时间：2023-06-01 09:31:10
开篇：写作不仅是一种记录，更是一种创造，它让我们能够捕捉那些稍纵即逝的灵感，将它们永久地定格在纸上。下面是小编精心整理的12篇正交实验设计，希望这些内容能成为您创作过程中的良师益友，陪伴您不断探索和进步。
【摘要】
目的分析naa的浓度（50，150，300 mg·l-1）、处理时间（10，20，30 s）和不同基质配比（泥炭和珍珠岩比例为1∶1，1∶2，1∶3）对白术嫩枝扦插的生根影响。方法采用3因素3水平l9（34）正交设计法进行试验处理，利用方差分析和公式分析法确定最优扦插方案。结果试验中白术嫩枝扦插最高成活率和生根率达80.00%。结论naa浓度为150 mg·l-1，处理时间为10 s，泥炭和珍珠岩配比为1∶3的处理组合利于白术嫩枝扦插生根，实验方案适用于浙北主产区白术的嫩枝扦插。
【关键词】 术 嫩枝扦插 naa浓度 基质 生根率 正交实验
白术atractylodes macrocephala koidz.为菊科多年生草本，以地下根茎入药，是常用的补气中药，具有补脾、健胃、化湿、止泻等功能。白术含挥发油，油中主要成分为苍术酮、苍术醇、白术内酯等［1］。 现代 药理研究表明，白术具有利尿、降低血糖等功效，对放化疗所引起的白血球下降具有回升作用（生白）［2］。
白术主产于浙江、江苏、安徽，是“浙八味”之一，为著名的地道药材。wwW.133229.cOM由于目前白术品质混杂、病虫害发生严重，因此较多的研究选择以抗病性强、株型良好的白术作为研究对象，利用叶片或侧芽进行组织离体快繁［3～6］，但叶片的愈伤组织诱导和分化率不高，并且成本高，不便于推广。本研究从多年栽培研究中选育出植株矮化、叶色深绿、抗病能力强的薯叶型植株作为材料，对其嫩枝进行扦插繁殖，通过正交实验研究分析激素浓度、扦插处理时间和基质对白术嫩枝生根的影响，以期取得最佳白术嫩枝扦插穗条件，从而获得更多性状稳定、无病害感染的白术幼苗，为白术的栽培提供优良的种质资源。
1 材料
1.1 试剂本研究选用由sigma公司生产的分析纯naa作为扦插激素，用去离子水配置浓度为50，150，300 mg·l-1溶液，供扦插使用。
1.2 扦插基质本研究采用泥炭和珍珠岩混匀作为插床基质，泥炭和珍珠岩配比（体积比）依次为1∶1，1∶2和1∶3。试验前24 h用50 %多菌灵800倍液喷洒消毒，用塑料膜覆盖，备用。
1.3 插穗培育于2007年在白术地块选定薯叶型植株挂牌，留作种用。200802挖出，选择大小相似、无病虫害及机械损伤的健康根茎，用50％多菌灵800倍液浸泡10 h，移栽到浙江林学院百草园中。按照常规的种植要求，耕深25 cm，土粒小于1 cm，施腐熟鸡粪作为底肥，做高20 cm、宽100 cm、步道底宽25 cm的苗床。株行距20 cm×30 cm，每行开沟深10 cm，垫6 cm焦泥灰，栽5株。栽苗2 cm深，焦泥灰盖满行，上面覆盖茅草等蓬松物料，用以遮挡大雨以及保湿。待白术嫩枝生长至15～20 cm时供采穗扦插试验用。
2 方法
2.1 实验设计采用3 因素3 水平的正交实验，正交表选用l9（34）。3个因素分别是a（激素浓度：50，150，300 mg·l-1），b（处理时间10，20，30 s），c（基质配比，泥炭和珍珠岩体积比为1∶1，1∶2，1∶3）。见表1。表1 正交实验l9 （略）
2.2 扦插试验于200804进行，在采穗圃切取白术茎段，去除叶片以减少插穗水分蒸腾散失，切成7 cm左右插穗，按上、下切口分开摆齐，放置伤口微干。按照试验设计处理白术嫩枝，每个处理为30株插穗。处理后直接扦插，为避免擦伤插穗皮层，采用玻璃棒引洞。插穗的株行距为5 cm×10 cm，插入基质深度约2～3 cm，压实。
扦插后建塑料小拱棚保温保湿（见表2）。每天早晚喷水各1次，中午揭开薄膜以通风透气。扦插后16 d去膜，改用遮阳网遮荫，透光率在20%左右，喷水1 次/d，防止新生根腐烂。表2 环境温度和湿度（略）
2.3 调查扦插1周后开始调查，每两天1次，调查项目包括：愈伤组织产生时间（d）、不定根产生时间（d）、插穗存活率（%）、生根率（%）、假性成活率（%）、根数（条）、根长（cm）等。对试验数据进行统计分析。
3 结果与分析
3.1 试验结果通过l9（34）试验，对各处理组白术嫩枝存活率、生根率、根数、根长等的调查结果列于表3。表3 白术嫩枝扦插生根正交试验结果（略）
3.1.1 激素处理对于白术生根的影响从表3可见，用naa处理白术插穗均能诱导生根，但浓度不同生根率亦不同，其中5号处理（浓度为150 mg·l-1）的白术插穗存活率和生根率最高，均为80.00%。而且，在一定浓度范围内（50 ～150 mg·l-1），白术嫩枝的扦插生根率随naa的浓度升高呈升高趋势（平均生根率分别为64.44%和67.78%），有低浓度促进的特点，但当naa浓度为300 mg·l-1时，生根率反而呈下降趋势（平均生根率为40.00%），表现出高浓度抑制，与夏铁骑［7］、许红艳等［8］的研究结果近似。
在调查白术插穗愈伤组织形成和生根情况时发现，各种处理水平的白术插穗均为首先在切口形成愈伤组织，然后在愈伤组织上面形成不定根。由表3可知，naa浓度为50 mg·l-1和150 mg·l-1时，愈伤组织形成时间较早，有利于提早发根。2号～7号处理形成愈伤组织的时间均为16 d，8号处理时间最长，为26 d；不定根由愈伤组织上长出，发根时间最短者为5号和7号处理，为19 d，发根时间最长者为8号处理，为30 d。
3.1.2 基质配比对于白术生根的影响实验结果（见表3）表明，基质配比对白术插穗生根产生明显影响：4号处理平均根数高于其他处理，为22条；其发根数亦为最多，为43条，明显高于其他处理。最长根长的处理组合为3号试验，为6.2 cm。
白术生根指标随泥炭和珍珠岩的配比水平增加而呈 规律 性变化：愈伤组织形成平均时间（21.33 ,17,16 d）和不定根形成平均时间（27.33，26，21.33 d）递减，平均根数（为10.67条，13.33条，14.33条）、平均最多发根数（为19条、27.33条、31.33条）和平均最长根长（为2.07，3.90，4.03 cm）呈递增趋势，与张雪平［9］实验结果基本一致。
3.1.3 处理时间对于白术生根的影响处理时间对扦插生根有一定影响，由于试验材料为白术未木质化的嫩枝，所以选择处理的时间为快速处理，防止naa各浓度造成白术嫩枝脱水，影响生根率和成活率。本实验结果表明，10 s和20 s的处理时间，生根效果较好。生产中选用低浓度长时间处理和高浓度快速处理，一般大面积扦插以后者居多［10］。
3.2 统计分析在扦插过程中，多数研究仅以生根率作为最终指标，但应同时考虑其他辅助指标的作用，从而综合优化出最佳扦插方案。根据苑玉凤［11］的多指标正交试验分析方法，本研究采取排队评分与公式评分法对几个主要指标打分后进行分析。
首先，排队评分。根据表3，生根率指标以5号处理最高（80.00%），排在第一，定为10分；8号最低（30.00%），排在最后，定为1分；平均根数以4号处理最多（22条），为10分；9号处理最少（7条），为1分；生根时间以5号和7号处理最短（19 d），为10分；8号处理时间最长（30 d），为1分。其它处理各指标的得分根据其与该指标优秀值的差异按比例 计算 得出。
其次，公式评分。在本试验中，生根率指标最重要，以5倍计算，即权数为5；平均根数指标次之，以3倍计算，即权数为3；生根时间以2倍计算，即权数为2。所以其评分公式为：评分= 5×生根率+ 3×平均根数+2×生根时间。对各处理所有指标的分数根据公式乘以加权系数，相加即得综合评分，见表4。表4 公式评分法结果数据（略）
由表4所示，在9个处理中，经过排队评分和公式评分后，得出4号处理综合评分最高，为85.55，即实验条件为 a2b1c2，5号处理次之。
由表4对各指标进行方差分析，得出表5，可以看出，因素a（激素）和c（基质配比）在α=0.05的置信区间内具有显著性。表5 公式评分法的方差分析（略）
依据每个处理的综合评分进行极差分析，如表6所示，因素主次顺序为c、a、b，较佳方案是a2b1c3，即naa浓度为150 mg·l-1，处理10 s，选取泥炭和珍珠岩体积比为1∶3的基质。表6 公式评分法极差分析（略）
4 讨论
4.1 白术扦插不定根的形成机制植物扦插生根分为两类，一是由潜伏根原基形成的不定根，即皮部生根；二是由离体诱导产生的根原基形成的不定根，即切口生根。诱生根原基常生于插穗下部的愈伤组织，即在适宜条件下由插穗基部形成的一团不规则的、具有不同木质化程度的薄壁细胞，起源于维管形成层部位的幼嫩细胞，皮层和髓部的各种细胞也可能参与愈伤组织的形成［12］。通过本次试验调查数据得出（见表3），各种处理水平的白术插穗均首先形成愈伤组织，之后在愈伤组织上分化发根，未见由插穗的皮部发根情况，因此认为白术插穗生根属于第二种生根类型，即以愈伤组织生根为主。
也有人认为，naa对扦插生根的效果比较明显，其主要机理为naa 能促进插穗贮存的淀粉水解为还原糖，作为呼吸底物，为不定根的形成提供较丰富的能源和碳源，从而促进不定根形成［13］。
4.2 假性成活扦插成活的关键是插穗能否产生和形成不定根。许多试验证实，外源激素对插穗产生不定根具有促进作用［14,15］。本实验中存活率和生根率存在差异，因此将扦插过程中只有愈伤组织但无不定根的成活苗现象称为假性成活［16］。由表3可以看出，除4号和5号处理无假性成活外，其他处理假性成活率为3.33%～10%。分析认为，愈伤组织和不定根的形成是各自独立的过程，即在愈伤组织中不一定能分化并形成不定根［12］。如果愈伤组织过于发达，不定根无法从膨大且紧密的愈伤组织处发出，推迟生根时间，甚至不能发根［17］，即成为假性成活苗。作者在以市售生根粉国光生跟（含20% naa）为激素对白术进行嫩枝扦插处理时观察到，由切口处只形成膨大的愈伤组织，但不产生不定根（另文报道）。假性成活苗由于长时间无法从膨大的愈伤组织上产生不定根，最终导致死亡。因此，降低假性成活率对于提高扦插生根成活至关重要。
4.3 基质对生根的影响本研究结果表明，泥炭和珍珠岩体积比为1∶3的基质为插穗生根提供了良好的条件，分析认为基质中泥炭容重较大，蓄水、保水能力强，而珍珠岩疏松多孔，容量小，毛管孔度、通气孔度均大于泥炭。二者体积比不同，基质结构中的总孔度、毛管孔隙不同，基质中的水分含量和通气能力不同，诱导发根能力因而不同。白术喜肥沃的砂质壤土，如果土壤过黏，会因透气性差引发病害及烂根现象［18］。本试验地点选在浙江临安，属于亚热带湿润型季风气候，且试验时间为春夏之交，阴雨天气较多，空气和土壤湿度比较大，容易引起插穗腐烂。因此在浙北地区春季对白术进行嫩枝扦插时，泥炭和珍珠岩为1∶3的基质配比为最佳选择。
本研究采用正交设计和数学统计分析，对于反映白术嫩枝扦插时激素的浓度、基质的配比、处理时间与插穗下端产生愈伤组织、生根的关系以及选择最佳处理方案，是十分有效的工具。本研究通过9种处理，对生根率、平均根数、生根时间等多项指标综合考虑，减少实验工作量，基本反映全部组合的效果。根据实验得出，在浙北地区春季，以naa为激素对白术进行嫩枝扦插时最佳方案是：naa浓度150 mg·l-1，处理时间10 s，泥炭∶珍珠岩体积比为1∶3。
【 参考 文献 】
［1］郭巧生. 药用植物栽培学［m］.北京:高等 教育 出版社,2004:245.
