时间：2023-05-31 09:11:35
开篇：写作不仅是一种记录，更是一种创造，它让我们能够捕捉那些稍纵即逝的灵感，将它们永久地定格在纸上。下面是小编精心整理的12篇细胞凋亡，希望这些内容能成为您创作过程中的良师益友，陪伴您不断探索和进步。
胰腺炎的病理生理过程，但要从本质上阐明细胞凋亡与胰腺炎之间的关系应从细胞凋亡的分子机制来进行研究。现在认为细胞调亡参与胰腺炎发病主要有两种机制：一类是受基因调控；另一类则是非基因调控。
1基因调控
受基因调控的细胞调亡又称为程序性细胞死亡。一般分为两类：一类是直接调控，如癌基因；另一类则是间接调控。如生物活性分子，通过诱导癌基因的表达发挥调控作用。
癌基因中bc1-2基因家族是最受关注的与细胞凋亡相关的基因之一。Wada等[1]对胰管结扎（PDL）鼠应用抗bc1-2单克隆抗体和抗增殖细胞核抗原（PCNA）单克隆抗体以免疫印迹和免疫组化方法对bc1-2和PCNA进行检测。结果显示，PDL鼠胰腺导管上皮细胞的bc1-2表达在第四、五天高于对照组2~5倍。bc1-2和PCNA免疫染色在对照组的胰腺导管上皮为微弱的染色，而在PDL鼠胰腺导管皮bcl-2和PCNA免疫染色阳性细胞数量增加，分别在第二天和第三天达最高值。该结果表明，bc1-2具有抑制胰腺导管上皮细胞凋亡的功能。为进一步研究bc1-2基因家族中各基因的作用，Miyamoto等[2]研究PDL和雨蛙肽诱导急性胰腺炎两种鼠实验模型和人慢性阻塞性胰腺炎（COP）胰腺外分泌细胞bc1-2家族相关基因的表达。结果显示，在正常胰腺未见bc1-2基因家族表达；在PDL组胰管结扎后1天在胰腺细胞即观察到bax和bc1-x表达，且在第二、三天尤为显著，而其时胰腺腺细胞也发生凋亡。同时导管细胞增加形成导管管状复合体，导管细胞内bc1-2、bc1-x染色增加并在第五天达最大值。鼠急性胰腺炎模型首次注射雨蛙肽后8小时和48小时发现胰腺细胞凋亡，同时应用免疫组化方法观察到胰腺细胞中存在 bax和bc1-x表达。COP时导管管状复合体导管细胞bc1-2、bc1-x、mc1-1染色阳性，但bax染色阴性。上述结果表明，在两种鼠胰腺炎模型中胰腺细胞内bax诱导细胞调亡；而bc1-2、mc1-1可能在防止导管细胞凋亡和形成导管管状复合体中起作用；bc1-x有既可诱导又可抑制细胞凋亡的双重作用。虽然许多实验证明bc1-2基因家族在胰腺细胞凋亡中发挥重要作用，但其作用机制尚未完全阐明。
癌基因中另一个与细胞凋亡相关的基因是被称为“基因组卫士”的野生型p53。Maacke等[3]在行ERCP时收集了27例慢性胰腺炎病人胰液细胞学标本，并应用一系列p53特异性单抗PAb1620、PAb1801、PAb240及CM-1（人重组p53多克降抗血清）以免疫过氧化酶染色观察p53表达情况，同时以TUNEL法检测调亡细胞。结果示，27例慢性胰腺炎病人中有16例（59%）p53蛋白表达阳性，11例PAb1620表达阳性，同时发现有凋亡细胞。可能的机制是慢性胰腺炎时氧自由基和一氧化氮基团损伤DNA。p53表达增加可能是DNA损伤的结果，并在DNA损伤的基础上诱导细胞调亡。有人认为野生型p53提高细胞内bax蛋白表达使得bc1-2/bax比例失衡而促进细胞凋亡[4]。
在基因调控与细胞凋亡关系的研究中，另一热点课题是一些间接调控细胞凋亡的生物活性分子，如转化生长因子（TGF）β、肿瘤坏死因子（TNF）等。最近，Subramanian等[5]从源于人中胚层的成骨细胞中识别一种TGF-β调控的锌指编码基因的TIEG（TGF-β诱导的早期基因）与胰腺炎细胞凋亡有关。为进一步研究TGF-β在胰腺外分泌细胞群中的表达、功能及其调控机制，Tachibana等[6]对培养的鼠胰腺AR42J细胞和人五种胰腺外分泌细胞PANC1、MIAPaCa2、BxPC3、HST66T和Capan1进行免疫印迹分析，结果发现，在这六种外分泌细胞中均有丰富的TIEG mRNA表达。应用纯化的TIEG亲和抗体进行定位检查发现TIEG存在于正常人胰腺外分泌部导管和腺细胞群。研究还发现，经TGF-β处理上述细胞2小时后可见TIEG表达上调。为进一步观察TIEG的表达增加是否诱导胰腺外分泌细胞凋亡，用5ng/ml tGF-β1处理PANC1细胞24小时、48小时和72小时，结果显示，在任一时间点TGF-β1都增加凋亡率，尤以72小时后为最甚。为进一步证实TIEG表达具有增加诱导凋亡功能，还进行了转染实验。用10μg表达TIEG载体（pMEX-neo-TIEG）转染PANC1细胞和仅转染对照载体（pMEX-neo）的PANC1细胞及未转染细胞进行研究。MTS增殖分析结果示，未转染细胞和pMEX-neo细胞生长正常；pMEX-neo-TIEG细胞增殖停止，而且72小时后pMEX-neo-TIEG细胞量较实验初低。DNA梯形图谱分析表明，pMEX-neo-TIEG细胞凋亡数在任一时刻均超过30%，而且还发现pMEX-neo-TIEG细胞凋亡率比TGF-β1处理的PANC1细胞凋亡率高，这可能是观察到的TGF-β1处理的PANC1细胞TIEG上调是瞬时的，而pMEX-neo-TIEG细胞内的TIEG上调则是稳定的。因此，TGF-β诱导的TIEG表达增加可诱导细胞凋亡。
还有一些资料表明，TNF是介导细胞凋亡的介质[7]，可能的机制是TNF激活T细胞表达Fas配体，Fas配体再与靶细胞结合促使靶细胞凋亡。
不仅TGF-β、TNF这些因子通过诱导癌基因表达发挥调控作用，而且一些生物活性物质也有类似的机制。有学者报道，用维生素K3和超过生理浓度的雨蛙肽（＞10-10M）[8]和用低浓度peroxynitrite（2~5μM）[9]分别培养鼠胰腺AR42J细胞，结果均可观察到细胞凋亡现象，且发现野生型p53表达增加。上述结果表明，一些生物活性物质可能通过野生型p53表达增加诱导细胞凋亡。
2非基因调控
近年来，尽管有关蛋白质和RNA合成抑制剂抑制凋亡研究已证实蛋白质大分子合成是凋亡的另一重要生化特征，同时证实细胞凋亡是一种由内在基因编码调控的细胞死亡方式[10]。但也有Fas介导细胞凋亡不依赖蛋白质合成的报道[11]。一些损伤因子直接或间接损伤DNA而致细胞凋亡，如缺血再灌注等。这些现象表明凋亡除受基因调控外还受非基因调控。
Fujimoto等[12]用血管钳钳夹鼠胰腺下方的脾动脉1小时后再松开血管钳造成选择性胰尾部缺血再灌注的实验模型，然后用DNA凝胶电泳方法观察细胞凋亡情况，结果在缺血再灌注后48小时观察到胰腺细胞凋亡的典型DNA梯形图谱。该实验表明，缺血再灌注可诱导胰腺细胞凋亡，但其机制尚不太清楚。
尽管从凋亡的分子机制研究凋亡与胰腺炎关系取得了一些进展，但仍需进一步阐明凋亡在胰腺炎中的确切作用机制，从而使之应用于临床实践。
新近，Matsuzaki等[13]研究发现，在雨蛙肽诱导的急性胰腺炎的急性阶段很少观察到细胞凋亡，但在急性期后恢复阶段则见大量细胞凋亡。而Tanaka等[14]研究观察到，在不同的慢性胰腺炎实验模型中显示凋亡的显著性。这些结果表明，细胞凋亡可能是胰腺炎病理生理中的一个环节，可能使胰腺炎向好的方向发展，亦可能使病情恶化。
3实验性胰腺炎的凋亡诱导治疗
Kaiser等[15]报道，在五种急性胰腺炎模型中急性胰腺炎严重程度与凋亡呈负相关现象，即在阻塞鼠胆胰共同通路和输注大剂量雨蛙肽诱导的轻度胰腺炎中可观察到细胞凋亡，而在阻塞负鼠胆胰共同通路和年幼雌鼠CDE饮食（无胆碱而乙硫氨酸充足的食物）诱导的重症胰腺炎则观察到坏死。凋亡与胰腺炎严重程度呈负相关，表明细胞凋亡可能是对胰腺损伤的有利反应。最近有研究提出，诱导细胞凋亡可减轻胰腺炎的严重程度。Saluja等[16]报道，在细胞凋亡存在条件下可减轻雨蛙肽诱导的胰腺炎严重程度。给予实验鼠5周大豆饮食后转为正常饮食27小时，然后重复注射超大剂量雨蛙肽50μg·kg-1·h-1共12小时诱导胰腺炎，对照组给予5周正常饮食后注射同样剂量的雨蛙肽诱导胰腺炎。结果发现，在5周大豆饮食继而转为正常饮食后，原来肥大的胰腺腺体迅速缩小，并且观察到缩小期间伴有大量的腺细胞凋亡，在缩小期间注射雨蛙肽诱导的胰腺炎炎症程度为2+，而对照组炎症为4+（4+表示广泛的炎症，0表达无炎症）。结果表明，在腺细胞凋亡时注射雨蛙肽，可减轻其诱导的胰腺炎严重程度。为进一步证实上述结果，Kaiser等[10]在结扎鼠胆胰共同通路诱导胰腺炎后给予蛋白质合成抑制剂环已酰亚胺以抑制细胞凋亡，结果发现抑制细胞凋亡后加重胰腺炎病变程度。另外一些学者用实验证明DA-9601[17]和1-cyano-2-hydroxy-3-butene(CHB)[18]诱导细胞凋亡也减轻了雨蛙肽诱导的胰腺炎严重程度。
由此可见，诱导调亡可能会降低胰腺炎的严重程度。尽管这些研究仅限于动物实验水平，但仍显示出细胞凋亡用于胰腺炎临床实践的美好前景。相信随着细胞凋亡的继续深入研究，必将有助于揭示胰腺炎的发病机制，并有可能提高胰腺炎的诊疗水平。转贴于 参考文献
1 wada M et al. Gastroenterology，1996;110(4 Suppl):A440
2 miyamoto Y et al. Gastroenterology，1997;112(4 Supp1):A464
3 maacke H et al. Br J Cancer，1997;75:1501～1504
4 burger M et al. Int J Cancer，1995;60:590
5 subramanian M et al. Nucleic Acids Res，1995;23:4907～4912
6 tachibana I et al. J Clin Invest，1997;99:2365～2374
7 norman J et al. Gastroenterology，1997;112(4 Supp1):A468
8 sata N et al. Gastroenterology，1996;110(4 Supp1):A428
9 sata N et al. Gastroenterology，1996;110(4 Supp1):A479
10 kaiser A et al. Am J Physiol，1996;271(3 Pt1):C982～C993
11 anderson M et al. J Immunol，1996;156:4083～4091
12 fujimoto K et al. Digestion，1996;57:228
13 matsuzaki S et al. Gastroenterology，1996;110(4 Supp1):A416
14 tanaka T et al. Gastroenterology，1997;112(4 Supp1):A487
15 kaiser A et al. Am J Physiol，1995;269(5 Ptl):C1295～C1304
16 saluja A et al. Biochem Biophs Res Commun，1996;220:875～878
【论文摘要】细胞凋亡是通过正常的方式在多细胞生物中消除不需要的、衰老的和受损的细胞，使机体细胞有丝分裂的速度与凋亡的速度相平衡。认识肝病发生、发展中细胞的异常凋亡有重要作用。
细胞凋亡是一个主动过程，是机体在生理或病理条件下受到刺激后，导致细胞产生一系列形态和生化方面的改变而引起的程序性细胞死亡（programmedcelldeath，PCD）。
一、细胞凋亡机制与检测方法
1.凋亡机制
细胞凋亡的生化特点包括质膜磷脂排列方向改变、细胞内离子环境自稳改变、蛋白酶和核酸内切酶激活分别致细胞蛋白质裂解和DNA断裂、细胞内产生神经酰胺、线粒体功能障碍、谷胱甘肽耗竭以及转谷氨酰胺酶激活。参与引发细胞凋亡的蛋白酶有多种，包括半胱氨酰天门冬氨酸特异蛋白酶家族成员和组织蛋白酶等。特别是caspase家族成员与细胞凋亡关系最为密切，至少有14种哺乳动物caspase已获克隆，但仅对caspase-3和caspase-8的功能有所了解。caspase-8在细胞凋亡中发挥启动作用；caspase-3在细胞凋亡中发挥效应作用。由于各caspase可相互激活，所以caspase蛋白酶级联反应是导致细胞凋亡结构改变的主要环节。线粒体功能障碍在细胞凋亡发生机制中起关键作用，能促进线粒体功能障碍的因素很多，包括各种有害刺激和信号传递过程，其中某些配体/受体相互作用最为重要。配体与靶细胞表面受体相结合，就导致复杂的多蛋白复合物形成，即将凋亡信号传递给效应蛋白酶FLICE，FLICE与caspase-8相互反应可激活caspase-8，caspase-8激活后就通过某些不明的机制引发线粒体功能障碍。线粒体功能障碍导致细胞色素C释放，细胞色素C与凋亡激活因子-2相结合，使caspase-3激活。caspase-3又激活DNA断裂因子，导致静息状态的核酸内切酶激活，最终引起DNA断裂。从线粒体功能障碍到DNA断裂，是细胞凋亡生化途径的共同途径。在肝细胞凋亡发生机制中，以Fas配体/Fas受体引发凋亡信号级联反应研究得最多。此外，转化生长因子β1及其受体、肿瘤坏死因子及其受体在肝细胞凋亡发生机制中均起重要作用。细胞凋亡的主要调节因子是B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白家族的成员。Bcl-2，通过抑制凋亡以延长细胞存活时间，是哺乳类动物细胞凋亡的一种强大抑制因子。与Bcl-2关系密切的同源物是Bcl-x，有两个RNA拼接变种，长Bcl-X是较大的拼接变种，短Bcl-X是短拼接变种。
2.检查方法
