以调节粥样斑块内血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞等多种细胞和生长因子的合成［7］。ox-LDL 可增加单核细胞源巨噬细胞MMP-9 的蛋白表达并增强其活性，是细胞功能和基因表达的主要调节因子［8］。
氨氯地平可能机制有抗氧化、抗炎、改善内皮功能、抑制血管平滑肌增殖与迁移、保持斑块稳定性等［9］。
本研究用ox-LDL诱导人单核巨噬细胞24 h后，与单核巨噬细胞组相比，MMP-9mRNA及其蛋白表达增加，与文献报道一致；ox-LDL诱导人单核巨噬细胞2 h后，加入不同剂量的氨氯地平，与ox-LDL空白对照组相比，MMP-9的表达减少且与氨氯地平的剂量有浓度剂量依赖关系。氨氯地平可通过抑制ox-LDL诱导的人单核巨噬细胞MMP-9的表达，发挥稳定粥样斑块和抗炎的作用，减少急性冠脉事件的发生，但其通过何种途径减少MMP-9的表达，还有待进一步研究。
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巨噬细胞移动抑制因子（MIF）是一种重要的前炎症因子，主要作用为抑制巨噬细胞的游走移动，促进巨噬细胞在炎症局部浸润、聚集、增生、活化，增强其黏附、吞噬作用，还能促进多种炎性细胞因子的生成。MIF广泛参与机体多种生理及病理生理学反应，包括炎性反应、肿瘤生成和皮肤创伤修复等。MIF在病毒性心肌炎发病机制中起重要作用。近年来，随着克隆MIF cDNA的成功及其结构的阐明，MIF的特殊生物功能及其在不同炎症性疾病中的重要作用已日益为人们所重视。病毒性心肌炎（viral myocarditis，VM）是由亲心肌病毒感染所致以心肌炎症病变为主的疾病，MIF是一种重要的促炎因子，MIF在VMC发病机制及治疗中的作用成为目前研究的热点。因此，本文将MIF的最新进展及其与VM的关系作一综述。
1 MIF的细胞和组织学来源
MIF既产生于激活的T细胞、单核巨噬细胞及脑垂体前叶，也产生于多种组织细胞，哺乳动物的MIF mRNA和蛋白广泛表达于各种各样的造血细胞、中枢和外周神经细胞、具有内分泌和外分泌功能的上皮细胞、脂肪细胞、表皮细胞、汗腺细胞、肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞、血管内皮细胞、角膜上皮细胞及内皮细胞、皮肤角质细胞、肝细胞、肺、前列腺及等[1]。单核巨噬细胞是血液中MIF的主要来源。
2 MIF的膜受体
细胞因子通常需要与其相应的受体结合，活化信号传导途径而发挥生理作用。目前大量研究证实MIF激活丝裂原激活蛋白激酶（MAPKs）家族成员之一的细胞外信号调节激酶（ERK1/ERK2）传导通路，而对其激活方式是受体依赖型还是非受体依赖型的研究也是近年来的热点。2003年Leng等[2]研究发现，CD74是MIF的可能膜受体。MIF可能通过与细胞膜表面蛋白CD74的细胞外基团结合而发挥作用。CD74为MHCⅡ类相关恒定链，是一种跨膜蛋白。MIF与CD74分子的胞外部分即73-232位氨基酸残基高亲和力结合后，激活ERK磷酸化级联反应，从而引起各种细胞的增生及炎性介质的合成与释放，产生各种生理效应，而两种抗CD74抗体（LN2或M-B741）可明显阻抑MIF的上述作用。CD74胞外部分的可溶性片段sCD7473-232及抗CD74 中和性抗体均可抑制细胞膜上的CD74分子与MIF的结合，从而阻抑MIF的促炎作用。
3 MIF的基因与蛋白结构
人类基因组中MIF定位于21号染色体(21q22，3)，为单拷贝基因。但在小鼠基因组中，则是由10个以上假基因组成的多拷贝基因，定位于10号染色体上。MIF的基因较小，人和小鼠的MIF mRNA长度大约为0.8 kb。1995年，美国Duke大学医学中心Picower医学研究所Mitchell等人首次克隆了人MIF基因。人MIF基因全长约2 119 bp，其编码区由3个外显子和2个内含子组成，启动子区域有几个保守的DNA序列可以和转录因子AP1、NF-κB、ETS、GATA、SP1、cAMP结合元件反应蛋白等结合，从而受其调控。在MIF cDNA序列中，第173位碱基G或C的变化构成了MIF的单核苷酸多态性。MIF蛋白结构独特，为α/β结构，以同源三聚体形式存在，通过单体内的β2片层及α2螺旋C末端之间氢键相互作用加以稳定[3]。人和啮齿类动物MIF蛋白质的一级结构为115位氨基酸残基，相对分子量为12.5 kD。不同种动物的MIF蛋白质分子的氨基酸序列同源性大于80%，同源性最高的为大鼠和小鼠的MIF蛋白质，仅差1个氨基酸，人和小鼠的同源性也高达90%。人和大鼠的MIF蛋白质三维结构基本相似，差别仅在于C末端的11氨基酸碱基上。
4 MIF的生物学功能
4.1 免疫调节功能：MIF是先天性免疫和获得性免疫的重要调节因子，是宿主抵抗致病微生物免疫防御系统和应激反应系统中不可缺少的成员。在免疫过程中，MIF不仅有抑制巨噬细胞游走、黏附、吞噬和聚集的功能，还促进其在炎症局部浸润、增生、激活及通过调节细胞信号转导，促进某些细胞因子的表达，分泌细胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ，同时使NO释放增加和磷脂酶A2的表达增强，产生促炎作用[4~5]；而抗MIF中和性抗体则对过度炎症反应具有显著的保护作用；反义MIF可以下调Toll蛋白样受体4-LPS受体复合物的信号转导分子，减少Gˉ细菌LPS诱导的TNF-α产生，同时负性调节NF-κB调节的相关细胞因子基因的转录。
4.2 对肿瘤的作用：有报道发现肺癌、鼻咽癌、膀胱癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、结肠癌、食管鳞状细胞癌、胃癌以及颅咽管瘤等细胞上有MIF mRNA及蛋白表达，并且多数呈高表达[6]。进一步研究可证实转移生长因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor， PDGF）均可上调MIFmRNA及蛋白表达，说明MIF可直接或通过协助其它生长因子而间接地促进肿瘤细胞生长。近期又有发现，抗MIF抗体可有效地抑制肿瘤细胞在淋巴细胞系和血管内皮细胞系中的生长及新血管的形成，从而有效地减慢肿瘤的生长速度。另外，有研究提示，癌细胞的MIF高表达可能影响了肿瘤细胞间的黏附性，使肿瘤细胞更加容易相互分离移动，并向周围邻近组织侵袭，从而促进恶性肿瘤的浸润转移。目前，关于MIF促进肿瘤发生发展的机制还不清楚，有研究认为MIF对抑癌基因P53的抑制作用可能与其致癌作用有关[7，8]。另外，MIF也可以通过促进基质金属蛋白酶MMP-9的表达增加，从而促进癌细胞向淋巴结的转移。
4.3 神经内分泌功能：MIF作为垂体激素和糖皮质激素的一种负反馈调节剂。某些促甲状腺素垂体细胞通过下丘脑-垂体-肾上腺轴起始宿主应答时伴有MIF的释放，在下丘脑切除的裸鼠里注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）后发现垂体细胞释放MIF的量与血清中MIF的量基本接近。在下丘脑-垂体-肾上腺轴受刺激后，垂体以“激素样”方式分泌MIF。MIF可能是一种对糖皮质激素起负调节作用的细胞因子。
4.4 酶学功能：MIF能催化互变异构反应和氧化还原反应，具有3种催化活性作用[9]：为多巴色素异构酶；羟苯丙酮酸互变异构酶，能催化羟苯丙酮和羟苯丙酮酸的酮基-烯酸的互变异构；谷光甘肽（GSH）和二羟酯酰胺作为MIF生理性氧化还原底物，并且它还作为一种新型蛋白质-巯基氧化还原酶参与氧化还原反应。但MIF明确的生理和病理生理功能与催化特性间的关系并未确定。
4.5 损伤修复功能：有研究发现在角膜损伤的愈合过程中，伴随着角膜细胞浸润和内皮细胞的分化，MIFmRNA的表达水平也相应增加。随后发现，在小鼠皮肤损伤愈合过程中，MIF表达有增加趋势，而应用抗MIF抗体可推迟损伤的愈合。近期Mitchell 等发现内源性、外源性MIF均可刺激NIH/3T3成纤维细胞的增殖，MIF的这种促增殖效应与P44/P42有丝分裂原激活的蛋白激酶的活性有关。此外，他们还发现MIF可通过蛋白激酶A来调节胞质中磷脂酶的活性；而外源性增加的rMIF还可逆转糖皮质激素对胞质中磷脂酶A2的抑制作用，
5 MIF与VM
