时间：2023-06-02 09:57:21
开篇：写作不仅是一种记录，更是一种创造，它让我们能够捕捉那些稍纵即逝的灵感，将它们永久地定格在纸上。下面是小编精心整理的12篇核酸检测方法，希望这些内容能成为您创作过程中的良师益友，陪伴您不断探索和进步。
关键词：禽流感病毒；H5N1；多重RT-PCR；检测
中图分类号：S854.43 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2013）04-0005-03
高致病性禽流感是一种严重危害养禽业发展的烈性传染病，被OIE列为必须通报的传染病[1]。禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）属于正粘病毒科A型流感病毒属，AIV除了可感染禽类外，部分亚型还可感染人、猪、马等。AIV基因组由包括基质蛋白（M）基因、血凝素（HA）基因和神经氨酸酶（NA）基因在内的8个负链单股RN断组成，其中M基因组序列高度保守，HA基因组变异性最强，NA基因组变异次之。HA基因和NA基因某些位点的变异可导致不同的HA亚型和NA亚型[1]，目前发现AIV有16个HA亚型和10个NA亚型，其中H5、H7亚型常表现为高致病性，除了给养禽业带来严重经济损失外[2]，还可感染人，甚至导致死亡[3]。目前，病毒分离、血清学试验仍是诊断AI和对AIV进行定型普遍采用的方法，但病毒分离不仅操作繁琐、复杂和耗时，难以对AI进行快速诊断，还存在潜在散毒的危险。PCR方法是一种基因体外扩增技术，可以在数小时内对某片断基因扩大数百万倍。该技术具有特异性强、敏感性高、检测快速等特点，已广泛应用于生物学、医学、兽医学的各个领域。多重分型PCR是一种特殊PCR形式，其最突出的特点是一次反应可以达到既分型又能够鉴定亚型的目的，在A、B、C三种流感及其他病源混合感染的鉴别诊断上具有独特优势和很高的实用价值[4，5]。根据RT-PCR技术的原理，研究建立了鉴定H5、N1、M1的多重RT-PCR分型技术。
1 材料与方法
1.1 试验用材料
AIV H5N1抗原，购自哈尔滨维科生物技术开发公司；AIV H6N2、H9N2病毒以及新城疫病毒Lasota疫苗株（NDV）、鸡减蛋综合征病毒（EDSV）和传染性支气管炎病毒（IBV），本室留存。
1.2 生化试剂
Ex-Taq E、dNTP （25 mol/L，内含Mg2+）、RNA酶抑制剂、反转录酶AMV、10×PCR buffer以及 DNA Marker DL2000 均购自宝生物工程（大连）有限公司；RNA提取液购自科登生物工程有限公司；0.1% DEPC水由本室自制；二甲基亚砜购自上海生工生物工程有限公司。
1.3 引物设计及合成
参考基因库中禽流感病毒M基因、HA基因和NA基因序列，经Clustalx序列软件比对后，选择在保守区域用Primer Primer5.0软件设计了3对引物（表1）上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
1.4 病毒RNA的提取
（1）1.5 mL离心管中加入120 μL RNA提取液和120 μL样品，混匀，室温放置5 min。
（2）加入120 μL -20℃预冷的氯仿，混匀，室温放置3 min。
（3）12 000 r/min， 4 ℃离心5 min，取上清120 μL于另一离心管中，加120 μL -20℃预冷异丙醇，室温放置5 min。
（4）12 000 r/min， 4 ℃离心10 min，弃上清，加入600 μL -20 ℃预冷75%乙醇，上下颠倒，12 000 r/min， 4 ℃离心5 min，弃上清。室温放置约3 min近干燥。
（5）加20 μL 0.1% DEPC处理过的水溶解沉淀RNA，-20 ℃保存备用。
1.5 多重RT-PCR
采用总体积为50 μL的多重PCR反应体系，即10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP混合液5 μL，40 U/μL的Rnase Inhibitor 1 μL，5 U/μL的Taq E 1 μL，反转录酶（AMV）1 μL，二甲基亚砜3 μL，10 pM/μL的 M1、N1、H5基因的上下游引物各0.5 μL，提取的病毒RNA模板1 μL，最后加0.1% DEPC处理过的水补足至50 μL。振荡离心混匀后，在PCR仪上设定程序进行扩增，通过对反转录条件及多重PCR变性、退火、延伸的温度和时间以及循环次数等的优化，最终确定其反应参数为50 ℃反转录30 min，94 ℃预变性2 min后，进入94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共循环35次，然后72 ℃延伸8 min，于12 ℃结束多重PCR扩增。
1.6 PCR产物分析
取7 μL多重PCR产物与2 μL Loading Buffer上样缓冲液混合，在1.5%琼脂糖凝胶上以100 V电压进行电泳28 min，然后置数码凝胶系统观察拍照，分析记录结果。
回收、纯化229、380、878 bp的cDNA扩增片段，送上海生工生物工程有限公司进行测序，并用DNAStar基因分析软件分析测序结果。
1.7 H5N1多重RT-PCR 敏感性试验
用建立的多重RT-PCR 反应体系对10倍系列稀释的禽流感H5N1抗原进行检测，检验该体系对各稀释度抗原模板的敏感度。
1.8 委托样本的检测
用建立的多重RT-PCR 反应体系对5份已知AIV H9样本、1份已知AIV H6样本和360份禽咽肛拭子盲样进行检测，与出口检疫正式采用的荧光RT-PCR检测方法比较。
2 结果
2.1 多重RT-PCR特异性试验
经多重RT-PCR扩增，其产物与DNA分子量标准比较，显示H5N1抗原扩增出380、878、229 bp3条带，而H6N2、H9N2病毒仅扩增出M1cDNA1条带，NDV、IBV、EDSV则无条带呈阴性，与理论预期值一致（图1）。
2.2 H5N1多重RT-PCR敏感性试验
对禽流感H5抗原做HA试验，病毒滴度为1：256。抗原分别做10倍系列稀释，10-1、10-2、10-3倍抗原稀释液多重RT-PCR检测结果阳性；抗原做10-4及以上倍数稀释，多重RT-PCR检测结果阴性。敏感度试验表明，多重RT-PCR 对抗原的最低检测稀释度为10-3，是一种较为灵敏的检测方法（图2）。
2.3 委托样本的检测
5份已知AIV H9样本、1份已知AIV H6样本检测结果显示，仅扩增出229 bp M1cDNA1条带，360份禽咽肛拭子样本则无条带呈阴性，与荧光RT-PCR 方法检测结果一致，符合率达100%，说明该多重RT-PCR方法可以用于基层动物防疫和监督部门的检测。
3 讨论
AIV H5亚型不仅感染家禽，引起大批死亡，造成严重的经济损失，还可感染其他动物和人，有重要的公共卫生意义。传统的病毒分离和血清学试验无法对流行的AIV亚型进行快速检测鉴别。本试验根据AIV 基因易变异的特性及多重分型PCR引物设计原则，参考基因库中AIV HA基因、NA基因和M基因序列，分别针对H5、N1和M1基因设计了3对特异性引物，其中M1（S，A）是A型流感的通用引物。而H5、N1为分别针对H5、N1亚型的特异性引物，能够分别特异性地检测相对应的亚型。利用这3对引物，通过对多重RT-PCR扩增条件的优化，建立了快速检测鉴定AIV H5亚型的多重RT-PCR分型技术。
该多重RT-PCR分型方法检测结果显示，AIV H5N1在380、878、229 bp位置同时出现3条cDNA扩增带，而H6N2、H9N2病毒仅扩增出M1 cDNA 1条带，传染性支气管炎病毒、新城疫Lasota疫苗株（NDV）和减蛋综合征病毒则呈阴性。多重RT-PCR 敏感性试验结果表明，H5N1抗原最低检测稀释度为10-3。H5亚型特异性试验结果表明，仅H5呈阳性，其他H6、H9亚型和NDV、IBV、EDSV均呈阴性。对所扩增片段进行回收、纯化并测序，其测序结果经DNAStar基因分析软件分析，这些片段分别与AIV HA基因、NA基因和M基因有着高度同源性，提示这些扩增基因的序列与原参考序列的基因来源一致，即分别来源于AIV的H5亚型HA基因、NA基因和M基因，表明该多重RT-PCR分型方法具有高度特异性。
同时，该多重RT-PCR分型法不需要进行多次PCR扩增，在数小时内就可完成对AIV H5亚型的快速检测鉴别，能够在分型同时一步鉴定到亚型，达到快速诊断和鉴别AIV的双重目的，对及时有效控制AIV感染有重要意义，对AIV H5亚型感染制定有效的防制措施具有实用价值和指导意义。
参考文献：
[1] SENNE D A， PANIGRAHY B， kAWAOKA Y， et al. Survey of the hemagglutinin（HA） cleavage site sequence of H5 and H7 avian influenza viruses： amino acid sequence at the HA cleavage site as a marker of pathogenicity potential[J]. Avian Dis， 1996， 40：425-437.
[2] ALEXANDER D J.A review of avian influenza in different bird species[J]. Vet Microbiol， 2000， 74：3-13.
[3] HIEN T T， LIEM NT， DUNG NT， et al. Avian influenza A（H5N1） in 10 patients in Vietnam[J]. NEngl JMed， 2004， 350：1179-1188.
关键词：猪传染性胃肠炎；病毒分子；生物学检测方法
中图分类号 S858.28 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）12- 0110-02
猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）导致猪出现脱水、水样腹泻以及呕吐等为主要临床症状的高度传染性疾病，该病在春季、初秋以及冬季具有较高的发病率[1]。猪传染性胃肠炎最早发生于美国，随后在世界各地均有发生，我国于20世纪50年代首次发现该病，目前全国大部分地区均发生过猪传染性胃肠炎。不同日龄和品种的猪均可以感染传染性胃肠炎，其中以15日龄左右的仔猪发病后死亡率最高，高达100%；5周龄以上的仔猪感染传染性胃肠炎后死亡率较低，但是会影响仔猪后期的生长，降低仔猪的饲料利用率。目前，该病已被世界动物卫生组织列为B类必检传染性疾病。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，该技术已经广泛用于各种细菌性和病毒性疾病的检测[2]。本文综述了分子生物学技术在传染性胃肠炎中的应用，以期能为从事传染性胃肠炎诊断和防控的工作者提供帮助。
1 传染性胃肠炎病毒基因组结构和基因表达方式
1.1 TGEV基因组结构 传染性胃肠炎病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，该病毒的基因组不分节段、单股正股RNA，具有高度传染性。传染性胃肠炎基因组全序列分为7个区29kb，结构序列为5'-la-lb-S-3a-3b-sM-M-N-7-3'，并且该基因组的3'-末端以共价键结合的poly结构，5'末端有帽结构[3]。基因组1约有20kb，主要负责病毒的编码，其余基因均在近3'端。传染性胃肠炎病毒全基因组编码由4种结构蛋白和3种非结构蛋白组成，其中基因7、基因3和基因1为非结构蛋白，N、M、sM、S为传染性胃肠炎的结构蛋白。
1.2 基因表达方式 传染性胃肠炎病毒在胞浆脱壳以后，其正链RNA就呈现了mRNA的功能，使基因1转录表达RNA聚合酶，同时该基因有作为模板合成负链RNA，进而亲代RNA与负链RNA形成双链复制中间体。因此，在感染传染性胃肠炎病毒的细胞内，可以检测出不完全RNA、基因组RNA、mRNA以及双链中间体4个特异性RNA，这可以作为猪传染性胃肠炎病毒分子生物学检测指标之一[4]。
2 结构蛋白及功能
猪传染性胃肠炎病毒的结构蛋白主要为S糖蛋白、M蛋白、N蛋白以及sM蛋白等。S蛋白是猪传染性胃肠炎病毒纤突的主要成分之一，在病毒粒子的表面，该蛋白基因全长4.3kb，蛋白分子量为195～220ku；S蛋白不仅是决定猪传染性胃肠炎病毒抗原的重要结构，也影响着病毒对细胞的致病性、亲嗜性等。M蛋白是构成病毒粒子蛋白的主要有效成分之一，研究表明[5]，M蛋白前体是由膜外区、信号肽、极性区、跨膜区突于病毒粒子内C-端区等功能区域构成，分子质量为29～31ku；M蛋白不仅决定了病毒粒子的出芽位点和装配位点，也可以影响病毒变异。N蛋白是一种酸性蛋白质，分子量为47KDa，含有382个氨基酸残基，该蛋白不仅是猪传染性胃肠炎病毒的结构蛋白，同时对病毒基因组的加工、复制都具有重要作用。sM蛋白分子质量为78ku，含有1种小膜蛋白和82个氨基酸残基，该功能蛋白在抗猪传染性胃肠炎病毒感染的体液和细胞免疫中具有重要作用。
3 分子生物学检测方法
3.1 核酸探针 核酸探针检测方法的基本原理是利用核苷酸碱基互补，在碱基互补过程中，采用标记物标记与被检测靶序列互补的单链核酸分子，进而检测到目的核序列。该检测方法与扫描电镜、荧光抗体试验、病毒分离等相比，具有较好的特异性，并且可以实现快速检测的目的。现代研究表明[6]，不同的病毒探针可以分别扩增出与其对应的病毒模板，对其他病毒模板影响不大，同时核酸探针扩增的最低检测限为3 000～6 000个拷贝的单个病毒核酸，具有较高的特异性和敏感性。
3.2 普通RT-PCR方法 该检测方法使用的首要条件是知道被检测病原的相关目的基因序列，根据相关目的序列后，采用相关软件设计相应的引物，然后进行体外扩增目的基因，进而达到检测的目的。王黎等[7]采用RT-PCR方法检测猪传染性胃肠炎病毒，并采用相同浓度做重复性检测，结果显示RT-PCR扩增的特异性条带为590bp左右；然后又以猪瘟病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒以及猪轮状病毒做特异性试验，结果显示仅有猪传染性胃肠炎病毒得到了特异性目的条带，所以RT-PCR检测方法对猪传染性胃肠炎病毒检测具有较好的重复性和特异性。
3.3 多重RT-PCR方法 多重RT-PCR检测方法是以普通PCR为基础发展的一种新型检测方法，该检测方法可以在一个PCR反应体系中加入多对引物，并通过采用优化后的PCR反应条件，达到同时检测多种病原的目的，具有快速、成本低等优点，目前也常用于各种疾病的诊断。霍金耀等[8]建立了多重RT-PCR法检测传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、嵴病毒和A群轮状病毒的方法，并对该检测方法进行了敏感性试验和特异性试验，结果显示，多重RT-PCR法可以检测出50TCID50的混合病毒，且能扩增出长度为275bp、544bp、750bp的3条特异性片段，具有较高的特异性和敏感性，可以在临床上推广使用。
3.4 套式PCR方法 套式PCR方法需要设计内、外2对引物，并通过2次扩增对样品进行检测，该方法相对其他PCR检测方法，具有较高的敏感性，且节约成本。现代研究表明，PCR技术在检测病毒时，可以省略不同病毒分离的过程，具有较高的敏感性和特异性，而套式PCR方法在病毒粒子较少的情况下依然能够检测出，表明套式PCR比常规PCR具有更好的敏感性。沈海娥等[9]采用套式PCR检测猪呼吸道冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒的S基因序列，根据两组病毒的基因序列分别设计了2对引物，然后分别以猪呼吸道冠状病毒细胞和猪传染性胃肠炎病毒细胞为模板进行套式PCR特异性片段扩增，结果显示，猪呼吸道冠状病毒扩增的基因片段为214bp，猪传染性胃肠炎病毒扩增的基因片段为886bp，同时检测出了这种病毒，具有较高的特异性和敏感性。
3.5 荧光定量RT-PCR方法 荧光定量RT-PCR检测方法的原理是在PCR反应体系中采用荧光探针标记法或加入了SYBR GreenI荧光染料标记PCR的反应产物，然后使用反应仪器收集反应产物的荧光信号，并根据荧光信号的强弱确定产物的量，进而达到与起始模板准确定量的目的。该检测方法与常规RT-PCR相比，不需要进行电泳试验检测PCR反应产物，反应结果更为直观、方便，同时又避免了因电泳试验对环境造成污染。王建中等[10]根据猪传染性胃肠炎病病毒的S基因序列设计了引物，并通过多组试验对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化，结果显示，优化后的检测方法对其他病原的检测结果均为阴性，检测结果的敏感性高达43.07拷贝/μL，是常规PCR检测方法的100倍，具有较高的敏感性和特异性。
3.6 环介导等温扩增技术 环介导等温扩增技术是近几年新兴的一种分子生物学检测方法，因其具有特异性强、敏感性高、检测速度以及操作简单等优点，目前已经广泛应用于病毒病和细菌病检测。高睿泽等[11]根据猪传染性胃肠炎病毒的N基因建立了环介导等温扩增快速检测方法，并对该检测方法的敏感性和特异性进行了评价，结果显示，该方法在63℃下可以使猪传染性胃肠炎病毒N基因获得较高的特异性扩增，且与猪流行性腹泻病毒等物交叉反应，具有加高的特异性；同时该检测方法可以检测到131.4fg/μL的DNA，其灵敏度比常规PCR高出3个数量级。
参考文献
[1]王文秀，王善辉，沈志强，等.猪传染性胃肠炎病原学检测方法的研究进展[C]//2012第四届中国兽药大会论文集.2012：90-92.