（1）对细胞凋亡形态学的观察有HE染色光镜观察以及电子显微镜、相差显微镜、共聚焦激光扫描显微镜检查。
（2）对DNA降解片段的分析有琼脂糖凝胶电泳检测DNA以及SouthernBlotting方法。
（3）荧光标记膜蛋白V的检测。
（4）流式细胞技术（FCM）可以对活体或已固定的凋亡细胞进行定量分析。（5）末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记术（TUNEL）。（6）免疫组化。
二、肝中的细胞凋亡
近年来研究表明：肝细胞的死亡方式包括坏死和凋亡两种。凋亡在肝脏疾病发展过程中的重要作用得到了人们的重视，现将有代表性的几种肝脏疾病中的凋亡现象分述如下1.病毒性肝炎。Fas系统介导的细胞凋亡在肝炎发生发展过程中起着重要作用，在不同条件下，穿孔素、颗粒酶、TNF-α、TGF-β等也参与了肝细胞的凋亡。1998年Galle等报道乙型肝炎时肝细胞Fas表达增强，致敏的细胞毒性T细胞（CTL）表达Fas配基（FasL），CTL经过免疫途径介导肝细胞凋亡，参与病毒的清理和肝炎的病理生理过程。若该反应过强，则可能诱发暴发性肝功能衰竭。
2.肝纤维化。肝纤维化是慢性肝病共有的病理改变，有研究表明各种类型的肝纤维化中都存在凋亡。肝星状细胞（HSC）的激活是肝纤维化发生的中心环节。1998年Gong等报道HSC向肌成纤维细胞（MFB）的转变与sFasL介导的凋亡增强相平行，Bcl-2和Bcl-XL在早期HSC上的表达高于晚期HSC和MFB，Bax则相反。这说明调节HSC的凋亡易感性在肝纤维化发生机制中起重要作用。
3.肝硬变。凋亡现象在肝硬变病例的肝细胞、胆管细胞、单核细胞中普遍存在。1999年Frommel等对照研究了正常肝组织、丙型肝炎和肝硬变标本，发现对Bcl-2的表达逐渐增强，肝硬变患者中表达最强，提出了一种解释肝硬变患者中肝癌高发生率的新机制。
4.肝癌。肝细胞癌形成过程中，不仅癌细胞异常增生，而且突变的细胞凋亡减少，肝癌细胞对凋亡诱导反应明显缺陷，1998年Jodo等报道肝癌血清中sFas水平升高，切除肿瘤后，sFas水平即下降。一些抑癌剂如:硒、类维生素A、化疗药物等可促进鼠肝的潜在恶性细胞的凋亡，从而降低肝癌的发病率，这从一个侧面反映了凋亡在肝癌发病机制中的地位。1997年CrasL等报道在非基因毒性致癌物nafenopin所致的原发性肝癌中，正常肝细胞和肝肿瘤细胞都会受到抑制。当nafenopin的作用消失后，二者的凋亡都增加。后者的增殖率和凋亡率都高于前者。
急性肾功能衰竭（acute renal failure，ARF）是一种常见的临床危急重症，以泌尿功能急剧障碍和继发的水、电解质平衡紊乱内环境稳态调节失衡为特征，死亡率在50%以上，甚至高达80%[1]。血管和肾小管是ARF发生的主要因素[2]，如急性肾小管上皮细胞坏死致小管液回漏可使ARF发生。但由于临床活检及实验研究表明轻度急性肾小管坏死（acute renal tubule necrosis，ATN）与临床表现的肾功能障碍程度之间不一致，因此有学者推测存在ATN以外的肾小管上皮细胞丢失途径[3]，目前研究表明细胞凋亡是肾小管上皮细胞丢失的一个主要途径[4]。
细胞凋亡（apoptosis）是在一定的生理或病理条件下细胞遵循其自身的程序结束其生命的过程。其特点为染色质凝聚、胞质浓缩、胞膜空化，最后形成凋亡小体[5]。研究表明[6]，细胞凋亡在ARF发病学中的两个阶段出现，第一个阶段发生在急性缺血或肾毒素引起损伤后的12～48h内，细胞可以通过死亡配体与死亡受体、凋亡相关基因、氧化应激、线粒体细胞色素C等多种途径引起肾小管上皮细胞凋亡和功能障碍，其相关基因家族有Bcl2家族、IAP（inhibitor of apoptosis）家族和caspase家族；第二个阶段发生在肾衰竭的恢复阶段，对于清除增生细胞、重建肾小管组织结构、恢复细胞功能是有利的，提示从凋亡途径来控制和改善ARF。本文综述ARF的细胞凋亡途径及其防治对策。
1 死亡配体和死亡受体介导的细胞凋亡
死亡受体和死亡配体结合是一条形成细胞凋亡的独立激活途径，以fas和fas L为例。fas和fas L结合后形成由死亡配体-死亡受体FADD胱冬酶原分子构成的凋亡小体，经由caspase8、caspase6、caspase7参与最后激活caspase3而导致细胞凋亡。研究表明，fas/fas L、TNFα/TNFR L在LPS诱导ARF的发病学中具有重要作用：在注射LPS后TUNEL法测得肾小动脉、肾小管及周围区域的细胞凋亡数目增加，凋亡小体与肾功能改变呈正相关；免疫组化结果显示fas/fas L，TNFα/TNFR L在ARF肾组织的近曲小管、远曲小管周围表达增加。结果提示细胞凋亡可能是LPS诱导ARF的发病机制之一，且凋亡的fas/fas L、TNFα/TNFR L途径参与了肾小管上皮细胞凋亡的发生。也有研究报道[7]，fas/fas L，TNFα/TNFR L介导的凋亡途径在顺铂导致的肾小管上皮细胞损伤的病因学中与损伤直接相关：顺铂可上调小鼠fas/fas L、TNFα/TNFR L离体和在体肾脏的表达；给小鼠注射顺铂可提高肾脏中TNFR1和TNFR2 mRNA的水平，TNFα缺失小鼠TNFR2增高较TNFR1迟钝，提示TNFR2的提高是配体依赖性的[8]；给TNFR1缺乏小鼠和野生型TNFR2缺乏小鼠注射顺铂后，其肾功能障碍程度、细胞凋亡指数、以及白细胞浸润均较轻，表明TNFR参与了顺铂致肾损伤的病理过程。
2 P53 与细胞凋亡
野生型P53基因具有诱导细胞凋亡的功能，但该基因发生突变后，反而可以抑制细胞的的凋亡。P53导致的凋亡在P14缺乏的细胞中被顺铂激活，并且给予特异性的P53 SiRNA能够增加顺铂耐受，说明P53在P14缺乏恶性胸膜脏层间皮瘤中起作用[9]。在RNA聚合酶Ⅲ作用下，ARF可抑制tRNA合成；当P53被敲除时，tRNA转录不受抑制，提示ARF时细胞凋亡与P53有关[10]。P53也参与负反馈途径调节细胞凋亡，如E2F1P19P53途径对局部缺血性ARF的肾小管上皮细胞增殖周期的调节起负反馈作用[11]。免疫组织化学染色发现急性损伤72h的肾小管上皮细胞在外髓表达P19蛋白。
3 氧自由基导致细胞凋亡
氧自由基（oxygen free radical，OFR）损伤细胞主要机制之一就是触发细胞膜上的不饱和脂肪酸发生过氧化链式反应，使内质网、溶酶体、线粒体等生物膜结构破坏，可使DNA变性、蛋白质氧化、髓质过氧化，导致细胞的一系列功能紊乱，并可导致细胞凋亡[12]。研究表明，汞中毒所致ARF时表现的血液流变性异常[13]以及由其引起的自由基损伤[14]，是加重ARF家兔肾组织细胞损伤和凋亡的因素[15]。ARF的缺血性损伤也发生在缺血再灌注的过程中，缺血再灌注时肾组织OFR产生增加，导致细胞凋亡或损伤。OFR介导的细胞凋亡与OFR对DNA损伤导致的ADP核糖转移酶活化和caspase酶原的活化以及脂质过氧化物等与胞内钙离子水平增加有关[12]，同时，活化对其敏感的核转录因子诱导细胞凋亡。而抗氧化剂与自由基清除剂能不同程度地抑制细胞凋亡的发生，为探讨凋亡相关疾病提供了方向[16]。
4 抑制凋亡与ARF治疗
研究表明[17]，速尿阻止缺血再灌注致大鼠ARF的促凋亡基因的表达：缺血再灌注促使皮质和髓质的细胞凋亡，导致凋亡相关基因73的Akt磷酸化显著下降，而给予速尿则明显减少缺血再灌注大鼠肾组织凋亡相关基因72的表达，显著提高AKt的磷酸化。缺血再灌注后不同时间注射抗炎因子alphaMSH可使血中尿素和肌酐的含量下降，减少fas/fas L表达，中性粒细胞浸润和白细胞粘附分子1表达下降；提示alphaMSH可以减轻缺血再灌注引起的ARF[18]。Klotho基因具有抗衰老作用，缺血再灌注后，Klotho mRNA和蛋白的表达明显下降，而实验前给予adkl可以明显提高Klotho在肝细胞而非肾细胞中Klotho mRNA和蛋白的表达，但可减轻肾组织细胞凋亡[19]。在叶酸导致的ARF中，在体实验给予叶酸可以增强炎症介质TNFα的产生，降低了Bclxl蛋白表达，导致肾小管上皮细胞凋亡；而给予抗TNFα的抗体后，降低肾组织TNFα含量，恢复肾组织Bclxl蛋白的表达，抑制肾小管上皮细胞凋亡，因此，给予TNFα阻断剂是预防和治疗ARF的良好途径[20]。
2008年6月闫 斌等：细胞凋亡与急性肾功能衰竭第3期2008年6月河北北方学院学报（医学版）第3期总之，多种诱发细胞凋亡的刺激因素通过使肾小管上皮细胞凋亡而导致肾功能障碍，在多种病因导致ARF的发病学中有重要意义。由于坏死具有不可逆的生物学特性，针对凋亡过程的不同靶点进行干预，抑制肾小管上皮细胞凋亡，从而减轻肾功能障碍或衰竭，可能是ARF极有希望的治疗途径，也为ARF的治疗提供了新的思路。x
转贴于 【关键词】 细胞凋亡；肾功能衰竭/急性；坏死
急性肾功能衰竭（acute renal failure，ARF）是一种常见的临床危急重症，以泌尿功能急剧障碍和继发的水、电解质平衡紊乱内环境稳态调节失衡为特征，死亡率在50%以上，甚至高达80%[1]。血管和肾小管是ARF发生的主要因素[2]，如急性肾小管上皮细胞坏死致小管液回漏可使ARF发生。但由于临床活检及实验研究表明轻度急性肾小管坏死（acute renal tubule necrosis，ATN）与临床表现的肾功能障碍程度之间不一致，因此有学者推测存在ATN以外的肾小管上皮细胞丢失途径[3]，目前研究表明细胞凋亡是肾小管上皮细胞丢失的一个主要途径[4]。
细胞凋亡（apoptosis）是在一定的生理或病理条件下细胞遵循其自身的程序结束其生命的过程。其特点为染色质凝聚、胞质浓缩、胞膜空化，最后形成凋亡小体[5]。研究表明[6]，细胞凋亡在ARF发病学中的两个阶段出现，第一个阶段发生在急性缺血或肾毒素引起损伤后的12～48h内，细胞可以通过死亡配体与死亡受体、凋亡相关基因、氧化应激、线粒体细胞色素C等多种途径引起肾小管上皮细胞凋亡和功能障碍，其相关基因家族有Bcl2家族、IAP（inhibitor of apoptosis）家族和caspase家族；第二个阶段发生在肾衰竭的恢复阶段，对于清除增生细胞、重建肾小管组织结构、恢复细胞功能是有利的，提示从凋亡途径来控制和改善ARF。本文综述ARF的细胞凋亡途径及其防治对策。
1 死亡配体和死亡受体介导的细胞凋亡
死亡受体和死亡配体结合是一条形成细胞凋亡的独立激活途径，以fas和fas L为例。fas和fas L结合后形成由死亡配体-死亡受体FADD胱冬酶原分子构成的凋亡小体，经由caspase8、caspase6、caspase7参与最后激活caspase3而导致细胞凋亡。研究表明，fas/fas L、TNFα/TNFR L在LPS诱导ARF的发病学中具有重要作用：在注射LPS后TUNEL法测得肾小动脉、肾小管及周围区域的细胞凋亡数目增加，凋亡小体与肾功能改变呈正相关；免疫组化结果显示fas/fas L，TNFα/TNFR L在ARF肾组织的近曲小管、远曲小管周围表达增加。结果提示细胞凋亡可能是LPS诱导ARF的发病机制之一，且凋亡的fas/fas L、TNFα/TNFR L途径参与了肾小管上皮细胞凋亡的发生。也有研究报道[7]，fas/fas L，TNFα/TNFR L介导的凋亡途径在顺铂导致的肾小管上皮细胞损伤的病因学中与损伤直接相关：顺铂可上调小鼠fas/fas L、TNFα/TNFR L离体和在体肾脏的表达；给小鼠注射顺铂可提高肾脏中TNFR1和TNFR2 mRNA的水平，TNFα缺失小鼠TNFR2增高较TNFR1迟钝，提示TNFR2的提高是配体依赖性的[8]；给TNFR1缺乏小鼠和野生型TNFR2缺乏小鼠注射顺铂后，其肾功能障碍程度、细胞凋亡指数、以及白细胞浸润均较轻，表明TNFR参与了顺铂致肾损伤的病理过程。
2 P53 与细胞凋亡
野生型P53基因具有诱导细胞凋亡的功能，但该基因发生突变后，反而可以抑制细胞的的凋亡。P53导致的凋亡在P14缺乏的细胞中被顺铂激活，并且给予特异性的P53 SiRNA能够增加顺铂耐受，说明P53在P14缺乏恶性胸膜脏层间皮瘤中起作用[9]。在RNA聚合酶Ⅲ作用下，ARF可抑制tRNA合成；当P53被敲除时，tRNA转录不受抑制，提示ARF时细胞凋亡与P53有关[10]。P53也参与负反馈途径调节细胞凋亡，如E2F1P19P53途径对局部缺血性ARF的肾小管上皮细胞增殖周期的调节起负反馈作用[11]。免疫组织化学染色发现急性损伤72h的肾小管上皮细胞在外髓表达P19蛋白。
3 氧自由基导致细胞凋亡
氧自由基（oxygen free radical，OFR）损伤细胞主要机制之一就是触发细胞膜上的不饱和脂肪酸发生过氧化链式反应，使内质网、溶酶体、线粒体等生物膜结构破坏，可使DNA变性、蛋白质氧化、髓质过氧化，导致细胞的一系列功能紊乱，并可导致细胞凋亡[12]。研究表明，汞中毒所致ARF时表现的血液流变性异常[13]以及由其引起的自由基损伤[14]，是加重ARF家兔肾组织细胞损伤和凋亡的因素[15]。ARF的缺血性损伤也发生在缺血再灌注的过程中，缺血再灌注时肾组织OFR产生增加，导致细胞凋亡或损伤。OFR介导的细胞凋亡与OFR对DNA损伤导致的ADP核糖转移酶活化和caspase酶原的活化以及脂质过氧化物等与胞内钙离子水平增加有关[12]，同时，活化对其敏感的核转录因子诱导细胞凋亡。而抗氧化剂与自由基清除剂能不同程度地抑制细胞凋亡的发生，为探讨凋亡相关疾病提供了方向[16]。
4 抑制凋亡与ARF治疗