［2］刘索英. 白术的应用研究［j］.广东药学,1999,9(3):22.
［3］彭 菲,周日宝,张喜利. 白术侧芽离体诱导的处理研究［j］. 湖南中医学院学报,2001,21(4):26.
［4］李 慧. 白术的组织培养［j］.特种 经济 动植物,2002,27(7):27.
［5］周日宝,王朝晖. 湖南道地药材白术组织培养及再生植株的处理［j］.湖南林业科技,2001,28(4):79.
［6］朱玉球，夏国华，方慧刚，等.白术组织快繁技术［j］.中药材,2006,29(3):212.
［7］夏铁骑,陶令霞. naa对小麦根、芽生长的影响［j］.濮阳教育学院学报,2001,14(1):45.
1 考纲解读
1.1考纲要求
(1)孟德尔遗传实验的科学方法Ⅱ；
(2)基因的分离定律和自由组合定律Ⅱ；
(3)基因与性状的关系Ⅱ；
(4)伴性遗传Ⅱ。
2010年与2011年对比，考纲要求相同。即要求学生能在较复杂的情境中综合运用其进行分析、判断、推理和评价，属于理解、应用水平。
1.2能力要求
(1)理解与综合运用能力：能运用所学知识与观点，通过分析与综合等方法对某些生物学问题进行解释、推理，作出合理的判断或得出正确的结论。
(2)实验与探究能力：具备验证简单生物学事实的能力并能对实验现象和结果进行解释、分析和处理，能对一些简单的实验方案作出恰当的评价和修订。
2 教学目的
遗传学实验设计类习题高考的频率比较高，而且分值还比较大，但部分学生总是把握不好。本节课针对遗传学实验设计题的相关类型进行解法指导及例题来展开教学复习，以便使学生更好地解决遗传学实验设计题，增加得分率。
3 教学重点
(1)熟悉相对性状中显、隐性关系判断的实验设计。
(2)探究某性状的遗传是细胞核遗传还是细胞质遗传。
(3)掌握基因在常染色体还是x染色体上判定的实验设计。
(4)了解环境因素和遗传因素对生物性状影响的实验设计。
4 教学难点
相关实验设计的解题方法及例题分析。
5 教学用具
多媒体课件。
6 教学流程
6.1探究一：相对性状中显、隐性关系判断的实验设计
6.1.1解题方法
方案一：自交。
(1)若自交后代出现性状分离，则亲本性状为显性，新出现性状为隐性；
(2)若子代全部表现为亲本性状，可认定它们都是纯合子，再让它们进行杂交，其后代表现出的性状为显性，未表现出的性状为隐性。
方案二：杂交。
(1)若后代出现某一亲本性状，则该性状为显性性状，另一性状为隐性性状；
(2)若后代表现出两种亲本性状，可再进行自交，出现性状分离的为显性性状，未出现性状分离的为隐性性状。
6.1.2例题
经鉴定，玉米的红粒与黄粒是一对相对性状，且为常染色体完全显性遗传。请你用某株玉米果穗上的红粒与黄粒为实验材料设计实验，以鉴定这一相对性状的显隐性关系。
解题环节：__________________。
确定方法或思路：_________________。
预期结果、得出结论：_________________。
解析：
方案一：自交。若子代全部表现为黄粒或红粒，可认定黄粒或红粒为纯种；若让子代的黄粒和红粒杂交，其后代表现出的性状为显性，未表现出的性状为隐性；若自交后代出现性状分离，则亲本性状为显性，新出现的性状为隐性。
方案二：杂交。若子代表现出某一亲本性状，则该性状为显性性状，另一性状为隐性性状；若后代表现出两种亲本性状，可再进行自交，出现性状分离的为显性性状，未出现的性状为隐性性状。
设问：根据所学知识，还有没有其他方法来解决该题?
提示：采用单倍体育种后，再杂交即可。
6.1.3学生感悟
显性性状和隐性性状的判断方法：
(1)自交：让具有相对性状亲本分别自交，看其后代有无性状分离，若有则亲本的性状为显性性状。
(2)杂交：让具有相对性状的两亲本杂交，观察后代的表现型，若后代只表现一种亲本性状，则此性状为显性性状。
(3)隐性性状的亲本自交后代都是隐性性状。
6.2探究二：判定细胞核遗传与细胞质遗传的实验设计
6.2.1细胞质遗传与细胞核遗传的区别(表1)
6.2.2区别细胞质遗传与细胞核遗传的方法(正交和反交)
(1)实验设计：隐性的雌性×显性的纯合雄性；
显性的纯合雌性×隐性的雄性。
(2)结果预测及结论：
①若两组杂交结果相同，则该基因位于细胞核内的常染色体上：
正交：aa×AA－Aa；
反交：AA×aa－Aa。
②若两组杂交结果不同，且子代性状表现都与相应母本性状相同，则该基因位于细胞质中：
正交：H×L－H；
反交：L×H－L。
③若两组杂交结果不同，且子代性状的表现与性别相关，一种情况子代与母本性状一致，另一种情况子代雌性与父本性状一致，子代雄性与母本性状一致，则该基因位于细胞核内的x染色体上：
正交：XaXa×XAY－XAXa、XaY；
反交：XAXA×XaY－XAXa、XAY。
6.2.3例题
如图1所示系谱的阴影部分表示患者家族性疾病的个体。据图可知Ⅳ1携带致病基因的概率以及与Ⅲ4个体既非直系血亲，又非三代以内旁系血亲的异性个体分别是( )
A 1／2和Ⅱ1，Ⅱ3
B 0和Ⅱ1，Ⅲ3
C 2／3和Ⅲ2，Ⅲ3
D 1／8和Ⅲ8，Ⅱ6
答案：B。
6.2.4学生感悟
判定细胞核遗传与细胞质遗传的实验设计。
正交、反交法。
6.3探究三：判断基因位于常染色体上还是位于X染色体上的实验设计
6.3.1解题方法
(1)方法一：
①实验设计：隐性的雌性×显性的纯合雄性，
显性的纯合雌性×隐性的雄性。
②结果预测及结论：
A 若两组杂交结果相同，则该基因位于细胞核内的常染色体上：
正交：aa×AA－Aa；
反交：AA×aa－Aa。
B 若两组杂交结果不同，且子代性状的表现与性别相关，一种情况子代与母本性状一致，另一种情况子代雌性与父本性状一致，子代雄性与母本性状一致，则该基因位于细胞核内的x染色体上：
正交：XaXa×XAY－XAXa、XaY；
反交：XAXA×XaY－XAXa、XAy。
(2)方法二：
①实验设计：隐性的雌性×显性的雄性(使用条
件：知道显隐性关系时)。
②结果预测及结论：
A 若子代中的雄性个体全为隐性性状，雌性个体全为显性性状，则基因位于X染色体上：
XaXa×XAY－XAXa、XaY。
B 若子代中的雌雄个体中既有显性性状又有隐性性状且各占1／2，则基因位于常染色体上：
aa× Aa－Aa、aa。
(3)方法三：
①实验设计：选多组显性的雌性×显性的雄性(使用条件：知道显隐性关系且显隐性基因的基因频率相等)。
②结果预测及给论：
A 若子代中的隐性性状只出现在雄性中，则基因位于X染色体上：
XAXA×XAY－XAXA、XAY；
XAXa×XAY－XAXA、XAXa、XAY、XaY。
B 若子代中的隐性性状同时出现在雌性与雄性中，则基因位于常染色体上：
AA×AA－AA；
AA×Aa－AA、Aa；
Aa×Aa－AA、Aa、aa；
Aa× AA－AA、Aa。
3.2例题
(2006年全国卷I)从一个自然果蝇种群中选出一部分未过的灰色和黄色两种体色的果蝇，这两种体色的果蝇数量相等，两种体色的果蝇雌、雄各半。已知灰色和黄色这对相对性状受一对等位基因控制，所有果蝇均能正常生活，性状的分离符合遗传基本规律。现用两个杂交组合：灰色雌蝇×黄色雄蝇、黄色雌蝇×灰色雄蝇，只做一代杂交试验，每个杂交组合选用多对果蝇。推测两个杂交组合的子一代可能出现的性状，并以此为依据，对哪一种体色为显性性状，以及控制体色的基因位于X染色体还是常染色体上这两个问题，做出相应的推断(要求：只写出子一代的性状表现和相应推断的结论)。
解析：题目所列两个杂交组合为正交、反交，若正交、反交子代中体色遗传与性别无关，且黄色个体多或灰色个体多，则说明黄色或灰色为显性，此基因位于常染色体上；若正交、反交子代中体色与性别有关，即雌性个体某体色或雄性个体某体色多，则此体色基因位于X染色体上，然后根据不同体色个体的多少来推断哪种体色为显性。
答案：①如果两个杂交组合的子一代都是黄色个体多于灰色个体，并且体色的遗传与性别无关，则黄色为显性，基因位于常染色体上。
②如果两个杂交组合的子一代都是灰色个体多于黄色个体，并且体色的遗传与性别无关，则灰色为显性，基因位于常染色体上。
③如果在杂交组合灰色雌蝇×黄色雄蝇中，子一代中的雄性全部表现灰色，雌性全部表现黄色；在杂交组合黄色雌蝇×灰色雄蝇中，子一代的黄色个体多于灰色个体，则黄色为显性，基因位于x染色体上。
④如果在杂交组合黄色雌蝇×灰色雄蝇中，子一代中的雄性全部表现为黄色，雌性全部表现为灰色；在杂交组合灰色雌蝇×黄色雄蝇中，子一代中的灰色个体多于黄色个体，则灰色为显性，基因位于x染色体上。
设问：拓展延伸：
1 探究基因位于XY的同源区段还是仅位于X染色体上的实验设计。
(1)实验设计：隐性的纯合雌性×显性的纯合雄性。
(2)结果预测及结论：
A 若子代中的个体全表现为显性性状，则基因位于XY的同源区段：
XaXa×XAAA－XAXa、XaYA。
B 若子代中雌性全表现为显性性状，雄性全表现为隐性性状，则基因位于X染色体上：
XaXa×XAY－XAXa、XaY。
2 探究基因位于常染色体上还是位于XY染色体上的同源区段的实验设计。
(1)实验设计：隐性的纯合雌性与显性的纯合雄性杂交获得的F1全表现为显性性状，再选子代中的雌雄个体杂交获得F2，观察F2表现型情况。
(2)结果预测及结论：
A 若F2雌雄个体中都有显性性状和隐性性状出现，则该基因位于常染色体：
P：aaxAA－F1：Aa；
F1：Aa×Aa－F2：AA、Aa、aa。
B 若F2雄性个体中都是显性性状，雌雄个体中都有显性性状和隐性性状出现，则该基因位于XY的同源区段：
P：XaXa×XAYA－XAXa、XaYA；
F1：XAXa×XaYA－XAXa、XaXa、XAYA、XaYA。
6.3.3感悟
不论基因位于常染色体上或x染色体上或Y染色体上，还是在XY染色体的同源区段，均可按如下方法解决：
①根据题意确定杂交亲本组合；
②作出假设，草稿纸上书写简要图解，找到区别；
③如果只在雄性中出现，则在Y染色体上；
如果性状的遗传号性别无关，则在常染色体上；
如果性状的遗传与性别有关，则可能在X染色体上。
如果性状的遗传与性别有关，则可能在XY染色体同源区段。
6.4探究四：环境因素和遗传因素对生物性状影响的实验设计
环境因素――外因；遗传因素――内因。
6.4.1例题
一种以地下茎繁殖为主的多年生野，分别生长在海拔10m、500m、1000m处的同一山坡上。在相应生长发育阶段，同一海拔的野菊株高无显著差异，但不同海拔的野菊株高随海拔的增高而显著变矮。为检验环境和遗传因素对野菊株高的影响，请完成以下实验设计。
(1)实验处理：春天，将海拔500m、1000m处的野菊幼苗同时移栽于10m处。
(2)实验对照：生长于10m、500m、1000m处的野菊。
(3)收集数据：第2年秋天测量株高，记录数据。
(4)预测支持下列假设的实验结果。
假设一：野菊株高的变化只受环境因素的影响，实验结果是：移栽至10m处野菊株高与10m处野菊株高无显著差异。
假设
野菊株高的变化只受遗传因素的影响，实验结果是：移栽至10m处野菊株高与原海拔处(500m、1000m)野菊株高无显著差异。
假设三：野菊株高的变化受遗传和环境因素的共同影响，实验结果是：移栽至10m处野菊株高比10m处矮，比原海拔处高。
6.4.2学生感悟
要求掌握表现型是基因型和环境因素共同作用的结果。
7 教学总结
本节课主要介绍了以下四个方面的解题方法，以便应对相关遗传学实验设计问题。
(1)探究一：相对性状中显、隐性关系确定的实验设计。
(2)探究二：探究某性状的遗传是细胞质遗传还是细胞核遗传。
(3)探究三：基因在常染色体还是x染色体上的实验设计。
(4)探究四：环境因素(外因)和遗传因素(内因)对生物性状影响的实验设计。
【关键词】 创伤弧菌； 金属蛋白酶； 正交设计； 直观分析； 方差分析
Abstract Objective: To optimize the expression of recombinant metalloprotease of Vvibrio vulnificus in E.coliBL21/DE3 induced by IPTG. Method: The plasmid of pET-32a-vvp/E.coliBL21 was constructed by our laboratory. Four different factors，including time， temperature， agitation speed and concentration of IPTG， were studied by orthogonal experimental design. The data were analyzed by direct calculation and ANOVA method. Results: The R value of agitation rate resulting from direct calculation was highest among four factors. The P value of agitation rate was lower than 0.05. The P value of the other factors were higher than 0.05. Conclusions: The expression level is remarkable affected by the agitation rate. The expression level of VVP protein is highest when agitation rate is 250 rpm. Therefore we have established a method for high-level expression of VVP-four hours-inducing time， 37℃-inducing temperature， 1mmol/L concentration of IPTG and agitation rate in 250rpm.