[2]刘邓，袁秀芳，徐丽华，等.猪传染性胃肠炎诊断技术研究进展[J].动物医学进展，2008，29（12）：64-68.
[3]霍芳，宋道祯，汤少伟，等.猪传染性胃肠炎病毒诊断技术研究进展[J].饲料与畜牧・规模养猪，2014，（2）：30-33.
[4]董加才.猪胃肠炎病毒的分离鉴定及S基因的克隆、序列分析与原核表达[D].郑州：河南农业大学，2008.
[5]闫贵伟，库旭钢，陈淑华，等.猪乳汁中抗猪传染性胃肠炎病毒IgA抗体间接ELISA检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2015，37（1）：31-34.
[6]陈伯祥，杨明，郭慧琳，等.猪传染性胃肠炎间接ELISA检测方法建立[J].中国农业信息（上半月），2012，（1）：167-168.
[7]王黎，李碧，周远成，等.猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J].中国兽医学报，2015，35（2）：190-194.
[8]霍金耀，郑逢梅，陈陆，等.猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、A群轮状病毒和嵴病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J].中国兽医学报，2013，33（12）：1792-1797.
[9]沈海娥，郭福生，龚振华，等.应用套式PCR检测和区分猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的试验[J].中国动物检疫，2003，20（7）：21-23.
[10]王建中.猪传染性胃肠炎病毒S基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国畜牧兽医，2014，41（1）：66-71.
关键词：食品安全；现代检测技术；食品检测
1引言
近年来，食品安全问题逐渐成为全球关注的焦点之一。危及人类健康和生命安全的重大食品安全事件屡屡发生，从欧州的疯牛病、二恶英到我国的苏丹红、瘦肉精和三聚氰胺等令人防不胜防。新技术的发展、农用化学品的滥用，养殖业的不规范用药以及环境的污染等都是造成食品安全问题的原因，因此加强食品安全检测是解决食品安全的重要措施。传统的食品检测方法已不能满足人们对食品安全的需求，因此，新的检测技术应运而生。现代食品检测技术主要通过仪器分析、分子生物学等方式对食品进行科学检测，能够对食品中含有的有害物质、微生物及食品转基因等问题进行检测，从而及时采取合理措施对问题食品进行处理，保障社会中食品使用的安全。
2现代检测技术
2.1荧光定量PCR检测技术
荧光定量PCR检测技术是在常规PCR的基础上运用荧光共振能量转移技术，把核酸扩增、杂交、检测等技术结合在一起，在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的量，据此计算待检样品中目的基因的拷贝数。荧光定量PCR标记的方法由最初单一的染料法，发展到特异性更高的探针法。
荧光定量PCR技术自产生以来，经过不断的发展完善，已广泛应用于食品中致病微生物的检测。李光伟等[1]采用沙门氏菌fimY基因序列，设计特异引物和探针，建立了检测食品中沙门氏菌的荧光定量PCR检测方法。胡建华等[2]根据GenBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物，筛选合适的DNA 模板制备方法，以荧光定量PCR检测方法与常规PCR检测方法结合，检测培养液和牛奶阳性样品中的志贺菌目。
同时，荧光定量PCR技术是检测转基因食品最可靠、最快捷的方法，基于转基因特异DN段的荧光定量PCR筛选方法已被一些国家作为相关食品法规的标准检测方法。吴志毅等[3]采用普通PCR法和荧光定量PCR法对Bt63转基因大米的检测灵敏度进行对比研究。根据大米内源蔗糖磷酸合成酶基因SPS和结构特异性基因Btc的基因序列，选用特异性的引物和探针进行研究，经验证试验表明具有专一性，能用于品系鉴定。在灵敏度试验中，阳性转基因大米按照不同质量百分比进行梯度稀释，提取DNA进行PCR扩增。结果表明：普通PCR检测的灵敏度在0.1%左右，而荧光定量PCR检测的灵敏度为0.01%，是普通PCR检测的10倍以上。
2.2核酸探针检测技术
核酸探针检测技术的原理是碱基配对、互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品定基因序列的检测。每一种病原体都有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断及食品安全等研究，该技术具有特异性好、灵敏度高的优点。
在食品检测中，核酸探针检测技术主要用于致病性病原菌的检测。核酸探针可用于检测任何特定的病原微生物，并能鉴别密切相关的毒株，因此可广泛应用于进出口动物性食品的检验，包括沙门氏菌、弯杆菌、轮状病毒、狂犬病毒等多种病原体[4]。但核酸探针技术在实际应用中仍存在一些问题，如放射性同位素标记的核酸探针半衰期短，对人体有危害，操作技术复杂，使用费高等缺点，所以多作为实验室诊断手段。
2.3酶联免疫吸附技术
ELISA是一种把抗原和抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的检测技术。基本原理是，使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。
ELISA已广泛应用于食品安全检测的各个领域。在致病微生物检测方面姚斐等[5]用间接ELISA可快速有效检测出活的非可培养状态的大肠杆菌O157：H7。此外，采用Dot-ELISA检测沙门氏菌，耗时短，比传统方法快4～6d，这都表明了ELISA可以快速的检测出食品中的致病微生物。
在农药残留检测方面，余向阳等[6]以辣根过氧化物酶对兔抗拟除虫菊酯类农药抗体进行标记，建立了检测蔬菜中多种拟除虫菊酯类农药的直接竞争抑制ELISA方法，用该方法对南京市场107个样品检测的阳性检出率明显高于气相色谱法。贺亮[6]建立了直接竞争ELISA检测磺胺二甲嘧啶残留方法，该方法最小检出量为1.97ng/mL，检测范围5～200ng/mL。现已开发的商业化酶联免疫ELISA检测试剂盒，可快速定性、定量检测动物组织、鸡蛋、蜂蜜、牛奶、血清等样品中磺胺间甲氧嘧啶（SMM）、磺胺嘧啶（SD或SDZ）、磺胺甲恶唑（SMZ）、磺胺噻唑（ST）药物的残留量。
ELISA已用于检测食品中毒素。黄曲霉毒素是一种致癌性很强的真菌毒素，各国都严格限制其在食品中的含量，其中B1的毒性最强。蒋建云等[7]利用ELISA法的AFB1试剂盒，通过抗黄曲霉毒素B1抗体与酶标抗原、待测抗原的竞争免疫反应以及酶的催化显色反应相结合来检测黄曲霉毒素B1的含量。该方法具有分析速度快，提取和纯化步骤简便，准确度高、成本低、污染少，一次可测定大批量标本等优点。
2.4高效液相色谱～质谱连用技术
HPLC-MS技术是将液相色谱与质谱串联成为一个整机使用的检测技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在食品安全检测领域得到了广泛的应用。
HPLC-MS技术在食品安全方面的应用主要集中在食品中农药、兽药残留和非法添加物的检测。王凤池[8]建立了通过固相萃取（SPE）-HPLC-MS/MS技术同时测定肠衣品中8种硝基咪哇类药物残留量的方法。样品经乙酸乙醋提取，经SCX固相萃取柱净化后，通过HPLC-MS/MS测定，8种分析物在0.1、0.5和1μg/kg 3个水平的回收率在87.3%～117%之间，重复性在3.35%～10.1%，8种分析物的检出限为0.049～0.083μg/kg。黄芳等[9]建立了食品中三聚氰胺的高效液相色谱-质谱测定方法，用Kromasil C18 柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为5%乙腈：95%水（含0.1%甲酸），采用正离子模式的电喷雾质谱检测，线性范围为0.01～0.5mg/L，检出限0.01mg/L，回收率为80%～99%。
2.5近红外光谱技术
现代近红外光谱技术是将光谱测量技术、计算机技术、化学计量学技术与基础测试技术有机结合，以无损检测为优势的分析技术。近红外光是介于可见光和中红外光之间的电磁波，近红外光谱区与被测物质中O-H、N-H、C-H 及S-H 等含氢基团的分子内部原子间振动的倍频和合频的吸收区一致，通过扫描样品的近红外光谱，能得到其中有机分子含氢基团的特征信息[10]。不同物质在近红外光谱区因成分不同而存在特定的吸收特征，这为近红外光谱定量或定性分析物质提供了理论依据。
近红外光谱技术具有无损性、前处理操作简便、检测成本低、反应迅速等特点使其在食品安全检测中的应用日益广泛。Kawasaki等[11]构建了基于近红外光谱技术的牛奶品质检测模型，该模型可较好地检测牛奶的各项理化指标，评价牛奶的品质。屠振华等[12]运用近红外光谱技术，结合模式识别法对蜂蜜掺假进行了识别分析，分别采用偏最小二乘判别分析、独立软模式法等方法进行蜂蜜掺假识别模型的建立和样品检测，结果表明该方法的正确判别率达100%。Liu等[13]采用表面增强拉曼光谱建立了苹果和番茄表面西维因、亚胺硫磷、谷硫磷残留的检测方法，采用偏最小二乘法和主成分分析法建立这3种农药的定性和定量模型对光谱数据进行校正处理，处理后西维因、亚胺硫磷和谷硫磷这3种农药在苹果上的检出限分别为4.51、6.51、6.66mg/mL，在番茄上的检测限分别可达5.35、2.91、2.94mg/mL，方法回收率可达78%～124%，所建立的方法可以有效检测水果和蔬菜中的农药残留。
3结语
随着经济的发展，人们生活水平的提高，食品安全越来越受到大家的关注。食品安全关乎国计民生，政府机构应制定切实可行的食品安全政策法规，建立健全市场监管机制，加强消费者的食品安全意识。同时，必须大力发展食品安全检测技术，完善检测体系，为食品的安全和品质监管作出更大的贡献。
参考文献：
[1] 李光伟，邱杨，肖性龙，等.沙门菌荧光实时定量PCR检测试剂的研制及应用[J].微生物学通报，2007，34（3）：496～499.
[2] 胡建华，李洁莉，马兆飞，等.牛奶样品中志贺氏菌的快速PCR检测技术研究[J].食品科学，2007（8）：433～437.