VM是临床较常见的疾病之一，患病率达21.83/10万，且年龄越小，发病率越高。病毒感染后所致的心脏炎症可累及心肌细胞、间质组织、血管成分及心包，而导致急性、亚急性和慢性病变。VM急性期可引起心衰、心律失常等症状，极少数患者因严重心律失常、心力衰竭和心源性休克而死亡。部分患者由于急性期后炎症持续，转为慢性心肌炎，出现进行性心脏扩大、心功能减退、顽固性心律失常，经过数年或更长时间后死于并发症。引起VM的病原体有20余种，但最常见的为柯萨奇病毒B组（coxsackievirus B，CVB），有50%以上的VM与之有关，其次为腺病毒（adenovirus，ADV）。VM的发病机制至今尚未完全阐明，目前多数认为是病毒直接损害和免疫变态反应所致。目前临床上VM常采用支持治疗、中药、抗心力衰竭和抗病毒药物、免疫抑制剂等治疗方法，但疗效欠佳，部分预后不良[10]。因此，深入研究该病的发病机制，阐明其病理生理过程，寻找有效的药物治疗和生物治疗靶点，成为国内外学者研究的热点和难点。
近年来VM发病率呈增长趋势，现已知CVB是VM的主要病原，并认为CVB诱导的心肌炎可能在感染过程中依赖细胞因子的释放，细胞因子在VM发病机制中占有主导地位。MIF是新发现的一种多效型细胞因子，是一种重要的前炎症因子，由单核巨噬细胞、激活的T细胞、角质细胞等产生，其主要作用为抑制巨噬细胞的游走移动，促进巨噬细胞在炎症局部浸润、聚集、增生、活化，增强其黏附、吞噬作用，此外，还能促进IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等多种细胞因子的生成，从而间接增强巨噬细胞的功能，参与机体炎性反应和免疫应答。最近，MIF在心肌炎中的作用受到广泛关注。Matsui等[11]在实验性自身免疫性心肌炎中发现，心肌组织MIF mRNA和蛋白水平明显增加，此外，血清MIF浓度也显著升高，而通过MIF中和抗体阻断MIF的表达则可以明显减轻心肌的病变程度，以及降低心肌中VCAM-1（血管细胞间黏附分子）、IL-1β、TNF-α的表达。同样，Shioji等[12]在研究自身免疫性巨细胞性心肌炎时发现，当注射MIF中和抗体后，心肌炎症病变也显著减轻。郭富强等[13]的研究亦发现，MIF在柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心肌表达上调，与心肌损害程度密切相关。张小佛等[14]报道急性VM患儿血清MIF水平明显升高，并与CK-MB呈正相关。这些研究提示，MIF可能与VM的形成有密切关系，有望成为治疗和预防VM的一种关键靶分子。
6 展望
MIF作为机体的一种多效性的细胞因子，在炎症应答、免疫调节、神经内分泌和细胞增殖中发挥作用，近年来其在VM发生中的致病作用倍受人们关注。尽管目前对其致病机制还不完全清楚，但MIF的中和抗体已经在动物实验和临床上取得较好的疗效，另外，其他拮抗MIF的药物也相继被发现，如维生素E和西替利嗪等。因此，随着研究的深入，针对MIF的干预治疗将为临床治疗VM提供一个新的思路和方法。
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最初发现MIF在先天性免疫和获得性免疫过程中起重要作用。既能活化淋巴细胞、粒细胞及巨噬细胞，又能抑制糖皮质激素的生理作用，从而调节免疫系统功能。进一步研究发现抑制MIF可改善自身免疫性疾病大鼠模型的病情进展；此外，值得注意的是MIF在多种肿瘤细胞中高表达，这使得MIF极可能成为治疗自身免疫病及肿瘤的新靶点。很多研究表明MIF与急性胰腺炎、炎性肠病、川崎病、哮喘、脓毒症等炎症性疾病及胃癌、肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤密切相关，本文将对其分子机制做一综述。
1MIF在细胞中的分子作用机制
MIF由115个氨基酸构成，分子量为12.5kd，二级结构与主要组织相容性抗原（MHC）高度相似，由两个反向平行的α螺旋和六个β折叠构成。MIF的活性形式是由三个同源单体构成的三聚体与D-多巴色素互变异构酶高度同源。这种独特的三级结构使其具有异构酶活性，它的羧基末端是其酶学活性的关键并能稳定其三级结构[1]。已合成多种MIF抑制剂，ISO-1抑制MIF互变异构酶活性及其细胞因子活性，抑制内毒素大鼠巨噬细胞TNF的释放，降低其死亡率；Mitchell等[2]合成了一种效用强于ISO-1的小分子量MIF抑制剂4-IPP，能不可逆性抑制MIF异构酶活性，尤其是在癌症组织中。
最初认为MIF由T淋巴细胞分泌作用于巨噬细胞，然而接下来的研究发现巨噬细胞、B淋巴细胞、粒细胞等大多数炎性细胞均表达MIF，并在宿主防御反应中起关键作用。大多数上皮细胞表达并储存MIF，鉴于上皮细胞是阻挡病原体的第一道屏障，MIF的存在提示其在早期固有免疫中起重要作用。有趣的是MIF在腺垂体中被检测到，特别是在分泌ACTH的细胞内，在此MIF的分泌遵循昼夜节律，并与皮质类固醇的分泌峰值相一致。从在不同组织细胞中的分布情况看，MIF很可能不仅在机体免疫防御方面起重要作用，还有其他生理功能未被阐明。
尽管MIF在多种免疫细胞中的作用已经知晓，但科学家花了很长时间研究它所参与的信号传导途径。试验表明MIF信号传导途径的受体CD74为一种II型跨膜蛋白，在巨噬细胞CD74与MIF结合具有高度亲和力，这种复合物介导胞外MAPK活性及细胞增殖。此外CD44作为MIF的复合跨膜受体协同引发ERK1和ERK2激酶磷酸化，MIF与CD74和CD44受体丝氨酸磷酸化有关，进一步能够抑制细胞凋亡[3]。Bernhagen J等[4]研究认为MIF竞争性结合功能性受体CXCR4和CXCR2，形成CXCR2-CD74-MIF复合物诱发单核细胞聚集于动脉粥样硬化炎性病变处，可实测到快速整合蛋白及钙离子内流。而MIF缺陷大鼠动脉粥样硬化模型可见单核细胞聚集明显减少。作者认为MIF具有趋化因子样功能调节炎性细胞募集。MIF与受体结合后，发生细胞内ERK-MAP信号通路级联反应，通过细胞周期蛋白D1转录和Rb基因磷酸化促进细胞增殖。在此快速短暂级联反应中还有另外一条通路，MIF与蛋白Jab-1/CSN5在胞内结合，丝氨酸激酶起重要作用并加快细胞周期[5]。
2MIF与炎症
MIF最初被发现于研究IV型迟发型免疫反应的细胞上清液中。结核菌素注射引发的炎性细胞浸润的巨噬细胞亦产生MIF，与对照组比较MIF抗体明显减轻过敏反应及炎性细胞浸润。因此，MIF被认为是一种促炎性细胞因子。这种观点进一步在感染性休克大鼠模型上得到证实，注射内毒素之后MIF的分泌及蛋白合成明显增加，然而加入重组MIF后这种效应被减弱。利用反义MIF可抑制MIF及TNF α等细胞因子的产生，这表明MIF具有自分泌功能以抑制类固醇效应及部分细胞因子的生成[6]。在多种炎性组织中均检测出MIF分泌增多，然而破坏MIF功能能否减轻炎症反应及疾病预后，各项研究成果有所冲突。
Bacher 等报道MIF能够影响T细胞的增殖与活性。随后发现巨噬细胞不仅是MIF的效应细胞也是MIF的分泌细胞，而MIF增强TNF及IFN的表达，这种自分泌的形式加快了细菌自感染病灶的迁移，并且能够减少中性粒细胞的凋亡[6]。Roger等[6]一系列实验研究表明MIF作用于巨噬细胞及单核细胞的TLR-4（Toll-like receptor 4），后者则是内毒素受体。MIF基因敲除大鼠仅低表达这种受体，这或许能够解释内毒素对这种大鼠相对较低的致死率。
当机体处于“应急”或免疫反应时，肾上腺释放糖皮质激素，后者可以削弱Th1及单核巨噬细胞的活化，抑制促炎细胞因子的释放和PLA2的合成，减轻炎症反应。另一方面，腺垂体和单核巨噬细胞又合成大量的MIF，MIF又可促使巨噬细胞释放大量细胞因子，两者的分泌可相互促进。这提示MIF和下丘脑垂体肾上腺轴有直接的因果关系，具有拮抗糖皮质激素的抗炎作用。这种相互拮抗作用提示有某种潜在机制避免炎症反应过度化[7]。Attila Paszt等应用糖皮质激素及其拮抗剂干预AP大鼠模型示MIF是急性胰腺炎发病过程中的一个关键性炎症因子，糖皮质激素在其导致的多器官损害中发挥重要作用[8]。
多项研究表明MIF在特应性皮炎、哮喘、银屑病、溃疡性结肠炎、风湿性关节炎等多种炎性疾病中高表达。Otukesh等[9]对小儿尿路感染的临床研究显示MIF可作为鉴别膀胱炎与肾盂肾炎的一项重要指标，并且是永久性肾损害的危险因素。Santos等[10]研究认为MIF作为一种多效性促炎性细胞因子在风湿性关节炎具有多个细胞靶点，通过MAP激酶及ERK激酶信号通路活化T细胞，促进特异性免疫反应，与风湿性关节炎的严重程度密切相关。J.Wu等[11]研究认为MIF具有多态现象，因基因启动子在不同炎性疾病中表达不同，并证实MIF-173G/C与小儿哮喘密切相关。在DSS诱导的溃疡性结肠炎大鼠中MIP-1及MCP-1表达显著增加，活体研究发现MIF调节MIP-1及MCP-1的表达，MIF缺陷大鼠炎性改变明显减轻，揭示MIF在自身免疫性肠病的发病起关键作用[12]。