研究表明[17]，速尿阻止缺血再灌注致大鼠ARF的促凋亡基因的表达：缺血再灌注促使皮质和髓质的细胞凋亡，导致凋亡相关基因73的Akt磷酸化显著下降，而给予速尿则明显减少缺血再灌注大鼠肾组织凋亡相关基因72的表达，显著提高AKt的磷酸化。缺血再灌注后不同时间注射抗炎因子alphaMSH可使血中尿素和肌酐的含量下降，减少fas/fas L表达，中性粒细胞浸润和白细胞粘附分子1表达下降；提示alphaMSH可以减轻缺血再灌注引起的ARF[18]。Klotho基因具有抗衰老作用，缺血再灌注后，Klotho mRNA和蛋白的表达明显下降，而实验前给予adkl可以明显提高Klotho在肝细胞而非肾细胞中Klotho mRNA和蛋白的表达，但可减轻肾组织细胞凋亡[19]。在叶酸导致的ARF中，在体实验给予叶酸可以增强炎症介质TNFα的产生，降低了Bclxl蛋白表达，导致肾小管上皮细胞凋亡；而给予抗TNFα的抗体后，降低肾组织TNFα含量，恢复肾组织Bclxl蛋白的表达，抑制肾小管上皮细胞凋亡，因此，给予TNFα阻断剂是预防和治疗ARF的良好途径[20]。
2008年6月闫 斌等：细胞凋亡与急性肾功能衰竭第3期2008年6月河北北方学院学报（医学版）第3期总之，多种诱发细胞凋亡的刺激因素通过使肾小管上皮细胞凋亡而导致肾功能障碍，在多种病因导致ARF的发病学中有重要意义。由于坏死具有不可逆的生物学特性，针对凋亡过程的不同靶点进行干预，抑制肾小管上皮细胞凋亡，从而减轻肾功能障碍或衰竭，可能是ARF极有希望的治疗途径，也为ARF的治疗提供了新的思路。
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细胞凋亡(apoptosis)又称为程序性死亡，是由基因控制的细胞自我消亡过程。其特征是质膜保持完整性，而核染色质固缩，内源性内切酶激活，将染色质DNA降解成寡聚小体，电泳带谱表现为特征性梯状带，无整个组织的破坏和炎性反应。1992年英国科学家Hickman等首次提出可以将诱导肿瘤细胞凋亡作为以后肿瘤治疗研究的主要目标和手段，诱导肿瘤细胞凋亡治疗逐渐成为国际肿瘤研究的一个热点。近年研究表明，许多中药的有效成分或其提取液具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，中药诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制主要有以下几个方面。
1 阻滞肿瘤细胞增殖周期
一般而言，每一代肿瘤细胞的增殖周期都需要依次经历G1期、S期、G2期、M期四个阶段。许多中药的有效成份能够作用于细胞周期的某一环节，从而使细胞增殖周期受阻，诱导其发生凋亡。用藤梨根氯仿提取液处理人肺腺癌A549细胞，可以对细胞周期产生影响，表现为G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，出现G0/G1期阻滞，并呈现一定的剂量依赖关系，伴PI染色检测的细胞凋亡率增加，提示藤梨根氯仿提取液可抑制A549细胞的有丝分裂，诱导肿瘤细胞凋亡[1]。Li等[2]报道黄连提取物及其主要成分小檗碱都可以在不影响CyclinB1 mRNA表达情况下，抑制CyclinB1蛋白活性，但不抑制Cyclin A～Cyclin E蛋白活性，使cdc2激酶活性降低，细胞进入有丝分裂受阻滞，被阻滞在G2期。某些药物可以阻滞肿瘤细胞由S期进入G2/M期而诱发其凋亡。左云飞等[3]研究发现，榄香烯对肝癌腹水瘤细胞系Hca2F25/CL216A3的G0/G1期细胞无明显作用，主要作用在S期，阻止细胞由S期进入G2/M期，从而抑制肿瘤生长。并观察到在G0/G1期前出现一个凋亡特异的AP峰。黄志煜等[4]报道小檗胺可抑制人白血病Jurkat细胞的增殖，使细胞阻滞在S期，G0/G1期细胞比例也有减少，同时并也观察到肿瘤细胞凋亡明显增加。
较多的中药通过阻滞肿瘤细胞于G2/M期而发挥诱导细胞凋亡的作用。马东礼等[5]在研究榄香烯对HeLa细胞的作用时发现，HeLa细胞增殖受到明显的抑制，细胞的分裂能力降低，绝大多数细胞阻滞在G2/M期。张曼颖等[6]研究发现，刺五加叶皂苷能诱导肺癌细胞SpcA1凋亡，细胞周期分析发现，G0/G1和S期细胞比例明显降低，G2/M期细胞明显升高，提示刺五加叶皂苷作用也是使SPCA1细胞阻滞于G2/M期。毛兰素是从鼓槌石斛中分离得到的，也可以阻滞人早幼粒细胞白血病HL60细胞于G2/M期，并伴Bcl2表达下调，Bax表达上调，诱导肿瘤细胞凋亡[7]。
2 影响癌基因和抑癌基因的表达
在肿瘤的发生发展过程中，肿瘤细胞表达的凋亡相关基因起重要的调控作用，其中的某些基因发生缺失，突变或过度表达，可导致细胞增殖失控或凋亡受阻。因此，如何调控凋亡相关基因或其相应产物，提高肿瘤细胞对药物的敏感性，并诱导细胞进入凋亡是肿瘤治疗取得成功的关键。目前bcl2、cmyc、p53是几个了解较为深入的、与凋亡调控有关的基因。
野生型p53(wtp53)基因的主要生物学功能为引起细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡和促进分化，对细胞生长起负调控作用，而因基因缺失或突变产生的突变型P53(mtp53)蛋白则对细胞的增殖和转化起促进作用，抑制细胞凋亡，导致肿瘤的发生[8]。p53基因发生突变是许多人类恶性肿瘤中常见的基因改变之一。实验证明[9]，大蒜素通过促进抑癌基因p53和p21的表达诱导人早幼粒细胞白血病HL60细胞和胃癌BGC823细胞凋亡。Wilson等[10]发现金雀异黄素(genistein)能诱导大肠癌HCT2116细胞的抑癌基因非甾体抗炎药活化基因NAG21和p53、p21的表达，并通过诱导p53基因来调节NAG21的表达。而在大肠癌HCT215细胞(p53基因缺失)中NAG21不能被诱导表达，提示金雀异黄素通过调节p53基因而诱导肿瘤细胞凋亡。
郭伟剑等[11]采用血清药理学方法研究健脾理气药(党参、白术、茯苓、八月札等)的体外诱导凋亡效应。结果显示，含中药血清作用2天后，诱导肝癌细胞凋亡，使细胞周期阻滞于S期，并上调p53蛋白的表达，提示上调p53蛋白的表达可能为健脾理气药诱导肝癌SMMC7721细胞凋亡的分子机制之一。抗癌口服液(由人参、灵芝和白花蛇舌草组成的复方水煎汤剂)作用于人胃癌MGC803细胞株，发现其具有明显抑制增殖和诱导凋亡作用，用药前后凋亡相关基因p53蛋白、Bcl2蛋白表达均减少，而Fas抗原表达明显增高，差别均有显著性改变[12]。
原癌基因bcl2、cmyc是主要的凋亡调控基因。bcl2能抑制细胞凋亡，bcl2受抑制被认为可能是细胞凋亡的共同通道[13]。而bax基因则倾向于分布在终末分化细胞、退化细胞，在凋亡旺盛的细胞中表达更强，在功能上与bcl2相反，其过度表达则触发凋亡。袁怀波等[14]用RTPCR和蛋白质免疫印迹技术，发现葛根黄酮提取物、葛根素和大豆苷元处理HL60细胞后能够上调bax mRNA表达水平，下调Bcl2蛋白表达和上调bax蛋白表达。姚保泰等[15]研究，发现盐酸小檗碱可通过下调bcl2的表达而达到防治胃癌及癌前病变的目的。左小东等[16]研究华蟾素诱导肿瘤细胞凋亡与细胞周期阻断和抗凋亡基因bcl2表达之间的关系。结果华蟾素能将肿瘤细胞阻断在S期，并能抑制bcl2基因的表达。马靖等[17]研究表明，cmyc、cjun和cfos上调参与甘草诱导肿瘤细胞凋亡的调控。何承伟等[18]研究半边旗提取物6F对HL60细胞内cmyc、bcl2及增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响，发现给予6F 8～231nmol/L，作用HL60细胞12小时，流式细胞分析示cmyc、bcl2及PCNA蛋白表达水平明显下降，并呈剂量效应关系。
因此，中药诱导肿瘤细胞凋亡的机制可能与一些癌基因和抑癌基因的表达改变有关，但其中可能的具体机制仍需进一步研究。
3 抑制端粒酶活性
端粒酶可能是目前已知的最广谱的恶性肿瘤分子标记物，并且与细胞周期和肿瘤凋亡基因表达关系密切。因此，鉴于端粒酶在肿瘤发生和发展中所扮演的重要角色，端粒酶活性的抑制可能是某些抗癌药物发挥作用的机制。
陈伟忠等[19]利用TRAPELISA法半定量检测了不同浓度的苦参碱对肝癌细胞HepG2端粒酶活性的影响。结果显示，苦参碱对HepG2的端粒酶活性有一定的抑制作用。同时认为苦参碱抗肿瘤的机制可能与抑制hTERT表达、降低端粒酶活性有关。曾建新等[20]实验发现，肝癌HCC9204细胞中端粒酶活性较高，而当用AS2O3处理48小时后，测得端粒酶活性显著降低，提示抑制端粒酶活性是AS2O3诱导肝癌细胞凋亡的机制之一。黎丹戎等[21]实验表明，茶多酚具有诱导BEL7402细胞分化的作用，并能降低端粒酶活性的表达。同时并没有发现发生分化的细胞端粒酶活性不下降的情况。说明端粒酶的活性抑制是细胞分化过程所伴有的，提示茶多酚的抗癌机制可能是通过抑制端粒酶的活性而实现。李伏娥等[22]用PCRELISA法对胃癌细胞端粒酶活性进行检测，苦参碱在诱导细胞凋亡的同时伴随端粒酶活性下调，且随苦参碱浓度增大和时间延长，抑制作用逐渐增强。提示苦参碱诱导细胞凋亡的调控可能与端粒酶表达调控之间存在密切联系。
韩国槲寄生中的凝集素能抑制肝癌细胞端粒酶活性[23]，桔梗属grandiflorum的水提取物能抑制肺癌细胞株A549端粒酶活性[24]。姜黄素能诱导白血病细胞株HL60细胞[25]和卵巢癌K562[26]细胞凋亡，伴有端粒酶活性抑制，且表现为浓度依赖性[25，26]。柴胡属中的scorzonerifolium也能诱导肺癌细胞株A549细胞凋亡并能抑制其端粒酶活性[27]。
目前，多数研究认为，这些药物抑制肿瘤细胞端粒酶活性可能是诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一。
4 影响细胞凋亡信号传导
caspase是一个半胱氨酸蛋白酶家族， 是细胞凋亡的主要执行者。 已发现的14种caspase均以酶原(procaspase)形式存在并定位于细胞内不同的亚细胞部位。 caspase8基因位于染色体2q3334。 caspase8也称MACH、FLICE、Mch5，1996年被克隆成功， 以无活性的酶原(procaspase8)形式存在于成人及除胎儿脑组织外的各种组织中， 在外周血白细胞中分布较高。 procaspase8有479个氨基酸， 分子量为55kD， 其8种异构体中2种有完整的酶活性， 能启动死亡受体介导的凋亡。 在死亡受体(Fas、DR4和HDR5等)介导的细胞凋亡途径中， caspase8是关键的启动型caspase。 caspase3是CE/CED3家族的重要成员， 是细胞凋亡调控的重要因子之一。 一般以23000相对分子质量的无活性前体存在于细胞质中， 当细胞进入凋亡时被激活， 并可促进ICE家族其他成员一起促进细胞凋亡， 被认为是多种凋亡途径的共同作用因子。
Moragoda[28]报道，姜黄素能抑制胃癌KAT0III和结肠癌HCT116细胞增殖并诱导凋亡，使HCT2116细胞的细胞周期停止于G2/M期，免疫印迹结果显示两种细胞cyclinD、E水平下降，其诱导凋亡的机理是导致PARP断裂，激括caspase8活性，启动Fas凋亡途径。
Pan等[29]研究乌龙茶多酚诱导人组织淋巴瘤U937细胞凋亡时发现，乌龙茶多酚可通过释放细胞色素C，活化caspase9、caspase3来诱导细胞凋亡。
韩国槲寄生中凝集素[23]、桔梗属grandiflorum[24]、姜黄素[25，26]、柴胡属中的scorzonerifolium[27]已经被发现能诱导肿瘤细胞凋亡且能抑制端粒酶活性，具有毒副作用小的优点。他们的研究均提示诱导肿瘤细胞凋亡是通过触发细胞色素C从线粒体向胞质的释放，伴有一些caspase激活而实现的，并可见上调bax表达和下调bcl2蛋白表达。推测线粒体途径是主要的通路。
尽管caspase3是多种凋亡途径共同作用的因子，但并非是所有细胞凋亡途径的共同通路。有报道证实，冬凌草素甲可以诱导人乳腺癌MCF7细胞凋亡，表现为caspase9依赖性，而非caspase3依赖性[30]。最近，还有报道白藜芦醇MCF7细胞凋亡与caspase8和casDase3的激活无关，但与bcl2、NFkappaB下调有关[31]。曲古抑菌素A也能诱导胃癌细胞凋亡，可能与P53和bax蛋白表达增加，bcl2蛋白和SurViVin蛋白表达减少有关，并独立于caspase途径[32]，这也说明细胞凋亡可在没有caspase参与的条件下发生，存在不依赖caspase的凋亡通路。
另外，某些中药诱导肝癌细胞凋亡的机理还与蛋白激酶(PKC)、cAMP等信息分子有关。PKC可拮抗皮质激素诱导的胸腺细胞凋亡，槲皮素作为PKC的拮抗剂，可逆转这种作用，增强机体对肿瘤细胞的吞噬能力，诱导细胞凋亡。槲皮素能降低PTK活性，抑制cAMP和cGMP的磷酸二酯酶，增加cAMP水平，降低cGMP水平，调节细胞内二者的比值，控制细胞凋亡的蛋白磷酸化，导致肿瘤细胞凋亡[33]。
5 展 望
随着研究工作的不断深入，细胞凋亡的研究为肿瘤治疗提供了新的思路和靶点。人们已经认识到诱导肿瘤细胞凋亡很可能是肿瘤治疗的一个新策略。但是，在中医药与细胞凋亡关系研究领域，相关中医基础理论研究明显滞后于中药作用机制研究，目前主要限于运用现代医学手段检测某些中药或方剂对肿瘤细胞的诱导凋亡作用，而缺乏对相应中医理论的探讨。因此，将传统中医基础理论与现代分子生物学有机地结合，开展“中医分子生物学”的研究，对中医药现代化研究具有十分重要的意义。