[3] 吴志毅，张明哲，陈曦.大米和米制品Bt63转基因检测PCR方法的灵敏度研究[J].浙江农业学报，2009，21（6）：549～554.
[4] 舒柏华，孙丹陵，王胜利，等.肉类食品细菌污染生物发光快速分析技术研究[J].中国公共卫生，2003，19（4）：483～484.
[5] 姚斐，沙莎.间接酶联免疫吸附技术检测活的的非可培养状态的大肠杆菌O157：H7[J].青岛海洋大学学报，2001，31（2）：211～214.
[6] 余向阳，骆爱兰.拟除虫菊酯类农药多残留直接竞争ELISA建立及初步应用[J].分析测试学报，2008，27（3）：249～252.
[7] 蒋建云，杨学文.酶联免疫法检测饲料中黄曲霉毒素B1[J].江西饲料，2006（6）：18～19.
[8] 王凤池.液质联用技术在食品安全检测中的应用研究[D].保定：河北大学，2008.
[9] 黄芳，黄晓兰，等.高效液相色谱-质谱法对饲料及食品添加剂中三聚氰胺的测定[J].分析测试学报，2008，27（3）：313～315.
[10] 徐广通，袁洪福，陆婉珍.现代近红外光谱技术及应用进展[J].光谱学与光谱分析，2000，20（2）：1l34～142.
[11] Kawasaki M，Kawamura S，Tsukahara M，et a1.Near-infrared spectroscopic sensing system for on-line milk quality assessment in a milking robot [J].Computers and Electronics in Agriculture，2008，63（1）：22～27
2009年，我国各行各业人士都在为抗击甲型H1N1流感做着力所能及的事情，中科院广州生物医药与健康研究院的科研人员则为对抗甲流研制了核酸检测生物传感器。据团队负责人曾令文教授介绍，甲型H1N1流感是一种急性呼吸道传染病，其病原体是一种新型的H1N1流感病毒，而核酸生物传感器对这种病原体具有特异性的快速应答效应，非常适合用于初筛工作。
自此之后，曾令文团队便开始致力于生物传感器研究，不久前他们又成功开发出了基于核酸等温链置换反应技术与胶体金技术的核酸检测生物传感器，研究成果已在英国皇家化学杂志《化学通讯》上发表。据曾令文教授介绍，新型的核酸检测生物传感器灵敏度高，一次反应最低可以检测出6个待检核酸，同时特异性也很高，除了可以检测特异性病原体核酸外，也能区分单核苷酸突变，且简单、快速，不需要复杂仪器支持，仅需30分钟，肉眼就能见到所出的结果。
曾令文教授表示，核酸检测生物传感器适用于各种各样的基因检测，既能用于遗传性疾病基因缺失突变检测（如地中海贫血），也能进行疾病和药物易感基因检测（如SNP检测和耐药检测），还能用于癌症基因突变检测（如K-ras突变检测），以及用于个体化治疗基因检测（如肿瘤个体化用药指导）等。目前，该生物传感器已经在医院进行了实验验证，用它检测出的结果与医院常规检测方法检测出的一致。
任何科研成果的研发过程必定与困难相伴，核酸检测生物传感器同样如此。曾令文团队在研发该生物传感器过程中，就曾遇到特异性、交叉反应以及检测线不出线等问题。他说：“特异性是分子检测方法中的重点，所以我们在设计反应体系中发夹结构时，必须准确设计茎与环的碱基比。因为，当待检测核酸存在时，待检测核酸与环的结合力比其与茎的结合力强，才能把发夹结构打开，所以环要足够长，但太长又会降低反应的特异性。为了解决这些问题，我们进行了无数次比对和实验。”
近年来，我国分子生物学技术有了突飞猛进的发展，并带动了整个生物科学的全面发展，与国际先进水平之间的差距正在逐步缩小，甚至部分研究已经处于国际领先水平。但曾令文教授认为，我们还应该在源头创新方面不断努力。他说：“创新是科学的灵魂，对于分子生物学研究而言，除了了解学术动态之外，我们还应该解放思想，善于总结经验，并将经验上升到理论层面，提高理论修养，增强分辨能力和表达能力，并敢于坚持真理。”
此外，曾令文教授还表示，分子生物学的发展离不开优秀的团队，因此如何科学管理团队也显得非常重要。“科研团队的管理是对知识生产过程中的社会活动的管理，它不同于其他管理，科研活动具有较大的灵活性和不确定性，科研管理是对以探索性、创造性为主的脑力劳动的管理，工作过程中出现的问题也是难以预测的。”曾令文教授认为，只有富含创新热情，拥有良好学习氛围，有一定产出，且成员之间相互交流与合作的团队才能被称为优秀团队。
目前，曾令文团队又瞄准了人类重大疾病分子诊断技术以及兽药残留、生物毒素和重金属等食品安全和环境污染检测技术的研究。他说：“开发人类重大疾病分子诊断技术，有利于疾病诊断及指导临床用药。而食品安全及环境污染检测技术关系到国计民生和人民健康，我们希望通过努力开发出具有自主知识产权的新型分子诊断技术，为更多人的健康保驾护航。”
关键词：现代 生物检测技术 食品检验
1.现代生物技术在食品检验中应用的意义
食品检验检测对于保障食品安全、促进食品生产水平都起着及其重要的作用。长期以来获得广泛应用的物理、化学、仪器等检测方法，由于存在某些局限，已不能满足现代食品检测的需要，随着生物技术的发展，人们已逐步认识到生物技术在食品检验中的重要作用及其意义。
生物技术检测方法以自身独特优势在食品检验中显示出巨大的应用潜力，其应用几乎涉及到了食品检验的各个方面，包括食品的品质评价、质量监督、生产过程的质量监控及食品科学研究。
生物技术检测方法不仅具有特异的生物识别功能、极高的选择性，而且它可与现代的物理化学方法相结合，产生一些简单、结果精确、灵敏、专一、微量和快速、成本低廉的检测方法，因此其在食品检验中占有越来越重要的地位。
2.在食品检验中应用的几种生物检测技术
2.1 免疫法
免疫法是最灵敏的生物检测方法，具有高特异性和高灵敏性（灵敏度可达1ppb，1ppm）、操作简便、再现性好，应用前景看好。用免疫法可进行蛋白质检测，由于不同蛋白质的物理、化学性质差别极小，只能通过各种免疫方法或标记探针法加以区别。
2.1.1 荧光抗体法
将荧光抗体溶液滴加于固定的标本上，一定时间后用缓冲液冲洗，若有相应抗原存在，即与荧光抗体结合，在荧光显微镜下即可看到发荧光的抗体复合物。荧光抗体法在微生物污染鉴定中经常使用，最常用于沙门氏菌的检测。
2.1.2 放射免疫法
灵敏度高，但操作相对复杂，放射免疫法同位素半衰期短，保存及操作不便。目前应用情况受到限制。
2.1.3 酶联免疫吸附法
是一种基本的酶免疫检测方法，其选择性好、灵敏度高、快速、易操作、结果判断客观准确、实用性强。酶免疫法和其他免疫法一样，都是以抗体和抗原的特异性结合为基础的。以酶或辅酶为标记物，标记抗原或抗体，用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应。
酶联免疫吸附法除可检测食品中的毒素、残留农药及微生物外还可用于营养素的测定。
2.1.4 凝集反应法
当有电解质存在时，颗粒状的抗原与其特异性的抗体结合并生成可见凝集块的反应称为凝集反应，有直接反应和间接反应法。利用凝集反应可测定抗体的效价，也可用于细菌、病毒等的分类。
2.1.5 沉淀反应法
沉淀反应法常见的是一种琼脂扩散试验。单向扩散是利用不同抗原抗体在琼脂中不同的扩散速度而会在琼脂中出现几条相互分离的沉淀带。双向扩散则是利用抗原抗体都向中间层―――琼脂扩散而形成沉淀带，根据分离沉淀带的数量可确定抗原抗体种类。
2.1.6 免疫扩散法
利用蛋白质在半固体基质上的扩散作用，使抗原和抗体在浓度比例合适的部位产生沉淀带或沉淀环，从而检测蛋白质。如血清中IgG、IgA、IgM含量的测定。
2.1.7 免疫电泳法
免疫电泳法是将电泳和琼脂扩散沉淀反应相结合的一种方法，即先将血清或蛋白质抗原在琼脂凝胶中进行电泳。带电的蛋白质抗原向负极移动，加入抗血清后，不同区点的抗原再与抗体进行沉淀，当相应抗原抗体接触，在适当比例下形成弧形沉淀带，根据沉淀带的位置对蛋白质的各组分进行检测。如免疫球蛋白含量的测定。
2.2 酶检测法
酶检测法就是用酶来测定某些用一般化学方法难于检测的食品成分的含量或测定食品中某些特殊酶的活性或含量。其最大特点就是特异性强。所以常用于分析结构和物理化学性质比较相近的同类物质的分别鉴定。如测定食品中残存有机农药的含量、微生物污染或了解食品的制备、保存情况。
酶检测法的样品一般不需要进行很复杂的预处理，由于酶的催化效率很高，反应条件温和，酶检测法的检测速度也比较快。常用的有以下方法：
2.2.1 终点测定法
在以待测物质为底物的酶反应中，如果使底物能够接近完全地转化为产物，而且底物或产物又具有某种特征性质，通过直接测定转化前后底物的减少量、产物的增加量或辅酶的变化等就可以定量待测物质。
2.2.2 动力学测定法
在反应体系中精确加入一定数量的酶，测定反应物或产物变化的速度。测定的参数可以是吸光度、荧光度、pH值等。
2.2.3 多酶偶联测定法
当被测定的底物或反应产物没有易于检测的物理化学手段时，可采用两种或两种以上的酶进行连续式或平行式的偶联反应，使底物通过两步或多步反应，转化为易于检测的产物，从而测定待测物质的含量。例如葡萄糖的定量测定。
2.2.4 利用辅酶作用或抑制剂作用测定法
如果待测物质可作为某种酶专一的辅酶或抑制剂，则这种物质的浓度和将其作为辅酶或抑制剂的酶的反应速度之间有一定关联，因此通过测定该酶的反应速度就能进行这种物质的定量。嘌呤、核甙酸、维生素、辅酶及食品中农药、杀虫剂的检验可用此法。
2.2.5 通过酶反应循环系统的高灵敏度测定法
对于极微量的物质进行酶法检测时，由于灵敏度的原因，在很多情况下不能应用通常的终点测定法，可设计一个酶反应循环系统来提高检测灵敏度。
2.2.6 酶标免疫检测法
抗体与相应的抗原具有选择和结合的双重功能。若要测定样品中抗原的含量，就将酶与待测定抗原的对应抗体结合在一起，制成酶标抗体。然后将酶标抗体与样品液中待测抗原，通过免疫反应结合在一起，形成酶―抗体―抗原复合物，通过测定复合物中酶的含量就可得出待测抗原的含量。此法可用于食品的污染检测，尤其适用于毒素的快速检测。
2.2.7 放射性同位素测定法
酶的活性可以采用同位素标记的底物进行测量。经酶解后随时间所生成的放射性产物含量与酶的浓度成正比。也可用放射性同位素的底物在酶的作用下得到的产物，分离测定产物的同位素含量。此法可用于需要进行极微量的分析或因新发现的酶还未找到适当的分析法时的测定。
2.4 核酸探针技术
核酸探针技术又名基因探针技术或核酸分子杂交技术，具有敏感性高（可检出10-9―10-12的核酸）和特异性强等优点。两条不同来源的核酸链如果具有互补的碱基序列，就能够特异性的结合而成为分子杂交链。据此，可在已知的DNA或RN段上加上可识别的标记（如同位素标记、生物素标记等），使之成为探针，用以检测未知样品中是否具有与其相同的序列，并进一步判定其与已知序列的同源程度。
核酸探针技术已被广泛应用于进出口动植物及其产品的检验。用于检验食品中一些常见的致病菌及产毒素菌，如大肠杆菌、沙门氏菌等多种病原体的检验。近年来，放射性同位素标记的核酸探针正越来越多地用于产肠毒素性大肠杆菌的快速检测。
2.5 多聚酶链反应技术
多聚酶链反应技术是一种极敏感的分子生物学方法，是一项DNA体外扩增技术，在体外对特定的双链DN段进行高效扩增，故又称基因体外扩增法。
多聚酶链反应技术快速、特异、敏感，在食品中致病菌的检测方面具有很大的应用潜力。如可用于单核细胞增多症李氏杆菌、金黄色葡萄球菌、顽固性梭状芽胞杆菌、沙门氏菌等的检测。
2.6 基因芯片技术
基因芯片技术能同时将大量探针固定于支持物上，可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术的操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足，是一种在生物技术产品检测中极有发展前景和应用价值的技术，也是近年来国内外研究的热点，基因芯片检测技术完全可能成为21世纪最具活力的检测技术之一。
基因芯片检测技术可以判断该植物是否含有外来的基因序列，而鉴定该植物是否为生物技术作物。
2.7 免疫传感器
免疫传感器是根据生物体内抗原-抗体特异性结合并导致化学变化而设计的生物传感器，其主要由感受器、转换器和放大器组成。免疫传感器是多学科边缘交叉的产物，其研究涉及到电化学、物理、生物、免疫学和计算机等领域的相关知识。
免疫传感器主要有:酶免疫传感器、电化学免疫传感器(电位型、电流型、电导型、电容型)、光学免疫传感器(标记型、非标记型)、压电晶体免疫传感器、表面等离子共振型免疫传感器和免疫芯片等。
基于抗原-抗体特异性结合的工作原理，免役传感器在食品检测中的应用主要体现在对生物性危害的检测。如可用于致病菌、生物毒素、农药、兽药等的检测。
3.现代生物技术在食品检验中的应用进展
当今食品检验趋向于简便、快捷、灵敏和微量化。现代生物技术以其自身的独特优势在食品检验中显示出巨大的应用潜力，已引起分析化学家和生物学家的浓厚兴趣，并已获得广泛的应用，前景广阔。国外生物技术在食品检验中的应用研究已比较系统、完整、成熟，国内由于各种条件的限制，目前实际应用并不多。生物技术要在食品检验中取得更加广泛的应用，仍需在价格、效能、方便、实用性和可靠性方面进行深入的研究。
参考文献
[1] 彭志英.食品生物技术[M].中国轻工业出版社,1998.8.