3MIF与肿瘤
目前认为，MIF作为一种独特的细胞分泌因子，不仅可以参与调节炎症反应以及机体免疫调节反应，而且MIF 还在多种肿瘤细胞，癌前病变中都过表达，从而促进肿瘤的发生和发展[13]，和细胞增殖、细胞分化及肿瘤血管生成等关键环节密切相关[14]。
有研究证明，靶向沉默MIF基因后，肺腺癌A549细胞的侵袭与迁移能力下降90%，若MIF过表达，则可观察到相反现象[14]。MIF参与了肺癌特别是非小细胞肺癌(NSCLC)的发生和发展，研究表明：NSCLC 肺癌组织标本高表达MIF与血中血管内皮生长因子(VEGF) 和肺癌组织CXC趋化因子表达升高呈正相关，特别是与肿瘤组织微血管密度呈显著正相关。McClelland等[15]进一步发现，NSCLC组织标本异的MIF受体－CD74 表达同样显著增高且诱导体内外促血管新生的CXC趋化因子表达升高；MIF 这种诱导血管新生效应可被CD74 抗体所拮抗；侯俊娜等[16]研究表明：大细胞肺癌H460 细胞株高表达MIF蛋白，体外应用siRNA 靶向沉默MIF基因后，H460 细胞的活性、增殖能力下降; 继而用AnnexinV-FITC / PI 双染色凋亡检测发现，转染MIF siRNA 部分阻断MIF 表达后，H460 细胞凋亡率显著增加。上述结果均提示MIF 与NSCLC血管生成和肿瘤细胞转移有密切关系。大量研究表明，MIF 通过抑制抑癌基因p53 的功能、持续激活胞外信号调节激酶(ERK)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路、诱导环氧化酶(COX)/前列腺素E2(PGE2) 激活、促进血管内皮细胞的增殖及分化等独特的生物学作用多层次促进肿瘤的生长、增殖及侵袭[17]，并且在低分化肿瘤中，MIF表达与预后相关。Jung等[18]研究表明，MIF 阻止P53 从胞浆转移至胞核，并且可抑制P53 的活性，抑制细胞增殖、促进凋亡。Binsky等[19]在慢性淋巴细胞白血病的研究中发现，MIF表达明显升高，通过激活IL -8，继而Bcl-2表达增加，抑制肿瘤细胞凋亡，促进细胞增殖。Arenberg等[20]发现，在C57BL /6 小鼠肺损伤急性期，MIF表达增加，抑制在急性期注入小鼠体内的Louis 癌细胞的凋亡，促进其增殖，而在敲除MIF基因的小鼠中则无此现象。
最新研究报道，在单核细胞，巨噬细胞中发现高尔基体蛋白p115和MIF都有表达，且在细胞质中p115能够调节MIF的分泌。在炎症刺激下，单核细胞中p115 能从高尔基体上移位到细胞质其他部位，游离的p115 可与细胞质中的MIF因子结合，可将MIF 转运到细胞膜上与其特异的CD74，CD44受体结合；也可刺激MIF 的分泌，使得上清液中的p115和MIF含量增加。p115 的这种位置变化可以产生一系列的级联反应，从而引起细胞内的信号传导。在前列腺癌中免疫共沉淀结果也显示高尔基体上的蛋白p115的羧基末端与MIF相连[21]，这表明前列腺癌细胞中p115 和MIF相关。Bucala[22]提出MIF的调节是受体为基础的信号转导通路, 可与靶细胞表面受体相互作用，CD74 是细胞膜上MIF的高亲和力结合蛋白, 分布在细胞质和胞膜上, 但是MIF不能与胞质中的CD74结合, 只能与胞膜及膜外区域的CD74受体结合，且CD74 是一种II 型跨膜蛋白, 可启动向ERK /MAPK 激酶传导依赖的M IF信号, 有研究报道MIF能短暂也可持续地激活ERK信号通路, 与细胞增殖, 分化相关[23]。MIF结合到CD74-CD44复合体, 导致CD74-ICD释放, 通过Sky和Akt激活NF-B, 促进B细胞DNA合成, 进入S期, 细胞分裂, Bcl-XL 和Bcl-2转录增加, 细胞存活。何兴祥等[24]实验表明靶向MIF的siRNA可以促进大肠癌细胞的凋亡, 可能的机制是MIF siRNA抑制MIF的表达, 导致CD74 的表达下降, Caspases8和Caspases3表达增加诱导凋亡增加。易永芬等[25]研究指出胃癌及肝癌中P115和MIF的表达呈正相关, P115在肿瘤中表达的增加影响MIF的表达和分泌, 改变其在细胞内空间位置, 使得MIF能够与细胞膜及胞外的CD74受体结合,活化MAPK途径, 导致肿瘤的发生。
综上所述，MIF在炎症性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤的发生发展过程中起重要作用，有望成为疾病早期诊断预测疾病进展和治疗预后的生物靶标。一些小分子MIF抑制剂已被合成并进入临床试验阶段。
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学意义; 甘露糖不能诱导Mφ分泌TNFα与IL4。结论: RTP引起的Mφ分泌TNFα作用是通过甘露糖受体介导， 而APS的作用不仅仅与甘露糖受体有关。两种多糖与甘露糖受体的作用差异可能与其单糖组成密切相关。
【关键词】 巨噬细胞 甘露糖受体 大黄多糖 当归多糖 肿瘤坏死因子 白细胞介素4
许多中药多糖能够刺激巨噬细胞（Macrophage， Mφ）释放前炎症因子或者某些细胞因子， 推测其可能机制与Mφ膜上的模式识别受体（pathogen recognition， PRR）结合引起细胞内某些信号通路的活化有关。前期研究发现， 当归多糖（Angelica sinensis Diel polysaccharide， APS）能够促进树突状细胞的成熟， 增强抗原提呈能力［1， 2］; 促进脾细胞IL2、 IFNγ的分泌［3］; 而RTP（Rheum tanguticum polysaccharide， RTP）能够对抗结肠炎大鼠CD4+T细胞的扩增， 降低克隆氏病大鼠IFNγ的升高， 升高结肠炎小鼠降低的IL4水平［4， 5］。但是RTP和APS的免疫反应作用机制， 尚不清楚。
Mφ是体内特定的吞噬细胞和抗原提呈细胞， 是连接先天免疫系统及后天免疫系统的桥梁。其表面众多膜受体参与完成这些功能， Mφ甘露糖受体(Macrophage Mannose receptor， MMR)为其中之一。研究表明， MR是一种PRR， 可特异性地识别以甘露糖、 N乙酰葡糖胺或岩藻糖为末
端的配体并与之结合［6］， 这些配体可来源于内源性或外源性分子。推测MR在病原体的识别、 吞噬与清除， 在结核、 肿瘤、 感染等许多疾病过程中都发挥着重要的作用。我们的研究表明， RTP含有近50%的甘露糖［7］， 组分RTP1， RTP2所含单糖比例不同; APS则含有N乙酰
葡糖胺残基［1］， 组分APS1， APS2， APS3所含单糖比例也不同。这两种多糖的免疫调节作用可能是通过MMR而起效的。本研究将探讨APS混合组分、 RTP混合组分对Mφ吞噬及分泌细胞因子的影响， 以揭示两种中药多糖的免疫调节作用。
1 材料和方法
1.1 材料
SD大鼠（200～220 g， 雌雄各半）， 由第四军医大学动物实验中心提供， 动物分笼饲养于空调温室内， 温度22±2℃， 相对湿度50%～60%， 自动调控昼夜各12 h， 颗粒饲料喂养， 自由饮水。RPMI1640培养基购自Gibco公司， 胎牛血清购自杭州四季青公司生物制品厂， PBS缓冲液购自博士德生物工程公司， 甘露糖购自上海试剂二厂; 半乳糖购自国药集团化学试剂有限公司; APS及RTP由我实验室提供， EDTA以及异硫氰酸荧光素标记的甘露糖化牛血清白蛋白(ManFITCBSA) 购自Sigma公司; GENios pro多功能酶标仪为瑞士TENCN公司产品; Nikon H600L荧光显微镜为日本Nikon公司产品。
1.2 方法
1.2.1 腹腔Mφ的分离、 纯化及培养