Key words vibrio vulnificus; metalloprotease; orthogonal experimental design; direct analysis; analysis of variance(ANOVA)
很多临床病例及动物实验已经证明，进食被创伤弧菌（Vibrio vulnificus，Vv）污染的食物或者皮肤破损接触Vv均可引起Vv感染，主要表现为严重的蜂窝组织炎和败血症［1~3］。一旦出现败血症，其死亡率高达50%以上［4~6］。因其病情凶险，故对创伤弧菌感染的临床早期快速诊断尤为重要。目前，Vv的致病机制尚未明了。但有研究表明该菌分泌的金属蛋白酶（VVP）具有增加血管通透性，引起出血性损伤的作用，已被证实是创伤弧菌的主要毒力因素之一［7~9］，并且vvp基因在不同创伤弧菌菌株之间具有高度保守性。故金属蛋白酶可作为创伤弧菌感染重要的临床实验室检测靶标。而要制备以VVP为靶标的Vv免疫检测试剂盒，首先必须获得作为足量高纯度的VVP抗原来制备抗体。但是金属蛋白酶作为创伤弧菌种特征性的外毒素，其自然分泌产量并不高，且由于方法学的限制，采用常规生化方法获得足量高纯度溶细胞素相当困难。而通过基因工程的方法，我们可以在一个合适的系统中，使外源基因高效表达，从而生产有价值的蛋白质，对其应用或进行功能的研究。但是外源基因在工程菌中的诱导表达受很多因素的影响，例如，诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度及摇菌的转数等。因此，如何得到一种最佳的诱导条件组合，从而使蛋白高效稳定的表达是我们研究的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒
原核表达载体pET-32a-vvp由本课题组构建；宿主菌E.coliBL21/DE3由南方医科大学公共卫生与热带医学学院吴昆博士惠赠。
1.1.2 诱导剂IPTG和筛选用氨苄青霉素
购自鼎国生物制品有限公司。
1.2 方法
1.2.1 实验设计
针对诱导过程中对菌体表达蛋白产生影响的4个因素诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度以及诱导时摇菌的转数，运用SPSS 11.5统计学软件进行正交实验设计。因素及水平见表1。表1 因素水平表（略）
1.2.2 诱导
质粒pET-32a-vvp转化E.coliBL21/DE3后，挑取单菌落接种于含氨卞青霉素(100mg/L)的LB培养基中，37℃活化过夜，次日按1:100的比例转接，37℃培养至OD600约0.8时即根据不同诱导条件进行诱导，诱导条件见实验设计。离心收集菌体，做SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色、脱色后观察。扫描后运用图像分析软件Quantity One得出各不同诱导条件下融合蛋白VVP的表达浓度。
1.2.3 正交试验直观分析法
分别计算每个因素各水平下的平均收率，用各因素各个水平平均收率的极差R(极差=平均收率的最大值- 平均收率的最小值)来反映各因素的水平变动时对试验结果影响的大小［10］。
1.2.4 方差分析
运用SPSS 11.5统计学软件对正交设计资料进行分析。
1.2.5 结果验证
在由上述方法得出的最佳诱导条件下，对转化了质粒pET-32a-vvp的E.coliBL21/DE3进行诱导，并对结果进行SDS-PAGE分析，以验证此组合的诱导条件的诱导表达效果。并设置转化空载体组及未诱导组进行对照。
2 结果
2.1 SDS-PAGE 结果
取16组经不同诱导条件诱导的菌液作组间平行SDS-PAGE，经Quantity One对染色凝胶做图像分析，来确定融合蛋白VVP表达的相对比例。SDS-PAGE 结果见图1，图上方的数字代表组别。经扫描得到各组VVP的表达比例见表2。
2.2 优化结果
2.2.1 正交试验直观分析法
运用正交试验直观分析法得出的条件优化结果见表2和图2，K1、K2、K3、K4分别表示每个因素各水平下的蛋白表达量的均值［10］。由极值R的大小推知，各因素的重要性依次为诱导摇菌转数、诱导时间、诱导温度、诱导剂IPTG浓度。本实验的最佳搭配诱导条件为摇菌转数250r/m、诱导时间4h、诱导温度37℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L。表2 实验设计与结果分析（略）
2.2.2 方差分析
运用SPSS 11.5统计学软件对进行正交设计资料进行方差分析得出的条件优化结果见表3。摇菌转数的P值小于0.05，即该因素对试实验结果影响显著；而时间、温度及IPTG浓度的P 值均大于0.05。表3 方差分析表（略）
2.2.2 结果的验证
在诱导条件为摇菌转数250r/m、诱导时间4h、诱导温度37℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L的情况下，VVP的表达量达到了40.67%。而其它4组对照组均无表达，见图3。
3 讨论
正交试验设计是一种安排多因素多水平试验，并利用普通的统计分析方法来分析试验结果的一种试验设计方法［10］。对于多因素多水平的问题，通常都希望通过试验找出因素的主次关系和最优搭配条件。用正交设计合理地安排试验，可以做到省时、省力、省钱，同时又能得到基本满意的试验效果［10］。因此在本研究中，我们运用这种实验设计方法对融合蛋白VVP在工程菌中的诱导表达条件进行优化，旨在获得稳定高效表达的VVP蛋白，从而为VVP的致病机理研究以及Vv免疫检测试剂盒制备奠定基础。
目的基因在大肠杆菌中的诱导培养方式主要有两种，即化学物质诱导和温度诱导，pET32a载体带有启动子T7lac，可采用化学物质IPTG进行化学诱导［11］。要实现蛋白产物的高表达，需要考虑重组菌生长和产物表达的最适环境条件，包括诱导时间、诱导温度、摇菌的转数及最适诱导剂浓度等。细菌在诱导后，大量能量会消耗在外源蛋白的表达上，使细菌的生长提前进入衰亡期，过度诱导会造成溶菌。因此需要对诱导时间进行控制，找到能使外源蛋白充分表达而又不会导致溶菌的适当诱导时间，我们在实验中设计了3个连续的时间水平1h、2h、3h。在诱导温度上，不同的蛋白对温度有不同的要求。有研究表明，有些外源蛋白在低温下才能大量表达［12］；而本实验中的工程菌大肠杆菌的最适生长温度是37℃。考虑到这两方面的要求，我们在实验中设计了3个温度水平：20℃、30℃、37℃。摇菌的转数对细菌的生长也是极为重要的。体系溶解氧是影响菌体代谢的重要参数，外源基因在高效转录和翻译时需要大量能量，及时给予饱和需氧量对高效表达有意义［13］。加入诱导剂后通过改变搅拌转数(r/min)来改变氧传递推动力和液相体积氧传递系数，以达到调节体系溶解氧的目的。通常搅拌转数愈大液相体积氧传递系数愈大，但当r/min 很大时，体系产生不可避免的泡沫而阻止了氧的传递;同时r/min过大则产生较大的剪切力，亦对菌体生长不利［11］。我们在实验中设计了3个r/min水平：100、180、250。诱导剂IPTG的浓度对外源蛋白的表达水平有较大影响，浓度过高会对宿主菌造成损害，过低则影响诱导剂的效用。因此实验中设计了4个浓度水平:0.1mmom/L、0.5mmom/L、1mmom/L、2mmom/L。
本实验设计的因素水平不等，因此在对正交设计资料进行直观分析时，我们运用平均蛋白表达量K1、K2、K3值的大小来反映各因素的不同水平对实验结果(蛋白表达量)影响的大小，并以此确定实验的最佳搭配。用各因素各个水平蛋白平均表达量的极差R来反映各因素的水平变动时对实验结果影响的大小。极差大的就表示该因素的水平变动时对实验结果的影响大，极差小的就表示该因素的水平变动时对实验结果的影响小。本实验中，我们得到因素的主次顺序为诱导摇菌转数、诱导时间、诱导温度、诱导剂IPTG浓度。主要因素应取较好的水平，而次要因素，则可根据对成本、时间、收益等方面的统筹考虑而选取适当的水平。正交试验的直观分析法简便、直观、计算量小，但不能估计试验误差，即不能区分是由于各因素的水平变化而导致试验结果的差异，还是由于试验的随机波动而导致试验结果的差异。为解决此问题，可对试验结果做方差分析。由表3可知，摇菌转数的P值小于0.05，而时间、温度及IPTG浓度的P 值均大于0.05。按方差分析法的观点，只须对有显著意义的因素确定好水平，而其它对试验结果没有什么影响的因素，则可按实际需要来确定适当的水平。方差分析的结果与直观分析方法得到的结果相同。并且这一结果也通过VVP的高表达(表达浓度达到了40.67％)得到了验证。由此得本研究的试验最佳组合为摇菌转数250rpm、诱导时间4h、诱导温度37℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L。
【参考文献】
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2 Bisharat N，Agmon V，Finkelstein R，et al.Clinical， epide miological，and microbiological features of Vibrio vulnificus biogroups 3 causing outbreaks of wound infection and bacteraemia in Israel.Israel Vibrio Study Group. Lancet，1999，354(9188):1421~1424.
3 郑晶，申洪，陈清.海水环境创伤弧菌感染的病理学研究.中华创伤杂志，2007，23(11): 874~878.
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5 Campbell MS， Wright AC. Real-Time PCR Analysis of Vibrio vulnificus from Oysters.Appl Environ Microbiol， 2003，69(12): 7137~7144.
6 郑晶，申洪，陈清. 创伤弧菌经食管感染小鼠的致病性.世界华人消化杂志，2005，13(7):860~863.
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8 Miyoshi S. Effects of Vibrio Vulnificus metalloprotease on the capillaries:pathological actions and inactivation by alpha-macroglobulin.Yakugaku Zasshi，2000，120(11):1149~1157.
9 Miyoshi S，Narukawa H，Tomochika K，et al.Actions of Vibrio vulnificus metalloprotease on human plasma proteinase-proteinase inhibitor systems:a comparative study of native protease with its derivative modified by polyethylene glycol.Microbiol Immunol，1995，39(12):959~966.
10 祝国强，滕海英，黄平. 正交试验设计方法在医药学中的应用.数理医药学杂志，2007，20(4):568~569.
11 pET系统操作手册 Novagen.