[2] 卢大用等.免疫法在食品分析中的应用[J].生物学杂志,1995.6.
[3] 朱慧莉等.酶联免疫吸附法及其在食品分析中的应用[J].食品工业科技,2001.2.
[4] 卿柳庭等.核酸探针技术在食品检验中的应用[J].动物医学进展,2000.1.
【关键词】 人瘤病毒；液基细胞学；年龄因素
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.03.039 文章编号：1004-7484（2014）-03-1235-02
宫颈癌的发病率在全球女性恶性肿瘤中排名第三（15%），但是在发展中国家却居于第二位，[1]仅次于乳腺癌。据世界卫生组织统计，全球每年大约有530000名妇女被诊断为宫颈癌，每年约有75000名妇女死于这种疾病[2]。在宫颈癌患者中，高危型人瘤病毒（HR-HPV）感染是其发生的主要病因[3]。
1 资料与方法
1.1 一般材料 收集2013年1月至2013年6月在我院妇科门诊进行就诊的患者，进行TCT检测者2658例，其中阳性患者257例，进行HPV检测者1183例，其中阳性患者174例。所有标本按不同年龄分为6组。
1.2 仪器与试剂 凯普医用核酸分子快速杂交仪与HPV核酸扩增分型检测试剂盒均由凯普生物仪器有限公司生产。TIB-Autoprep 1000由泰普生物科学（中国）有限公司生产。
1.3 检测方法
1.3.1 TCT检测方法 首先用棉球擦去患者宫颈表面分泌物，然后用颈管刷插入子宫颈管内收集宫颈脱落细胞，标本取完后将宫颈刷放入装有Thin prep（液基宫颈细胞学检查）专用保存液的小瓶中搅拌、漂洗，盖好瓶盖送检。标本经过TIB-Autoprep 1000处理仪处理，就可以得到一张薄而均匀的直径为2cm大小的圆形细胞涂片，在显微镜下观察宫颈细胞并进行细胞学分类诊断。
1.3.2 HPV检测方法 同样是先用棉球擦去患者宫颈表面分泌物，然后用专用的HPV特制毛刷收集宫颈脱落细胞，标本连同毛刷保存于HPV保存液中。采用杂交捕获2代技术（HC2），即使用化学发光法的核酸杂交检测方法，在体外进行核酸杂交，利用化学发光法，使微孔板信号扩增，对宫颈标本中的13种高危型人瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）DNA进行半定量检测。可检测的13种HPV亚型，包括16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68，阳性阂值是HPV-DNA，1.0pg/ml。
2 结 果
2.1 TCT不同年龄组结果 见表1。共有2658例患者进行TCT检测，其中阳性患者257例，占患者总数的9.7%。有表1可见，40-49岁年龄组阳性率最高（12.48%），20-29岁年龄组次之（9.48%），此后排序分别为50-59岁，30-39岁年龄组。
2.2 HPV不同年龄组结果 见表2。共有1183例患者进行HPV检测，其中阳性患者174例，占患者总数14.7%。有表2可见，20-29岁年龄组阳性率最高（16.99%），40-49岁年龄组次之（15.20%），此后排序分别为50-59岁，30-39岁年龄组。
3 讨 论
HPV是一组无包膜的双链环状DNA病毒，对皮肤及黏膜上皮具有特殊嗜性，目前发现和鉴定出200多种HPV亚型[4]，据诱发病变的良恶性不同，HPV又分为高危型和低危型。低危型HPV-6、11、42、43和44，常与生殖器尖锐湿疣和低程度鳞状上皮病变的发生有关。高危型HPV-16、18、31、33和45常与中重度鳞状上皮病变及恶性肿瘤的发生有关。
我国是宫颈癌的高发区，我国每年侵袭性宫颈癌的新发病例为45689例，死亡例数为25561例，占全球总数10%。本文所做统计TCT阳性率在40-49岁年龄组最高，为12.48%，20-29岁次之为9.48%。HPV阳性率在20-29岁年龄组达到最高，为16.99%，40-49岁年龄组次之为15.20%，其中LSIL以20-29岁年龄组阳性率最高为3.7%，HSIL以40-49岁年龄组阳性率最高为3.4%。与一些文献报道有所差异，可能是由于地区性和环境的差异所致，有待进一步研究。
最主要原因，大量吸烟、避孕药、及和生殖、社会经济和卫生状况等各种途径均增高HPV感染概率，促使宫颈癌的产生。性活跃期妇女HPV感染十分常见，初次性活跃期的妇女中HPV感染率最高，约50-80%性活跃期妇女感染HPV，其中50%为高危型HPV感染。呼吁晚婚、少育，做好宫颈癌三级预防：一级预防（应用疫苗），将HPV扼杀在摇篮中，对青少年女性，提前应用疫苗；二级预防（宫颈筛查），建立健全防癌抗癌计划，做好宫颈细胞筛查计划；三级预防（检查治疗），发现有感染迹象女性，做好下一步治疗，在早期，阻断病变，做到早发现早治疗，以预防、杜绝宫颈癌发生。
参考文献
[1] Appleby P，Beral V，de González AB，et al.Cervical cancer and hormonal contraceptives：collaborative reanalysis of individual data for 16，573 women with cervical cancer and 35，509 women without cervical cancer from 24 epidemiological studies[J].The Lancet，2007，370（9599）：16091621.[PubMed]
[2] Arbyn M，Castellsagué X，de Sanjosé S，et al.Worldwide burden of cervical cancer in 2008[J].Annals of Oncology，2011，22（12）：26752686.mdr015[PubMed]
基因扩增是分子生物学领域的常用研究手段，目前应用最广的是常规PCR和real－timePCR技术［1］，因其灵敏度高，特异性强，已成为分子生物学领域的关键技术。但PCR方法的操作较复杂，对操作人员和仪器设备的要求都较高，不适合基层及现场的快速检测。随着分子生物学技术的不断发展和改进，新技术不断涌现，TsugunoriNotomi等［2］于2000年提出了LAMP，一种新颖的核酸扩增技术，利用该技术只需在恒温条件下(60～65℃)保温几十分钟就可快速完成核酸的扩增，无需购置昂贵的PCR仪，操作简单，快速，可用于现场的快速检测，近年来已得到广泛的应用。本文综述了LAMP技术的基本原理、相对于传统核酸检测技术的优点、产物的检测方法及其临床应用，最后指出LAMP目前存在的不足以及应采取的相应措施，并对其发展前景进行了展望，从而为LAMP技术在临床研究上的应用提供参考。
1LAMP法的原理及特点
1.1LAMP引物的设计LAMP技术的核心之一在于引物的设计，因此，设计出特异性强的引物是进行LAMP实验的首要任务。LAMP引物由一对内引物(FIP与BIP)和一对外引物(F3与B3)组成，其中FIP由F1c和F2组成，BIP由B1c和B2组成，严格针对靶基因3'端的F1c、F2c和F3c区以及5'端的B1、B2和B3区而设计［3］，结构组成如图1所示。
1.2扩增原理DNA在65℃左右处于动态平衡状态，此时，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链［4，5］。据此，LAMP反应被划分为2个阶段，即起始物合成阶段和循环扩增阶段。在第1阶段，内引物FIP首先与模板F2c区结合，启动互补链的合成，产生双链DNA。接着，引物F3与F3c互补配对，在BstDNA聚合酶的作用下，启动链置换反应，并释放出由FIP引导合成的单链，此单链的5'末端存在互补序列(F1c和F1)，于是通过碱基互补配对形成一环状结构。以此链为模板，与FIP和F3类似，在BIP和B3的作用下，在DN段的另外一端产生了新的环状结构，于是整条链呈哑铃状结构［6］，如图2所示，到此，第1阶段反应完成。循环扩增阶段，以哑铃状结构为模板，FIP与茎环区域F2c杂交，同时，F1c与F1结合，启动新一轮链置换反应，解离出由F1引导合成的双链核酸，并释放由F2引导合成的单链，此单链两端均成环状结构，BIP与茎环区域B2c互补，启动新一轮扩增。如此不断循环，茎的长度和环的个数都不断增加，最后的产物为茎－环状DNA与花椰菜状DNA所组成的混合物。
1.3LAMP技术的优点与普通PCR相比，LAMP具有许多优点:①特异性强，引物的设计须严格针对靶基因的6个区域，任何一个不匹配就会导致反应无法进行;②灵敏度高，可检测出1～10拷贝的模板，比PCR高出10倍的检测限［7］;③反应时间短，只需在恒温条件下保温30～60min就可完成扩增;④设备简单，不需要昂贵的PCR仪和特殊的试剂，只需一台恒温设备就可进行;⑤产物易检测，只需用肉眼观察有无白色浑浊或有无绿色荧光，就可判断扩增是否发生。LAMP与普通PCR的比较结果见表1。
1.4LAMP产物的检测反应结束后，对结果进行判定常用琼脂糖凝胶电泳检测、浊度检测、荧光比色检测和荧光实时定量检测
1.4.1浊度检测随着核酸的大量生成，溶液中会发生如下反应:(DNA)n－1+dNTP=(DNA)n+P2O4–7P2O4–7+2Mg2+=Mg2P2O7(白色)由dNTP析出的P2O4－7与溶液中的镁离子结合，生成肉眼可见的焦磷酸镁白色沉淀，通过与阴性管比较反应液的浑浊情况，或用浊度仪检测其在400nm处的沉淀浊度，就可判断扩增的有无。
1.4.2荧光比色检测对LAMP产物进行荧光比色检测时，常用的染料有SYBRGreenⅠ、钙黄绿素、HNB、溴化乙淀和Picogreen等［8］。其中，SYBRGreenⅠ和HNB的检测灵敏度最高，是钙黄绿素的10倍［9］，然而SYBRGreenⅠ不能在反应前加入LAMP体系中，否则会抑制反应［10］，而反应后加就必须开盖，又违反了LAMP不开盖原则，造成气溶胶污染。HNB则是在反应前加入体系中，避免了开盖污染的问题，扩增结束后，阳性管呈紫色，阴性管呈天蓝色，由此，可判断靶基因的有无。
2LAMP技术的应用
LAMP技术自2000年开发以来，因其简便快速，操作简单等优点，已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫和动物胚胎性别鉴定等检测中。
2.1细菌的检测YoshiteruAoi等［11］利用LAMP对环境中的氨氧化细菌进行了测定，结果可检测出10个拷贝数的DNA，具有与real－timePCR相同的灵敏度，且背景DNA对LAMP的检测干扰很小，可忽略不计。徐芊等［12］将LAMP用于检测副溶血弧菌，直接对食品样品进行检测，只用一台恒温水槽，65℃反应1h，即完成扩增反应，与传统培养方法相比，大大缩短了检测周期，检测限达到89cfu/g。叶宇鑫等［13］将原位荧光LAMP技术应用于食品中沙门氏菌的检测，与传统沙门氏菌检测方法和PCR方法相比，原位荧光LAMP无需破碎细胞提DNA，反应方便易行，耗时少;恒温条件(63℃)下反应，避免了原位PCR方法过高的循环温度(95℃)对细胞结构的破坏;在检测人工污染的样品时，结果没有受到杂质的影响，可以检测到样本中的单个细胞。张宏伟等［14］以荚膜脂多糖合成调控子resA为靶基因片段，设计了肺炎克雷伯菌特异性引物，建立了LAMP检测方法，灵敏度可达2.2～3.4CFU/100g，检测流程可缩短至2d，比PCR法更加快速。董培陪等［15］结合LAMP与横向流动试纸条技术(Lateralflowdipstick，LFD)建立起一种鳗利斯顿氏菌快速检测方法，能在30min内完成检测，灵敏度为7.7cfu/ml，比常规PCR方法高一个数量级，通过与横向流动试纸条检测技术结合，进一步克服了由非特异性扩增导致的假阳性。可见，将LAMP技术用于细菌检测时，其检测限比常规PCR更高，与real－timePCR法相比则具有相同的灵敏度，无需分离培养细菌，可直接提取感染动物组织基因组进行扩增［16］，操作更为简单、方便，且不需要昂贵的仪器，该方法有望成为细菌检测的常规手段。
2.2病毒的检测
2.2.1DNA病毒TingCai等［17］利用LAMP方法检测血清样本中的HBV，并与real－timePCR法进行了比较，结果表明两者的检出率一致，且对于低浓度的样品，LAMP的准确率更高，更适用于临床检测。李明云等［18］根据对虾白斑综合症病毒(WSSV)的结构蛋白VP26基因序列，设计一套引物，建立了针对WSSV的LAMP检测方法，可检测到最低模板浓度为0.563pg/μl，灵敏度比常规PCR法高1个数量级，并且当模板浓度由10－5倍稀释到10－6倍时，PCR产物浓度显著降低，受模板浓度的影响较大，而LAMP的扩增产物浓度则基本不受影响。张侃等［19］将LAMP用于伪狂犬病病毒的检测，在45min内完成检测，其特异性与PCR方法一致，敏感性则是PCR的100倍，最低能够检测10个拷贝的目的基因。
2.2.2RNA病毒LeoL．M．Poon等［20］于2004年首先建立了针对SARS的RT－LAMP技术，通过对31例SARS患者的检测，检出率为64%，其灵敏度略低于实时PCR，但是比常规PCR法更高。TetsuoYoneyama等［21］用RT－LAMP法检测了粪便中的HAV，实验中加入了环引物，将检测时间缩短至50min，与RT－PCR法(需要2～3h)相比大大节省了时间;对HAV实验室病毒毒株的检测，灵敏度为0.4～0.8FFU/5μl，与侵染性实验法相当，且能检测到HAVⅢ型，比real－timeRT－PCR法的检测范围更广，可作为基层疫情监控的常规检测方法。聂凯等［22］采用一步法的RT－LAMP检测人甲型H1N1流感病毒基因，在反应体系中直接加入反转录酶，大大简化了LAMP技术用于RNA病毒检测的操作步骤。此外，LAMP技术在检测艾滋病病毒［23］、鹅细小病毒［24］、猪繁殖与呼吸综合症病毒［25］、人星状病毒［26］、单纯疱疹病毒Ⅰ型［27］、猪圆环2型病毒［28］等方面均有报道，无论是DNA还是RNA病毒LAMP都能做到快速检测，在检测RNA病毒时更是省去了RT－PCR法中费时的反转录步骤，在临床检测上显示出越来越重要的地位。