取6只雌性SD大鼠， 乙醚麻醉， 750 mL/L乙醇浸泡1 min， 取出， 消毒腹部皮肤， 打开腹壁， 但勿伤及腹膜。用注射器向腹腔内注入PBS 10 mL， 轻揉腹腔5 min， 剪开腹膜， 用吸管吸取腹腔内液体， 注入离心管， 1 000 r/min 离心5 min。弃上清， 分别加入6 mL含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液， 吹打混匀后计数， 调整细胞密度为1×109个/L， 分别接种腹腔Mφ于对应的培养板中， 置37℃ 50 mL/L CO2孵箱中培养。3 h后轻轻吸弃培养液后， 再用PBS洗去未贴壁细胞， 重复3次， 每孔加入含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液， 用姬姆萨瑞氏染色法染色， 观察Mφ占 95％以上［8］。纯化后的单层大鼠腹腔Mφ用含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液置于37℃ 50
mL/L CO2孵箱中培养。
1.2.2 荧光显微镜观察MFITCBSA与Mφ的结合能力
取纯化腹腔Mφ， 以每孔1×106个腹腔Mφ接种于底部覆盖玻片的6孔培养板， 纯化后分为3组: 空白对照组（2 mL 500 mL/L RPMI1640/PBS缓冲液）; ManFITCBSA阳性对照组（2 mL 0.01 g/L ManFITCBSA）; 甘露糖加MFITCBSA实验组（1 mL 1 g/L Man+1 mL 0.01 g/L ManFITCBSA）。用锡铂纸包严培养板， 置37℃ 50 mL/L CO2孵箱中避光孵育60 min; 用PBS冲洗接种有Mφ的盖玻片3遍， 40 g/L多聚甲醛固定30 min， PBS洗片， 晾干后滴上500 mL/L的甘油PBS 10 μL， 石蜡封片， 4℃短时储存留待观察。荧光显微镜激发光谱495 nm， BA520阻挡滤光片， DM505二向分色滤光片。
1.2.3 多糖对Mφ吞噬ManFITCBSA的影响
取纯化腹腔Mφ， 以每孔1×104个接种于Costar96孔底部透明板， 置37℃及4℃， 50 mL/L CO2孵箱中孵育4 h， PBS冲洗3遍， 分别加入不同浓度的甘露糖（Man）、 半乳糖(GaL)、 APS混合组分、 RTP混合组分以及ManFITCBSA， 每组3个孔各加100 μL， 置37℃及4℃， 50 mL/L CO2孵箱中避光孵育60 min后， 弃上清， PBS冲洗3遍， 重复3次［9］。
1.2.4 多糖对Mφ分泌细胞因子的影响
取纯化Mφ， 以每孔1×104个腹腔Mφ接种于Costar96孔培养板， 分别与APS、 RTP、 Man、 APS+ Man
、 RTP+ Man在37℃， 50 mL/L CO2孵箱中培养36 h， 取细胞上清按照试剂盒说明（Rat IL4 ELISA Kit， Rat TNFα ELISA Kit， BOSTER）测定细胞因子水平。简述如下: 在酶标板加入100 μL不同浓度的标准品， 绘制标准曲线， 在反应孔中加入待测样品的Mφ培养液上清各100
μL， 然后加入100 μL生物素标记抗体， 37℃反应1 h， 0.01 mol/L PBS洗板3次， 然后每孔加入100 μL亲和素过氧化物酶复合物（ABC）， 37℃反应30 min， 洗板5次， 加入TMB显色液， 避光反应10～25 min， 加入TMB中止液， 450 nm测定光吸收值。
1.2.5 统计学处理
数据以x±s表示， 利用SPSS11.0软件进行分析， 显著性检验采用t检验及SNKq检验， P
2 结果
2.1 甘露糖抑制Mφ吞噬ManFITCBSA 采用荧光显微镜观察腹腔Mφ吞噬ManFITCBSA的情况(图1A)， 通过竞争抑制试验观察到: D甘露糖可以抑制该现象(图1B)。
2.2 多糖对Mφ吞噬功能的影响
采用多功能酶标仪检测Mφ吞噬ManFITCBSA的能力， 实验结果表明: 在37℃时， Mφ吞噬活性与ManFITCBSA浓度呈正相关， 在4℃时， ManFITCBSA与Mφ为非特异性吸附， 荧光强度不随ManFITCBSA浓度改变而发生变化（图2）; ManFITCBSA与MMR的结合为Ca2+依赖性， EDTA可阻断该过程（图3）， 其阻断能力与EDTA浓度呈正
相关; 甘露糖作为MR的阻断剂， 也阻断该过程， 其拮抗能力与甘露糖浓度相关， 半乳糖则不能阻断MR介导的Mφ对ManFITCBSA的吞噬作用（图4）; APS、 RTP均可阻滞Mφ吞噬ManFITCBSA的作用， 且呈剂量依赖性(图5、 6)。
2.3 多糖刺激Mφ释放TNFα， IL4的测定
采用ELISA法检测细胞培养液中TNFα和IL4水平， 体外将APS和RTP与Mφ共孵育36 h， 可以促进正常腹腔Mφ分泌TNFα(图6)， 与正常对照组相比有统计学意义（P
3 讨论
我们已发现， RTP与APS均具有免疫调节作用， 但它的免疫调节机制目前尚不清楚。本实验证明RTP、 APS均可抑制Mφ吞噬ManFITCBSA，提示RTP、 APS的免疫调节作用可能通过MR介导。
许多中药多糖富含甘露糖或葡萄糖， 且以反复串联的结构存在， 与MR具有比MRmAb更高的结合特性［10］。如壳寡糖可通过Mφ表面的MR， 产生白介素1β和TNFα［11］; 海带多糖能激活小鼠腹腔Mφ， 对S180肿瘤细胞有较好的杀伤作用［12］。我们的研究表明RTP含有近50%的甘露糖， 而APS则含有N乙酰葡糖胺残基， 因此， RTP、 APS具有潜在的MR结合特性。我们的实验结果表明， RTP与APS均可以阻断MR介导的Mφ吞噬作用， 且这种作用呈现剂量依赖关系， 为两种多糖作用于MR提供了依据。
为了进一步研究两种多糖与MR的作用， 我们发现RTP和APS均可以促进Mφ分泌细胞因子TNFα， 而MR的拮抗剂甘露糖可完全阻断RTP刺激Mφ分泌TNFα的作用， 说明RTP是通过MR而起作用; 甘露糖则没有该作用; RTP和APS对Mφ分泌细胞因子IL4无明显影响， 揭示RTP和APS影响Mφ的免疫功能主要通过Th1型细胞免疫发挥作用， 同时提示我们以前实验中RTP和APS影响T细胞极化可能通过MR起作用。
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关键词：KLF4；基因转染；R8w264.7细胞；C2C12细胞；细胞增殖
中图分类号：R361 文献标识码：A 文章编号：1007－7847(2007)03－0263－05
Kruppel样因子4(Kruppel-1ike factor4，KLF4)是Sp/Kdlppel样锌指转录因子家族的成员之一，这个家族目前已发现20多个成员，如Spl-4、KLPl-14等，Sp/Kruppel样因子是机体内一类具有重要功能的蛋白质，它们参与调控细胞增殖、分化、胚胎发育等重要生命过程，并与肿瘤等多种疾病有关，研究表明，KLF4在胚胎发育晚期及肠管分化终末期的上皮细胞中其表达均增高，提示KLF4具有抑制某些细胞增殖的功能，为了深入探讨KLF4的功能，本研究室建立了稳定高表达该基因的Raw264.7小鼠巨噬细胞株和C2C12小鼠肌原细胞株，在此建株过程中，我们发现转染KLF4对上述两种细胞增殖的影响明显不同。
1 材料和方法
1．1 材料
Raw264.7巨噬细胞株购自上海细胞中心；C2Cn小鼠肌原细胞由本校细胞中心提供：DMEM及RPMI-1640培养基购自Gibeo公司；G418购自Promega；无支原体小牛血清，杭州四季青生物工程公司产：丙烯酰胺、N，N′2亚甲基双丙烯酰胺购自Fluka公司；二硫苏糖醇(DTT)、过硫酸胺、TEMED、硝酸纤维素膜购自Promega公司；Lipo-feetamineTM 2000、真核表达载体质粒pcDNA3.1购自Invitrogen life technologies公司：peDNA3.1-KLF4重组质粒本室构建；兔抗KLF4多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG及DAB显色试剂盒购自博士德生物工程有限公司：CCK-8溶液由日本同仁化学株式会社提供。
1．2 方法
1．2．1 KLF4过表达细胞株的建立
利用脂质体介导的转染技术(根据Invitrogenlife technologies公司提供的转染操作说明书进行操作)将空载体pcDNA3.1和重组质粒pcDNA3.1-KLF4导人Raw264.7和C2C12细胞中，根据本室以往所建立的方法筛选过表达细胞株。
1．2．2 免疫印迹分析