【摘要】 目的 寻找在超声条件下从促生长散中提取水溶性成分的优化条件并进行含量测定。方法 在单因素实验的基础上采取正交设计法，以超声时间、提取温度、固液比及提取次数为因素，每个因素3个水平，选择L9(34)正交表，用酸碱滴定法测定有机酸含量作为综合评价指标。结果 该提取实验影响因素:为提取次数>提取时间>提取温度>固液比。结论 最佳提取条件为：超声时间20 min，超声温度45 ℃，固液比1∶10，提取次数3次。
【关键词】 促生长散；超声提取；正交实验；含量测定；有机酸
Abstract：Objective To optimize the extracting condition of water-soluble component from herbal medicine of promoted growth and determine the content of organic acid. Methods With the content of organic acid as the index， ultrasonic time， extracting temperature， ratio of solid and liquid and extracting times were screened by L9 (34) orthogonal test on the basis of single factor test. Results The effect factors of the extracting condition were as follows：extracting times>extracting time>extracting temperature>ratio of solid and liquid. Conclusion The best extracting condition was that ultrasonic time of 20 min， temperature of 45 ℃， ratio of solid and liquid of 1∶10， and extracting 3 times.
Key words：ultrasonic extraction；orthogonal experiment；content determition；organic acid
促生长散是一种纯中药制剂，由山楂、甘草、地榆等中药材组成，含有较多的水溶性成分，主要成分为有机酸[1-2]，多年来应用效果良好。但尚存在很多不足：口感差、药效发挥时间慢、有效成分利用率低、产品易发霉变质、不易贮存、质量可控性差等。为了提高促生长散产品的科技含量，实现产品 稳定、高效、可控的质量要求，本研究拟采用超声辅助技术对促生长散中的水溶性成分进行提取，为有效成分的高效利用奠定基础。
1 实验材料
1.1 主要仪器
LD隆达HF-2.5B超声循环提取机(北京弘祥降生物技术开发有限公司)，碱式滴定管(50 mL)，TDL-5台式离心机(上海安亭仪器厂)，电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)，DL-360A超声仪(上海之信仪器有限公司)，RE52-05旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，SHZ-CB型循环水式多用真空泵(河南巩义市英峪宁华仪器厂)，ZK-82A型电热真空干燥箱(上海实验仪器厂有限公司)。
1.2 药物和试剂
促生长散(石河子大学化学化工学院提供)，NaOH(A.R)、邻苯二甲酸氢钾(A.R)、蒸馏水、酚酞指示剂，石河子医药公司提供。
2 实验方法
2.1 含量测定
促生长散中含有较多的水溶性成分，主要来源于山楂、甘草、地榆等，均含有有机酸，参照《中华人民共和国药典》(一部)山楂项下的含量测定方法，用氢氧化钠滴定液(0.1 mol/L)滴定，即得，每1 mL氢氧化钠滴定液(0.1 mol/L)相当于6.4O4 mg的枸橼酸计算有机酸含量。
2.2 单因素试验
2.2.1 超声时间
取促生长散10.00 g，溶剂100 mL，在25 ℃下进行超声提取，每5 min取样1次，测定滴定的NaOH的体积，并算出有机酸的含量。
2.2.2 超声温度
取促生长散10.00 g，溶剂100 mL，在30 min提取1次的条件下，分别在25、35、45、55、65 ℃的条件下提取并测定滴定用的NaOH体积，算出有机酸的含量。
2.2.3 超声次数
超声次数不同提取效果不同。试验发现超声次数太多，浪费溶剂，提高成本，而且给后处理带来困难；超声次数太少，不能充分提取出有效成分。在对大量文献资料综合分析的基础上，结合试验具体情况，选定超声次数为1、2、3次进行正交实验。
2.2.4 固液比
固液比不同提取效果不同。试验发现固液比太大，影响超声提取器的循环和搅拌；固液比太小浪费溶剂，提高成本，而且给后处理带来困难。在对大量文献资料综合分析的基础上，结合试验具体情况，选定固液比为1∶8、1∶10和1∶12进行正交实验。
2.3 正交试验
在对以上单因素分析和试验的基础上，对影响有机酸提取效果的几个因素，着重考察超声时间(A)、超声温度(B)、固液比(C)、提取次数(D)4个因素，每个因素3个水平(具体试验因素及水平见表1)，用L9(34)进行正交实验设计，选择最佳的提取条件。表1 因素水平表（略）
3 结果
3.1 单因素实验
3.1.1 超声时间对提取效果的影响
根据超声单因素试验，平行测定3次的条件下研究出提取时间对有机酸含量的影响。随着提取时间的增加，有机酸的含量也在增加，25 min后增长趋缓，因此选择20 min左右进行正交实验。
3.1.2 超声温度对提取效果的影响
根据超声单因素试验，平行测定3次的条件下研究出提取温度对有机酸含量的影响。随着提取温度的升高，有机酸的含量也在增加，45 ℃后增长趋缓，因此选择35 ℃左右进行正交实验。
3.2 正交实验设计
在单因素影响的基础上，为探讨各条件参数的相互影响，试验中设计了四因素三水平正交试验，确定应用L9(34)进行正交实验设计。结果见表1、表2。表2 L9(34)正交设计及结果（略）
表中因素A(时间)它的3个水平所对应的提取百分含量以第2水平的数值为最大，所以取它的第2水平最好；因素B(温度)以第3水平的数值为最大；因素C(固液比)以第2水平的数值为最大；因素D(提取次数)以第3水平的数值为最大。
实验结果表明，有机酸的最佳提取条件是A2B3C2D3，即超声时间20 min，超声温度45 ℃，固液比1∶10，提取次数3次。根据极差分析影响有机酸的提取因素大小为：次数>时间>温度>固液比。该提取工艺影响因素最大的是提取次数，影响因素最小的是固液比。
3.3 验证实验
取促生长散10.00 g，溶剂100 mL。根据筛选得到的最佳提取条件A2B1C2D3平行提取3次，分别测定有机酸的含量。结果见表3。表3 验证实验结果（略）
经验证实验，根据最佳的提取条件所测得的有机酸的含量均大于正交设计中的含量。
4 结论
促生长散中水溶性成分的最佳提取条件为：超声时间20 min，超声温度45 ℃，固液比1∶10，提取次数3次。促生长散中水溶性成分主要来源于组方中的山楂、甘草、地榆等，所以本实验采用有机酸为评价指标，方法简便，合理可行。
参考文献
关键词：二妙胶囊；盐酸小檗碱；正交实验
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2009)05-1087-02
二妙丸由苍术、黄柏两味药组成，为主治湿热流注之筋骨疼痛或两足痿软或足膝红肿、下部湿疮、带下以及湿热成痿诸症的首选方剂，临床运用甚广，被收录在2005版药典…。本次实验针对二妙丸服用量大，携带不方便的特点，拟将丸剂改为胶囊剂，以减小服用量，提高药物的稳定性和生物利用度。苍术健脾燥湿为方中君药。黄柏为芸香科植物黄柏Phellodendmnam illnse Rupr(关黄柏)和黄皮树Phellodendron ehinse Sehneid(川黄柏)的除去栓皮部分的树皮，为中医临床常用的中药材之一，具有清热、燥湿、泻火、解毒之功效。文献报道，黄柏主要含有小檗碱、木兰碱、黄柏碱、掌叶防己碱等多种生物碱及内酯、甾醇、黏液质等成分，为了更好的发挥黄柏的药用功效，本实验采用正交实验设计法，以盐酸小檗碱的含量和出膏率为检测指标，考察溶媒浓度、溶媒用量、提取时间及提取次数等4种因素对提取工艺的影响，并对提取工艺进行优选。
1 仪器与试药
黄柏，购于四川。盐酸小檗碱化学对照品批号：110713―200609。购自中国药品生物制品检定所。岛津LC-10A高效液相色谱仪、浙大N3000色谱工作站、电子分析天平等。其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 正交试验设计表的设计
根据初筛试验结果，分别确定提取溶媒(乙醇)浓度、溶媒用量、提取时间及提取次数为实验因素，每个因素选择3个水平的正交实验设计方案，见表1。
2.2 样品的制备
取黄柏(炒)药材25g，共取9份，按照表1、表2分别进行回流提取，提取液滤过，合并，回收乙醇，浓缩，定容到250mL的容量瓶中，取5mL到25mL的容量瓶中，甲醇定容，微孔滤膜过滤后，精密吸取10μL，注入高效液相色谱仪。
2.3 出膏率的测定
精密吸取滤液10mL，水浴蒸干，置于105℃烘箱中恒温干燥3h，取出置干燥器中1h，精密称定，计算浸膏得率。
2.4 盐酸小檗碱的含量测定
2.4.1 对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱适量，溶解制成每1mL含0.28mg的溶液。
2.4.2 实验条件及系统适用性色谱条件：色谱柱为Diamortsil C18(5μm，4.6nm×150nm)；流动相为乙腈：0.025mL/L磷酸水溶液=1:3，检测波长265nm；柱温40℃；流速1mL/min。理论塔板数按盐酸小檗碱计算应不低于4000。
2.5 实验结果
以小檗碱和出膏率为指标，权重系数为60:40。见表2、表3。
由表2、表3可以看出，影响因素D>A=C>B，且因素D具有显著性，所以黄柏的最佳提取工艺为以D3A2C2B3。即黄柏的最佳提取工艺为10倍量的70％乙醇回流提取3次，每次1.5h。
3 讨论
摘要：目的筛选芩连抗病毒胶囊醇提和水提最佳工艺。方法采用正交实验法对芩连抗病毒胶囊提取工艺进行考察，分别以组方中的黄芩苷和盐酸小檗碱的含量为指标进行测定。结果醇提工艺以10倍量70%的乙醇提取3次，1 h/次；水提工艺以10倍量水，煎煮2次，2 h/次所得到的黄芩苷和盐酸小檗碱的含量最高。结论此工艺对黄芩苷和盐酸小檗碱的提取率高，稳定性好，适合工业化生产。
关键词：黄芩苷；盐酸小檗碱；提取工艺
Study on Extraction Processes of Qinlian Antivirus Capsule
Abstract:ObjectiveTo determine the optimum condition of extraction processes of Qinlian Antivirus Capsule.MethodsThe extraction processes were studied with the potentiametric method and the contents of baicalin and berberine hytrochloride as the markers.ResultsThe contents of baicalin and berberine hytrochloride were the highest when the following extraction condition was used:extracting with 70% alcohol and 10 times solvent for an hour a time and the process was repeated three times，and the extraction process of water is that 10 times solvent ，boiling twice ，2 hours per-time.ConclusionThe contents of baicalin and berberine hytrochloride are high and the stability is good when this extraction process is used. This extraction process is suitable for industrial production.