2.3寄生虫的检测HiromiIkadai等［29］将LAMP法用于巴贝斯虫的检测，证实LAMP具有与PCR和光学显微镜同样的敏感性，而且更加简便，快速。李群等［30］为提高牛巴贝斯焦虫病的检出率，采用LAMP法进行了检测，结果表明，LAMP检测体系特异性强，与双芽巴贝斯焦虫DNA不发生交叉反应;敏感性高，最小检测值为0.014fg，为一般PCR法的103倍。Jun－HuChen等［31］用LAMP法对间日疟感染患者进行诊断，在117例镜检呈阳性的血清样本中，LAMP检出115例，灵敏度和特异性与镜检法和nestedPCR法相近，但是操作更加简单，不需要昂贵的仪器，且对DNA的抽提要求不高，有望成为检验科或疟疾诊所的常规诊断方法。
2.4动物胚胎性别的鉴定LAMP在动物胚胎性别的鉴定方面也有应用，HirokiHirayama等［32］首次利用LAMP法检测牛胚胎的性别，鉴定的准确率为88.9%～94.4%，整个鉴定过程不超过1h。KhairyM．A．Zoheir等［33］也成功将LAMP用于牛胚胎性别的鉴定，以EB和CuSO4为指示剂，反应45min即可通过肉眼观察颜色的变化，从而鉴定出雌雄，准确率达100%，简单快速，成本低，可用于养殖场现场操作。
3不足与对策
3.1存在的不足对扩增产物定量检测时，需要购置昂贵的荧光定量PCR仪或浊度仪;LAMP法的扩增靶序列长度控制在300bp以下，对引物要求高，由在线软件设计的引物有上千条，要筛选出合适的引物需要耗费大量的工作;LAMP灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染;传统PCR产物的电泳图都是呈现单带，而LAMP法阳性反应则是呈阶梯状条带，因此，若有非特异性扩增的产生，则不易辨别，造成LAMP容易出现假阳性。
3.2对策严格做好防污染工作，体系的配制一定要在超净台内进行，实验器材要进行消毒灭菌;BstDNA酶最后加入体系，若有必要可以在体系上覆盖一层矿物油;LAMP体系的配制和检测必须要严格分区，操作人员往返两区域进行实验时要更换实验服，同时要尽可能地避免无关紧要的人员流动，凡进入检测区的实验器材都不要再拿回配制区。由于开盖检测容易造成气溶胶污染，所以反应结束后最好不要打开PCR管，可采用反应前加入HNB染料的方法对扩增产物进行定性检测。一旦出现污染，应立即停止实验，每天给实验室通风，给超净台紫外灭菌并通风，一段时间后更换所有试剂再做。采用HidenoriTani等［34，35］提出的ABC－LAMP技术对LAMP产物进行定量，该方法主要是在反应体系中加入探针AB－QProbe和已知浓度的内标，探针的荧光值代表靶基因与内标的比值，随着反应的进行，靶基因与内标被同等程度扩增，通过测定反应终点两者的荧光值之比，结合内标的初始浓度就能对初始模板定量，从而实现了以较低的成本对产物的定量检测。
1引言
特定序列单链核酸（DNA）的特异性检测在临床诊断、基因治疗、环境调查、食品安全及生物医学研究等领域都具有十分重要的意义＼[1～5＼]。分子信标（Molecular beacons）是一种呈发夹结构的茎环双标记的寡核苷酸探针，具有操作简单、选择性好以及不必与未反应的探针分离即可实时检测等特点，在特定序列单链DNA的检测中扮演着越来越重要的角色＼[6～13＼]。近年来，有关分子信标对特定序列单链DNA检测的报道逐渐增多＼[14～16＼]。尽管分子信标在DNA的定性及定量分析中显示出广阔的应用前景，但经典分子信标在实际定量分析中还存在一些不足： （1） 经典分子信标具有较强的背景信号，影响定量检测的检出限＼[17＼]；（2） 相对于核酸染料而言，分子信标对核酸检测的灵敏度较低；（3） 经典分子信标需要在两端分别标记荧光基团及猝灭基团，制备时间长且成本高。
核酸染料Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，具有很高的灵敏度＼[18，19＼]。它在水溶液中荧光很弱，与单链DNA几乎不发生作用，但与双链DNA具有很强的亲和性，能嵌入双链DNA的小沟中，与双链中的A/T碱基对发生特异性结合，使其结构发生变化，导致荧光强度大大增加＼[20，21＼]。根据此原理，Hoechst 33258在双链 DNA 含量测定中，已得到广泛应用＼[22，23＼]。
Hoechst 33258 与分子信标联合应用的报道较少。James等＼[24＼]利用Hoechst 33258 与分子信标研究了发夹聚酰胺对双链DNA的解链温度的影响，并获得了较好的结果。到目前为止，利用Hoechst 33258 结合分子信标对特定序列核酸的检测还未见报道。
本研究利用无标记的分子信标（无有机荧光基团和荧灭基团）及Hoechst 33258建立一种高灵敏、高选择性的特定序列核酸检测方法。在这种分析方法中，将无标记分子信标的茎完全设计成C/G碱基对，分子信标的环设计为目标DNA的互补序列。利用分子信标与目标DNA反应之前，Hoechst 33258荧光信号很弱，而与目标DNA反应之后，其荧光信号显著增强的基本原理，实现对特定序列DNA的定量检测。
相对于经典分子信标对核酸的检测而言，本方法具有以下特点：（1）使用无标记分子信标，省去了标记步骤， 降低了分析成本； （2）将分子信标的茎完全设计成C/G碱基对，而Hoechst 33258不与C/G碱基对发生作用，因此背景荧光很低，可显著降低分析方法的检出限； （3）利用Hoechst 33258的荧光代替经典分子信标中的荧光基团对目标核酸进行检测，可显著提高检测的灵敏度。这主要是因为利用核酸染料检测核酸时，一个核酸分子能与多个核酸染料相结合，而每个分子信标只有一个荧光基团。同时无标记的分子信标又保留了经典分子信标中茎环的结构，仍然具有很高的选择性。
3结果与讨论
3.1检测原理
利用无标记的分子信标及Hoechst 33258对特定序列核酸检测的原理如图1所示。在没有目标DNA时，尽管分子信标处于茎环结构状态，但分子信标的茎全部由C/G碱基对组成，不与Hoechst 33258作用，此时Hoechst 33258的荧光信号很弱；在有目标DNA时，其与分子信标发生杂交反应，形成双链DNA后再与Hoechst 33258结合，Hoechst 33258的荧光强度显著增强。根据荧光增强的程度，实现对特定单链DNA的检测。
3.3.6核酸染料Hoechst 33258与双链DNA作用的时间的影响核酸染料Hoechst 33258只有与双链DNA结合之后才会发出较强的荧光，因此它与双链DNA的结合时间是影响其荧光强度的重要因素。本实验对Hoechst 33258与双链DNA的结合时间进行了考察。结果表明，在9 min内，Hoechst 33258的荧光强度随着时间的增加而增大；当结合时间超过9 min后，Hoechst 33258的荧光强度不再发生变化。
3.4工作曲线及复杂样品中核酸的检测
在3.5碱基错配分析
对不同碱基错配序列DNA进行了分析，以考察方法的特异性，结果如图4所示。对于不同碱基错配序列的DNA，Hoechst 33258的荧光强度具有显著区别。对于目标DNA序列、单碱基错配DNA序列、双碱基错配DNA序列及三碱基错配DNA序列，所对应的荧光强度之比
4结论
利用无标记的分子信标与单链DNA特异性反应生成双链，再与Hoechst 33258结合后，其荧光显著增强的基本原理，建立了检测特定序列核酸的新方法。本方法操作简单、检测速度快、灵敏度高、重现性好、检出限低。
References
1Ding C F， Zhang Q， Lin J M， Zhang S S. Biosens. Bioelectron.， 2009， 24（10）： 3140-3143
2Montgomery J L， Sanford L N， Wittwer C T. Expert Rev. Mol. Diagn.， 2010， 10（2）： 219-240
3Endo T， Kerman K， Nagatani N， Takamura Y， Tamiya E. Anal. Chem.， 2005， 77（21）： 6976-6984
4Wang X Y， He P G， Fang Y Z. J. Lumin.， 2010， 130（8）： 1481-1484
5Song S P， Liang Z Q， Zhang J， Wang L H， Li G X， Fan C H. Angew. Chem. Int. Et.， 2009， 48（46）： 8670-8674
6Nesterova I V， Erdem S S， Pakhomov S， Hammer R P， Soper S A. J. Am. Chem. Soc.， 2009， 131（7）： 2432-2433
7Radi A E， Sanchez J L A， Baldrich E， O′Sullivan C K. J. Am. Chem. Soc.， 2006， 128（1）： 117-124
8ZHENG AiHua， ZHU Qing， XIANG DongShan， HE ZhiKe. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（3）： 325-329
郑爱华， 朱 庆， 向东山， 何治柯. 分析化学， 2013， 41（3）： 325-329
9Haner R， Biner S M， Langenegger S M， Meng T， Malinovskii V L. Angew. Chem. Int. Et.， 2010， 49（7）： 1227-1230
10Tang Z W， Liu P， Ma C B， Yang X H， Wang K M， Tan W H， Lv X Y. Anal. Chem.， 2011， 83（7）： 2505-2510
11LIU Bin， YANG XiaoHai， WANG KeMin，TAN WeiHong. Chem. J. Chinese Universities， 2012， 32（3）： 486-491
刘 斌， 羊小海， 王柯敏， 谭蔚泓. 高等学校化学学报， 2012， 32（3）： 486-491
12Sheng P P， Yang Z Y， Kim Y M， Wu Y R， Tan W H， Benner S A. Chem. Commun.， 2008， 44（41）： 5128-5130
13Qiao G M， Zhuo L H， Gao Y， Yu L J， Li N， Tang B. Chem. Commun.， 2011， 47（26）： 7458-7460
14Wu C S， Oo M K K， Cupps J M， Fan X D. Biosens. Bioelectron.， 2011， 26（9）： 3870-3875
15Li F， Huang Y， Yang Q， Zhong Z T， Li D， Wang L H， Song S P， Fan C H. Nanoscale， 2010， 2（6）： 1021-1026
16Wu J K， Huang C H， Cheng G F， Zhang F， He P G， Fang Y Z. Electrochem. Commun.， 2009， 11（1）： 177-180
17Zhang P， Beck T， Tan W H. Angew. Chem. Int. Ed.， 2001， 40（2）： 402-405
18Buurma N J， Haq I. J. Mol. Biol.， 2008， 381（3）： 607-621
19Furse K E， Corcelli S A. J. Am. Chem. Soc.， 2008， 130（39）： 13103-13109
20Anuradha， Alam M S， Chaudhury N K. Chem. Pharm. Bull.， 2010， 58（11）： 1447-1454
21Ojha H， Murari B M， Anand S， Hassan M I， Ahmad F， Chaudhury N K. Chem. Pharm. Bull.， 2009， 57（5）： 481-486
22Kobayashi M， Takashi K B， Saito M， Kaji S， Oomura M， Iwabuchi S， Morita Y， Hasan Q， Tamiya E. Electrochem. Commun.， 2004， 6（4）： 323-343
23Zhou Y L， Mao S N， Li Y Z， Chang W B. Microchim. Acta， 2004， 144（1）： 191-197
24James P L， Le S L， Ellervik U， Bratwall C， Norden B， Brown T， Fox K R. Biophys. Chem.， 2004， 111（3）： 205-212