按《分子克隆实验指南》所载方法进行，用1×SDS加样缓冲液裂解细胞，收集细胞蛋白质，采用Bradford法进行蛋白定量。制备好的蛋白样品置，80℃冰箱保存备用，每泳道上样30μg蛋白，经10％SDS-PAGE(70V，120V分别电泳2h和4h左右)电泳后，电转膜至硝酸纤维膜，室温封闭后加入兔抗KLF4多克隆抗体，室温孵育2h，加入HRP标记的羊抗兔IgG孵育1h，DAB显色，拍摄照片，记录试验结果。
1．2．3 细胞形态观察
取各转染细胞于倒置显微镜下，观察其生长速度和形态改变，并逐日记录。
1．2．4 CCK-8法检测细胞的增殖
取生长状态良好的对数生长期各组细胞接种于96孔板(每孔1×104个细胞)，每组接种5个复孔，在含10％新生小牛血清的条件下分别培养24h，48h及72h后加入CCK-8溶液10μL继续培养4h，将96孔板放人酶标仪，在450nm波长处测定各孔OD值。
1．2．5 流式细胞术检测
本实验由北京鼎国生物技术公司协助完成，分别接种等量的对数生长期的各组细胞于100mL培养瓶中，每组5瓶，培养24h后，参考该公司流式细胞检测说明收集细胞，送北京鼎国生物技术有限公司进行流式细胞术分析。
1．2．6 统计学处理
数据以均数土标准差(x±s)表示，两组间比较用t检验分析，以P＜0.05判断为有统计学意义。
2 结果
2．1 Western blotting筛选高表达KLF4的细胞克隆
采用脂质体分别转染KLF4的真核表达质粒pcDNA3.1-KLF4和空载体pcDNA3.1至Raw264.7和C2C12，细胞中，经G418筛选后，利用KLF4多克隆抗体进行Western印迹分析，鉴定高表达克隆，结果显示，筛选到高表达克隆，在两种细胞株中KLF4蛋白表达量较转空载体组明显增加(图1)。
2．2 细胞生长情况
2．2．1 KLF4过表达对细胞形态的影响
KLF4过表达的Raw264.7细胞形态无明显变化，C2C12空载体组贴壁细胞主要呈长梭形，极向或交叉排列，部分KLF4基因过表达的细胞形态发生改变，如细胞向多角形转变，细胞形状多样等(见图2)。
2．2．2 CCK-8法结果
Raw264.7的空载体组和KLF4组之间细胞增殖能力无明显变化(p＞0.05)(表1)，C2C12的KLF4组与其空载体组相比较，细胞增殖能力降低(p＜0.05)(表2)。
2．2．3 流式细胞术分析KLF4对细胞周期及细胞凋亡的影响
利用流式细胞术检测了Raw264.7-pcDNA3.1、Raw264.7-KLF4，C2C12-pcDNA3.1及C2C12-KLF4 4组细胞的周期分布及凋亡百分率，结果显示转染空载体和KLF4过表达对Raw264.7细胞的细胞周期分布及细胞凋亡无明显影响(P＞0.05)；与转
空载体的C2C12相比较，KLF4过表达的C2C12细胞中处于S期的细胞减少，而G1期的细胞相应增多(图3)，凋亡细胞也增多(P＜0.05)(图4)。
3 讨论
KLF4是Kriippel样锌指转录因子家族的一个重要成员，小鼠KLF4蛋白全长包含483个氨基酸残基，分子质量为53kD，和人的KLF4蛋白具有90％的相似性，KLF4蛋白的羧基端具有3个连续的C2H，锌指结构，这3个锌指的结构均符合保守序列：CX2-4CX3FX5LX2HX3H；两个锌指结构之间由一个7个氨基酸残基的H/C连接序列连接，该连接序列为了GEKP(Y/F)X，KLF4能够对角蛋白4(keratin)、肠碱性磷酸酶(intestinalalkaline phosphatase，IAP)、鸟氨酸脱羧酶(omithine decarboxylase，ODC)、β链蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和组氨酸脱羧酶(histidine decarboxylase，HDC)等多个启动子的转录活性进行调控，从而在机体的生长和发育过程中起着重要的调节作用，对KLF4的研究最初是从胃肠道开始研究的，它的表达在生长抑制的状态下明显增高：此后的研究发现，KLF4除了在肠的不同组织中表达外，还在表皮有高水平的表达并在皮肤表皮细胞分化晚期起重要作用；KLF4缺失能导致皮肤屏障功能障碍从而使新生小鼠在出生后短时间内死亡，此外，最近的研究还表明，KLF4在细胞及其支持细胞的终末分化过程中出现高表达，这说明KLF4可能在哺乳动物发育过程中起到重要作用，但是，KLF4对Raw264.7细胞和C2C12细胞增殖的影响，目前尚未见报道。
为了阐明KLF4对Raw264.7细胞和C2C12细胞增殖的影响，本研究分别建立了KLF4过表达的Raw264.7和C2C12细胞株，并采用多种方法共同检测了KLF4过表达对该两种细胞增殖的影响，结果显示，KLF4过表达对Raw264.7细胞的形态和增殖无明显影响：而KLF4过表达的C2C12细胞株中，多角形的细胞增多，细胞周期中S期的细胞相对减少，细胞增殖速度明显减慢，由此可见，KLF4对这两种细胞增殖的影响具有显著的细胞差异性。
【摘要】 目的: 克隆并构建含小鼠sST2和人IgG Fc 融合基因的真核表达质粒， 初步探讨其表达产物sST2Fc融合蛋白对LPS刺激小鼠巨噬细胞生物学活性的影响。方法: 借助RTPCR技术， 从小鼠脾脏总RNA中扩增全长sST2 cDNA， 构建sST2与hIgG Fc段融合基因的真核表达载体（psST2Fc）。应用脂质体将重组质粒psST2Fc转染CHO细胞， 经G418筛选， 获得稳定表达sST2Fc融合蛋白的CHO细胞株。细胞培养上清经蛋白A亲和层析纯化后， 采用Western blot进行鉴定， 应用FACS检测sST2Fc与RAW264.7巨噬细胞表面相应受体结合情况; ELISA法检测sST2Fc对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞分泌TNFα和IL6的影响。结果: 测序证实克隆和构建的小鼠sST2Fc cDNA阅读框序列正确， Western blot 证实sST2Fc融合蛋白的表达， sST2Fc抑制LPS诱导巨噬细胞分泌的炎性细胞因子TNFα和IL6。结论: 成功构建sST2Fc融合基因并获得稳定表达， sST2Fc通过与其特异性受体结合可抑制巨噬细胞介导的炎性反应。
【关键词】 小鼠sST2Fc; 真核表达; RAW264.7; TNFα; IL6
ST2 最早被认为是由成纤维细胞分泌的一种血清免疫应答产物， 随后发现肥大细胞［1］和Th2细胞［2］表面存在一种跨膜型ST2， 但其不表达在Th1细胞表面。目前证实ST2属于IL1受体超家族成员， 但不能与IL1家族成员IL1α、 IL1β或IL1R拮抗剂结合。由于在mRNA水平剪切方式的差异， ST2基因表达产物以跨膜型（ST2L）和分泌型(sST2)两种形式存在， 前者主要分布在源于造血细胞的细胞表面如肥大细胞和嗜酸性粒细胞， 而后者主要由成纤维细胞分泌产生。近来研究显示， ST2除了诱导免疫应答由Th1型向Th2型偏移， 还涉及到类风湿性关节炎、 过敏性哮喘等多种疾病的发生发展［3， 4］。我们通过构建小鼠sST2人IgG1 Fc重组质粒（psST2Fc）并表达可溶性ST2Fc融合蛋白， 观察其对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞生物学活性的影响， 为进一步应用该分子治疗炎症相关性疾病奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 BALB/c小鼠(8～12周龄， 雄性)由湖北省医学实验动物中心提供; CHO细胞购自中国典型培养物保藏中心; RAW264.7巨噬细胞由华中科技大学同济医学院免疫学系保藏。单克隆大鼠抗小鼠ST2抗体购自R&D公司。LPS和人IgG标准品购自Sigma公司， TRIzol试剂和脂质体LipofectAMINETM2000购自Invitrogen公司， RTPCR试剂盒购于MBI公司。各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Promega公司。Sepharose CL4B蛋白A亲和层析柱购自Amersham Biosciences。DNA合成和测序由Invitrogen (上海)完成。
1.2 方法