Key words:Baicalin; Berberine hytrochloride; Extraction process
芩连抗病毒胶囊由黄芩、黄连、桔梗、牛蒡子等组成。具有清瘟解毒之功效，用于外感时疫或外感风热引起的头疼身痛，恶寒发热，喉痛咳嗽，痄腮红肿等诸症。黄芩苷和盐酸小檗碱分别是方中君药和臣药的主要有效成分［1～3］，故本实验以黄芩苷和盐酸小檗碱的含量为指标采用正交实验法对醇提工艺和水提工艺进行考察，以确定芩连抗病毒胶囊的最佳提取工艺。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪(美国安捷伦1100)；Extend ODS C18色谱柱 (大连依利特)；微量进样器（HAMITON COMPANY）；岛津CS9301双波长薄层扫描仪；KQ3200DE型医用数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；定量毛细管（美国Drummond Co.）。液相用试剂均为色谱纯；薄层用试剂均为分析纯。试验用药材购自郑州市神州大药房，经鉴定，符合《中国药典》规定。
2 醇提工艺考察及结果
2.1色谱条件［4］用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇水磷酸（47∶53∶0.2）为流动相；检测波长280 nm；柱温室温。
2.2 对照品溶液的制备取黄芩苷对照品加甲醇制成每毫升含60 μg的溶液作为对照品溶液。
2.3 线性化范围考察精密称取减压干燥后的黄芩苷对照品，用甲醇溶解制成每毫升含黄芩苷149.3 μg的溶液，作为对照品溶液。精密吸取黄芩苷对照品溶液2，4，6，8，10 μl注入液相色谱仪，按以上条件进行测定。结果见表1。表1 黄芩苷线性化范围实验（略）
其回归方程为y=122.85+3.077 7x，r=0.999 6黄芩苷在0.298 6～1.493 μg之间呈一通过原点的直线。
2.4 精密度实验精密吸取同一对照品溶液10 μl，注入液相色谱仪，按上条件进行测定。结果见表2。表2 精密度实验（略）
结果表明：黄芩苷精密度良好，符合定量分析要求。
2.5 据资料表明［5］处方中黄芩，桔梗，牛蒡子，甘草四味药物中的主要成分均为苷类化合物，且为其活性成分。因为苷类化合物在含水醇的溶解性较好，为了有效提取此类化合物，以保证药效，同时也为了减少药物服用量，故对以上几味药物采用不同浓度的乙醇来提取。
2.6 正交实验设计与结果考虑加醇量、乙醇浓度、提取时间及提取次数，其因素水平表见表3。表3 黄芩、桔梗、牛蒡子、甘草乙醇提取因素水平（略）
2.7 黄芩苷含量测定取乙醇提取液适量作为供试品溶液；参照《中国药典》2000年版Ⅰ部黄芩药材含量测定项下色谱条件，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇水磷酸（47∶53∶0.2）为流动相；检测波长280 nm，照高效液相色谱法［4］测定，分别精密吸取对照品溶液10 μl和供试品溶液5 μl，注入液相色谱仪，测定，即得。结果见表4，方差分析见表5。表4 正交实验设计及结果实验（略）表5 方差分析方差来源 （略）
2.8 样品测定精密称定3批一定量药样，照优化条件提取：加70%的乙醇10倍量提取3次，1 h/次，提取液作为供试品溶液按照2.7项下黄芩苷的含量测定方法测定，得黄芩苷相当于药材含量分别为10.522％，10.308％，10.617％，RSD=1.51％。
3 水提工艺考察及结果
3.1 工艺条件筛选据研究资料表明，处方中黄连主要含生物碱类化合物，以小檗碱含量最高，同时小檗碱也为其主要有效成分，小檗碱在热水中溶解度较好；方中石膏为矿物药，其主要成分为CaSO4・10H2O，根据传统中药理论，石膏以久煎入药，故把黄连，石膏采用水煎煮的方法提取，在煎煮过程中，采用正交实验法来筛选最佳工艺，其影响因素主要有：加水量、煎煮次数、煎煮时间等，因素水平见表6。表6 黄连、石膏共水煎煮因素水平（略）
3.2 盐酸小檗碱含量测定［4］精密量取各正交组取提取液适量，加盐酸甲醇（1∶100）稀释作为供试品溶液；另取盐酸小檗碱对照品加甲醇制成1 ml含0.5 mg的溶液作为对照品溶液；参照《中国药典》2000年版Ⅰ部黄连药材含量测定项下测定方法，分别吸取供试品溶液6 μl，对照品溶液2 μl和4 μl，交叉点于同一硅胶G板上，以苯醋酸乙酯异丙醇甲醇水（6∶3∶1.5∶1.5∶0.3）为展开剂，另槽加入等体积浓氨试液，预平衡15 min，展开，取出，挥干，照薄层色谱法进行荧光扫描，激发波长λ=348 nm，测定供试品与对照品荧光强度的积分值，计算，即得。测定结果见表7，方差分析见表8。表7 正交实验设计及结果实验（略） 表8 方差分析方差来源 （略）
3.3 基于上述正交实验各影响因素没有显著性差异由直观分析可知煎煮时间和加水量影响因素较大，故拟以煎煮时间和加水量做两因素两水平正交实验，考察指标为小檗碱百分含量。因素水平见表9，正交实验结果见表10。表9 因素水平水平（略）表10 正交实验结果实验（略）
3.4 样品测定精密称取3批一定量药样，照优化条件提取：加10倍量水，煎煮2次，2 h/次；提取液按照3.2项下盐酸小檗碱含量测定法进行测定，分别得盐酸小檗碱相当于药材含量为5.464%，5.378%，5.527%，RSD=1.37％。
4 结果分析及讨论
4.1 表5方差分析表明，因素A，B，C，D对实验结果的影响都非常显著。根据正交实验结果，选取显著因素的最好水平，得到醇提最佳工艺条件为，A2B3C2D3，即以10倍量70%的乙醇提取3次，1 h/次。3批验证试验结果表明，该工艺稳定可行。
4.2 表8方差分析表明，因素A、B、C均不具有显著性，但由直观分析可知，煎煮时间和加水量对实验结果有较大影响，煎煮次数对实验结果影响较小，故以煎煮时间和加水量做两因素两水平正交实验对水提工艺继续进行考察，考察指标为小檗碱百分含量。由表10结果直观分析表明，因素A对实验结果的影响较因素B大，结合两次的正交实验的结果，确定最佳水提工艺为：10倍量水，煎煮2次，2 h/次。3批验证实验结果表明，该工艺稳定可行。
参考文献
［1］贺海平，梁宁生.002黄芩药理研究的新进展［J］.国外医学・中医中药分册，2000，22（1）：14.
［2］瞿佐发.黄芩的药理作用及临床应用［J］.时珍国医国药，2002，13（5）：316.
［3］耿东升，刘发.小檗碱药理作用研究进展［J］.人民军医药学专刊，1997，13（1）：24.
【摘要】
目的对从老鹰茶中提取总皂苷的工艺进行优化。方法以齐墩果酸为对照品，香草醛-高氯酸法显色，用紫外分光光度法在550 nm处测定总皂苷含量。采用L9（34）正交设计，以老鹰茶总皂苷含量为考察指标，考察乙醇浓度、提取时间、乙醇用量、提取次数4个因素对提取的影响。结果最佳提取工艺为80 %乙醇，12倍量，回流提取3次，1 h/次。结论该工艺经实验重复性好，对进一步的工艺开发有较好的参考价值。
【关键词】 老鹰茶 总皂苷 正交实验 紫外分光光度法
老鹰茶系樟科木姜子属毛豺皮樟Litsea coreana Leve的叶，俗称“白茶”，分布于云南、贵州、四川、安徽等地。民间饮用表明老鹰茶具有解毒消肿、明目益思、生津止渴、解表防暑等功效，且无毒副作用，为药食同源植物［1］，长期饮用有益于健康。老鹰茶中含有黄酮、皂苷、有机酸、香豆素和鞣质等成分，其中皂苷类成分含量丰富［2］。研究老鹰茶的化学成分，对研究天然产物化学多样性，以及寻找新的药用成分具有重要意义。为了有效开发和利用资源，本文采用正交实验对老鹰茶总皂苷的提取工艺进行了研究。
1 仪器与试药
1.1 仪器722S分光光度计；8453紫外-可见分光光度计(Agilent)；电子天平BP211D (Sartorius)；GSY-8电热恒温水浴锅；EK-S5AB电热真空干燥箱。
1.2 试药齐墩果酸标准品，购自中国药品生物制品检定所；老鹰茶，2006-05购自安徽省宁国县茶农，阴干备用，经植物学鉴定为樟科木姜子属毛豺皮樟Litsea coreana Leve的叶。试剂均为分析纯，水为双蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 标准曲线的制作［3］精密称取经120℃干燥至恒重的齐墩果酸标准品5.0 mg，置于25 ml容量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得对照品溶液(每毫升含齐墩果酸标准品0.2 mg)。精密量取对照品溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml于10 ml试管中，抽干甲醇，加0.2 ml 5%香草醛，0.8 ml高氯酸，摇匀于60℃水浴中加热15 min，冷却，加冰醋酸5 ml，摇匀。以相应试剂做空白，在8453紫外-可见分光光度计上进行全波长扫描，最大吸收波长为（λmax）550 nm。按分光光度法在550 nm波长处测定吸光度。以吸光度值(Y)为纵坐标，对照品浓度(X)为横坐标绘图，得回归线性方程Y = 53.666X-0.067 4，r=0.999 9，线性范围：6.666 7～33.333 3 mg ·L-1。
2.2 提取溶剂的选择
2.2.1 水提取法精密称取老鹰茶5 g，加水50 ml，在水浴上加热回流提取1 h，趁热过滤，共提取2次，洗涤残渣，合并滤液和洗涤液，蒸干溶剂。固体水溶后，正丁醇萃取，萃取液过氧化铝柱，收集流出液，定容至200 ml容量瓶中，摇匀，待用。
2.2.2 乙醇提取法精密称取老鹰茶5 g，加80 %乙醇50 ml，在水浴上加热回流提取1 h，趁热过滤，共提取2次，洗涤残渣，合并滤液和洗涤液，蒸干溶剂。固体水溶后，正丁醇萃取，萃取液过氧化铝柱，收集流出液，定容至200 ml容量瓶中，摇匀，待用。
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2.2.3 样品中总皂苷的含量测定精密量取供试品溶液0.3 ml，按标准曲线方法进行操作，测定吸光度值，由回归方程计算样品中总皂苷的含量。结果见表1。
表1 提取溶剂与含量的关系（略）
2.3 正交实验设计与结果根据药材性质和生产实际要求，拟定影响浸出效果的4个主要因素，即A为乙醇浓度(%)，B为乙醇用量(倍体积)，C为提取时间(h/次），D为提取次数，每个因素选择3个水平，编制因素水平表见表2。
表2 因素水平（略）
称取适量老鹰茶干燥粗粉9份，按正交实验设计的工艺进行提取，以老鹰茶提取物中总皂苷含量为考核指标，对正交实验结果进行方差分析见表3～4。
表3 正交试验(L934)直观分析（略）
表4 方差分析（略）
根据分析结果可知，各个因素对老鹰茶总皂苷提取效果的影响程度依次为A（乙醇浓度）>D（提取次数）>C（提取时间）>B（乙醇用量），且对提取效果影响有统计学意义的因素是因素A（乙醇浓度）。综合直观分析和方差分析的结果，老鹰茶总皂苷理想的提取工艺方案是A3B3C1D3，即用12倍量的80% 乙醇，回流提取3次，1 h/次。
2.4 提取工艺的验证实验为进一步考察上述最佳工艺的稳定性和合理性，按该工艺条件进行重复性实验3次，分别测定老鹰茶总皂苷的含量。结果见表5。测定的结果均等于或优于正交实验表中的任何一组，重复性好，RSD = 0.934% (n=3)。说明该工艺稳定可行。
表5 最佳工艺的验证实验（略）
3 讨论
香草醛-高氯酸法显色体系最大吸收波长在550 nm处，该显色体系呈色稳定，但由于老鹰茶粗提物中有色物质的干扰，粗提物须经过氧化铝脱色。样品脱色后显色在近550 nm处有最大吸收，因此该显色体系可用于老鹰茶总皂苷含量测定。
由正交实验的直观分析和方差分析结果可知，从总皂苷这一指标来看，因素A（乙醇浓度）的影响最大，差异性最为显著；老鹰茶总皂苷的最佳提取工艺为12倍量的80%乙醇，回流提取3次，1 h/次。本实验优选出的工艺简单，操作容易，稳定性好。
参考文献
［1］ 李延松. 老鹰茶资源调查与开发利用［J］.贵州茶叶，1995，4:10.
【关键词】 芒果止咳片；，，薄膜包衣；，，正交实验
摘要：目的通过优化选择薄膜包衣的生产工艺条件，提高芒果止咳包衣片的稳定性。方法通过正交实验摸索薄膜包衣工艺的最佳条件，并通过溶出度、耐温耐湿实验，比较糖衣及薄膜衣对芒果止咳片理化性质的影响。结果薄膜包衣可提高芒果止咳片的储存期稳定性。结论 芒果止咳片采用薄膜包衣比糖衣有优势。
关键词：芒果止咳片； 薄膜包衣； 正交实验
Abstract：ObjectiveTo optimize the thin film coating production craft. MethodsBy orthogonal experiment， we tried to find out the optimum condition to thin film coating production craft and compared the different effects on Mango Anticough Tablet's physics and chemistry nature applying sugarcoating and thin film coating separately by dissolution， heat and humidity test. ResultsThin film coating can promote the storage stability of Mango Anticough Tablet. ConclusionApplying thin film coating has more advantages to Mango Anticough Tablet.