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【关键词】 肺肿瘤 蛋白质PTEN 细胞凋亡 细胞增殖 免疫组织化学
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the expression of PTEN and its relationship with cell proliferation and apoptosis in nonsmallcell lung cancer (NSCLC). MethodsThe immunohistochemistry stain （SABC） method was applied to investigate the expression of PTEN and PCNA in samples of 43 NSCLC and 20 normal adjacent lung tissues. TUNEL method was applied to detect the apoptosis. The apoptosis index (AI) and mitotic index (MI) were defined. ResultsThe positive rate of PTEN was significantly lower in cancer tissues than in their normal adjacent tissue (χ2=13.609，P
［KEY WORDS］ lung neoplasms; protein PTEN; apoptosis; cell proliferation; immunohistochemistry
细胞周期失控是癌变的重要原因。细胞总是处于一种增殖与凋亡的动态平衡中，细胞的增殖和凋亡状态受一系列基因的调控，当促增殖的基因过度表达，促进凋亡基因突变或缺失均会造成增殖和凋亡动态平衡的打破，导致肿瘤的发生。基因控制增殖与凋亡失衡在肺癌发生发展中起主要作用。本研究对PTEN基因在不同组织类型、分化程度、临床分期及预后的肺癌组织标本中的表达进行检测，旨在探讨PTEN基因表达及细胞增殖、凋亡在肺癌发生发展中的作用和它们之间的关系。
1 材料与方法
1.1 标本及其来源
43例肺癌、20例癌旁正常肺组织标本均取自我院手术病理证实标本。43例肺癌病人中，男23例，女20例；年龄41～77岁，平均（59.2±9.7）岁。鳞癌17例，腺癌26例；高分化2例，中分化20例，低分化21例。有淋巴结转移21例，无淋巴结转移22例。按国际抗癌联盟（UICC）1997年肺癌国际分期修正标准进行TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期10例，Ⅲ期19例，Ⅳ期4例。随访3年，存活19例，死亡24例。
1.2 方法
1.2.1 标本处理 标本均经40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，按4 μm厚连续切片4张，1张行苏木精伊红染色，3张分别行PTEN、PCNA免疫组化染色和TUNEL法染色。
1.2.2 PTEN、增殖细胞核抗原（PCNA）以及TUNEL免疫组化染色 采用SABC免疫组化检测技术，严格按照试剂盒说明书进行操作，以PBS替代一抗作为阴性对照，以已知肺癌阳性切片作为阳性对照。
1.2.3 结果判断 PTEN蛋白主要分布在胞浆，细胞浆显示棕黄色颗粒者为阳性。肿瘤细胞核、胞浆均未见棕黄色颗粒为（－）；0～10%癌细胞内可见棕黄色颗粒为（±）；11％～30%癌细胞内可见棕黄色颗粒为（+）；31％～50%癌细胞可见棕黄色颗粒为（）；>50%癌细胞见棕黄色颗粒为（）。以（+）、（）及（）表达作为阳性，以（±）及（－）表达作为阴性。PCNA主要分布在胞核，细胞核出现棕黄色颗粒为增殖细胞。TUNEL染色阳性颗粒位于细胞核内，细胞核出现棕黄色颗粒为凋亡细胞。随意计数5个以上高倍视野，不少于1 000个细胞，以凋亡细胞与总细胞比值作为凋亡指数（AI），增殖细胞与总细胞的比值作为增殖指数（MI）。
1.3 统计学处理
数据间比较采用四格表χ2检验和t检验。
2 结
果
2.1 肺癌与癌旁正常肺组织PTEN表达、细胞凋亡和增殖情况
本文43例肺癌组织PTEN阳性20例，阳性率为46.51%；20例癌旁正常肺组织PTEN阳性19例，阳性率为95%，两者相比较差异有显著意义（χ2=13.609，P
癌旁正常肺组织AI为（1.250±0.775）%，肺癌组织为（4.126±2.088）%，两者比较，差异有显著性(t=8.279，P
癌旁正常肺组织的AI与MI无相关性（r=0.026，P>0.05）。肺癌组织AI与MI比值呈正相关（r=0.622，P
2．2 肺癌组织PTEN蛋白表达、AI、MI与临床病理的关系
鳞癌与腺癌PTEN表达、AI和MI差异无显著性，提示肺癌PTEN蛋白表达、AI和MI与组织类型无关。高中分化肺癌与低分化肺癌比较，PTEN蛋白表达和AI差异有显著性，MI差异无显著性，提示肺癌PTEN蛋白表达和AI与组织分化程度有关，MI与组织分化程度无关。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期比较，PTEN蛋白表达和AI差异无显著性，MI差异有显著性，提示肺癌PTEN蛋白表达和AI与TNM分期无关，MI与临床分期有关。肺癌淋巴结转移组PTEN表达与淋巴结无转移组差异有统计学意义，提示肺癌PTEN蛋白表达与淋巴结转移有关。肺癌淋巴结转移组AI和MI与淋巴结无转移组差异无统计学意义，提示肺癌AI与MI与淋巴结转移无关。肺癌存活组PTEN蛋白表达、AI及MI与死亡组比较有显著性差异，提示肺癌PTEN蛋白表达、AI及MI与预后有关。见表1。
2.3 肺癌PTEN蛋白表达与细胞凋亡和增殖关系
PTEN阳性的肺癌组织细胞AI为（5.585±1.782）%，阴性者为（2.857±1.399）%，二者比较，差异有显著性(t=5.525，P
3 讨
论
PTEN（或称MMAC1，TEP1）是1997年由STECK等3个研究小组分别发现并命名的一种新的抑癌基因，是至今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因［1］。它在肿瘤细胞浸润、血管发生以及肿瘤转移中起重要作用［2］。研究发现，PTEN可去除3，4，5三磷酸磷脂酰肌（PIP3）3′位上的磷酸基团，调节丝苏氨酸激酶（Akt）的功能， 对细胞增殖分化具有负调节作用［2，3］。丢失PTEN的细胞会失去这种负调节作用，促进肿瘤的进行性生长。在多种人体肿瘤中均发现PTEN基因的突变和杂合性丢失。KIM等［4］报道，42％～70%的小细胞肺癌和27％～50%的非小细胞肺癌有PTEN的杂合性丢失（LOH）。
本实验结果显示，肺癌组织中PTEN基因的蛋白表达主要分布在胞浆，在核膜上也有少量着色，癌旁正常肺组织较肺癌组织着色明显增强，肺癌组织PTEN的蛋白表达显著低于癌旁正常肺组织，肺癌PTEN表达下调，提示PTEN蛋白的缺失在肺癌的发生中可能起重要作用；PTEN蛋白表达与肺癌的组织类型、临床分期无关，而与组织的分化程度、淋巴结转移和病人的预后密切相关。MCMENAMIN等［5］报道，PTEN蛋白在前列腺癌中表达水平越低，肿瘤的恶性程度越高；临床分期越晚，预后越差。本实验结果也显示，低分化肺癌PTEN蛋白表达水平低，说明PTEN蛋白表达水平越低，肺癌恶性程度越高。REIFENBERGER等［6］研究发现，PTEN突变的恶性黑色素瘤较未发生突变的黑色素瘤更易发生淋巴结转移。本文实验结果显示，有淋巴结转移的肺癌病人PTEN表达水平明显低于无淋巴结转移者，提示PTEN蛋白低表达的肺癌病人更容易发生淋巴结转移，可能是因为PTEN蛋白缺失的肺癌病人失去PTEN对FAK介导细胞浸润、转移和生长的抑制作用，从而更容易发生淋巴结转移。以上结果提示，PTEN的蛋白表达可以抑制肿瘤细胞的浸润、转移和生长。PTEN蛋白表达与肺癌病人预后的关系至今未见报道。MCMENAMIN等［5］研究发现，PTEN蛋白的丢失严重影响前列腺癌病人的预后。本实验结果显示，PTEN蛋白表达与肿瘤的恶性程度及淋巴结转移密切相关，PTEN蛋白高表达的肺癌病人预后良好，PTEN可以作为判断肺癌病情和预后的指标。
细胞凋亡是一种不同于细胞坏死的细胞生理性死亡方式，是受基因编码的细胞主动“自杀”过程，又称程序性细胞死亡。细胞凋亡在肿瘤发生发展过程中主要起负反馈调控作用，可以阻遏肿瘤细胞的迅速生长。
STAUNTON等［7］研究发现，不同类型的肿瘤有不同的细胞AI，而且与肿瘤分化、分级、进展和肿瘤的生物学行为有关。本文实验结果与HWANG等［8］报道结果相似。AI与肺癌临床病理特征之间的关系目前研究较少。本实验结果显示，细胞AI与肺癌组织的分化程度密切相关，细胞AI越高，肺癌恶性程度越高。但本实验结果未显示细胞AI与肺癌组织类型、TNM分期有关。LANGENDIJK等［9］报道，细胞AI越高的非小细胞肺癌，越容易发生淋巴结及远处转移。本组资料虽显示淋巴结转移组比非转移组细胞AI高，但无统计学意义。
细胞AI与肺癌预后的关系报道较少，EEROLA等［10］报道，细胞AI高的手术治疗的大细胞肺癌病人的预后差。本实验资料显示，肺癌死亡组细胞AI较存活组明显增高，提示细胞AI可作为判断肺癌预后的指标。另有文献报道，行放疗肺癌病人中高AI者提示预后良好。提示在临床上可以通过检测细胞AI，选择细胞AI高的肺癌病人行放化疗，或通过转基因技术提高病人对放化疗的敏感性。
肿瘤细胞增殖活性是指肿瘤组织的增生状态，取决于进入细胞周期的增殖细胞及它们在全体肿瘤细胞所占的比例，是用以反映肿瘤良恶性及恶性程度的重要指标。PCNA也称周期蛋白（cyclin），是存在细胞核内的一种蛋白质，它对细胞由G1期向S期过渡起着重要的调节作用。
有关PCNA与肺癌的关系，国内外学者作了较多研究。本实验结果与KAWAI等［11］报道的结果相似。目前有关PCNA及MI与肺癌组织类型之间的关系还存在争论，本实验结果未发现MI与肺癌组织类型及淋巴结转移有关，与大多数学者结果一致，认为PCNA的表达仅能反映细胞的增殖状态，与组织类型无关。
本实验结果显示，癌旁正常肺组织细胞MI明显低于肺癌组织，提示肺癌组织较癌旁正常肺组织细胞增殖明显活跃，这可能也是肺癌得以发生发展的重要机制。有学者研究表明，PCNA表达与肺癌分期相关，分期越晚，PCNA表达越高［10］。本实验结果也显示，PCNA表达与肺癌临床分期密切相关，临床分期越晚，PCNA增殖指数越高。PCNA可作为肺癌早期诊断的参考指标。
有研究表明，PCNA表达随肺癌的恶性程度增高而增高，PCNA及MI与肿瘤分级呈正相关，提示肺癌PCNA的表达可反映肺癌细胞分化的程度，预示肿瘤恶性度的高低。本实验显示，高分化肺癌较低分化癌MI低，但无统计学意义。OYAMA等［12］报道，PCNA的表达与非小细胞肺癌的预后密切相关，PCNA的阳性表达越强，病人的预后越差。本实验结果也显示，PCNA及MI与肺癌病人的预后密切相关，MI越高，病人的预后越差。PCNA可作为判断肺癌病人病情及预后的指标。
以往认为肿瘤的发生仅仅是由细胞凋亡减少引起。许多证据证实，在大多数肿瘤，细胞凋亡不是减少了，而是增多了。王洁等［13］报道肺癌组织细胞凋亡较癌旁肺组织明显增多，且随着细胞增殖的增加而增加。本实验结果显示，肺癌组织细胞增殖和凋亡均较活跃，细胞AI与细胞MI呈正相关。推测其机制可能是肺癌恶性细胞无限度增殖，打破细胞增殖与凋亡的平衡，启动了凋亡机制。本实验结果显示，肺癌组织MI/AI比值为11.97，癌旁正常肺组织为10.96，肺癌组织MI/AI值同癌旁肺组织基本一致，提示细胞凋亡随细胞增殖的增加而呈比例增加。本实验结果还显示，癌旁正常肺组织AI与MI无相关性，而肺癌组织AI与MI呈正相关。这也说明肺癌组织细胞凋亡增加是由于增殖增加引起。但因为增殖细胞在数量上远远大于凋亡细胞，凋亡速度不可能跟上增殖的速度，在肿瘤的发生发展过程中所谓细胞凋亡减少是相对过快的细胞增殖而言的，癌细胞过度增殖及凋亡的相对不足在肺癌的发展过程中起重要作用，这可能是肿瘤得以迅速发展的原因之一。
PTEN蛋白与细胞凋亡的关系至今未见报道。本实验结果显示，PTEN蛋白阳性表达的肺癌细胞AI明显增高，MI明显降低，提示PTEN蛋白在肺癌具有促进细胞凋亡、抑制细胞增殖的双重作用。在众多抑癌基因中，具有双重抑癌作用者是不多见的，已有研究将PTEN作为靶基因用于肺癌基因治疗中。因此，PTEN很有可能成为将来肺癌转基因治疗最为有效的基因之一。
PTEN是通过诱导细胞凋亡和抑制癌细胞增殖双重作用来抑制肺癌发生发展过程的。而细胞增殖与凋亡又是癌细胞周期失控发生癌变的根源。基因治疗癌症是一种新的有效方法。目前主要是难以筛选出一种较为有效的靶基因。PTEN可能成为今后肺癌基因治疗最为重要的靶基因。
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［12］ OYAMA T， MITSUDOMI T， MIZOUE T， et al. Proliferating cell nuclear antigen may be superior to argyrophilic nucleolar organized regions in predicting shortened survival of patients with nonsmall cell lung cancer［J］. Surg Oncol， 1995，4:8387.