1.2.1 重组表达载体的构建 采用TRIzol试剂提取BALB/c小鼠脾细胞总RNA， 经RTPCR扩增全长sST2 cDNA。PCR 引物的序列为: 5′AAA ACA AGC TTG GCC GCC ACC ATG ATT GAC AGA CAG AG3′和5′AAA ACG GAT CCG AGC AAT GTG TGA GGG ACA CTC CT3′。采用Hind III和BamH I分别双酶切sST2和载体pcDNA3.1Fc， 将酶切片段sST2插入pcDNA3.1Fc载体Fc的上游， 构建重组表达载体psST2Fc， 转化E.coli DH5α宿主菌， 筛选阳性克隆， 经酶切和测序鉴定。
1.2.2 转染与筛选 用QIAGEN质粒试剂盒提取重组表达载体pcDNA3.1sST2Fc， 采用脂质体LipofectamineTM 2000转染CHO细胞， 同时转染空载体pcDNA3.1和未转染细胞作为阴性对照。具体方法为: CHO细胞在含100 mL/L胎牛血清的DMEM中， 于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度下培养。转染前1 d， 细胞用2.5 g/L胰酶消化并接种于24孔培养板中（细胞数为1×105/孔）， 待细胞融合至70％～80％时， 按LipofectamineTM 2000试剂说明书进行转染， 并设空载体和未转染组对照。培养48 h后， 加入G418(800 mg/L)筛选阳性抗药克隆。
1.2.3 sST2Fc蛋白的纯化及鉴定 收集细胞培养上清用Sepharose CL4B蛋白A亲和层析柱纯化sST2Fc融合蛋白， 纯化样品的浓度用A280吸收法测定。采用Western blot鉴定sST2Fc蛋白表达， 一抗为单克隆大鼠抗小鼠ST2抗体， HRP标记的兔抗大鼠为二抗， ECL化学发光法检测。
1.2.4 流式细胞术分析 RAW264.7巨噬细胞在含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中， 于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度下培养。刺激前1 d， 将RAW264.7巨噬细胞接种于6孔细胞培养板， 细胞数为2×106/孔， 次日加入LPS（1 mg/L）刺激， 同时设立LPS未处理组。继续培养24 h后收集细胞， 用预冷PBS洗涤3次， 细胞计数后分装于流式细胞管（1×105/管）。加入Fc封闭抗体， 4℃孵育30 min， 用PBS洗涤3次， 分别加入sST2Fc（0.5 mg/L）和hIgG（0.5 mg/L）， 4℃孵育30 min， 用PBA（1×PBS， 含20 mL/L胎牛血清和1 g/L叠氮钠）洗涤3次， 随后加入同型对照抗体和FITC标记的山羊抗人Fc抗体， 4℃避光作用30 min， PBS洗涤3次后， 进行流式细胞术检测。
1.2.5 RAW264.7巨噬细胞的培养和刺激 将RAW264.7巨噬细胞接种于24孔细胞培养板， 细胞数为5×105/孔， 第2天加入sST2Fc（0.5 mg/L）或hIgG（0.5 mg/L）， 同时设未处理对照组， 混匀培养3 h后， 加入LPS（1 mg/L）刺激， 继续培养至24 h收集培养上清， -80℃保存。
1.2.6 ELISA检测 采用ELISA检测试剂盒(eBioscience) 测定细胞培养上清中TNFα和IL6的水平。
1.2.7 统计学分析 数据以x±s表示， 采用t检验， P
2 结果
2.1 重组sST2Fc表达载体的构建及鉴定 sST2 cDNA经RTPCR扩增， 酶切消化后， 插入pcDNA3.1Fc载体， 图1显示重组载体psST2Fc酶切后的片段大小与预期结果一致。序列测定结果表明， sST2序列与GenBank中注册的序列完全一致(GI: 2171234)。
2.2 sST2Fc融合蛋白表达的鉴定 CHO细胞培养上清经Shepharose CL4B蛋白A亲和层析纯化后， Western blot分析显示（图2）， 在转染psST2Fc实验组中出现一个特异性条带， 其相对分子质量（Mr）大小约100 000， 而在转染pcDNA3.1和未转染的对照组中未出现特异性条带。
图2 sST2Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达
A: SDSPAGE检测蛋白A亲和层析纯化sST2Fc蛋白; B: Western blot鉴定ST2Fc蛋白表达.2.3 sST2特异性结合RAW264.7巨噬细胞 为了检测RAW264.7巨噬细胞表面是否存在sST2相应受体， 用流式细胞术分析sST2的特异性结合能力。图3显示， 在封闭RAW264.7巨噬细胞表面Fc受体后， sST2能特异性结合于RAW264.7细胞表面， 并且其结合强度伴随LPS刺激而显著上升。
图3 sST2特异性结合巨噬细胞表面相应受体
A: RAW264.7巨噬细胞表面存在特异性sST2受体. 流式细胞术检测hIgG (点线) 和sST2Fc(粗线) 与巨噬细胞表面相应受体结合 (其中细线代表同型对照). B: LPS上调RAW264.7巨噬细胞表面sST2受体表达. 巨噬细胞在LPS刺激前(点线)和刺激后(粗线)， sST2受体表达变化 (其中细线代表同型对照).
2.4 sST2抑制LPS刺激RAW264.7巨噬细胞分泌的TNFα和IL6 在LPS刺激下， RAW264.7细胞能上调结合sST2的能力， 故进一步检测sST2对LPS激活巨噬细胞的生物学活性影响。在sST2或hIgG预处理RAW264.7巨噬细胞3 h后， 加入LPS（1 mg/L）继续培养至24 h， 用ELISA检测不同时间点细胞培养上清中TNFα和IL6的水平。结果显示（图4）， sST2能明显抑制LPS刺激巨噬细胞分泌的炎性细胞因子TNFα和IL6， 而hIgG对照组则无此作用（P
3 讨论
在细菌裂解产物如细菌脂蛋白、 LPS等因素刺激下， 巨噬细胞可产生大量的炎性细胞因子包括IL1α/β、 IL12、 TNFα及各种炎性介质如热休克蛋白（HSP）、 氧自由基等， 它们在诱导机体产生天然免疫应答向特异性免疫应答偏移中发挥了重要作用［5］。广泛性的细菌感染能引起这些炎症物质产生混乱， 最终导致多器官衰竭和内毒素休克。ST2可通过调节Th1/Th2型免疫应答偏移而影响疾病的转归， 而且在炎性因子IL1α/β和TNFα刺激下， 成纤维细胞分泌sST2的水平上升; 经LPS预处理的人单核细胞产生sST2的水平亦增加， 这些结果均提示sST2可能参与了炎症反应的调节作用［6］。
巨噬细胞表面与sST2特异性结合的受体及其相应功能尚未完全清楚。虽然ST2与IL1R具有高度同源性， 但未能发现它与已知的IL1家族成员IL1α、 IL1β或IL1R拮抗剂结合。目前， 巨噬细胞表面特异性ST2结合蛋白的cDNA序列已被克隆鉴定， 但是由该蛋白所介导的胞内信号传递途径尚待明确［7］。现已知， ST2结合蛋白含有一个跨膜端以及由12个氨基酸短肽组成的胞内端， 故推测它可能与巨噬细胞识别sST2并介导下游相应的信号传递有关。本实验通过流式细胞术应用重组sST2Fc融合蛋白证实RAW264.7巨噬细胞表面存在特异性的ST2结合蛋白， 并且ST2结合蛋白的表达水平在LPS刺激下显著上升。或有可能， 与sST2结合的相应受体是巨噬细胞表面一种未知的IL1R家族新成员， 这有待进一步研究。
为了评价sST2在巨噬细胞所介导炎症反应中的作用， 我们检测了sST2Fc融合蛋白对LPS激活巨噬细胞的生物学活性影响。结果显示， ST2Fc融合蛋白预处理组能明显地抑制LPS诱导巨噬细胞产生的炎性细胞因子TNFα和IL6。亦有文献报道［8］， sST2能有效抑制肺泡巨噬细胞促炎性细胞因子TNFα、 IL1和IL6的基因转录和蛋白表达， 而抗炎性细胞因子IL10、 TGFβ及NO的表达水平未受影响， 从而证实sST2通过直接与细胞表面受体相结合而发挥作用， 并非通过间接途径。并且， sST2预处理可明显抑制巨噬细胞TLR4受体mRNA的转录， 这种下调LPS相应受体信号途径的能力， 在一程度上解释了sST2对炎症反应的调节作用。由此可见， 通过进一步明确下调巨噬细胞所介导炎症反应的作用机制， sST2有望成为一种治疗内毒素休克及炎症相关性疾病的新途径。
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［6］ Kakkar R， Lee RT. The IL33/ST2 pathway: therapeutic target and novel biomarker［J］. Nat Rev Drug Discov， 2008， 7(10): 827-40.