Key words：Mango anticough tablet； Thin film coating； Orthogonal experiment
芒果止咳片是由芒果叶提取物、鱼腥草素钠等制成的中药片剂，目前的国家标准指定包糖衣［1］。糖衣片吸湿性强，且易裂片、出现色斑，降低了产品质量。我们采用薄膜包衣技术对芒果止咳片进行包衣，有效解决了上述问题。
1 仪器与试药
BGB150C型包衣机（温州市制药设备厂）；TM85型胶体磨（天津市鑫普机械制造有限公司）；HG53型快速卤素水分测定仪（瑞士梅特勒）；SPX250C型恒温恒湿箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；1014型电烤箱（上海医疗机械厂）；RC6型溶出度测试仪（天津光学仪器厂）。芒果止咳片片芯（广西中医学院制药厂，批号20050419）；聚丙烯酸树脂Ⅳ号（江苏省苏州市立新医药原料有限公司，批号20041026）；HPMC（潍南山沙药用辅料有限公司，批号20040804）；吐温80（汕头市西陇化工厂，批号20040708）；95%乙醇（工业级，广西南宁化工厂，批号200411082）。
2 方法与结果
2.1 糖衣片的制备先预热包衣锅（30～40℃），将合格的片芯置于包衣锅内，启动包衣锅使片芯均匀受热，分别上隔离层，粉衣层，糖衣层，色衣层，打光。
2.2 薄膜衣片的工艺及其优化
2.2.1 包衣液配制 取聚丙烯酸树脂Ⅳ号90 g与HPMC20 g分别溶于适量95 %和70 %乙醇中，静置浸泡过夜，待完全溶解，分别加95 %和70 %乙醇至总体积1 000 ml，将两者混匀，依次加入吐温80、蓖麻油、滑石粉、钛白粉适量，过胶体磨反复研磨均匀，过120目筛备用。
2.2.2 包衣先预热包衣锅（30～40℃），将合格的片芯置于包衣锅内，启动包衣锅使片芯均匀受热，将配制好的包衣液用喷枪喷雾于转动的片芯表面，以60～70℃热风干燥，连续喷雾至片面完整光洁，色泽均匀，停止喷雾。用热风继续干燥10 min后，再用冷风吹干即得。
2.2.3 正交实验设计实验设计：影响薄膜包衣质量的因素主要有片芯的硬度、包衣液浓度、喷雾流量等，将之作为考察因素，并相应安排了3个水平，选L9（34）正交表安排实验。见表1。
表1 因素及水平（略）
指标确定：以薄膜衣片芒果膏主要有效成分芒果苷溶出度及薄膜衣片外观合格率为指标，实施综合评分。溶出度实验：按《中国药典》第1法［2］设定转篮转速为120 r/min，溶出介质为人工胃液，进行溶出度实验，在45 min取样5 ml，微孔滤膜过滤，滤液按文献［3］测定芒果苷，与样品薄膜衣片芒果苷含量比较，计算薄膜衣片芒果苷在45 min溶出度。溶出量％最高者记“10”分，最低者记“0”，按公式Xj=(Y10-Y0)×(Y10-Yj)/10依次类推；外观合格率实验：每批取100片，按文献［2］薄膜衣片外观标准评判合格率，合格率％“< 80”，记“0”分，“≥80，85，90，95，98”依次记“2，4，6，8，10”分。因溶出度是评价中药片剂溶出特性的关键指标，溶出度作为重要指标，参照文献［4］系数设为1.5，外观合格率系数设为1，综合评分值＝1.5X1＋X2。结果见表2。
表2 正交实验设计表及结果（略）
正交实验结果分析：方差分析见表3，实验结果表明，片芯硬度、包衣液浓度和喷雾流量对薄膜包衣有显著性影响，其中片芯硬度对薄膜包衣影响最大，其次是包衣液浓度和喷雾流量根据优化实验结果，选取芒果止咳薄膜包衣工艺为A2B1C2。按此条件试生产的芒果止咳片，达到预期的效果。
2.3 质量分析
2.3.1 溶出度按正交实验样品溶出度实验方法测定。结果见表4。
表4 溶出度实验（略）
2.3.2 耐低温、高温实验 实验研究了薄膜衣片（开放式）与糖衣片（开放式）分别在低温，高温条件下对外观的影响。结果见表5。
表5 耐温实验（略）
2.3.3 抗湿实验实验研究薄膜衣片及糖衣片暴露在高温(40℃)、高湿(75%)环境下存放30 d，检测各项指标，结果见表6。
表6 抗湿实验（略）
3 讨论
3.1 正交实验结果表明：片芯硬度4~5 kg・mm-2，包衣液浓度8%，喷雾流量0.30~0.34 kg・min1.为芒果止咳片芯的薄膜包衣工艺最佳条件，按此工艺条件进行生产验证，芒果止咳薄膜衣片符合药典薄膜衣片标准，主要成分芒果苷溶出量为88.5％，产品质量稳定，提示芒果止咳片芯的薄膜包衣工艺是可行的。
3.2 对比实验结果表明，芒果止咳薄膜衣片中芒果苷溶出量明显高于糖衣片，在低温、高温、高湿环境，薄膜衣片外观、硬度、崩解时限、水分各项指标基本稳定，而糖衣片已严重吸潮变质，提示芒果止咳薄膜衣片溶出特性、抗湿、耐温性能明显优于糖衣片。
3.3 实验结果表明，芒果止咳薄膜包衣片的抗湿、耐温、抗氧等稳定性都有较大提高，并且有较好的溶出特性，提示了中药浸膏片采用薄膜包衣有优势，中药浸膏薄膜包衣片在贮运过程中具有较好的抗磨损、抗吸潮变质性能，稳定了产品质量。
参考文献
［1］ 中华人民共和国卫生部药典委员会.卫生部药品标准・中药成方制剂，第5册［S］.1992：50.
［2］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2000：附录7，附录75.
【摘要】
目的筛选咳安含片的最佳提取工艺。方法采用正交实验设计对提取的条件进行优选。结果最佳提取工艺为用70%的乙醇渗漉，渗漉速度为2 ml/min，浸泡时间5 d，川贝母粉碎成粗粉提取效果最佳。结论该工艺所制成品含量稳定。
【关键词】 咳安含片 正交实验 西贝碱 制备工艺
Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction technology of KeAn buccal tablets.MethodsAn orthogonal experimental design was adopted to optimize the technology for the extraction of the percolate .ResultsThe optimum conditions for the extraction technology were found to be: the concentration of ethanol was70%， the time for immersion of the drug was 5 days， 8 volumes of ethanol were used for the extraction of volume of the drug and the flow rate was 2 ml·min-1.ConclusionThe preparation with this technology is of high clarity and stable contents.
Key words：KeAn Buccal Tablet; Orthogonal test; Imperialine; Preparation technology
咳安含片是由川贝母、枇杷叶、桔梗、薄荷脑组成的方剂，其功能为清热宣肺、化痰止咳，主要用于感冒咳嗽及支气管炎。其制备工艺受多种因素影响，导致含片质量不稳定。为了更好地控制其质量，为制备工艺提供科学性依据，本文根据处方中川贝母的主要成分西贝碱含量为指标［1］，采用正交实验法对其提取工艺进行了系统考察，以筛选出最佳提取工艺。
1 仪器与试药
薄层扫描仪(TCL 瑞士CAMAG)；点样仪(瑞士)，Compa计算机(配CATS软件)， PBQ-I 型薄层自动铺板器(重庆南岸新力实验电器厂)；定量毛细管(美国)；250超声波清洗器(上海超声波仪器厂) 硅胶(青岛海洋化工厂)；西贝碱对照品（中国药品生物制品检定所），咳安含片（河南大学药物研究所）。
2 方法与结果
2.1 工艺正交实验选择乙醇浓度、渗漉速度、浸泡时间、药材粒度、乙醇用量5种因素进行考察，选用L8（2）7表安排实验，考查指标为西贝碱含量。因素水平见表1。
表1 因素水平（略）
2.2 咳安含片的制备按L8（2）7正交表设计的工艺条件，以处方比例称取各药材， 系取川贝母粉碎成粗粉，照流浸膏剂与浸膏剂项下的方法（附录IO），用乙醇作溶剂，浸渍后，缓缓渗漉，收集初漉液，另器保存，继续渗漉，俟可溶性成分完全漉出，续漉液浓缩至适量，加入初漉液，混合，继续浓缩成相对密度1.30~1.32（60~65℃测）的浸膏，减压干燥备用；将桔梗和枇杷叶加水煎煮两次，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度1.30~1.32（60~65℃测）的浸膏，减压干燥，与川贝母提取物粉碎成细粉，加甜蜜素、蔗糖等辅料。混匀，用50%乙醇制粒，干燥，整粒，加薄荷脑0.85 g，杏仁香精适量、硬脂酸镁混匀，压成1 000片。
2.3 含量测定
2.3.1 标准曲线制备精密吸取西贝碱对照溶液1，2，3，4，5 μl（每个量点两个点），分别点于同一硅胶G-CMC薄层板上，依法展开，显色，扫描测定，以点样量（μg）为横坐标，面积积分值为纵坐标，回归方程为Y=527.07X+47.27，r=0.999 8。结果表明，点样量0.26~1.60 μg内，点样量与面积积分值呈良好线性关系。因直线不通过0点，所以用外标二点法。
2.3.2 加样回收率实验精密称取已测得西贝碱含量的同一批样品5份，分别精密加入一定量西贝碱对照品，依法测定，计算西贝碱的平均回收率为95.60%，RSD为1.60%。
2.3.3 样品含量测定
供试品溶液的制备：取本品 60 g ，精密称定，研成细粉。取细粉30 g，精密称定，加氨水4 ml，精密加氯仿100 ml称定重量，超声处理30 min，放至室温，用氯仿补足重量，滤过，弃去初滤液，取续滤液50 ml，水浴蒸干，残渣加氯仿适量使溶解定容1 ml容量瓶中，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：精密称定西贝碱对照品一定量，加氯仿制成0.26m g/ml溶液，即得。
含量测定：精密吸取对照品溶液2 μl（点2个点）与5 μl（点2个点），供试品溶液10 μl（点2个点），分别交叉点于同一硅胶G-CMC薄层板上，同法展开，显色、扫描、测定并计算西贝碱的含量。结果见表2。
表2 正交实验设计及西贝碱的含量（略）
2.4 结果分析用正交实验的直观分析法进行分析，从R的大小可知：因素的主次顺序为A＞B＞C＞D＞E。因素E的极差小于第3空列的极差。所以可以认为因素E的极差是由实验误差造成的。为减少乙醇的用量，节约成本，E取E2，因ⅠA＞ⅡA ，ⅠB＞ⅡB ，ⅠC＞ⅡC，ⅠD＞ⅡD，所以A用A1， B用B1，C用C1，D用D1，即用70%的乙醇渗漉，渗漉速度为2 ml/min， 浸泡时间5 d，川贝母粉碎成粗粉提取效果最佳。
3 讨论
本实验采用正交实验法，以西贝碱含量为指标，对咳安含片的提取进行了优选，选出了最佳工艺，并进行重复试验，结果发现以优选工艺所制产品含量较稳定。川贝母生药中含有生物碱类物质，因此以测定西贝碱含量来控制本制剂质量，此方法简便、稳定、准确， 回收率为95.60%，RSD为1.60%， 可作为工艺研究和制剂质量控制依据。
【摘要】
目的优选超临界CO2萃取薤白挥发油成分的工艺条件。方法通过正交实验，以萃取的压力、温度、时间为主要因素，考察薤白挥发油的最佳提取工艺。结果最佳工艺为压力15 MPa，温度30 ℃，时间3 h，其挥发油得率为1.093 %，是水蒸气蒸馏法得率（0.296 %）的3.7倍。结论超临界萃取具有耗时少、效率高等优点，适合批量生产。
【关键词】 薤白； 挥发油； 超临界萃取； 正交实验
Abstract：ObjectiveTo choose the optimal extraction conditions from the volatile oils of Bulbus Allii Macrostemonis by supercritical carbon dioxide.MethodsThe orthogonal experiments were used to choose the optimal conditions，and the factors were pressure，temperature，time and the yield of extraction.ResultsThe optimal conditions:pressure 15 MPa，temperature 30℃ and time 3 hours.Under the above optimal conditions，the yield of the volatile oils was 1.093%，which was 3.7 times of the yield(0.296%) of stream distillation.ConclusionThe extraction by supercritical carbon dioxide has advantages such as high effect，short time etc.and it can be used in factory.