【关键词】 Ghrelin；高血糖；心肌细胞；凋亡caspase3
心肌细胞凋亡是糖尿病心肌病主要病理改变之一，长期心肌细胞凋亡的发生，将会导致临床早期心肌舒张功能障碍、晚期合并心肌收缩功能障碍及心力衰竭的形成〔1〕。近期研究发现，Ghrelin可以抑制多种细胞的凋亡，如成骨细胞、胰岛β细胞、脂肪细胞、内皮细胞及神经元等，但Ghrelin对高糖环境下心肌细胞凋亡影响的相关文献报道较少。因此，本实验以高糖环境培养心肌细胞，Ghrelin作为干预因素，旨在探讨Ghrelin对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响，从而为糖尿病心肌病的防治提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞来源
新生1～3 d的SD大鼠的心肌细胞（重庆医科大学动物实验中心提供）。
1.1.2 主要试剂
Ghrelin(美国Phoenix Biotech公司)，DMEM培养基（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），Ⅱ型胶原酶及胰酶（均购于Sigma公司），PBS、αactin单克隆抗体、SABC试剂盒、TUNEL检测试剂盒及DAB显色试剂盒（均购于武汉博士德生物技术公司），caspase3 活性检测试剂盒（购于南京凯基生物公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 原代心肌细胞的分离与培养
取出生1～3 d龄SD大鼠10～15只，无菌条件下取心脏，仔细剥离心包膜去除心房及大血管，剩余组织于PBS液中漂洗多次，放于青霉素小瓶侧壁上，用眼科剪将心组织剪成约1 mm3碎块。加入5倍体积的0.08％胰蛋白酶，反复吹打后36℃水浴消化7 min，静置，待自然沉降后弃上清。剩余沉淀再加入约5倍体积0.08％胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶1∶1混合液，置36℃水浴消化5～8 min，静置后将上清液移入10 ml离心管中，反复吹打至无细胞团块后用等体积含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化。剩余沉淀用同样条件及方法继续消化，一般经8～10次消化即可将组织消化完毕。各次消化产物以1 000 r／min离心8 min，弃去上清液后将细胞重悬于含15％胎牛血清的DMEM培养液，然后接种于50 ml培养瓶，37℃，5％ CO2培养箱中孵育1.5 h去除贴壁的成纤维细胞。轻轻吸出上层细胞悬液，调整接种密度，将细胞接种于24孔板（板底铺盖玻片），置37℃，5％CO2培养箱中培养(培养液中加入5溴脱氧尿嘧啶0.1 mmol/L，以抑制成纤维细胞增殖)，培养48 h换液，以后每2 d换液1次。
1.2.2 台盼蓝拒染实验检测原代心肌细胞存活率
将0.4％台盼蓝溶液与细胞悬液等比例混匀，滴入细胞计数板，2 min后于倒置相差显微镜下计数，未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞，计算细胞存活率〔%，活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%〕，重复3次。
1.2.3 心肌细胞纯度鉴定
细胞培养第3天取出细胞爬片，4％多聚甲醛固定30 min后，用0.01 mol／L PBS漂洗3次。加入3％H2O2消除过氧化氢酶，封闭血清，室温封闭30 min后加入以1∶300稀释的兔抗大鼠特异性αactin抗体于4℃孵育过夜。然后分别用荧光标记的山羊抗兔IgG抗体37℃避光孵育60 min。PBS清洗3次后立刻荧光显微镜下观察，绿色荧光染色的细胞即为阳性心肌细胞。阳性细胞百分率(%)＝阳性细胞数/细胞总数×100%，重复3次。
1.2.4 实验分组
原代心肌细胞培养3 d后进行实验分组，分为以下3组：①正常对照组（N组)：葡萄糖浓度为5.5 mmol／L;②高糖组（H组）：葡萄糖浓度为25.0 mmol/L；③高糖+Ghrelin组（G组）：酰基化Ghrelin终浓度为107 mol/L，葡萄糖浓度为25.0 mmol/L。
1.2.5 TUNEL法检测心肌细胞凋亡
将各组细胞爬片用PBS洗3次后，4％多聚甲醛固定30 min，采用TUNEL法检测细胞凋亡情况，同时设置阳性与阴性对照。检测结果判断：光镜下阳性细胞为细胞核中有深浅不一的棕黄色颗粒（DAB显色）。而正常非凋亡细胞及阴性对照胞核被苏木素复染呈蓝色。凋亡细胞分析：计数200倍视野下的凋亡细胞数及细胞总数，每组拍摄10个视野，计算凋亡细胞百分率(凋亡细胞/心肌细胞总数×100%)，重复5次。
1.2.6 caspase3活性测定
按照caspase3活性试剂盒说明书进行操作。收集各组实验细胞，PBS清洗2次，2 000 r/min离心5 min，去除PBS。沉淀细胞中加入50 μl预冷裂解液和0.5 μl DTT。 吹打，冰上裂解60 min，期间涡旋4次，每次10 s，4℃10 000 r ／min离心1 min，吸取上清至新管中置冰上，测蛋白浓度。各组应采用同样蛋白量进行实验，加入50 μl的2×Reaction Buffer和0.5 μl DTT，加入5 μl caspase3 substrate并于37℃ 避光孵育4 h ，分光光度计在400 nm波长测定其吸光值，计算OD诱导剂／OD阴性对照确定各组caspase3活性值。
1.3 统计学处理
数据以x±s表示，用SPSS11.0软件对数据进行各组间单因素方差分析。组间两两比较采用t检验。
2 结果
2.1 心肌细胞存活率测定
台盼蓝染色随即观察细胞存活率分别为95.4％，98％，96％。
2.2 心肌细胞形态学观察
刚接种的心肌细胞尚未贴壁，以圆形为主。8～12 h后，部分心肌细胞逐渐变形并贴壁生长，可出现单个细胞自发性搏动。24 h后观察细胞已大部分贴壁，单个搏动细胞数目增加，并逐渐在瓶底铺展，伸出伪足，相互接触交织成网，第48小时可形成呈同心圆放射状排列的细胞簇，搏动频率、节律、强度稳定，60～140次／min左右。
2.3 心肌细胞纯度鉴定
心肌特异性αactin单克隆抗体做免疫荧光染色鉴定，阳性率接近96％。见图1。
2.5 caspase3 活性测定 N组心肌细胞caspase3 活性较低；H组caspase3 活性较N组明显增加(P＜0.05)；G组caspase3活性较高糖组明显降低(P＜0.05)。见表1。表1 各组心肌细胞凋亡率及caspase3活性测定比较(略)
3 讨论
糖尿病心肌病是糖尿病主要的心血管并发症之一。越来越多的证据表明，心肌细胞凋亡与糖尿病心肌病密切相关，并在糖尿病心肌病的病程发展过程中起着重要作用。
Ghrelin是首先从大鼠胃黏膜中分离得到的一种含28个氨基酸的多肽，是生长激素促分泌素受体（GHSR）的内源性配体〔2〕。GHSR在全身多器官组织中广泛分布，心脏和血管均有表达〔3～5〕。Ghrelin与受体GHSR结合后，通过自分泌、旁分泌及内分泌形式发挥多种生物学效应。近期研究发现，除可刺激生长激素释放外，Ghrelin能够抑制多种细胞的凋亡〔6～12〕，如成骨细胞、脂肪细胞、胰岛β细胞、小肠上皮细胞、内皮细胞及大脑皮层神经元等。但目前尚未见Ghrelin对高糖环境下心肌细胞凋亡影响的相关文献报道。
本研究显示，H组心肌细胞凋亡率较N组明显增高，说明高糖环境可以增加心肌细胞凋亡。引起心肌细胞凋亡的机制尚不清楚，可能与高血糖状态下线粒体通路及死亡受体通路激活、PKC同工酶的凋节、P53基因的参与、活性氧物质的积累和氧化应激等有关〔13〕。与H组比较，G组心肌细胞凋亡率明显降低，表明Ghrelin对高糖诱导的心肌细胞凋亡具有抑制作用。caspase3是细胞凋亡中的关键蛋白酶，是最重要的凋亡执行者。一旦caspase3被激活，细胞凋亡的发生将不可避免，因此caspase3活化也被称为凋亡发生的标志性事件。本研究中，H组较N组心肌细胞caspase3活性显著升高，表明高糖环境可以增加caspase3活性，诱导心肌细胞凋亡。而Ghrelin处理后，caspase3活性与H组相比明显降低，提示Ghrelin可能通过抑制caspase3的活化发挥抗凋亡作用。
本研究提示，caspase3活性降低，可能是Ghrelin保护细胞凋亡的重要机制之一。除此之外，Ghrelin还可以通过下述途径抑制细胞凋亡：①上调肿瘤坏死因子α（TNFα），激活NFκB途径。有研究报道，Ghrelin能够减少心力衰竭时心肌细胞凋亡，同时伴有心肌细胞内TNFα增加，NFκB活性升高。表明Ghrelin抑制心肌细胞凋亡，部分可能通过激活TNFα、NFκB的死亡受体途径介导〔14〕；②激活PI3K/Akt通路。PI3K/Akt是细胞内重要的信号转导分子。活化的Akt通过磷酸化作用进一步激活或抑制下游靶蛋白，进而发挥调节细胞增殖、分化等作用。研究发现，Ghrelin可以激活Akt，抑制caspase3的激活，减少高糖引起的内皮细胞凋亡。予以PI3K抑制剂LY294002后，Ghrelin对caspase3的抑制作用明显减弱，显示Ghrelin可以通过PI3K／Akt通路实现抗内皮细胞凋亡的作用〔12，15〕；③抑制活性氧簇的产生。活性氧物质的过多积累是导致细胞凋亡的原因之一。Ghrelin能够抑制活性氧簇的产生，提示Ghrelin保护神经元凋亡的机制可能与减少活性氧簇产生有关〔16〕。
总之，研究表明Ghrelin能够抑制多种细胞的凋亡，但其影响细胞凋亡的具体作用机制尚未完全明了，有待进一步研究。Ghrelin可以通过降低caspase3的活性减少高糖诱导的心肌细胞凋亡，可能为今后糖尿病心肌病的防治提供新的治疗靶点。
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血管平滑肌细胞（VSMC）的凋亡在动脉粥样硬化的进展中有十分重要的作用，因此对于其诱导因素的研究十分有意义。本文就VSMC凋亡诱导因素做浅要的概述。
1血管平滑肌凋亡的诱导因素
1.1氧化型低密度脂蛋白（OX-LDL）沈洪[1]等报道OX-LDL刺激可使培养的VSMC表现明显的细胞增殖，NS-398可减弱VSMC的增殖，但却协同OX-LDL导致凋亡作用的增强。巴玉峰[2]等发现7-酮胆固醇能诱导VSMC凋亡，并且是由脂质过氧化作用引起。Ding[3]等研究发现高浓度OX-LDL能增强平滑肌细胞凋亡。Ingueneau[4]等也发现OX-LDL诱导VSMC凋亡，其机制与caveolin-1有关。Zhang[5]等实验发现OX-LD诱导大鼠血管平滑肌细胞的增殖且其机制与ERK1/2和Ki-67的表达增加有关。因此笔者认为如何在AS的不同阶段控制OX-LDL的浓度对于预防和治疗AS是极为重要的。
1.2一氧化氮田宏[6]等发现一氧化氮（NO）可以促使平滑肌细胞中Fas抗原高表达，诱导血管平滑肌细胞发生凋亡，其机制与NF-kB信号通路有关。
1.3E1A激活基因阻遏子E1A激活基因阻遏子（CREG）是新近发现的一种分泌型糖蛋白，实验表明[7]在药物刺激后，CREG表达抑制的VSMC更容易发生凋亡，而CREG过表达明显抑制细胞凋亡。
1.4MG132郭芳[8]等的研究表明MG132能阻止26S蛋白酶体对泛素结合蛋白的降解、抑制20S蛋白酶体的糜凝乳蛋白酶活性，从而阻断UPP，它能激活c-Jun氨基端激酶（JNK1）从而启动凋亡。此外，MG132还可以通过上调caspase3来诱导凋亡。
1.5同型半胱氨酸同型半胱氨酸（HCY）被称为是致动脉粥样硬化独立而非传统的危险因素。张伟伟[9]等发现HCY呈时间依赖性诱导人VSMC的死亡受体Fas等表达上调，表明HCY诱导人VSMC凋亡可能是由Fas和TNFR1参与的死亡信号通路介导的。
1.6其他微小RNA-146a可以促进血管平滑肌细胞的增殖，抑制凋亡[10]。此外，活性氧、细胞成分细胞生长因子和炎症因子等也能调控平滑肌细胞的凋亡。
2展望
血管平滑肌细胞凋亡的诱导因素很多也十分复杂，如何控制好凋亡的速度，使血管平滑肌的增生和凋亡处于动态平衡是稳定粥样斑块的关键。虽然近年来对于血管平滑肌细胞凋亡机制的研究十分迅速，但仍有许多问题亟待解决，这些问题的不断深入研究对临床应用有十分重要的意义。
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《中华中医药杂志》2014年第七期
一、软骨细胞凋亡调控软骨退变的作用机制
细胞凋亡（细胞程序性死亡）是一个主动的、信号依赖的过程，并由基因控制的主动的、高度有序的死亡过程。在正常情况下，软骨细胞也存在着凋亡的现象，软骨细胞凋亡对维持关节软骨的形态结构及功能发挥重要的调控作用。不同年龄组动物关节软骨中细胞凋亡程度与年龄增长有关，软骨细胞的凋亡在成熟关节软骨形态结构的维持、再建和更新过程中也发挥重要的调控作用。若软骨细胞的凋亡超出一定的范围，会导致软骨细胞数量减少，软骨细胞数量的变化不仅引起软骨基质合成与分泌的减少，而且还能引起维持软骨基质合成与降解酶系统平衡的紊乱，最终引起软骨基质的质与量发生变化，软骨基质的这种变化又会促进软骨细胞的凋亡，从而导致软骨退变。目前研究表明，线粒体凋亡、内质网应激性凋亡、细胞自噬在OA的发病过程中发挥重要的调控作用。
1.软骨细胞线粒体凋亡信号通路与软骨退变的关系软骨退变是OA发生发展的一个重要因素，出现软骨细胞数减少、抗氧化防御能力下降、生长因子和细胞因子免疫应答改变及基因和蛋白表达模式改变等。促凋亡与抗凋亡信号之间的失衡是介导软骨细胞凋亡的关键，各种因素引起的凋亡信号传至软骨细胞内的作用位点，激活靶分子而产生酶级联效应，诱导细胞凋亡，线粒体凋亡通路是软骨细胞凋亡的重要途径之一。线粒体具有传递电子、氧化磷酸化、能量代谢、贮存Ca2+、抗活性氧化等重要生理作用。线粒体功能障碍时生成活性氧，过多的活性氧可引起线粒体损伤，从而释放促凋亡因子，导致细胞凋亡。活性氧可作用于线粒体内膜通透改变孔道（permeabilitytransitionpore，PTP），加速PTP开放，释放细胞色素C（cytochromeC，CytoC）促进软骨细胞凋亡，而释放的CytoC又改变线粒体内电子传递链的功能，引起活性氧生成增加。正常细胞中CytoC位于线粒体内外膜之间，在电子呼吸传递链中起重要作用。当在凋亡发生时，CytoC从线粒体释放入胞质，启动半胱氨酸蛋白水解酶活化，与半胱氨酸蛋白酶-9前体、凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）形成凋亡小体，并在脱氧腺苷三磷酸（deoxy-adenosinetriphosphate，dATP）辅助下激活Caspase-9；Caspase-9激活Caspase-3，活化的Caspase-3瀑布式活化Caspase-2、6、8、10，而激活的Caspases最终活化脱氧核糖核酸酶（CAD/DFF45），水解核酸及细胞骨架，引起细胞凋亡[7-8]。Bcl-2通过抑制CytoC释放，降低活性氧生成，从而抑制凋亡。Bax为编码Bcl-2相关蛋白X的基因，具有诱导细胞凋亡的功能，Bcl-2/Bax之间的比例是调控细胞凋亡的关键因素。p53位于线粒体上的转录因子，能上调促凋亡基因的表达，下调抗凋亡基因的表达。p53基因表达产物的聚集使Bax表达增加，进而释放CytoC并激活Caspase，引发细胞凋亡。