【摘要】目的 观察肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和microRNA-146a在脂多糖(LPS) 诱导的NR8383肺泡巨噬细胞中的动态表达，分析二者在时间上的变化关系，探讨microRNA-146a对肺泡巨噬细胞炎症反应的调控作用及其机制。方法 体外培养的肺泡巨噬细胞接种于六孔板，贴壁后加入1 μg/mL的LPS，刺激0、3、6、12 h后离心收集培养上清液和细胞。采用实时荧光定量PCR检测细胞中microRNA-146a和TNF-α mRNA的表达，酶联免疫吸附实验（ELISA）检测培养上清液中TNF-α蛋白水平的表达。microRNA-146a和TNF-α mRNA的相关性采用双变量Pearson相关性分析。结果 （1）培养上清液中的TNF-α蛋白在LPS刺激3 h后显著升高［（359.80±57.54 )pg/mL，P＜0.01］，于12 h达高峰［(729.22±50.40 )pg/ml，P＜0.01］；（2）LPS刺激3 h后，细胞中TNF-α mRNA的表达即达到顶峰［（67.48±24.52)倍，P＜0.01］，6 h后开始降低［（29.53±4.26)倍，P＜0.05］；（3）LPS刺激6 h后，microRNA-146a表达水平显著增高［（5.33±0.81)倍，P＜0.01］，并且持续增高［12 h：(8.21±1.19)倍，P＜0.01］；（4）细胞中microRNA-146a的表达水平与TNF-α mRNA的含量呈负相关（r=-0.895，P＜0.01）。结论 在LPS诱导的肺泡巨噬细胞中， microRNA-146a的表达水平与TNF-α mRNA的含量呈负相关，推测microRNA-146a可能参与了肺泡巨噬细胞的炎症反应调控。
【关键词】microRNA-146a；肺泡巨噬细胞；肿瘤坏死因子-α；实时荧光定量PCR；炎症
The relationship between microRNA-146a and TNF-α in lipopolysaccharide-stimulated alveolar macrophages of rats ZENG Zhen-guo,GONG Hong-han, LI Yong, NIE Zhen-yun, JIE Ke-min, ZHAN Yi-an, NIE Cheng, LIU Fen, DING Cheng-zhi, SHAO Qiang, QING Cheng, ZHU Bai-lu, QIAN Ke-jian.省略
【Abstract】Objective To determine kinetics of TNF-α and miR-146a (microRNA-146a) expressions in lipopolysaccharide (LPS)-induced NR8383 alveolar macrophages (AM) at different intervals and their relationships in order to explore regulatory effect and mechanism of miR-146a on alveolar macrophages inflammatory responses.Methods NR8383 alveolar macrophages were seeded in a 6-well plate, and stimulated with 1 μg/ml of LPS for 0 h, 3 h, 6 h and 12 h separately after 90 min. Cells were harvested and supernatant were collected 0 h, 3 h, 6 h and 12 h after incubation. The expressions of miR-146a and TNF-α mRNA in cells were detected by real-time qPCR and the levels of TNF-α protein in the supernatant of cells were assayed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Pearson correlation analysis was used to analyze the correlation between miR-146a and TNF-α mRNA. Results ①The level of TNF-α protein in the supernatant of cell was significantly increased 3 h after LPS challenge (359.80±57.54) pg/ml (P
【摘要】 【目的】 探讨辛伐他汀含药血清对U937单核细胞源巨噬细胞基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）表达与分泌的影响。【方法】 15只新西兰大白兔随机分为正常对照组（NL， n=5）、粥样硬化模型组（AS， n=5）和辛伐他汀含药血清组（SIM， n=5）。通过喂养高脂饲料，建立兔动脉粥样硬化模型后，予辛伐他汀药液灌胃，获得含药血清。分别予不同浓度含药血清（5%、10%、20%）培养U937单核细胞源巨噬细胞24 h，应用逆转录聚合酶链反应检测MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA的表达，以及应用酶联免疫吸附试验检测MMP-9及TIMP-1蛋白的分泌。【结果】与相同浓度AS组比较，5%、10%、20% SIM组U937单核细胞源巨噬细胞MMP-9 mRNA表达均显著性降低（P值为0.005、0.041和0.013）；5%、10%、20% SIM组TIMP-1 mRNA表达无显著性差异（P值均 >0.05）。而与相同浓度AS组比较，不仅10%、20% SIM组MMP-9分泌显著性减少（P值分别为0.009和0.001），而且10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显著性增加 （P值分别为0.017和0.001）。 【结论】 辛伐他汀可抑制单核巨噬细胞MMP-9的表达和分泌，以及促进TIMP-1的分泌。
【关键词】 辛伐他汀； 巨噬细胞； 基质金属蛋白酶-9； 金属蛋白酶组织抑制因子-1
Abstract:【Objective】 To investigate the effects of simvastatin drug-serum on the expression and secretion of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in U937 monocyte-derived macrophages. 【Methods】 Fifteen New Zealand rabbits were randomized to 3 groups， normal control group (NL， n=5)， atherosclerotic model group (AS， n=5) and simvastatin drug-serum group (SIM， n =5). The rabbit atherosclerotic model was developed by high cholesterol feeding. Then they were medicated with simvastatin liquor by gavage to prepare simvastatin drug-serum. U937 monocyte-derived macrophages were incubated with different concentrations (5%， 10%， and 20%) of simvastatin drug-serum for 24 hours. The mRNA expression and protein secretion of MMP-9 and TIMP-1 were detected by RT-PCR and ELISA. 【Results】 Compared to same concentration AS group， 5%， 10%， and 20% SIM group significantly inhibited the expression of MMP-9 mRNA in U937 monocyte-derived macrophages (P=0.005， 0.041， and 0.013)， and the expression difference of TIMP-1 mRNA were not significant (all P >0.05). Compared to same concentration AS group， 10% and 20% SIM group not only significantly inhibited the secretion of MMP-9 in U937 monocyte-derived macrophages (P=0.009 and 0.001)， but also significantly increased the secretion of TIMP-1 ( P = 0.017 and 0.001) . 【Conclusion】 Simvastatin inhibits the expression and secretion of MMP-9 and enhances the secretion of TIMP-1.
Key words: simvastatin; macrophage; matrix metalloproteinase-9; tissue inhibitor of metalloproteinase-1
冠状动脉粥样硬化斑块由稳定转为不稳定，继而破裂导致血栓形成是急性冠脉综合征最主要的发病机制[1， 2]。斑块脂质核心大、纤维帽薄、巨噬细胞多是结构性易损斑块[3]。斑块内单核巨噬细胞聚集，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMP）增多，金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases， TIMP）减少，导致斑块内胶原降解，纤维帽变薄，是斑块稳定性下降的重要原因[4， 5]。临床研究显示他汀对急性冠脉综合征治疗有效，可能与改善内皮功能、抗炎及稳定斑块等调脂以外的作用有关［6］，但其具体机制尚未完全明确。本研究拟观察辛伐他汀含药血清对U937单核细胞源巨噬细胞MMP-9及TIMP-1表达与分泌的影响，以探讨辛伐他汀稳定斑块、治疗急性冠脉综合征的机制。
1 材料与方法
1.1 材料准备
雄性纯种新西兰大白兔，体质量2.0~2.5 kg，购自中山大学动物实验中心。人单核白血病细胞株U937细胞，购自中山大学动物实验中心细胞库。辛伐他汀药片，购自默沙东公司，实验时溶解于蒸馏水灌胃。