Key words：Bulbus Allii Macrostemonis; Volatile oils; Extraction by SFE-CO2; Orthogonal experiments
薤白为百合科葱属植物小根蒜Allium macrostemon Bunge或薤Allium chinese G．Don的干燥鳞茎，为常用的药食两用植物，主产于黑龙江、吉林、辽宁、河北、山东、湖北、四川、云南等地。其味苦、辛，性温，无毒，有温中通阳、理气宽胸、还阳散结之功效［1］。临床常用于胸闷刺痛、心痛彻背、泻痢后重、肺气喘急等疾病。薤白挥发油中主要为含硫化合物、含氮化合物、甾体皂苷等成分，能强烈抑制血小板聚集、防止动脉粥样硬化等，还具有抗癌活性［2］。据文献报道，瓜蒌薤白汤治疗冠心病、心绞痛总有效率达95.19 %；薤白胶丸治疗原发性高脂血症，能使血脂及过氧化脂质显著降低；应用薤白单味药对支气管哮喘的即时止喘疗效为57 %～78 ％。本实验采用正交实验法，以挥发油提取率为指标，优选冠脉通胶囊配方中主要成分之一的薤白的超临界CO2萃取工艺，为薤白挥发油的生产和应用提供实验依据。
1
仪器与试药
5＋1升超临界CO2萃取装置(四川德阳四创科技有限公司)；水蒸气蒸馏提取挥发油装置；FE130型药物粉碎机。所用试剂均为分析纯；CO2为食品级（峨眉山涌鑫气体公司提供）；薤白药材购自成都五块石药材市场，产地为云南，经本院宋良科副教授鉴定为百合科葱属植物小根蒜的干燥鳞茎，将薤白样品粉碎成粉末状，过40目筛，待用。
2
方法
2.1
水蒸气蒸馏提取称取薤白样品粉末250 g，置入2 000 ml圆底烧瓶中，加入1 200 ml超纯水，浸泡过夜，加热至微沸，保持此条件回流8 h，所得挥发油用乙醚收集，挥干乙醚后，称取挥发油质量，计算得率，并于具塞棕色玻璃瓶中密闭保存，待用。
2.2
超临界CO2萃取
2.2.1
正交实验设计根据预试结果，确定以挥发油提取率为指标，选择萃取压力(因素A)、温度(因素B)和时间(因素C)作为考察因素，每个因素设3个水平，进行L9(34)正交实验，因素水平表见表1。
表1 超临界萃取正交实验因素水平（略）
2.2.2 萃取方法取薤白样品粉末750 g，投入5 L萃取釜中，按表1中设定的工艺参数萃取，分离釜压力为5.5～6.0 MPa，温度与萃取釜相同，调节CO2流量为25.00 L/h，待萃取釜压力达到设定压力后，先静态萃取30 min，再动态萃取至设定时间。
3
结果
3.1
水蒸气蒸馏提取结果共做了3组薤百挥发油的水蒸气蒸馏实验，挥发油的收率分别为0.291 %，0.294 %和0.303 %，平均收率为0.296 %。
3.2
超临界萃取结果萃取结果见表2～3。可见，超临界萃取薤白挥发油的影响因素中，温度影响较其它两项显著，萃取时间的影响次之，萃取压力的影响最不显著。由此得出超临界萃取薤白挥发油的最佳工艺条件为A1B1C2，即萃取压力15 MPa，萃取温度30 ℃，萃取时间3 h。
表2 正交实验结果（略）
表3 方差分析（略）
3.3
验证实验按最佳工艺条件为A1B1C2，重复3次实验进行验证实验，挥发油得率平均值为1.093 ％，表明实验所确定的最佳工艺条件比较符合实际。
4
讨论
通过正交实验设计，优选出了CO2超临界萃取薤白挥发油的最佳工艺，与传统的水蒸气蒸馏法提取薤白挥发油相比较，后者工艺简单、成本低，但提取率相对也较低；前者虽提取率较高，因系统需高压操作，对仪器设备要求较高，故提取成本高，但由于其工艺条件温和(无高温及溶剂无毒)，溶剂回收处理非常简单、无残留（在萃取过程中的分离釜中完全分离，分离出的CO2还可以循环使用），萃取后的药材残渣性状基本无变化，对药材中其他成分破坏较少，可根据需要进一步处理。相对而言，超临界萃取提取工艺具有更大的优势，可为含薤白药材制剂的进一步开发利用提供参考依据。
【参考文献】
【摘要】目的 优选达肝清颗粒最佳的提取工艺。方法采用正交实验法，以人参皂苷Rg1含量及干膏率作为评价指标，筛选最佳的提取工艺。结果达肝清颗粒最佳提取工艺为：药材加10倍量水提取2次，1 h/次，第1次提取前先将药材浸泡1 h。结论优选出的达肝清颗粒的提取工艺稳定合理可行。
【关键词】达肝清颗粒； 提取工艺； 正交设计； 人参皂苷Rg1
病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的常见传染病，我国病毒性肝炎发病数位居法定管理传染病的第一位，仅慢性乙型肝炎病毒携带者就达1.3亿。慢性乙型肝炎病程迁延，如得不到及时的治疗，将会发展为肝硬化甚至肝癌，严重危害人类健康。达肝清颗粒原方系长期用于临床实践的经验方――达肝清汤剂。其由广西特色药材绞股蓝、三姐妹、黄根等7味药组成,具有清热解毒、益气健脾、利湿等功效。现代药理研究表明达肝清有保肝降酶、抗乙肝病毒、提高免疫功能、抗肝纤维化的作用。为了将达肝清汤剂更好地应用于临床上，广西中医学院研究开发出服用、携带方便的达肝清颗粒剂，并对其制备工艺进行了研究。现报道如下。
一、 仪器和材料
1、仪器与设备
RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）； Agilent1100（DAD、VWD）高效液相色谱仪； HB43水分测定仪（梅特勒-托利多中国地区）。
2 、 材料
绞股蓝、三姐妹（三叶香茶菜）、黄根等多味药材均购自南宁市日益旺中草药材经营部，经鉴定为正品。人参皂苷Rg1标准品购自中国药品生物制品检定所（批号：110703-200322）。
二、方法与结果
1 、考察指标的确定
达肝清颗粒处方中有多味药材，有效成分众多，因此以干膏率作为考察指标之一较全面合理，君药绞股蓝的主要有效成分为人参皂苷Rg1，故将人参皂苷Rg1作为考察指标。
2、考察指标的测定方法
1）干膏率的测定方法
按处方比例称取黄根、三姐妹等药材适量，共9份，根据L9(34)正交实验设计表，将药材浸泡适当时间后提取。提取完毕后浓缩到密度1.05 g/ml(60～70℃)，醇沉(水提液∶95%乙醇=1∶2，醇沉24 h)，弃去沉淀，得醇沉液，测量其体积，备用。将不同条件下的水提液分别浓缩至相对密度为1.20（65℃），称重。称取2 g，分别置于已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，并于105℃干燥至恒重，取出，置于干燥器中放置30 min，迅速精密称定干膏重量。
干膏率（%）=干膏重×浓缩液总重取样量×生药总量×100%
2）人参皂苷Rg1的测定方法
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水（20∶80）为流动相；检测波长为203 nm。柱温为35℃，流速为1 ml/min，理论塔板数按绿原酸峰计应不低于4 000。
对照品溶液的配制：精密称取人参皂苷Rg1适量，加甲醇溶解，制成每毫升含人参皂苷Rg1 2.03 mg的溶液，即得。
供试品溶液的配制：精密量取50 ml醇沉液放入蒸发皿中，水浴蒸干，加30 ml水溶解，用水饱和正丁醇萃取3次，30 ml/次，合并萃取液，再用氨试液(氨水∶水=1∶1.5)洗两次，40 ml/次，蒸干正丁醇，加适量甲醇溶解，将甲醇液移至10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。取部分溶液离心20 min（12 000 r/min），即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪测定其峰面积，计算人参皂苷Rg1含量。
3 、正交实验法优选提取工艺
1） 实验设计
选择对提取效果有重要影响的3个因素（加水量、提取时间、提取次数）作为考察因素，每个因素选取3个水平，编制4因素3水平表。
2）正交实验安排及结果
按处方的一定比例称取药材，根据L9(34)正交表安排，分别以干膏率、人参皂苷Rg1含量为考察指标进行试验。
从以上方差分析结果可以看出：以干膏率为评价指标时，A，B因素有显著性影响，影响因素顺序为：B> A > C，且A2，B2，C3最佳，所以最佳工艺为A2B2C3；以人参皂苷Rg1为评价指标时，B因素有显著性影响，影响因素顺序为：B>A>C；且A2，B2，C3最佳，所以最佳工艺为A2B2C3。综合比较上述结果，由于C因素各水平间的差异不显著，从实际生产节约时间和节约能源考虑，B因素选第2水平，A因素选第2水平， C因素选第2水平，即A2B2C2。即加10倍量水提取2次，1 h/次，第1次提取前先将药材浸泡1 h。
4 、 最佳提取工艺验证
为了进一步验证正交试验结果的准确性，以确保提取工艺合理可行，按上述工艺条件A2B2C2，重复安排3批试验。
三、讨论
采用正交设计，确定了水提工艺的最佳条件，即：即称取水提取部分药材，加入药材量10倍体积的水，加热提取两次，1 h/次。其中第1次提取前先将药材浸泡1 h。验证试验结果表明提取工艺稳定。
参考文献：
1、中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会. 病毒性肝炎防治方案［J］. 中华传染病杂志,2001,9(1):56.