2.内质网应激反应与软骨退变的关系软骨内无血管和神经支配，代谢主要通过渗透作用，对缺氧、钙代谢紊乱、机械性压力、自由基侵袭等应激因素很敏感，易发生内质网应激反应，引发内质网相关性死亡。内质网在膜蛋白的合成、修饰和折叠及维持细胞内钙Ca2+的稳定等方面都发挥关键性作用。当机体细胞受到缺氧、饥饿、自由基侵袭及钙代谢紊乱等应激因素刺激时，内质网腔内未折叠蛋白增多或钙失衡，引发内质网应激反应。内质网应激感受蛋白（PEAK、ATF-6和IRE-1）介导的信号转导不仅是纠正内质网功能紊乱的重要机制，在强烈、持久应激刺激时，内环境紊乱无法纠正，内质网应激感受蛋白则会启动凋亡程序，诱发细胞凋亡。内质网应激引起的细胞凋亡异于其他凋亡路径，有其自身的信号通路，称为内质网相关性死亡途径，此途径包含内质网应激诱导CHOP/GADD153表达、C-JUN氨基末端激酶（JNK）活化和内质网特有的Capase-12蛋白水解酶活化。CHOP/GADD153是内质网应激特异的转录因子，PEAK、ATF-6和IRE-1的活化均能促进CHOP的大量产生。CHOP表达增加会下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，促进反应性氧中介物（ROIs）和减少细胞内谷胱甘肽生成，从而引发细胞凋亡。内质网应激时，活化的IRE1招募JNK和肿瘤坏死因子受体相关因子TRAF2，TRAF2激活细胞凋亡信号激酶1（ASK1），并形成IRE-1/TRAF2/ASK1三聚体，随后激活JNK，诱导细胞凋亡。Caspase-12位于内质网膜上，内质网Ca2+平衡的破坏或内质网未折叠蛋白的过量积聚均会诱导Caspase-12表达，同时也导致胞质内Caspase-7转移到内质网表面，Caspase-7激活Caspase-12，激活的Caspase-12可进一步活化Caspase-3，引发细胞凋亡。内质网上Bcl-2家族中抑凋亡蛋白则可调节网腔中游离Ca2+浓度，维持胞质内的Ca2+浓度在合适的水平，进而抑制细胞凋亡[14-15]。
3.细胞自噬与软骨退变的关系细胞自噬（autophagy）是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一种过程，并利用降解产物提供能量和重建细胞结构，在维持细胞稳态和细胞生命活动等方面起重要作用。细胞自噬与凋亡间的关系较为复杂，目前研究表明，自噬标志性基因ULK、Beclin1、LC3在正常的关节软骨中有明显表达，退变软骨中自噬水平下降（其机制与溶酶体水解失败密切相关），导致退变软骨中自噬体清除减缓和毒性蛋白增加。自噬在骨关节炎软骨细胞凋亡中更倾向于保护软骨细胞，当细胞器受损时，细胞内自噬水平明显升高，以清除受损的细胞器，阻止细胞凋亡启动，但自噬过度或不足均可能导致自噬性细胞死亡[17-18]。因此，细胞自噬一方面保护细胞，另一方面则可导致自噬性细胞死亡。Atg1、Atg6、Atg8（哺乳动物中的同源物分别称作ULK1、Beclin1、LC3）是自噬途径的3个主要管理者，分别充当诱导者、调节者、执行者的角色。在哺乳动物中，mTOR整合生长因子、营养分子、氨基酸和能量感受信号，调控细胞生长、增殖、营养运输、蛋白合成和自噬。细胞内营养缺乏时，mTOR活性受抑制，导致Atg家族成员激活，从而促进自噬泡形成；细胞内营养充足时，mTOR激活，从而抑制细胞自噬的发生。死亡相关蛋白激酶（DAPK）也是细胞自噬的重要调节因子，可使微管相关蛋白（MAP）1B磷酸化，进而使MAP1轻链3（LC3）-Ⅱ与自噬体膜结合。自噬蛋白Beclin1的BH3结构域与DAPK相互作用，可使BH3结构域磷酸化，从而阻断Beclin1与凋亡基因Bcl-2和凋亡抑制基因Bcl-xL相互作用，促进自噬发生。
二、独活寄生汤干预软骨细胞凋亡的机制
软骨细胞凋亡原因是多方面的，但最终都离不开凋亡相关因子的参与和调节。肝肾亏虚证存在不同程度的下丘脑-垂体-靶腺（肾上腺、甲状腺、性腺及胸腺）轴功能紊乱，影响机体的神经-内分泌-免疫系统功能，从而产生一系列的临床症状及体征。补肾柔肝药能多方位调节下丘脑-垂体-靶腺轴及神经-内分泌-免疫网络系统的功能，调节异常的细胞因子水平，上调性激素水平，保护软骨细胞，调节软骨基质的降解，参与调控软骨退变；补肾柔肝、祛风活血药通过影响凋亡信号通路，抑制促凋亡基因并促进抗凋亡基因的表达，从而抑制软骨细胞凋亡和促进增殖。因此，独活寄生汤作用机制可能是通过调节神经-内分泌-免疫系统、神经-内分泌-骨代谢系统的功能，调节线粒体功能、内质网应激反应、细胞自噬水平是独活寄生汤干预软骨细胞凋亡的重要作用途径。
作者：刘发元李西海叶蕻芝刘献祥单位：福建中医药大学中西医结合研究院
【关键词】 超声;凋亡;形态学
Abstract: Objective To investigate the effect of diagnostic ultrasound exposure on the apoptosis of human embryonic kidney (HEK293) cells. Methods HEK293 cells were exposure to abdominal ultrasound probe for 0， 10， 20 and 30 min， and their apoptosis was detected by Hoechst 33258 staining. Results Compared with control group， apoptotic rate of HEK293 cells increased significantly after 20min exposure (P
Key words:ultrasound; apoptosis; morphology
超声应用于产科，可以推算胎龄、诊断先天畸型及了解胎儿宫内发育情况，它能为胎儿、胚胎甚至正在发育成熟的卵泡提供一个清晰的图像，同时也需要更高的超声输出功率。随着孕前卵泡检测和产前检查越来越细致和精确，超声运用的频率、时间、输出功率也在不断增加，敏感的胚胎组织及生殖细胞受到的威胁也随之加大。人们对超声使用的安全性也越发关心。有关产科超声的安全性，目前尚无统一定论，更无具体的辐照剂量可引起哪方面的影响这样的规律可循，孕期超声检查只能尽可能地使用最低剂量。这使超声的产前检查安全性的遵循原则带有盲目性，或者引起因不了解超声的安全范围而滥用超声，为产前检查带来隐患。要明确知道产前超声的安全范围还需要一个漫长的过程，本实验拟探讨超声近距离辐照对体外培养细胞凋亡形态学改变的影响，为产前超声的安全使用提供一定的理论依据。
1 材料和方法
1.1 试剂
Hoechst 33258购自美国Sigma公司，DMEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程公司，胰蛋白酶购自美国Gibco公司，其余试剂为国产分析纯。HEK293细胞株由广东医学院生化教研室提供。1 mg Hoechst 33258溶解于10mL PBS中，配成100 mg/L的10×Hoechst 33258储存液，密封避光，4℃短期保存。
1.2 仪器
MCO15A CO2细胞培养箱(日本SANYO公司)，YJ875DA 医用净化工作台(苏州净化设备厂)，IMTI型荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)，Vivid 7彩色多普勒超声诊断仪(GE公司)。
1.3 细胞培养与处理
HEK293细胞采用常规培养方法，无血清饥饿培养调整细胞周期一致后进行实验。将细胞分成超声照射0 、10、20、30 min组，空白组予以假照，腹部探头产科诊断条件(3.5 MHz、MI 0.8)，介质为细胞培养液(主要成分为DMEM培养基)，辐照距离
1.4 细胞染色与观察
收集处理后的细胞，PBS洗涤离心2次后取10μL细胞悬液滴于盖玻片上，加1mL固定液(甲醇∶冰乙酸3∶1)，4℃固定5 min，弃去固定液，用PBS洗两遍，吸尽液体。加入1mL Hoechst 33258工作液(10 mg/L)，摇床轻摇，染色10 min，弃去染色液，用荧光显微镜避光拍照，激发波长350 nm左右，发射波长460 nm左右。
1.5 结果评判
细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。由两位病理学技术人员对图片进行分析对照。
1.6 凋亡百分率的计算
把载波片置于24孔板培养细胞，细胞爬片，调整周期及分组照射(方法同1.3)后培养24h，5mg/L的Hoechst 33258避光染色5min，荧光显微镜观察。计算每孔5个高倍(×400)视野平均细胞总数、凋亡细胞数，最终算出细胞凋亡百分率。
1.7 统计学处理
计量数据以(±s)表示，使用SPSS10.0统计软件进行处理，多个样本均数的比较采用单因素方差分析及q检验。
2 结果
2.1 HEK293细胞体外培养
HEK293体外培养成功，经传代培养后，待细胞生长疏密适中，于倒置相差显微镜下进行放大倍数为600倍拍照，光镜下HEK293细胞的形态呈多角形，贴壁生长，细胞间有连接，细胞核圆形或椭圆形，大小约占整个细胞的1/3，核内染色质及核仁清晰，部分可见分裂相。
2.2 凋亡细胞Hoechst 33258染色的形态学变化
空白组：超声处理0 min(假照)，细胞核大小较一致，核膜完整，核内染色质呈小点状均匀分布，部分可见有丝分裂相，未见异型核，见图1。
1组：超声处理10 min，细胞核形态尚规则，核膜完整，未见异形核，但对比空白组，本组细胞核部分出现大小不一，核内染色质聚集的现象，见图2。
2组：超声处理20 min，细胞核大小不均，一部分细胞核胀大，染色质边集，一部分细胞核缩小浓染，呈小颗粒状，个别细胞核膜不完整，染色质疏松，表现为凋亡Ⅰ期和Ⅱa期改变，见图3。
3组：超声处理30 min，细胞核大小不均，部分可见异形核的出现，部分细胞核内染色质浓染边集，呈小团块状，个别核膜破裂染色质疏松分布于胞质中，表现为凋亡Ⅱa期和Ⅱb期改变，见图4。
图1图2图3图4
图1 空白组细胞Hoechst 33258染色结果(×600);图2 超声照射10 min组细胞Hoechst 33258染色结果(×600);
图3 超声照射20 min组细胞Hoechst 33258染色结 (×600);图4 超声照射30 min组细胞Hoechst 33258染色结果(×600)。
2.3 细胞凋亡率比较
详见表1。
3 讨论
细胞凋亡是多细胞有机体为保持自身组织稳定、调控自身细胞的增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞主动性死亡过程。细胞凋亡的主要特点为：细胞体积小，染色质浓缩，呈块状致密染色区，DNA分子被特异性DNA内切酶在核小体间切断，核裂解，形成凋亡小体[1]。生殖细胞、受精卵和胚胎组织中，即便是个别细胞出现异常的凋亡，都有可能对其生长发育造成影响。因此超声对细胞凋亡的影响受到学者们的关注。bcl2是一种重要的凋亡抑制因子，周海燕等[2]研究证明，长时间连续超声照射可引起胎鼠肾小管上皮表1 不同剂量的超声作用HEK293细胞凋亡百分率的改变细胞bcl2蛋白表达水平下降。p53基因在诱导神经细胞凋亡时有重要的作用，赵晶等[3]研究表明，超声辐照时间和剂量的增加可引起p53基因的蛋白表达水平增加。何明生等[4]发现，电压为10 mV条件下超声辐照K562细胞10 min以上，辐照组细胞形态变化较大，核染色质浓缩呈斑块状，并有核碎裂、凋亡小体出现。有学者发现低频超声辐照HL60后细胞膜空隙率增加，这可能是凋亡前的形态学改变[5]。Lagneaux等[6]则认为低频超声效应与声化学机制有关，超声诱导的声化学冷光能触发光敏感性单态氧的产生，从而对细胞产生一个“氧化应激”，继而启动细胞凋亡反应。一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况，常用的DNA特异性染料有Hoechst 33258，它能与DNA非嵌入式结合，主要结合在AT碱基区，紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光，从而对细胞核进行形态学的观察。Hoechst 33258凋亡染色法具有直观，方便的优点，并可通过形态学的变化对其凋亡的早中晚期进行估测。本实验用Hoechst 33258对空白组和处理组细胞染色后，经荧光显微镜观察，与凋亡形态的标准相符合，其中超声处理30 min组部分细胞核染色质高度凝聚、边缘化并产生了凋亡Ⅱb期的形态学改变，部分细胞核呈异形核，细胞核形态改变最明显，细胞凋亡比例最高(P
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从20世纪80年代末期以来，人们对细胞凋亡的认识逐渐深入，对细胞凋亡发生机理的了解越来越透彻，同时也发现这一过程包含着非常复杂的调控机制。尽管仍有许多问题甚至是关键的问题没有搞清楚，但近几年的研究在凋亡信号转导途径、细胞凋亡的生化反应机制以及细胞凋亡的基因调控等方面都取得了显著的进展。本文就细胞凋亡的机理与调节作用进行综述。
1 细胞凋亡的生物学特征
1.1 形态学变化：从形态学观察，细胞凋亡的变化是多阶段的，细胞凋亡往往涉及单个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的。首先出现的是细胞体积缩小，胞间连接消失，与周围的细胞脱离， 核质浓缩，核膜核仁破碎 ；胞膜有小泡状形成， 胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞分割为几个凋亡小体[1] 。 1.2 生物化学变化
1.2.1 DNA降解：细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的DN段约为180~200 bp的整倍数，而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度，提示染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断，产生不同长度的寡聚核小体片段。实验证明，这种DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱，而坏死细胞呈弥漫的连续图谱[2]。