AbstractA highly sensitive and selective method for specific DNA sequence detection is developed using a nonlabeled molecular beacon （MB） and a nucleic acid dye Hoechst 33258. It is demonstrated by a specific DNA sequence of wildtype HBV as a model system. In this strategy， the stem of MB is completely designed as C/G base pairs. In the absence of target DNA， the interaction between Hoechst 33258 and the MBs is very weak，and the fluorescence signals of Hoechst 33258 is very low. In the presence of target DNA， the MBs hybridize with the target DNA and form doublestranded structure. Hoechst 33258 binds to dsDNA， and the fluorescence intensity is significantly enhanced. Under the optimum conditions， the fluorescence intensity of Hoechst 33258 exhibits good linear dependence on target DNA concentration in the range of 2×10
关键词：猪繁殖与呼吸综合征；抗体检测；病原检测
中图分类号：S858.28 文献标识码： 文章编号：1007-273X（2016）12-0009-02
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome， PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV）引起的一种严重危害养猪业的传染病。以妊娠母猪流产、死产、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍及各年龄阶段猪的呼吸道症状为特征[1-3]。该病毒具有抗原变异性、嗜巨噬细胞性、持续感染性及抗体依赖增强性作用，临床上常与其他病原混合感染使临床表现形式复杂化[4-5]。要确诊需要进行实验室检测，实验室检测方法很多，每种方法在检测的特异性、敏感性、成本等方面存在差异。因此，建立有效且适合基层使用的PRRS检测方法是防控PRRS的重要环节，本文就PRRS检测方法进行了综述，供参考。
1 抗体的检测
免疫荧光抗体（IFA）试验、免疫过氧化酶单层细胞试验（IPMA）、血清中和（SVN）试验及酶联免疫吸附试验（ELISA）等都可用于检测PRRSV的特异性抗体，通过检测抗体水平可以对猪个体或整个猪群的PRRSV感染状况或疫苗免疫效果给予一定的评价。
1.1 PRRSV抗体检出时间及维持时间
当猪感染PRRSV 7～14 d后，机体首先产生IgG抗体，机体产生的抗体随着时间的积累呈增加的趋势，当抗体达到峰值后在体内维持一段r间，然后抗体水平逐渐下降，不同检测方法检测出的抗体出现峰值时间、峰值维持时间以及抗体在体内存留时间均不一致。在试验感染条件下，通过IgG-IFA、IPMA、ELISA、SVN方法可分别在感染后5～9、9～11、9～13、9～28 d内检测到抗体。PRRSV特异性IgM抗体在接种后5 d可以检测到，并可持续21～28 d。不同的方法检测出的抗体峰值时间各不相同：IFA 30～50 d、IPMA 35～50 d、ELISA 30～50 d、SVN 60～90 d，随后抗体滴度逐渐下降。感染PRRSV后用各种方法检测的抗体消失时间为： IFA 4～5个月、ELISA 4～10个月以上、IPMA 11～12个月、SVN12个月[6-8]。疫苗免疫后各种方法的检测结果与上述时间段基本一致。
1.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）
ELISA适于大规模检测，方便、易行，操作过程及结果判断能够标准化，且具有高度的特异性和敏感性，以间接ELISA和阻断ELISA常见[6-8]。利用ELISA检测血清中PRRSV抗体出现的时间与用IPMA和IFA检测抗体出现时间基本相同，但是血清中PRRSV抗体持续时间明显长于IPMA和IFA所检测出的抗体维持时间，检出时间长达1年左右。
ELISA诊断抗原有2种，一种是从细胞培养物中纯化的全病毒抗原，另一种是重组的PRRSV核衣壳蛋白。无论是用全病毒还是用基因表达产物作为诊断抗原建立的ELISA，均具有较强的背景反应。IDEXX公司生产的PRRSV抗体ELISA检测试剂盒在全球范围内推广使用，曾被认为是PRRSV抗体检测的金标准。但不久通过对照试验对该试剂盒检测效果进行评价，发现IDEXX试剂盒存在假阳性结果，PRRSV全病毒抗原间接ELISA与IDEXX HerdChek ELISA试剂盒相比，前者特异性仅为26.6%，敏感性也仅为48.8%。如果该方法应用于实际生产中，将会对PRRS的净化以及后备种猪的筛选带来严重后果。因此，在ELISA试剂盒研制上还需要广大从事ELISA试剂盒研制的人员做出更大的努力来弥补现有试剂盒的不足之处，进一步完善中国ELISA诊断试剂盒标准[8-10]。
1.3 免疫过氧化酶单层细胞试验（IPMA）
IPMA是广泛用于该病诊断的一种方法，其敏感性和特异性都较好，可用于PRRSV的血清抗体检测、病毒鉴定及抗原检测。自1991年建立至今，仍是欧洲和美洲国家广泛使用的血清学诊断方法。利用IPMA和商品化的PRRSV ELISA试剂盒检测抗体，并进行比较，发现利用同源性抗原检测抗体，IPMA比ELISA试剂盒检测出抗体的时间提前2～3 d，特别是对母源抗体的灵敏度更高，然而ELISA却能在不损失特异性的基础上提高敏感性，所以相比之下，ELISA更适合用来诊断PRRSV。由于IPMA结果判定具有一定主观性，不能自动显示，同时费时，检测费用高，不适合大规模检测，因此在实际生产中未得到广泛应用[9，10]。
1.4 免疫荧光抗体（IFA）试验
IFA法在美国被广泛利用，该法需进行细胞培养、荧光镜检，结果借助肉眼来观察，因实验室操作方法的不同、技术人员的不同和非特异性荧光等原因产生较大的主观性。对IFA和ELISA方法进行比较，结果发现二者具有很高的符合率，不符合的原因可能是血清抗体的水平太低。ELISA可以检测抗体滴度比较低的血清，而用IFA则检测不到，由此造成假阴性结果。
利用间接荧光抗体试验对试验感染PRRSV的猪的抗体进行检测，结果表明，在感染病毒后9～14 d，首先检测出IgG抗体，高滴度的IgG抗体可以维持7周；感染病毒后35 d再次接种PRRSV，体内IgG抗体滴度不发生变化，病毒血症仍可检测到。在接种5～28 d可以检测到IgM抗体，35 d后再次接种病毒其抗体在短时间内增加。利用荧光抗体试验在不同时间对IgM抗体水平进行检测，在短时间内有助于鉴别是否感染PRRSV。因此，在实际生产过程中要尽可能避免假阴性结果的出现，在条件允许情况下结合其他检测结果得出结论[9-11]。
血清中和试验与IFA和ELISA相比，其敏感性低，原因可能是由于PRRSV特异的中和抗体出现比较晚，要在感染后30～60 d才能检测到。对于急性感染的敏感性更差，与其他检测方法的结果符合率低，达不到早期诊断的目的。因此，该方法不适合应用于实际生产中，仅限于实验室诊断[10-12]。
血清学呈阳性的结果并不能确定PRRSV是否能引起临床发病，也不能区别是感染野毒还是疫苗毒，也不能说明动物机体是否为病毒的携带者，仅能说明曾经感染过PRRSV。对于血清学阴性可能是未感染PRRSV或感染但还未产生抗体，或以前感染过但现在血清转阴，或是检测方法的敏感性不够或操作误差。因此，现有的血清学方法不适合监测整个猪群的群体情况，其仅能对单个个体作出初步诊断，要作出更准确的诊断，还应与免疫状况或病毒分离或抗原的检测相结合，才能达到对PRRS诊断、疫情净化的目的[10-12]。
2 病原的检测
病原的检测主要包括免疫学检测以及生物学检测，其中免疫学检测包括免疫荧光染色法、免疫过氧化物酶染色法以及免疫胶体金技术等，而生物学检测主要进行病毒的分离；核酸的检测主要利用分子生物学技术对病毒特定的基因组进行检测。由于免疫学检测存在较大的弊端，下面仅对生物学检测以及核酸检测技术作一简单的概述。
2.1 生物学检测―病毒的分离
用于PRRSV分离的细胞有原代猪肺巨噬细胞（PAM）、传代细胞系CL2621和Marc145。其中PAM最常用，因为传代细胞系对该病毒易感性差，故不能完全代替PAM，而且由于不是每批巨噬细胞对病毒的易感性都相同，所以在用PAM进行分离病毒前，还要进行批次试验，只有当特定滴度的标准病毒在新的巨噬细胞中生长良好时，方可使用，该方法是诊断PRRSV感染的经典方法，多用于急性病例的确诊和新疫区的确定，但是也存在不足之处，如费用较高、劳动强度较大，耗时多，且有可能污染其他病毒等，因此该方法不利于大规模猪场疫病的检测[10-12]。
2.2 核酸检测（反转录-聚合酶链式反应）
核酸检测（反转录-聚合酶链式反应）反转录-聚合酶链式反应（Reverse transcription polymer-ase chain reaction， RT-PCR）V泛应用于PRRSV的鉴定及临床诊断，并在方法上不断改进和提高，扩增的目的片段也主要是针对PRRSV的核衣壳蛋白基因，主要的原因是PRRSV基因组中ORF7编码的核衣壳蛋白（N蛋白）中包括所有毒株都保守的共同表位和区别于欧洲型的特异性决定簇。RT-PCR比病毒分离更省时、省力，敏感性和特异性更强。用于RT-PCR检测的样品包括血清、及肺脏、脾脏等组织[13-15]。
利用RT-PCR对试验感染猪进行抗原和抗体检测，并与病毒分离和ELISA抗体检测结果进行了比较，结果发现该方法可以在感染24 h后检测到病毒的核酸，但不能分离到病毒，而抗体只能在感染后第9d检测到，由此可见RT-PCR的灵敏度明显高于病毒分离和ELISA，有利于早期诊断[13-15]。
PCR方法可以区分欧洲株与美洲株，但其临床应用意义并不大。国外应用PCR诊断PRRSV已取得很大进展，许多学者根据PRRSV不同的ORF序列，设计了不同引物，建立了检测PRRSV核酸的RT-PCR方法。随着RT-PCR技术的发展，也陆续出现了荧光标记的RT-PCR方法，如采用TaqManTMRT-PCR或分子信标RT-PCR方法检测临床样品，这些方法比常规RT-PCR方法的特异性更强，敏感性更高，但需要更高的成本。应特别注意的是，因其敏感性特别高，易引起假阳性，因此在检测时应尽可能避免RNA的污染。RT-PCR方法在PRRS的诊断及监测中发挥很大作用，在ELISA检测为阳性的基础上，再用高敏感性的RT-PCR进行确诊，这不仅可以降低费用，而且可拓宽RT-PCR的应用前景，如后备种猪的筛选，持续性感染猪的诊断及猪群的净化等[13-15]。
参考文献：
[1] 陈溥言.家畜传染病学[M].第五版.北京：中国农业出版社，2006.
[2] WENSVOORT G，TERPST RA C，POL J M. Mystery swine disease in the Netherlands： the isolation of Lelystad virus[J].Vet Q，1991，13（3）：121-130.
[3] 蔡宝样.猪繁殖与呼吸综合征病毒最新研究进展[J].中国畜禽传染病，1998（8）：18-20.
[4] 吴加强，姜 平.猪繁殖与呼吸综合征[J].畜牧与兽医，1999 （S1）：42-46.
[5] 杨汉春.我国猪繁殖与呼吸综合征的流行现状与控制对策动态[J].当代畜禽养殖业，2003（4）：43-46.
[6] 孟令伟，孙颖杰.猪蓝耳病的几种血清学诊断方法[J].中国动物检疫，1995（2）：14-15.
[7] 杨小燕，李晓华，沈绍新.猪繁殖与呼吸综合征的血清学调查[J].中国兽医杂志，2001（4）：17-18.
[8] 温振标，汤瑞珍.猪繁殖与呼吸综合征血清学调查报告[J].广西畜牧兽医，1999，15（5）：28-29.
[9] 陆文俊，黄 夏，赵国明，等.广西猪繁殖与呼吸综合征血清学调查[J].中国动物检疫，2002（3）：29-30.
[10] （美）B.E.斯特劳，（加）S.D.阿莱尔，（美）W.L.蒙加林，等.猪病学[M].第八版.赵明德，张仲秋，沈建忠，译.北京：中国农业大学出版社，2003.
[11] KRISTENSEN C S，BOTNER A，TAKAI H，et al. Experilnental airborne transmission of PRRS virus[J].Vet Microbiol，2004，99：197-202.
[12] 陈继明.重大动物疫病监测指南[M].北京：中国农业科学技术出版社，2008.
[13] 童光志，周艳君，郝晓芳，等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析[J].中国预防兽医学报，2007，29（5）：323-327.