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设计、改进实验是有明确目的的，那就是更好地发挥实验在化学教学中的作用，不是为“改”而改，也不是标新立异。因而，设计、改进实验必须遵循如下的原则：
（一）以教学大纲为依据，紧密结合教材内容
教学大纲是指导教学的纲领性文件，它规定了教学内容的范围和深度，实验的改进或增补，应是严格遵循大纲的要求，不能“超纲”，也不能随意降低标准。教材是教和学的依据，教材的编排循序渐进、衔接紧密，形成了完整的科学知识体系。实验的编排是这一知识体系的重要组成部分。因此，实验的设计与改进，应首先明确该实验在教材中的作用。增补是否有价值，是否有助于化学概念的形成，化学原理的说明，增补与改进均应在不违背教学大纲的要求，不违背教材编排科学性的前提下进行。同时实验安排的时机也应有机地溶入教材的整体之中。
（二）遵循实验教学自身的科学性、系统性
优秀的教材在实验教学编排上也应自成体系，有其自身的规律。如对仪器的认识、使用是由简到繁、渐次增多；各种实验基本技能的训练由教师示范到学生逐步掌握应有计划的安排；又如对学生观察、分析能力的培养也是循序渐进的；组织学生结合教材自己设计实验习题更应在有一定知识及技能积累的条件下进行。因此，进行实验设计与改进，必须遵循实验教学自身的规律性，违背了学生的认识规律，就会适得其反。例如，对初中化学的增补与改进实验，宜装置简单、原理涉及单一，操作简便，随着学生接触的实验多了，化学知识更丰富了，再逐步提高实验的综合性和复杂程度。
（三）实验的设计与改进，要有利于全面提高学生的素质
前面已经论述过，实验的目的，不仅在于知识的传授和实验技能的训练，其重要作用还在于全面提高学生的素质。目前课本上的大部分实验虽都经过长期教学实践的检验是行之有效的，但多数是验证性实验。而探索性实验是从发展学生思维能力出发，将实验变成学生创造性学习的手段。在教师的指导下，通过学生亲自探索新知、亲自实验，去认识化学概念和规律，有利于对学生进行科学方法的初步训练。为此，教师要精心设计实验教学过程，尽量设法提高每个实验的智力价值，使整个教学过程充满启发性、思考性。例如在初中可设计一组探究性实验使学生形成分子的概念及认识分子的性质。
（四）实验的设计与改进应考虑教学法的因素
实验的设计与改进应符合教学法的需要，应有利于调动学生的学习兴趣和积极性。例如，新课的讲授往往以单独的实验为宜，复习课则可设计，增补综合系列实验，以实验为线索引导学生进行复习，如卤素性质综合实验等。并进实验课的设计应注意如何把演示实验简化，使之仪器简单，需时少，易成功，无危险。一般一节课只应安排2～3个实验。
（五）力求仪器装置简单、效果明显、直观性强
实验现象应使全班学生都能观察到，仪器装置简化的目的是为了突出重点，便于观察。当简单性与直观性发生矛盾时，应服从直观性的需要。
（六）提高实验的成功率，改进需时较长的实验
演示实验是为配合课堂教学内容进行的，时间过长会影响知识的讲授。为保证实验在预定的时间内顺利完成，教师应探究实验原理，寻找最佳反应条件，研究反应物的数量关系和形态，考虑影响实验的各种因素。提高实验成功率，使实验准确及时完成，是实验改进的重要课题。
（七）确保安全，防止污染
中学化学涉及一些易燃、易爆、腐蚀性强及有毒气体逸出的实验。在实验教学中确保学生的安全，防止中毒及污染也是实验设计与改进的重要课题。这可从改进仪器装置，增加防护措施，提高实验技巧等多方面加以研究。
二、实验设计与改进的思路与方法
（一）革新设计思想，巧妙构思
实验的设计与改进，本身是一项研究，是一种创造。不墨守陈规，是革新与创造的精髓。因此，成功的实验设计与改进，来源于立意的创新、构思的巧妙。这就要求教师在明确化学反应原理的基础上，有较广博的知识，要熟悉化学、物理学、生物学等学科的实验方法，要了解国内外化学实验设计与改进的动态。下面介绍的几个实验是近年来中学化学实验改革的成果，都很有新意。
1．一氧化氮气体简易发生器
由于一氧化氮气体极易与空气中的氧气化合而生成红棕色的二氧化氮气体，学生难以从实验现象上直观地得出稀硝酸与铜反应生成无色一氧化氮气体的结论。而改进的一氧化氮气体简易发生器（图16），利用一氧化氮气体不溶于水的性质，用稀硝酸盛满整个试管而将空气排出，避免了生成的一氧化氮与空气中氧气接触的可能。并将一氧化氮的制备与性质实验融为一体，即可清楚地看出实验的主要产物：无色的一氧化氮气体和蓝色的硝酸铜溶液，打开橡皮管夹又可演示一氧化氮与氧气反应生成红棕色二氧化氮气体，同时避免了二氧化氮气体污染空气。这一实验改进，构思巧妙，装置简单，直观性强，具有新颖性。
2．一氧化碳还原氧化铜实验
用锥形瓶或集气瓶收集一瓶一氧化碳，将瓶口用胶塞塞紧。取粗铜丝打磨干净后绕成螺旋状并插入一个与瓶口合适的胶塞中。手持胶塞将铜丝加热，离开火焰后表面要确实看到生成黑色氧化铜，趁热插入瓶中，铜丝由黑色瞬间被还原成光亮的红色，可重复做2～5次，倒入石灰水，石灰水变混浊证明有二氧化碳生成。
这是对原教材中实验的改进，仪器装置简单，操作方便，效果明显，易于观察，且减少了一氧化碳的逸出。
3．吸氧腐蚀实验
本实验为增补课本实验空白而设计。可使学生直观形象地看到吸氧腐蚀有电流产生，是电化腐蚀，加强对吸氧腐蚀机理的认识。
实验装置如图17，将废钢锯条用砂纸打亮，从中间折断，溶液呈微酸性，pH值为6。
实验时，每从导管鼓入一次空气流，即可看到电流计指针发生一次明显的摆动。此实验装置简单，材料易得，操作方便省时，现象明显，并可连续使用。
4．焰色反应效果改进实验
碱金属元素的焰色反应实验，现行教材是用铂丝蘸取检测液在酒精灯上灼烧观察。由于铂丝蘸取溶液很少，焰色反应很快消失，学生不易看清，特别是用蓝色钴玻璃观察钾更困难。
若改用同时点多盏焰色反应灯，能长时间观察金属的焰色反应。可废物利用将青霉素药瓶制作成焰色反应灯。由于酒精灯用乙醇做燃料，而乙醇火焰带黄色，对焰色有严重干扰。将燃料由乙醇改为甲醇，在灯芯上撒放少许粉状检测物，再用深色竖板做背景衬底，点燃灯芯，可观察到鲜明的被测元素焰色反应。
用滴管往小瓶内加入甲醇溶液不超过2／3容积，放入灯芯即可使用。由于点灯法增大了火焰的可见度，用甲醇做燃料，大大降低了对焰色反应的严重干扰，即使观察钾的焰色也不必用钴玻璃。灯芯上添加检测物后，可以保持较长时间使用。小瓶上要贴有标签，并设置瓶盖（可用眼药瓶底部）。
（二）采用其它学科的实验仪器和方法
当代科学技术的发展，使得新知识，新技术不断涌现，各学科之间相互渗透，相互促进成为科技进步的明显特征之一。化学实验也不再是传统的自我封闭的体系。一些其它学科仪器和电子元器件已成为广泛通用和普及的了。根据化学实验设计与改进的原则和方向，引入一些新的仪器或电子元器件，对革新实验往往会收到事半功倍的效果。下面的一些实例，也出自各地教师的研究成果。
1．化学实验中发光二极管、三极管、音乐集成块、压电陶瓷发声器等的应用
半导体发光二极管是一种将电能转化为光能的电子器件，具有耗电省及灵敏度高的特点，利用若干发光二极管和小功率晶体管可制作简单的直流放大电路。利用输入电压的变化，经放大后，能使不同数的发光二极管依次发光。用此装置可证明不同溶液导电能力的差异。由于不同溶液导电能力不同，输入电压也将发生相应变化，此时发光二极管发光的个数也不同，直观形象地说明了溶液导电能力的差异。
“水的电离度受温度影响实验”，“金属活泼性实验”，“氢氧化钡溶液和稀硫酸溶液的中和反应”等实验均可运用上述装置。目前，各地推荐的实验改进、教具改革成果中，很多项目使用发光二极管、三极管等电子器件。这不仅使实验现象直观、鲜明，也开拓了学生的思路。
2．利用投影器做化学投影实验
在简单装置中进行的化学实验一般都可以利用投影器投影。实验现象被投影放大后，使一些只有细微变化的现象，变得易于观察，使远离演示台的学生也能看清。由于投影实验只需在较小的器皿内进行，还可以节约药品。实验投影的方式分为竖直投影和水平投影两种。竖直投影时，银幕上得到的影像是侧视实验的效果；而水平投影时，银幕上得到的影象是俯视实验时的效果，教师可根据所做实验在观察上的要求来设计投影的方式。水平投影一般在结晶皿内进行，如金属钠与水反应、电解铜等实验均能得到较好的效果。竖直投影实验，一般在扁平投影反应槽内进行，可用于金属活动性比较、原电池、胶体电泳等实验。
（三）从探索最佳反应条件上改进实验
实验的研究与改进，一种是新的构思、新的设计，另一种则是对原教材中那些反应条件不易掌握，反应时间较长，效果不明显的实验加以改进，使之更适合教学需要。这还包括原教材中的实验设计无可挑剔，但结合本校具体条件做起来不尽理想的。在不改变原设计构思的情况下，研究的方向主要是探索最佳的反应条件，因为化学反应的发生与进行是受到多种因素制约的，首先是决定于反应物的组成、结构、性质与相互间的作用，其次还要受到外界多种因素与实验程序的影响。因此，化学反应条件的研究与控制是实验成败的关键之一。影响化学反应的速度与程度和实验现象的鲜明与准确的客观因素是众多的。常见的客观条件有反应物的浓度、用量的配比、纯度、温度，反应物间的接触面积，反应体系的压强、温度、光照及溶剂，反应介质的pH值，实验的程序，电化学反应所需要的电流强度与电压等等。这方面的研究与探索对提高实验教学质量具有十分现实的意义。
1．木炭还原氧化铜实验反应条件的研究
为得到光泽性好的块状金属铜是改进本实验的目的，关键在于研究最佳反应条件。
首先要解决的是木炭和氧化铜的用量比，理论上，木炭与氧化铜的质量比是1∶13．3。但若按此量，木炭的用量实际上会不足，因为试管中的空气会消耗一定量木炭。因而木炭用量要比理论值偏高，实验证明，木炭与氧化铜质量比以1∶10至1∶12为宜。反应物的总量也会影响实验效果，太多、太少均不好，如用15×150mm的试管以1.6克为宜。反应物颗粒要细，混合均匀，适度压实，使颗粒间紧密接触，目的是增大反应物的接触面。另一课题是研究反应温度及灯具，由于本实验是固相反应，要求使用高温灯加热，最宜控制掌握的是使用加铁纱网罩的大火酒精灯，还要考虑此反应是放热反应，当反应物开始发红，猛烈燃烧时应及时撤走酒精灯，便于观察反应继续进行直至反应完全。
2．利用正交试验设计法研究反应最佳条件
当原实验给定的条件不详，效果较差又无文献可查时，应利用正交试验设计法进行研究。正交试验设计法，简称正交法，它利用正交表来安排试验。对那些受诸因素影响的实验，要想获得最佳反应条件，如果盲目试验，不仅增加试验次数，延长周期，造成人力物力的浪费，有时还会因试验次数多得惊人以致无法进行。使用正交法能从众多的不同条件搭配中，选出少量的最具“代表性”的试验，并能对影响试验结果的各个因素的重要程度给予定量的估计。正交法是一种科学方法，一项科学试验要想达到预期的目的，除了正确的指导思想外，采用科学方法也是试验成败的关键。
（四）采用代用品，自己动手设计制作简单的专用仪器
由于学校条件，实验室设备及经费的限制，使部分学校不能按质按量完成教材规定的实验教学内容。为解决这一问题，因地制宜采用代用品，自己动手设计制作简单的仪器，是一项大有作为的研究课题。现举几例说明。
1．用红磷做“自燃”实验
白磷剧毒，易燃，一般中学不具备保存条件。但若将一般实验室中易得到的红磷转化成白磷做自燃实验，不但补足了教材中应做的实验，还扩展了学生的知识面。
取红磷2克装入大试管中，把10厘米长的滤纸条卷成螺旋状装入试管中，配上有直角导管的胶塞，并将导管插入盛有水的试管中。加热红磷，红磷升华为磷蒸气，被滤纸吸附。停止加热，换上无孔胶塞（此时红磷已转化为白磷），待用。实验时，用镊子夹出纸条，白磷遇空气即燃。
2．为引出催化剂概念而设计的实验装置
原教材中为引出催化剂概念而设计了三个实验，很费时间。现在用一个自制的简单仪器，可使三个实验用一个连续的实验代替。
仪器如图18。A为自制弯曲试管，B为氯酸钾，C为二氧化锰。实验时，首先加热二氧化锰，检验无氧气放出。再加热氯酸钾至熔化，有氧气放出。移开火焰，使试管直立，二氧化锰落入加热的氯酸钾中，检验有氧气迅速放出。此实验由于简洁，有利于概念的引出，已被选入北京市的新编教材中。
3．二氧化碳比空气重的实验
用托盘天平称量实验备用的烧杯的质量后，把集气瓶中的二氧化碳慢慢地向烧杯里倾倒，让学生观看天平指针发生偏移。这一实验由于种种原因往往不易成功。分析原因，有时是由于实验室的天平被腐蚀而不够灵敏所致；称量与感量不匹配等。如用250毫升烧杯称量二氧化碳和空气，其质量差是0.1705克，如果用感量0.2克的天平则指示不出明显变化，所以应当用再大一些的容器。再有集气瓶的体积也应与烧杯的体积相匹配，集气瓶的体积应等于或大于烧杯的体积，容器是否干燥也很重要。为了提高演示成功率，可改成一种自制天平。将悬有两个纸袋的杠杆支架起来并保持平衡，将其悬挂在铁架台上。用大烧杯收集满二氧化碳，然后将二氧化碳慢慢倾注到一端的纸袋里。杠杆失去平衡时，再向另一端的纸袋里倒入二氧化碳，杠杆又恢复平衡。本着就地取材，因陋就简的精神，可制作多种实用的仪器。如用废牛皮纸信封做成漏斗，再涂以蜡或树脂涂料实用且不易摔碎。用易拉罐，有机玻璃、泡沫板，聚光电珠等制作高亮度丁达尔现象实验器，实验现象十分明显；用135胶卷暗盒制作的酒精灯增温护焰罩，能使酒精充分燃烧，焰高是原来的1．5～2倍，处于半气化状态，加罩的酒精灯适用于木炭还原氧化铜、甲烷制取、焰色反应等高温实验。其它一些代用品或废弃物如输液管、塑料瓶等均可派上用场。
4．液封除毒气化学仪器的自制