1.2.2 生物大分子合成：细胞凋亡的生化改变不仅仅是DNA的有控降解，在细胞凋亡的过程中往往还有新的基因的表达和某些生物大分子的合成作为调控因子[3]。 如在糖皮质激素诱导鼠胸腺细胞凋亡过程中，加入RNA合成抑制剂或蛋白质合成抑制剂即能抑制细胞凋亡的发生。
2 细胞凋亡的机理
2.1 接受凋亡信号：细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号转导也不相同。
2.2 凋亡的重要执行者：现已能确定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。目前，至少有10多种Caspase被发现，Caspase分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶。根据功能可把Caspase基本分为二类：一类参与细胞的加工；另一类参与细胞凋亡。Caspase家族一般具以下特征。
2.2.1 常以酶原的形式存在：Caspases在细胞内以无活性的酶原形式存在（相对分子质量29~49 kDa），在受到激活后其内部保守的天冬氨酸残基经水解形成大（P20）小（P10）两个亚单位，并进而形成两两组成的有活性的四聚体，其中，每个P20/P10异二聚体可来源于同一前体分子也可来源于两个不同的前体分子[4]。
2.2.2 具有半胱氨酸激活位点和底物裂解位点：Caspases C端同源区具有半胱氨酸激活位点和底物裂解位点，当作用于胞内特异性底物后将引起细胞凋亡。Caspases的底物特异性由其裂解位点N-端的4个氨基酸残基决定，其底物裂解部位通常位于靶蛋白质一级结构中Asp残基后，数目由1个到多个不等。Caspase酶系作为细胞凋亡的中枢效应器，在细胞凋亡的启动及进程中发挥着极为重要的作用[5，6]。
2.2.3 Caspase活化机制：Caspase的活化是有顺序的多步骤水解的过程，Caspase分子各异，但是它们活化的过程相似。首先在caspase前体的N-端前肽和大亚基之间的特定位点被水解去除N-端前肽，然后再在大小亚基之间切割释放大小亚基，由大亚基和小亚基组成异源二聚体，再由两个二聚体形成有活性的四聚体[7]。
2.2.4 Caspase的效应机制
2.2.4.1 凋亡抑制物：正常活细胞因为核酸酶处于无活性状态，而不出现DNA断裂，这是由于核酸酶和抑制物结合在一起，如果抑制物被破坏，核酸酶即可激活，引起DN段化（fragmentation）。现知Caspase可以裂解这种抑制物而激活核酸酶，因而把这种酶称为Caspase激活的脱氧核糖核酸酶（caspase-activated deoxyribonulease CAD），而把它的抑制物称为ICAD。因而，在正常情况下，CAD不显示活性是因为CAD-ICAD以一种无活性的复合物形式存在。ICAD一旦被Caspase水解，即赋予CAD以核酸酶活性，DN段化即产生。研究发现CAD只在ICAD存在时才能合成并显示活性[8]，提示CAD-ICAD以一种其转录方式存在，因而ICAD对CAD的活化与抑制却是必需要的。
2.2.4.2 破坏细胞结构：Caspase可直接破坏细胞结构，如裂解核纤层，核纤层（Lamina）是由核纤层蛋白通过聚合作用而连成头尾相接的多聚体，由此形成核膜的骨架结构，使染色质（chromatin）得以形成并进行正常的排列。在细胞发生凋亡时，核纤层蛋白作为底物被Caspase在一个近中部的固定部位所裂解，从而使核纤层蛋白崩解，导致细胞染色质的固缩[9]。
2.2.4.3 使调节蛋白丧失功能：Caspase可作用于几种与细胞骨架调节有关的酶或蛋白，改变细胞结构。其中包括凝胶原蛋白（gelsin）、聚合黏附激酶（focal adhesion kinase，FAK）、P21活化激酶α（PAKα）等。这些蛋白的裂解导致其活性下降，如Caspase可裂解凝胶原蛋白而产生片段，使之不能通过肌动蛋白（actin）纤维来调节细胞骨架[10]。
2.2.4.4 其它功能：Caspase还能灭活或下调与DNA修复有关的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交联蛋白。由于DNA的作用，这些蛋白功能被抑制，使细胞的增殖与复制受阻并发生凋亡。
3 细胞凋亡的调节
细胞凋亡受到严格调控，在正常细胞Caspase处于非活化的酶原状态，凋亡程序一旦开始，Caspase被活化后发生凋亡蛋白酶的级联反应，发生不可逆的凋亡。 这与一系列凋亡抑制分子有关，现已发现多种凋亡抑制分子，包括P35，CrmA，IAPs，FLIPs以及Bcl-2家族的凋亡抑制分子。
3.1 P35和CrmA：P35和CrmA是广谱凋亡抑制剂，研究结果表明P35以竞争性结合方式与靶分子形成稳定的具有空间位阻效应的复合体并且抑制Caspases活性，同时Caspases在特定位点特异切割P35，切割后的P35与caspase的结合更强[11]；CrmA（Cytokine response modfer A）是血清蛋白酶抑制剂，能够直接抑制多种蛋白酶的活性。
3.2 FLIPs：FLIPs(FLICE-imhibirory proterins)能抑制Fas/TNFR1介导的细胞凋亡。它有多种变异体，但其N-端功能前区（Prodomain）完全相同，C端长短不一。FLIPs通过DED功能区，与FADD和Caspase-8，10结合，拮抗它们之间的相互作用，从而抑制Caspase8，10的作用[12]。
3.3 凋亡抑制蛋白：凋亡抑制蛋白（IAPs，inhibitors of Apoptosis protien）为一组具有抑制凋亡作用的蛋白质[13]，它首先是从杆状病毒基因组克隆并发现能够抑制由病毒感染引起的宿主细胞死亡反应。具有大约20氨基酸组成的功能区，这对IAPs抑制凋亡是必需要的，既可以结合活化的Caspase，又可结合Caspase酶原，进而抑制细胞凋亡。
3.4 Bcl-2家族：Bcl-2家族成员众多， 它们分别既有抗凋亡作用，也有促凋亡的作用。多数成员间有两个结构同源区域，在介导成员之间的二聚体化过程中起重要作用。Bcl-2成员之间的二聚体化是成员之间功能实现或功能调节的重要形式。Bcl-2生理功能是阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，在一些白血病中Bcl-2呈过度表达。Bcl-2的亚细胞定位已经明确，它在不同的细胞类型可以定位于线粒体、内质网以及核膜上，并通过阻止线粒体细胞色素C的释放而发挥抗凋亡作用[14]。此外， Bcl-2具有保护细胞的功能， Bcl-2的过度表达可引起细胞核谷胱苷肽（GSH）的积聚，导致核内氧化还原平衡的改变，从而降低了Caspase的活性。Bax是Bcl-2家族中参与细胞凋亡的一个成员，当诱导凋亡时，它从细胞质基质迁移到线粒体和核膜。
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目的：研究应用顺铂联合姜黄素对诱导胃癌细胞HGC27凋亡的影响及机制。方法：用CCK8法检测单独或联合使用不同剂量顺铂或/和姜黄素对胃癌细胞HGC27增殖的影响；用Hochest33258染色检测联合应用顺铂和姜黄素诱导胃癌细胞HGC27凋亡的发生率。用Westernblot检测细胞凋亡相关分子PARP1蛋白剪切体和DNA损伤蛋白p-γH2AX的表达变化。结果：单用顺铂可以呈剂量依赖性地促进HGC27细胞凋亡。5μmol•L-1姜黄素对HGC27细胞增殖无明显作用，10μmol•L-1姜黄素反而轻微促进HGC27细胞增殖。20、40、80μmol•L-1姜黄素对HGC27细胞的增殖抑制率分别为10.97%、15.15%、32.93%。分析联合用药组：5μmol•L-1姜黄素联合顺铂组反而促进HGC27细胞生长；10μmol•L-1姜黄素联合不同剂量顺铂和单用顺铂组比较，组间抑制率没有统计学差异（P>0.05）。20μmol•L-1姜黄素联合4、6μmol•L-1顺铂有明显的促进细胞的凋亡作用,抑制率分别为70.68%、87.30%。Hochest33258染色结果显示，联合用药组细胞凋亡小体和坏死细胞明显增多。Westernblot结果显示，在联合用药组HGC27细胞PARP1剪切体蛋白和p-γH2AX蛋白表达明显增加。结论：顺铂联合姜黄素可以促进胃癌细胞HGC27的凋亡，机制是姜黄素可以加重顺铂引起的细胞DNA双链损伤。
关键词
顺铂；姜黄素；细胞凋亡；p-γH2AX
自从Rosenberg等[1]发现顺铂的抗肿瘤活性后，铂类药物的研究得到迅速发展。铂类药物已被广泛应用于各种恶性肿瘤的临床治疗中。据统计，目前临床化疗或者联合化疗治疗恶性肿瘤的方案中有70%~80%应用到铂类药物。由于铂类药物在治疗过程中伴发严重的胃肠反应、肾毒性、耳毒性、神经毒性和耐药性等[2]，因此，如何减弱该类药物的毒副作用和增加其化疗敏感性日益受到关注。姜黄素是从姜黄根茎中提取的一种植物多酚。姜黄素的抗肿瘤作用为多靶点，因而日益引起重视。姜黄素对消化系统、生殖系统的多种肿瘤等均具有一定程度的抑制作用[3]。化疗药物增敏方面，联合使用顺铂和姜黄素已用于肝癌[4]、肺癌[5]、卵巢癌[6]等研究。目前，对于顺铂联合姜黄素是否可以直接通过引起DNA双链损伤的加重而诱导胃癌HGC27细胞凋亡尚未见报道。本实验通过联合用药直接观察双链损伤的指标p-γH2AX和凋亡相关标志物PARP1蛋白剪切体的变化，初步探讨这两种药物联合作用诱导胃癌细胞HGC27凋亡的作用机制。
1材料
1.1细胞来源及培养人胃癌细胞HGC27购自中国科学院上海细胞生物研究所。细胞培养于含100μg•mL-1链霉素、100U•mL-1青霉素和10%胎牛血清的RMPI1640培养液中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。
1.2试药与仪器RMPI1640培养基（Invitrogen，美国）；胎牛血清（四季青，杭州）；青霉素（山东新华鲁抗，批号20141007）；链霉素（华北制药，批号F31121126）；顺铂注射液（江苏豪森药业股份有限公司，诺欣TM，批号140302）；姜黄素（Turmeric，原植物Curcumalon-ga，Sigma公司）；BCA（BicinchoninicAcidproteinsaykit）蛋白浓度测定试剂盒、荧光染料Hochest33258试剂盒、RIPA裂解液[50mmol•L-1Tris（pH7.4），150mmol•L-1NaCl，1%TritonX-100，0.1%十二烷基磺酸钠，1%去氧胆酸钠]；裂液、单克隆抗α-tubulin抗体、抗荧光淬灭剂（南通碧云天生物技术有限公司）；CCK-8（CellCountingKit-8）试剂盒（上海同仁化学有限公司）；抗PARP1抗体、抗p-γH2AX抗体（美国Abcam公司）；增强化学发光液（Enhancedchemi-luminescence，ECL，美国Millipore公司）；其它生化试剂均为国产分析纯。CO2恒温培养箱（美国Thermo公司）；IX-70倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；垂直电泳仪；半干式电转移装置（美国Bio-Rad公司）；酶联免疫检测仪（美国Bio-TEKInstruments公司）。
2方法
2.1CCK-8法检测顺铂和姜黄素抑制胃癌细胞HGC27增殖培养HGC27细胞：在96孔板中每孔接种5000个细胞。对细胞进行分组处理：单用顺铂组（0、2、4、6、8μmol•L-1）、单用姜黄素组（0、5、10、20、40、80μmol•L-1）、顺铂联合姜黄素组，即2、4、6、8μmol•L-1顺铂分别联合5、10、20μmol•L-1姜黄素，以上各组处理细胞24h，每孔加入CCK-8试剂10μL，37℃继续培养1.5h，在酶标仪上450nm检测吸光度A450nm。每组设3平行实验。计算药物（或药物组合）对细胞增殖的抑制率。
2.2Hochest33258染色法检测顺铂联合姜黄素诱导胃癌细胞HGC27凋亡在6孔板中接种HGC27细胞，待细胞培养至80%满6孔板孔底。分别设4组：对照组、单用4μmol•L-1顺铂组、单用20μmol•L-1姜黄素组、4μmol•L-1顺铂联合20μmol•L-1姜黄素用药组。处理HGC27细胞24h，去培养液，用甲醇室温固定30min。每孔加入Hochest33258染色液50μL。避光染色30min后，应用磷酸盐缓冲液（PBS）液洗涤3遍，加入抗荧光淬灭剂20μL，立即在荧光显微镜下观察细胞中凋亡小体的情况。
2.3免疫印迹法检测HGC27细胞凋亡相关分子的变化在培养的HGC27细胞，按照“2.2”方法分别设立对照组和处理组，处理细胞24h。用RIPA裂解液裂解细胞，4℃、12000r•min-1离心10min，取上清液，运用BCA法测定蛋白浓度。灌制12.5%分离胶的SDS-PAGE。分别按照60μg/孔的上样量，加入全蛋白，经90V稳压电泳后，运用200mA恒流半干式电转移1h，5%脱脂奶粉室温封闭膜1h，PBST液洗涤3次，孵育抗体按照α-tubulin（1∶1000）、PARP1（1∶1000）；p-γH2AX（1∶500）稀释，4℃孵育过夜，PBST液洗涤；加入1∶1000稀释的辣根过氧化酶（HRP）标记二抗，37℃孵育1h，PBST液洗涤。ECL化学发光液曝光、检测。进行灰度值比较（相对灰度值=处理组灰度值/对照组）。
2.4统计学处理运用SPSS16.0统计软件包进行分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间样本均数间采用多因数方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。
3结果
3.1顺铂和姜黄素对HGC27细胞增殖的抑制作用
3.1.1顺铂和姜黄素单独作用结果预实验分别考察4种不同浓度顺铂和5种不同浓度姜黄素组对HGC27细胞的抑制作用，由表1可见，2、4、6、8μmol•L-1顺铂可以呈剂量依赖性的抑制细胞增殖。5μmol•L-1姜黄素对HGC27细胞增殖无明显影响；10μmol•L-1姜黄素对HGC27细胞增殖反而略有促进作用；20、40、80μmol•L-1姜黄素可以不同程度地抑制HGC27细胞增殖。其中20、40μmol•L-1姜黄素组间没有差异；80μmol•L-1姜黄素有明显抑制HGC27细胞增殖的作用（见表1）。