1诊断方法
1．1形态学诊断AP感染人和易感动物后，主要侵染成熟或未成熟的髓系白细胞。取可疑患者末梢血作厚、薄血涂片，经吉姆萨染色，于中性粒细胞胞浆内发现多个无形体紧密堆积在一起形成桑葚样包涵体(morulaeelementarybody)可支持诊断。形态学诊断方法对采血时间要求严格，且诊断者要有较丰富的看片经验，否则容易发生漏诊和误诊。
1．2血清学诊断通过检测患者血清中抗AP的IgM和IgG类抗体水平及升高程度，可特异性诊断HGA。常用方法为间接免疫荧光(immunofluorescenceassays，IFA)法。采集急性期(发热初期，一般发病1周内)与恢复期(至少间隔2～3周)双份血清。如恢复期血清抗体检测阴性，应建议医生采集第3份血液样本(间隔2～4周)。如果同时检测双份血清，IgG抗体4倍升高，则结果强烈支持AP感染。如果急性期抗体升高，而恢复期没有升高或轻微升高，则应采集第3份血液样本(间隔2～4周)进行进一步检测。血清学诊断方法准确，特异性高，但由于抗体出现较晚，诊断所需时间较长，故血清学检测无法在早期对HGA进行诊断［3］。
1．3分离培养病原体多用人白血病细胞系HL60进行AP的分离培养。最常用的分离方法是将白细胞部分接种培养基，然后将100～500μL抗凝血接种到2×105或1×106个悬浮细胞内，每2～3d染色检查包涵体，一般5～10d可查见包涵体。从患者血标本中分离AP是确诊该病最可靠的方法，但细胞培养分离AP方法复杂和耗时，而且成功率不高。最终确认依然需要检测AP特异性核酸。
1．4分子检测方法AP感染可通过检测AP的DNA进行诊断，AP的分子生物检测方法可用于感染急性期的诊断，或用于后期病原体培养物的鉴定。分子检测诊断方法具有较高敏感性、特异性和可重复性，而且诊断快速、操作简单。
2AP分子检测技术
AP分子检测技术可用于对可疑患者血清样本进行检测，亦可对细胞培养后血细胞标本进行检测，同时也用于AP传播媒介－蜱的基因分子检测和分类。AP的基因组由单股环状染色体构成，长度为1471282bp，G+C百分比为41．6%，含有1369个开放读码框(ORF)。其特征性基因为外膜蛋白(majorsurfaceprotein，msp)以及ankA基因，100%的菌株具有msp2基因，70%的菌株具有ankA基因。目前AP分子检测常用的目标包括编码16SrRNA、热激蛋白(heat-shockprotein，groESL)、msp蛋白、AnkA蛋白等的基因。16SrRNA高度保守，是PCR检测最常扩增的靶基因，热激蛋白基因groESL扩增虽不如16SrRNA应用广泛，但groESL基因在不同种属间具有较大的变异性，因此，对于诊断及菌株的鉴定有重要意义;msp编码AP特征性外膜蛋白，这种蛋白质主要介导AP与不同宿主细胞间相互作用，并保证AP能更快地进入宿主细胞内。由于AP的宿主范围很广，包括多种脊椎动物和非脊椎动物，所以msp在不同来源的AP之间差异性大。其中msp2作为AP主要特征性外膜蛋白，已作为诊断AP感染的指征;ankA编码的锚定蛋白能够介导蛋白与蛋白之间的作用，因此AnkA在不同宿主间表现出多样性［5］。目前ank基因鉴定通常用于msp2阳性病例基础上，进行种属分型［6］。AP感染的分子生物学诊断方法主要包括巢式PCR(nestedPCR)、实时定量荧光PCR(realtimePCR)和环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)等。PCR和PCR相关检测技术是诊断AP感染的常规方法，目标基因与PCR引物见表1。
2．1巢式PCR(nestedPCR)巢式PCR是一种变异的PCR，使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物(因其在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增产物。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR检测可提高检测灵敏度和特异性，通常采用属特异和种特异引物同时进行检测。PCR检测应分区进行，避免污染。16SrRNA高度保守，是巢式PCR检测AP最常扩增的靶基因。由于AP的地域分布范围广，且有高度的生物学和临床学多样性，在比较不同地域发现的AP时最常用的方法就是巢式PCR。例如在波罗地海与挪威发现的AP比较研究就是用巢式PCR对16SrRNA和msp4进行测序分析［16］。Wuri-tu等用巢式PCR比较日本发现的AP与美国和欧洲AP的P44/msp2基因结构。热激蛋白基因groESL扩增虽不如16SrRNA应用广泛，但groEL基因在不同种属间具有较大的变异性。Adrian等［17］通过巢式PCR鉴定和比对不同国家野生动物体内AP的groEL不同，鉴定出新的菌株。因此，对于诊断及菌株的鉴定，groEL基因有重要意义。Massung等［18］在对ank基因鉴定并对AP进行种属分型时也应用该种方法。
2．2实时定量荧光PCR(realtimePCR)实时定量荧光PCR是将荧光共振能量传递现象、光学技术与常规PCR结合的一种PCR检测技术。即在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，在PCR指数扩增期间通过连续检测荧光信号的强弱来实时测定特异性产物的量，从而实现核酸的精确定量，最后通过标准曲线对目的基因的初始量进行总量分析。由于实时荧光定量PCR仪自动化程度高，因此比常规PCR特异性更强且有效解决了常规PCR的污染问题。常用方法有SYBRgreen法和探针法(TaqManprobe)。Klaus-Peter等［10］将荧光染料掺入法(SYBRgreen)用于AP的抗生素药物敏感性研究中。Joshua等［14］的研究中用探针法来鉴定AP和伯氏疏螺旋体。
2．3环介导等温扩增技术(LAMP)环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一种2000年开始出现的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术。其特点是针对靶基因的至少6个区域设计至少4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下，60～65℃恒温扩增，15～60min即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有灵敏度高、操作简单、反应时间短、特异性强、产物易检测等特点。在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。由于LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，操作简单方便。Lei等［15］用LAMP共针对目标基因8个区域设计6种特异性引物，特异性达100%。相比传统PCR技术，LAMP的特点更适合HGA在农村用于早期诊断，有着广泛的应用前景。
3小结与展望
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的一种重要的世界性传染病[1]，这种病毒主要经由血液传播，也可能存在其他传播途径如母婴传播、性传播和家庭内接触传播。约有近半数的HCV感染传播途径不明确。丙型肝炎的流行呈全球性，是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因。根据WHO统计，全球HCV的感染率约为3％，估计约2亿人感染了HCV，每年新发丙型肝炎病例约有3.5万例。目前尚无治疗丙型肝炎的疫苗，也没有有效的治疗方法。因此防控丙型肝炎传染源及阻断传播途径最为有效的手段就是早期准确诊断并及时发现 HCV感染者。从传染源和传播途径两方面控制丙型肝炎[2]。正因为如此世界各国都在不遗余力地研究诊断丙型肝炎的新技术。自1989年建立了丙肝病毒抗-HCV检测方法以来，随着医学检测技术和仪器的不断发展，丙型肝炎的检测技术一直处于不断发展中。到目前为止，丙型肝炎检测技术主要有抗-HCV检测、HCV-RNA核酸扩增检测、HCV核心抗原的检测以及同时检测抗-HCV和HCV核心抗原4种类型。本文将对丙型肝炎临床检验技术的发展与展望做一综述，现报道如下。
1 抗-HCV的检测
最早出现的HCV检测技术是抗-HCV的检测。由于HCV在病人外周血液中的含量及病毒抗原的含量很低，这就使得用常规方法难以直接检测，经过十几年的不断改进和发展，其检测方法又演变出多种，如:双抗原夹心 ELISA、间接酶联免疫吸附实验(间接 ELISA)、重组免疫印迹法(RIBA)、蛋白芯片检测法以及免疫层析法。在这些方法之中，重组免疫印迹法 (RIBA)是抗体检测的金标准，蛋白芯片检测法主要用于抗-HCV的分型。而ELISA由于其操作简单，检测设备廉价，因此成为应用最广的抗体检测技术。
根据出现时间的先后以及使用抗原的不同，抗-HCV检测技术可分成三代。第一代抗-HCV IgG试剂盒所用的抗原来自病毒基因组非结构区 (C100)，它的使用使 HCV的输血感染率下降了80%以上。但其缺陷是:灵敏度较低，抗体检出时间较晚， 敏感性也较高，达到80％～90％，但假阳性较高。第二代试剂除了包被C100抗原外又加入了HCV核心区多肽C22—3和非结构区抗原C33C。抗-C22-3和抗-C33C感染后出现较早，敏感性和特异性明显提高，感染后8～12周即可检测。且对 HCV的特异性较好，二者联合应用可进一步提高检出率。第三代HCV抗体ELISA试剂中采用了重组的NSS多肽，核心区抗原比例相对下降，而相应地增加了非结构区的NSS区 C33C抗原的比例，添加了NSS区抗原使其敏感性和特异性得到进一步改善。
上述三代抗-HCV检测方法多采用间接 ELISA，虽然也有过双抗原夹心直接检测抗-HCV的报道[3]，但由于HCV抗原存在不稳定性，因此至今仍无商品化的试剂盒。目前我国市售的抗- HCV试剂盒普遍是采用间接法的第三代抗-HCV ELISA试剂盒和胶体金试剂盒，其特异性可以达到92%～100%。但由于各厂家使用的HCV基因重组抗原的质量和各抗原片段包被比例有所不同，从而使各厂家试剂的灵敏度和特异性存在一定的差异，导致抗一HCV检测结果的不一致，产生漏检和假阳性等[4]，未能解决在正常ALT者和健康献血者存在的假阳性问题。加上少部分免疫功能不正常的HCV感染者，则不能检出抗一HCV。另外，由于“窗口期”的存在，仍有一定的漏检率[5]。目前抗-HCV的检测方法仍有改进的潜力，随着对HCV的研究不断深入，更多的 HCV蛋白会被发现，其中新型核心蛋白和外膜蛋白被认为能有效提高抗-HCV的灵敏度，但其对抗体的检出率依赖于抗原的获得方法，可能与抗原的构象表位有关[6，7]。
2 HCV-RNA核酸扩增检测技术(Nucleic-acid Amplification Technology NAT)
从外周血中检出HCV RNA是HCV复制活跃的可靠指标，在感染2个星期内的血清中可检测到HCVRNA，在感染自然恢复前血清中 HCVRNA将达到一个高峰[8]， 目前NAT检测被国内外部分机构作为 HCV感染的确认方法。但HCV RNA在达到峰值或重新出现前数天或数周内偶尔也可能检测不到[9]。同时HCV RNA还受进食的影响，易与血中脂质及脂蛋白结合，降低检出率[10]。因此在一定程度上影响了NAT检测方法的完美。另外由于NAT检测技术本身在技术和设备上要求较高，且耗时、实验步骤较多(其中任何步骤出现问题均影响其检出)，因此该方法也容易因污染而出现假阳性，难以在常规工作或基层实验室推广，限制了其应用的普遍性。
NAT检测技术同为检测HCV RNA，但不同的厂商发展出不同的方法和技术，其中PCR技术发展得最为迅速，也得到了最广泛的应用，最早的是 RT-PCR，然后是套式PCR，现在是实时荧光定量PCR，检测灵敏度特异性不断提高，且实现了全自动定量检测。最新的NAT研究有环介导等温基因扩增技术(LAMP)以及基因芯片技术[11，12]，由于LAMP技术操作简单，且无需特殊仪器，具有广阔的应用前景。
3 HCV抗原的检测
目前报道有两类HCV抗原包括非结构抗原和核心抗原的检测可作为HCV感染的指标。血清中HCV抗原的检测有利于 HCV感染患者的早期发现，特别是某些免疫功能紊乱、免疫功能低下的患者和某些不产生抗体的携带者。HCV核心抗原与 HCV RNA的动力学变化密切相关，可以作为HCV复制的标志[13]。
近年来对HCV抗原的检测方法的研究不断取得进展，关键点在于单克隆抗体的研制以及抗原抗体复合物解离剂的研究。近期美国Ortho公司已推出了用双抗体夹心法定性或定量检测血清样品中总的或游离的HCV核心抗原ELISA试剂盒，与 RT-PCR方法相比，具有操作简单、耗时短、对实验环境要求较低以及假阳性率低等特点，在临床上可用于HCV血清学转换前的早期急性丙型肝炎诊断、抗-HCV阳性感染者的病毒血症分析以及HCV感染者治疗前后病毒血症追踪分析等[14]。HCV核心抗原存在的时间较短(约27～70d)，所以HCV核心抗原的检测还要结合抗-HCV的结果。同时HCV核心区基因的变异也可能影响了HCV核心抗原的检测，比如HCV核心区49位氨基酸的突变就降低了抗原测定的敏感性[15]。改进现行试剂盒的主要途径是提高单克隆抗体对于天然抗原的构象表位的亲和力。
对于非结构蛋白的检测主要为NS3、NS4和NS5位点的蛋白[16]，由于这部分蛋白出现变异的概率较大，目前仅见报道。
4 同时检测抗-HCV和HCV核心抗原
联合检测抗原抗体的思路是HCV筛查试剂盒和血清学检测的发展方向。目前主要把HCV核心抗原和外周蛋白抗体及部分核心抗体相结合的检测试剂盒[17]。HCV核心抗原是HCV感染者体内出现的早期感染指标，几乎与HCV RNA同时出现，核心抗原和HCV RNA的动力学变化密切相关。
HCV核心抗原检测用双抗体夹心法定性或定量检测血清样品中的HCV核心抗原。该方法不受被检测样品中抗-HCV的干扰，检测结果准确可靠。可用于HCV早期急性丙型肝炎诊断，抗-HCV阳性感染者的病毒血症分析以及HCV感染者治疗前后病毒血症追踪分析[18]。目前已有两家商品化的试剂盒面世，但是这两种试剂盒都使用两步检测，而且检测时间都较长（超过2h），不利于快速的筛查和POCT工作。另外这两种试剂盒都不能区分阳性样本中抗原和抗体的存在情况，不利于进一步分析病情。
综上所述，无论HCV检测技术的怎么发展，都必须秉着快速、准确和有效这些原则。由此可以预测未来HCV检测技术会朝着两个方向发展，一方面是要求技术上的快速、精确反应 HCV感染状况的检测，降低假阳性的概率，使人们尽早发现病情。另一方面是有助于治疗HCV和疗效观察的检测，不断优化治疗HCV的方法，争取早日研究出治疗HCV的疫苗。对于第一种方向，人们较为容易理解，因为随着实验技术的不断进步，HCV检测的灵敏度逐步提高，HCV感染的“窗口期”将不断缩短。第二种方向也是当前分子诊断领域的方向，人们可以通过新的检测方法或是几种 HCV检测方法的综合应用来判断病人的病情，从而给予临床治疗提供及时帮助和指导。
参 考 文 献
[1] 张贺秋．丙型肝炎病毒核心抗原检测技术国内外临床研究应用情况[J]．丙型肝炎病毒核心抗原检测技术研究与应用论文汇编，1-8．
[2] 买制刚．丙型肝炎临床检验技术现状与发展[J]．中国卫生检验杂志，2008．18(1)：190-191.
[3] 张贺秋，王国华，陈坤，等.Ⅰ丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法酶联免疫试剂的初步临床评价[J].临床输血与检验， 2006， 8(1):12-13.
[4] 王福生．ELISA和PCR法筛查无偿献血者结果的分析[J]．细胞与免疫学杂志.2010，26(4)：398.