RPMI 1640培养基，购自Gibco公司。新生牛血清，购自PAA公司。佛波酯（PMA），购自Sigma公司。Trizol reagent，购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒，购自Fermentas公司。Taq酶购自Takara公司。PCR反应引物，由上海生工生物技术有限公司合成。人MMP-9、TIMP-1细胞上清ELISA试剂盒，购自RapidBio公司。
1.2 动脉粥样硬化模型建立及含药血清制备
15只新西兰大白兔随机分为3组：正常对照组（normal， NL）、粥样硬化模型组（atherosclerosis group， AS）和辛伐他汀含药血清组（simvastatin group， SIM），每组5只。正常对照组予普通饲料喂养12周，其余各组予高脂饲料（1%胆固醇、10%猪油、89%普通饲料）喂养10周后，每组随机处死1只，证实有大动脉粥样硬化形成后，继续高脂喂养至12周，其中SIM组于第11周起给予辛伐他汀5 mg/kg，每天1次，灌胃14 d。末次给药前禁食12 h，给药后1 h颈动脉无菌取血，分离血清，同组动物血清混匀，0.22 ?滋m滤膜过滤灭菌，-80 ℃保存备用。
1.3 细胞培养及干预
U937细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基中，置于含5% CO2，37 ℃培养箱中，待细胞生长至接近融合时传代，2~3代后用于实验。调整细胞密度为5×106/mL，接种于6孔培养板，加入PMA使终浓度为50 ng/mL，培养48 h后见悬浮生长的U937细胞分化为巨噬细胞，伸出伪足，贴壁生长。弃去旧培养基，PBS液洗涤后，予不含血清的RPMI 1640培养基继续培养24 h，弃去培养基。分别加入各含5%、10%、20%正常兔血清，5%、10%、20%粥样硬化兔血清，以及5%、10%、20%辛伐他汀含药血清的RPMI 1640培养基，每组设3个平行组，培养24 h用于RT-PCR实验。
1.4 总RNA提取
吸净培养基，每孔加入1 mL的Trizol液，吹打裂解细胞，收集于无RNA酶离心管中，室温静置5 min。加入0.2 mL氯仿，剧烈颠倒15 s，室温静置3 min，4 ℃，12 000 × g离心10 min。转移上层水相液500 ?滋L到新的离心管，加入500 ?滋L异丙醇，室温静置10 min，4 ℃，12 000 × g离心7 min。弃上清，加入1 mL无RNA酶水配制的75%酒精，振荡混匀，4 ℃，7 500 × g离心5 min。重复酒精洗涤沉淀一遍，弃去酒精，室温干燥5 min，融解RNA于30 ?滋L无RNA酶水中，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计测定RNA含量，计算出RT-PCR所需样品量。
1.5 RT-PCR
取总RNA1.5 ?滋g，按逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA。以β-actin为内参照，进行半定量逆转录聚合酶链式反应。聚合酶链式反应：95 ℃ 5 min预变性，94 ℃ 45 s变性，56 ℃ 30 s退火，72 ℃ 45 s延伸，共35个循环，最后一次循环在72 ℃延伸7 min。RT-PCR产物用含1.5%琼脂糖凝胶电泳，Labwork成像系统采集图像及分析。合成引物序列，MMP-9-上游引物：5′- AGGACGGCA ATGCTGAT-3′，下游引物：5′- CGCCACGA GGAACAAACT-3′，扩增产物为362 bp；TIMP-1-上游引物：5′- TTCCGACCTCGTCATCAG-3′，下游引物：5′- GCATTCCTCACAGCCAAC-3′，扩增产物为340 bp；β-actin-上游引物：5′- ATCGTGCGTGA CATTAAGG-3′，下游引物：5′-ACAGGACTCC ATGCCCAGG-3′，扩增产物为195 bp。
1.6 ELISA测定
收集细胞上清液，4 ℃，3 000 r/min离心10 min，取上清，-80 ℃保存待检。ELISA采用双抗体夹心法，按照说明书步骤进行，测定细胞上清MMP-9、TIMP-1浓度。
1.7 统计学处理
所有数据均以均数±标准差（x±s）表示，三组间比较用单因素方差分析，两组间比较用LSD-t 检验，应用SPSS 10.0统计分析软件进行统计分析，P< 0.05 为差异有显著性。
2 结 果
2.1 辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞MMP-9 mRNA表达的影响
与相同浓度NL组相比，5%、10%、20%AS组MMP-9 mRNA表达均显著性增高（P值均< 0.05）。与相同浓度AS组相比，5%、10%、20%SIM组MMP-9 mRNA表达均显著性降低（P值分别为0.005、0.041和0.013）。与相同浓度NL组相比，5%、10%SIM组MMP-9 mRNA表达均增高（P值分别为0.034和0.029，表1、图1）。
不同浓度间SIM组MMP-9 mRNA表达差别无统计学意义（F=1.747，P=0.252）。
2.2 辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞TIMP-1 mRNA表达的影响
NL组、AS组和SIM组不同浓度之间TIMP-1 mRNA表达无显著差异（表2、图2）。5%、10%和20%SIM组之间TIMP-1 mRNA的表达有显著性差异（F= 6.498，P=0.032）。与5%SIM组相比，10%、20%SIM组TIMP-1 mRNA的表达显著性增加（P=0.039、0.014），而10%与20%SIM组之间无显著性差异（P=0.446）。
2.3 辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞MMP-9蛋白分泌的影响
与同浓度NL组比较，10%、20%AS组MMP-9分泌均显著性增加（P=0.007、0.002）；5%、10%、20%SIM组MMP-9分泌无显著性差异（P=0.824、0.857、0.658）。与同浓度AS组比较，5%SIM组MMP-9分泌无显著性差异（P=0.427），10%、20%SIM组MMP-9分泌显著性减少（P=0.009、0.001，表3）。
SIM组不同浓度之间MMP-9分泌无显著性差异（F=0.985，P=0.427）。
2.4 辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞TIMP-1蛋白分泌的影响
与同浓度NL组比较，AS组TIMP-1分泌均显著性减少（P=0.004、0.044、0.003）；与同浓度NL组比较，5%SIM组TIMP-1分泌减少（P=0.038）。与同浓度AS组比较，10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显著性增加（P=0.017、0.001，表4）。
SIM组不同浓度之间TIMP-1分泌有显著性差异（F=6.555，P=0.031）。与5%SIM组相比，10%、20%SIM组 TIMP-1分泌均显著性增加（P=0.038和0.014）。而10%和20%含药血清之间差异无显著性（P=0.456）。
3 讨 论
3. 1 MMP/TIMP与动脉粥样斑块稳定性
急性冠状动脉综合征患者是易损病人[1]，通常指在冠状动脉粥样硬化的基础上，斑块破裂，继而血小板粘附聚集和血栓形成，引起完全或不完全的血管阻塞，导致不稳定型心绞痛、非ST段抬高心肌梗死、ST段抬高心肌梗死及猝死。有报道[7-9]冠脉“罪犯”病变处多是软斑块、以正性重构为主，常伴血栓形成。斑块内细胞外基质过度降解，导致斑块中胶原含量减少，纤维帽变薄，是影响斑块稳定的重要因素。斑块破裂常发生在富含单核巨噬细胞的斑块肩部，此处巨噬细胞可分泌大量MMP，促进纤维帽降解[10]。MMP-9，又称明胶酶B，是巨噬细胞分泌的主要基质金属蛋白酶。TIMP是MMP的抑制物，目前已发现有4种：TIMP-1～TIMP-4，它们均可与激活的MMP 呈1 ∶ 1结合，从而使MMP失活。用免疫组化方法检测动脉粥样硬化斑块显示TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3显著性增多，且多存在于斑块肩部的巨噬细胞、纤维帽和脂核内，与MMP分布部位一致，部分抑制MMP的活性[11]。急性冠脉综合征患者存在着由炎症反应导致的以MMP-9升高为主的MMP-9/ TIMP-1失衡状态[2]。因此MMP与TIMP之间的平衡，对斑块稳定性的调节具有重要意义。研究还表明[12]，MMP-9在转录水平上受多种细胞因子、生长因子及活性物质的调节，而TIMP的表达很少受细胞因子和生长因子的影响。本实验采用血清药理学方法观察到，与同浓度NL组相比较，5%、10%和20%AS组U937单核源巨噬细胞MMP-9表达均显著性增高（P值均< 0.05）。这可能是因为粥样硬化血清中含有较高的低密度脂蛋白胆固醇，以及大量激活的炎性细胞因子、生长因子以及其他活性物质，促进MMP -9的表达。与相同浓度NL组比较，AS组TIMP-1 mRNA表达无显著性差异，但TIMP-1的分泌均显著性减少（P< 0.05），提示动脉粥样硬化血清不但可使巨噬细胞MMP-9增加，同时还可使TIMP-1分泌增加（翻译后水平）而表达（mRNA水平）并未增加，具体机制尚不清楚。
3. 2 他汀药与MMP/TIMP
PROVE IT（TIMI-22）研究[13]显示强化他汀治疗可使ACS患者30 d的临件减少，在稳定的患者，使临件长期降低，但其具体机制尚未完全明确。Luan等[14]报道，西立伐他汀呈剂量依赖性抑制兔平滑肌细胞和巨噬细胞MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9，但对TIMP-1和TIMP-2无影响。本研究显示，与相同浓度AS组相比，5%、10%和20%SIM组MMP-9 mRNA表达均显著性降低（P值< 0.05）；10%、20%SIM组MMP-9蛋白的分泌显著性减少（P值均< 0.01）。与相同浓度AS组相比，SIM组TIMP-1 mRNA表达无显著性差异（P >0.05）；但10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显著性增加（P值均< 0.01）。与Luan等[14]的报道有所不同，本研究显示辛伐他汀不但在一定剂量范围内可抑制巨噬细胞MMP-9的转录与分泌，而且增加TIMP-1的分泌。这可能是辛伐他汀稳定斑块、减少临件的机制之一。他汀具有多效作用（Pleiotropic effects）[15]，除了调脂作用外，还有抗炎、改善内皮功能等作用。辛伐他汀可能通过抑制巨噬细胞MMP-9的转录与分泌，同时还增加TIMP-1的分泌，从而调节MMP与TIMP之间的平衡，起到稳定斑块的作用。
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