3.1.2顺铂联合姜黄素对HGC27细胞增殖的影响联合用药结果（见表2）显示：2、4、6μmol•L-1顺铂和5μmol•L-1的姜黄素联合应用对HGC27细胞增殖的抑制率分别为17.64%、36.90%、66.29%。单用2、4、6μmol•L-1顺铂对HGC27细胞抑制率分别是34.09%、46.18%、71.55%。提示5μmol•L-1的姜黄素和顺铂联用反而抑制肿瘤细胞的凋亡。2、4、6、8μmol•L-1顺铂联合10μmol•L-1的姜黄素作用时，诱导HGC27细胞凋亡率分别为32.32%、49.00%、72.80%、86.21%，与单用顺铂组细胞凋亡率34.09%、46.18%、71.55%、86.21%相接近，两组间抑制率没有统计学差异（P>0.05）。当4、6μmol•L-1的顺铂联合20μmol•L-1的姜黄素作用时，诱导细胞凋亡率为70.68%、87.30%，显著高于单用顺铂的凋亡率，P<0.05，差异具有统计学意义（见表2）。
3.2顺铂联合姜黄素对HGC27细胞凋亡的影响联合用药作用于HGC27细胞24h后，经Hochest33258染色，并计数500个细胞中凋亡细胞的个数，折算凋亡率（每组3平行）。结果显示，单用顺铂可以引起细胞凋亡（图1-B），其凋亡率为23.2%；20μmol•L-1姜黄素可以诱导少量细胞凋亡（图1-C），凋亡率为5.71%；联合应用顺铂和姜黄素作用于HGC27细胞组发生的凋亡最明显（图1-D），其凋亡率为35.60%，显著高于单用顺铂组和单用姜黄素处理组（图2）（P<0.05）。
3.3免疫印迹法检测HGC27细胞在凋亡过程中相关因子的变化运用Westernblot法检测单用4μmol•L-1顺铂、单用20μmol•L-1姜黄素和顺铂联合姜黄素作用24h，HGC27细胞内DNA双链损伤分子标志物p-γH2AX和凋亡蛋白PARP1剪切体的表达水平。结果显示，单用4μmol•L-1顺铂和20μmol•L-1姜黄素均可以引起p-γH2AX表达增加，其相对灰度值分别为：6.70和3.7；联合用药组p-γH2AX表达增加最明显，其相对灰度值为8.52。单用顺铂和姜黄素也可以诱导HGC27细胞中PARP1蛋白的剪切体表达，其相对灰度值分别为5.32和3.27。联合用药组中，细胞内PARP1蛋白的剪切体表达增加最明显，其相对灰度值为6.27。与单用顺铂组比较，联合用药组p-γH2AX和PARP1剪切体均显著增加（P<0.05），提示姜黄素可促进顺铂诱导的HGC27细胞DNA损伤和凋亡（图3、图4）。
4讨论
我国胃癌的发病率占所有恶性肿瘤的第四位，死亡率占第二位。作为一线化疗药物，顺铂被广泛用于胃癌等实体瘤治疗中。顺铂主要通过主动运输形式进入细胞，与DNA嘌呤形成链内交联或链间交联，导致DNA双链损伤，引发细胞凋亡[7]，DNA损伤可激活PARP1蛋白，从而杀伤肿瘤细胞[7]。但是，应用顺铂治疗的同时会引发多种副作用和产生药物耐药性。如何降低铂类药物的耐药性，增加机体药物敏感性，愈来愈受到人们重视。将中药提取单体姜黄素联合顺铂用于诱导HGC27细胞DNA损伤和凋亡，结果显示，顺铂可以浓度依赖性诱导胃癌细胞凋亡；而姜黄素只有当浓度达20μmol•L-1时才有诱导HGC27细胞凋亡的作用。所以，最终选择4μmol•L-1顺铂和20μmol•L-1姜黄素用于观察其联合作用，其抑制率是单用4μmol•L-1顺铂的1.53倍，明显提高HGC27增殖抑制和诱导凋亡的效果。DNA双链损伤的早期反应是使组蛋白γH2AX蛋白的羧基末端磷酸化，γH2AX蛋白磷酸化的升高，激活凋亡相关蛋白PARP1的剪切体的表达，可显著增加癌细胞对顺铂等化疗药物的敏感性[8]。磷酸化γH2AX蛋白是DNA双链损伤的效应器，其变化可反映DNA双链损伤的程度[9]。本研究显示，4μmol•L-1顺铂联合20μmol•L-1的姜黄素可以引起磷酸化γH2AX表达明显上升，PARP1蛋白剪切体表达增加；联合用药诱导HGC27细胞的凋亡也相应增加。本研究结果为如何降低顺铂毒副作用、提高顺铂化疗药物的敏感性提供了新的思路。
顺铂联合姜黄素作用于HGC27细胞，可以增强顺铂诱导细胞凋亡的作用。姜黄素增强顺铂杀伤HGC27细胞作用的原因可能是姜黄素增强了顺铂和DNA的结合能力，从而抑制DNA修复功能[10]，使肿瘤细胞DNA损伤加重，促进细胞的凋亡。本文对顺铂联合姜黄素促进胃癌细胞凋亡作用进行了初步研究。姜黄素是否能增加其它化疗药物效果或用于逆转顺铂耐药细胞的敏感性和减少化疗药物毒副作用等值得深入研究。
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【摘要】 目的： 探讨羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂氟伐他汀对氧化亚氮缺乏性高血压大鼠肾脏细胞凋亡的影响。方法： 给予左旋硝基精氨酸甲酯(Lnitroargininemethylester，LNAME)建立氧化亚氮缺乏性高血压肾脏硬化大鼠模型，观察氟伐他汀对高血压肾脏硬化大鼠Fas、FasL、Bax和Bcl2蛋白表达水平的影响。结果： 氟伐他汀使高血压肾脏硬化大鼠凋亡蛋白Fas、FasL、Bax表达减少，抗凋亡蛋白Bcl2表达增加。结论： 氟伐他汀能够改善高血压肾脏硬化，调节细胞凋亡水平可能是其机制之一。
【关键词】 高血压肾脏硬化; 氟伐他汀; 细胞凋亡
[Abstract] Objective: To assess the apoptosis occurring in the kidney of SD rats induced by Lnitroargininemethylester(LNAME)over time and investigate the effects of fluvastatin treatment. Methods： Male SD rats were administered by LNAME to form hypertensive nephropathy，then the rats were administered by fluvastatin，at last the rats had their kidneys removed to measure protein expression of Fas，FasL，Bax and Bcl2 genes by Western blot. Pathologic measurement had been taken. Results: After fluvastatin treatment the protein expression of Fas， FasL and Bax were more depressed and the protein expression of Bcl2 was higher. Conclusion：Fluvastatin prevented or retarded hypertensioninduced renal nephropathy via inhibition of renal nephropathy fibrosis，the apoptosis might be one of the mechanisms.
[Key words] hypertensive nephropathy; fluvastatin; apoptosis
近来，随着我国人口的老龄化和人们生活方式的改变，原发性高血压的患病率逐年升高，高血压所导致的终末期肾衰发生率呈上升趋势，在终末期肾衰竭患者中，高血压肾脏硬化占第二位[1]。氟伐他汀是一种新型的3羟基3甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂，不仅具有降脂作用，还是有一定的肾保护作用[2]。本实验通过观察大鼠肾脏凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的变化，以探讨氟伐他汀对高血压肾脏硬化大鼠肾脏细胞凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 实验动物 健康成年雄性SD大鼠30只，体质量(230±20)g，由江苏大学医学院实验动物中心提供。
1.1.2 药品及试剂 左旋硝基精氨酸甲酯(Lnitroargininemethylester，LNAME，Sigma公司)，氯胺酮(江苏恒瑞医药有限公司)，氟伐他汀(北京诺华制药公司)，Fas、FasL、Bax和Bcl2抗体(南京凯基生物工程有限公司)。
1.1.3 实验仪器 无创尾动脉血压分析系统(上海奥尔科特生物科技有限公司)，病理切片机(德国Leica RM2135)，显微照相及图像分析系统(德国Leica QWIN3)，凝胶成像系统(美国BIORAD公司)。
1.2 方 法
1.2.1 大鼠分组及模型制备 选择健康成年雄性SD大鼠30只，随机取20只大鼠制备高血压肾脏硬化模型，另10只在相同条件下饲养，设为正常对照组。造模大鼠予LNAME 50 mg·kg-1·d-1灌胃给药，8周后造模成功的15只大鼠随机分为两组，一组为氟伐他汀组(8只)：给予5 mg·kg-1.d-1氟伐他汀灌胃，共8周;另一组为高血压肾脏硬化组(7只)：予等量生理盐水灌胃，共8周，每周测量各组大鼠体质量，根据体质量调整药物剂量。
1.2.2 血压的测定 第0，2，4，6，8，10，12，14，16周予尾动脉测血压，收缩压≥140 mmHg定为高血压。
1.2.3 组织标本的采集 给药结束后无痛处死大鼠，取出肾脏，并用冰生理盐水经肾动脉冲洗至发白，标本一部分用4%低聚甲醛固定，石蜡包埋制备切片，行HE和Masson染色，由两位病理科医生进行肾小球硬化评分：观察5个视野20个肾小球，计算每个肾小球内细胞数，再取平均值，计算出单个肾小球内细胞数;根据每个肾小球变性坏死程度、单个肾小球内细胞数、系膜基质区大小、毛细血管狭窄或扩张程度及球囊粘连程度等，进行损伤性评分：没有损伤记为0分，轻度损伤记1分，中度损伤记2分，重度损伤记3分，几乎完全损伤记4分。肾小球损伤指数=(1×n1/20+2×n2/20+3×n3/20+4×n4/20) ×100，其中n分别代表不同损伤程度的肾小球个数。
1.2.4 细胞凋亡的检测 采用蛋白质印迹方法测定Fas、FasL、Bax和Bcl2蛋白浓度。首先将肾皮质称重，加入裂解液以及蛋白酶抑制剂，制作匀浆，按比例配制分离胶和浓缩胶，加样后电泳，转膜，封闭抗体杂交，最后将PVDF膜放入 BIORAD凝胶成像系统，用软件计算灰度值。
1.2.5 统计学分析 所有资料采用SPSS11.5软件处理，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较用单因素方差分析，两组比较用LSD法。
2 结 果
2.1 各组大鼠收缩压的变化
LNAME灌胃后，造模大鼠2周血压即升高，到第4周时形成稳定的高血压模型，4周时收缩压>140 mmHg，均达到高血压诊断标准。8周时正常对照组收缩压为(102.6±6.48)mmHg，高血压肾脏硬化组为(213.8±13.44)mmHg，氟伐他汀组为(216.6±11.44)mmHg，高血压肾脏硬化组和氟伐他汀组相比，血压的差异无统计学意义(P>0.05)。16周时正常对照组收缩压为(106.7±7.26)mmHg，高血压肾脏硬化组为(207.3±11.53)mmHg，氟伐他汀组为(199.3±11.61)mmHg，高血压肾脏硬化组和氟伐他汀组相比，血压的差异无统计学意义(P>0.05)，氟伐他汀对血压没有影响，见图1。
2.2 肾脏病理变化
与正常对照组相比，高血压肾脏硬化组大鼠多数肾小球存在严重硬化，肾小球萎缩，囊腔缩小，球囊明显粘连，重度系膜细胞增生，基底膜增厚明显，单个肾小球内细胞数增多，HE染色可见系膜旁及系膜区嗜红物质基质沉积，见图2。Masson染色可见肾小球内有较强的基质胶原阳性染色(蓝色)，见图3。高血压肾脏硬化组的肾小球内细胞数、肾小球硬化评分与正常对照组比较显著提高，两组比较差异有统计学意义(P
2.3 细胞凋亡的检测结果
高血压肾脏硬化组肾皮质的Bax、Fas和FasL 蛋白表达水平显著高于正常对照组，Bcl2蛋白表达水平显著低于正常对照组，两组比较差异有统计学意义(P
3 讨 论
细胞凋亡和细胞增生共同调节肾脏各部分细胞总量的平衡，细胞凋亡可参与高血压肾脏硬化的发生， 并在调节靶器官细胞数量方面发挥重要作用。高血压可能作为一种触发因素， 激活凋亡基因表达， 从而诱导或抑制细胞凋亡， 参与高血压所致肾损害。
本研究结果表明，高血压肾脏硬化组的Fas、FasL和Bax蛋白水平明显高于正常对照组，而Bcl2蛋白水平低于正常对照组。目前认为肾实质细胞的凋亡是高血压肾脏硬化的重要机制之一，细胞凋亡是肾小球硬化时肾小球细胞清除的重要形式。高血压时肾实质细胞凋亡增加与下列因素有关：① 系膜细胞分泌的异常细胞外基质。在人肾小球肾炎和大鼠肾小球硬化模型中，系膜细胞凋亡主要出现在细胞外基质成分和结构发生改变的时期，提示在进行性肾小球硬化时，肾小球细胞凋亡可能受其周围细胞外基质的控制。② TGFβ1的增加。新近的研究发现TGFβ1对肾小球细胞是否发生凋亡也起重要调控作用，TGFβ1可诱导体外培养的肾小球足突细胞凋亡[3]。氟伐他汀使用8周后Fas和FasL的蛋白水平明显低于高血压肾脏硬化组，并且促凋亡基因Bax蛋白水平显著低于高血压肾脏硬化组，而抗凋亡基因Bcl2的蛋白水平显著高于高血压肾脏硬化组。氟伐他汀可能通过减少肾实质细胞的凋亡，改善肾脏硬化。已有研究表明，他汀类药物能够抑制细胞凋亡，辛伐他汀对糖尿病肾病晚期细胞凋亡有一定的抑制作用[4]。Mizuguchi等[5]研究表明，阿伐他汀显著抑制单侧输尿管梗阻模型大鼠肾小管上皮细胞凋亡，促进肾小管上皮细胞的再生。Usui等[6]研究表明，他汀类药物通过抑制法呢基焦磷酸(FPP)和拢牛儿基拢牛儿焦磷酸(GGPP)的产生，阻断了由Ras介导的细胞内信号传递，从而引起肾脏细胞的凋亡减少。他汀减少了小G蛋白p21RhoB的异戊二烯化，从而减少了血管平滑肌细胞的凋亡，通过调节信号途径而减少了细胞的凋亡。
我们认为在高血压肾脏硬化后期以肾实质细胞凋亡为主要表现时，他汀类药物可通过降低TGFβ1的作用而达到抑制细胞凋亡的作用。Zhang等[7]发现阿伐他汀治疗大鼠异体移植肾脏时，可降低TGFβ1的表达。体外研究也表明他汀类药物可降低TGFβ1的表达，可能是通过降低血管紧张素Ⅱ来下调其表达的[8]。另一方面他汀类药物可通过调节纤溶酶原减少细胞外基质沉积而减少细胞凋亡。他汀可通过调节纤溶酶原系统的活性使失活的纤溶酶原再生。董一飞等[8]研究表明，无论在mRNA水平还是蛋白水平，阿伐他汀都能明显抑制胶原Ⅰ和纤溶酶原激活物抑制剂1的表达，表明阿伐他汀能影响系膜细胞的细胞外基质合成和降解，改善大鼠系膜细胞的细胞外基质积聚。他汀通过减少细胞外基质沉积，使受其控制的肾小球细胞凋亡受到抑制。
因此，我们认为氟伐他汀可能通过减少细胞外基质沉积和降低TGFβ1的表达而抑制了肾实质细胞的凋亡，改善了高血压肾脏硬化。
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