[5] 谢立，吴晓东．丙型肝炎病毒检测方法的研究进展及其临床意义[J].世界华人消化杂志，2005，13(7)：884—886.
[6] 魏葆，李金明.丙型肝炎病毒感染筛检中抗原表位的应用及其研究进展[J]中华肝脏病杂志，2006，14(12):955-957.
[7] 邵圣文，武文斌，于建国，等.丙型肝炎病毒F蛋白抗原性及患者血清F抗体流行率的研究[J].中华肝脏病杂志，2006， 14(12):890-893.
[8] Castillo I，Rodrí guez-IÌigo E， Bart oloméJ，et alHepatitis C virus replicates in peripheral blood mononuclear cells of patients with occulthepatitis C virus infection[J].Gut，2005，54(5):682-685.
[9] 陈朝霞，闵保华，陈延平.影响HCV-RNA荧光定量PCR检测的因素及其对策[J]国际检验医学杂志，2007， 28(02):175-176.
[10] Yatsuhashi H，YanoM.The present state and problems of HCV blood screening system in blood products[J].Nippon Rinsho，2001，59(7):1303-1307.
[11] 李启明，马学军，周蕊，等.环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)在丙型肝炎病毒基因检测中的应用[J]病毒学报， 2006， 22(5)：334-338．
[12] 陈姝，杨光，崔金环，等．膜芯片技术诊断乙型和丙型肝炎病毒与基因分型[J]．现代预防医学，2007，34(05)：817—819．
[13] Lee S， Kim YS， JoM， et al.Chip-based detection of hepatitis C virus using RNA ap tamers that s pecifically bind to HCV core antigen [J].Biochem Biophys Res Commun，2007，358 (1):47-521.
[14] Ansaldi F， B Bruzzone G， Testino M， etal.Combination of hepatitis C virus antigen and antibody immunoassay as a new tool for early di-agnosis of infection[J].J Viral Hepat，2006，13:5-10.
[15] Kmieciak D，Biernacka-Lukanty J， Migdalski P，et al.A correlati on between the heter ogeneity of hypervariable regi on 1 of E2 glycop roteinof Hepatitis C virus (HCV) and HCV antibody p r ofile: a case study[J].Acta Virol，2005，49(2):97-103.
[16] Dipti CA， Jain SK， Navin K.A novel recombinant multiepitope pro-tein as a hepatitis C diagnostic intermediate of high sensitivity and specificity[J].Protein Expr Purif，2006，47(1):319-328.
关键词：羊奶；牛奶；豆浆；多重实时荧光定量PCR
中图分类号：S879.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）06-0118-06
由于羊奶中含有的维生素和微量元素均高于牛奶，并且含有大量的乳清蛋白，其所含有的蛋白结构成分与母乳基本相同，被营养学界称之为“奶中之王”[1]。羊奶中不含引起人体过敏的异性蛋白，尤其适合胃肠较弱、体质较差的婴幼儿饮用，但市场上的羊奶品质参差不齐。随着消费者认可度的不断提高，在利益的驱动下，在羊奶中掺入牛奶或者豆浆的现象非常普遍，掺假手段多种多样，不断变换，仅靠感官鉴评和传统的试验方法已不能满足市场需要[2]，严重影响我国奶业的健康发展。
目前，用于检测羊奶掺假的方法主要有气象色谱、液相色谱、电泳、PCR、ELISA和近红外光谱法等[3～6]。实时荧光定量PCR方法是以DNA为基础的一种检测技术，不受掺假形式的影响，可以进行快速、批量、自动、实时检测分析，具有灵敏度高、准确性好等优点，已经在动物源性成分检测项目上逐步取代一般PCR方法成为最常用的分子生物学检测手段[7]。为了保障羊乳及其产品品质，确保消费者的利益，建立准确检测牛羊乳及豆浆混掺的技术越来越重要。本试验旨在利用TaqMan探针实时荧光定量PCR方法，建立一种快速、准确检测羊奶中是否掺有牛奶和豆浆的方法。
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1试验材料试验所用标准液态牛奶、液态羊奶取自山东省畜牧研究所奶牛及山羊养殖基地，液态豆浆是本实验室用大豆加工而成。市售样品为购自济南市大、中、小型超市的不同品牌奶制品。
1.1.2主要试剂与仪器试剂：Chelex-100（天根生化科技有限公司，北京）、蛋白酶K（TaKaRa，日本）、核算定量检测试剂盒（TaKaRa，日本）。
仪器：ABI7500实时荧光定量PCR仪（ABI，美国）、高速冷冻离心机（Eppendorf，德国）、Nanodrop 核酸蛋白含量测定仪（Eppendorf，德国）。
1.2试验方法
1.2.1样品基因组DNA的提取分别取牛奶、羊奶、豆浆液体样品2 mL加入2 mL无菌离心管中，2 500 r/min、4℃恒温离心30 min，弃上清液保留沉淀；向离心管中加入1 mL无菌磷酸钾缓冲液（pH 7.4），轻轻混匀后转移至1.5 mL离心管中，3 500 r/min室温离心10 min，弃上清；向沉淀中分别加入280 μL 5%Chelex-100和20 μL 20 mg/mL蛋白酶K，56℃孵育30 min，漩涡震荡10 s混合均匀，100℃煮沸8 min，13 000 r/min离心3 min；将上清加入吸附柱中13 000 r/min离心1 min收集液体；向收集液中加入20 μL GlassMilk 和600 μL gDNA Binding Buffer充分混匀，65℃水浴15 min（其间不断轻柔地上下翻转离心管），室温放置5 min（其间不断轻柔上下翻转离心管）；4 000 r/min离心1 min，弃上清；向离心管中加入500 μL 70%乙醇，8 000 r/min离心1 min，弃上清，重复2次；加入500 μL无水乙醇轻轻混匀，8 000 r/min离心1 min，弃上清；8 000 r/min离心30 s，用10 μL枪头吸走残余液体，室温放置至彻底干燥；加入100 μL TE（pH 7.0）70℃水浴5 min，瞬间离心，转移上清液至新的离心管中-20℃保存备用。使用Nanodrop 核酸蛋白含量测定仪测定核酸浓度。
1.2.2引物及探针设计分别参照牛、山羊和绵羊线粒体基因组中高度保守的16S rRNA基因序列和大豆的KTi-S基因（GI：510514）序列，用Primer Premier 5.0设计牛奶、羊奶通用引物序列（UF、UR），大豆引物序列（Lectin-F、Lectin-R），内参引物序列（IACF、 IACR）。使用Beacon Designer 2.0 设计特异分子信标（MB）探针，其中牛奶探针（NP）用CY3标记，羊奶探针（YP）用JOE标记，豆浆探针（LectinP）用FAM标记，内标探针（IACP）用ROX标记，3′端的淬灭基团用Dabcyl修饰。引物及探针序列见表1。
1.2.3多重实时荧光定量PCR检测体系建立通过优化反应体系中的引物浓度、探针浓度和退火温度等条件，建立分别检测羊、牛和大豆源性成分的单重荧光定量PCR体系。将4种引物及探针组合在一起，分别或同时以羊、牛和大豆基因组DNA为模板，优化引物、探针浓度和退火温度等反应体系和条件，建立能同时检测羊、牛和大豆源性成分的多重荧光定量PCR体系。
1.2.4结果判定实时荧光定量PCR扩增结束后获取Ct值，当Ct值
1.2.5基因组DNA检测灵敏度试验分别提取羊奶、牛奶及豆浆的基因组DNA，用Nanodrop定量到50 ng/μL，做10倍梯度稀释（10-1、10-2、10-3、10-4），对每个梯度按照优化后的扩增体系和条件分别进行检测。
1.2.6羊奶中掺杂牛奶或豆浆灵敏度试验将豆浆和羊奶以一定体积比例混合，制成豆浆含量分别为0、0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的混合奶样品；将牛奶和羊奶以一定比例混合，制成牛奶含量分别为0、0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的混合奶样品。按照优化后的反应体系和条件分别进行检测。
1.2.7市售样本检测使用优化后的荧光定量PCR方法对35份奶制品样本进行源性鉴定，验证检测方法的实用价值。
2结果与分析
2.1多重实时荧光定量PCR检测体系的建立
参照优化的单重荧光定量PCR反应体系及条件，将羊、牛、大豆和内标质控的引物及探针组合在一起，先分别以羊、牛和大豆基因组DNA为模板优化反应体系，然后同时加入3种基因组DNA模板，通过调整反应体系中主要成分浓度和体积以及反应条件，优化反应体系，最终筛选出最适宜的多重实时荧光定量PCR体系。20 μL反应体系包括5× Premix 4 μL，HS-Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，引物 Mix（2 μmol/L）2 μL， 探针 Mix（2 μmol/L）2 μL，内标质控IAC DNA模板（1 ng/μL）2 μL，检测样品DNA 模板2 μL，双蒸水7.8 μL。PCR反应条件为：95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、34 s，40个循环，60℃延伸时收集荧光信号。图1为多重实时荧光定量PCR扩增曲线图，其中A图同时检测出羊和牛源性成分，大豆源性为阴性；B图样本中同时检测出大豆和牛源性成分，羊源性成分为阴性。
2.2基因组DNA灵敏度试验
结果（图2）显示，当模板DNA浓度稀释至10-4倍，即DNA质量为0.01 ng时，所建立的荧光定量PCR检测体系仍然能够产生良好的特异扩增曲线。此时纯羊奶、牛奶及豆浆模板检测到的Ct值分别为33.64±0.02、34.80±0.018和34.87±0.03，均
2.3羊奶中掺杂牛奶或豆浆灵敏度试验
将牛奶或豆浆以0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的体积比掺入至纯羊奶中，结果显示当牛奶或豆浆含量为0.1%时，多重实时荧光定量PCR体系仍有特异性扩增曲线，并且其Ct值均
2.4市售样本的实际检测
利用本研究建立的羊奶中牛奶和大豆源性多重荧光定量PCR检测体系对35份市售羊奶、羊奶粉、牛奶、牛奶粉进行源性鉴定。结果如表2所示，15份羊奶及相关制品中都含有羊源性成分，其中10份含有牛源性成分，4份含有大豆成分，分别占样本总数的66%和26%；20份牛奶及相关制品中全部检出牛源性成分，9份样品中检测出大豆成分，占样本总数的45%。
3讨论与结论
目前现有的牛羊乳检测方法多是依据羊乳和牛乳化学组成上的差异，以牛羊乳中蛋白质、脂肪、DNA、维生素等为特征指标进行检测[8]。色谱-质谱结合技术是分离蛋白质、定量检测牛羊乳混掺的重要方法，有研究表明该方法可以实现牛羊乳混掺的快速检测，能检测牛羊混合乳中牛乳含量的最低水平为5%[9]。毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）技术也在牛羊乳检测中得到了应用[10]，但存在检测灵敏度偏低的缺点[11]。利用近红外光谱法检测掺假羊奶需要足够的专业知识，建立模型才能对检测结果进行分析，对检测人员的要求较高，不易普及推广[12]。荧光定量PCR方法是基于DNA水平的检测，克服了以上技术的不足，被越来越多地应用到奶制品的检测中。由于核酸比蛋白质更稳定，抗热能力更强，并且含有更多遗传信息，所以基于DNA的动物源性检测方法比蛋白免疫法更有优势[13]。
曾少灵等用多重实时荧光定量PCR检测牛、山羊和绵羊源性成分[14]；孟芳等应用荧光定量PCR方法仅能鉴别牛、羊奶[15]；刘小艳等用实时荧光定量PCR方法检测模拟奶制品中常见谷物成分的检出限为0.5%[16]。本研究参照牛、山羊和绵羊线粒体基因组中高保守的16S rRNA基因和大豆的KTi-S基因为靶基因设计探针建立多重实时荧光定量PCR检测方法，该方法不仅能够针对羊奶、牛奶和豆浆进行快速准确的鉴别，而且能对奶制品进行掺假检测；在扩增循环内只出现特异性扩增曲线无交叉扩增曲线；对纯DNA含量的最低检出浓度为0.01 ng；对模拟掺假的奶制品中目标成分的最低检出限为0.1%（V/V），说明本研究建立的多重实时荧光定量PCR方法具有特异性好、灵敏度高等优点。经实际市售奶制品检测验证了其可行性和适用性，适用于奶类样品掺假的快速检测。
参考文献：
[1]焦凌梅， 袁唯. 改善山羊乳风味的方法研究[J]. 中国乳业， 2006（6）：56-58.
[2]蒋儒林， 张金丽. 关于原奶掺假提高脂肪和蛋白质含量的检测方法 [J]. 乳品加工，2005，10（5）：37-39.
[3]Chen R K， Chang L W， Chung Y Y， et al. Quantification of cow milk adulteration in goat milk using high-performance liquid chromatography with electrospray ionization mass spectrometry [J]. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2004， 18（10）： 1167-1171.
[4]López-Calleja I M， González I， Fajardo V， et al. Application of an indirect ELISA and a PCR technique for detection of cow’ s milk in sheep’s and goat， milk cheeses[J]. International Dairy Journal， 2007， 17（1）： 87-93.
[5]薛海燕，胡围围，宋宏新，等.羊乳中掺入牛奶的间接ELISA定量检测[J].食品科学，2010，31（24）：370-373.
[6]郭美兰，孙正鹏，张超，等. 近红外透反射光谱用于掺假牛奶的快速识别初探[J].化学界，2010（5）：270-273.
[7]刘旭辉，马贵平，史喜菊，等.商品中动物源性成分检测方法的研究进展[J].动物医学进展，2007，28（10）：91-94.
[8]张晓旭，葛武斌，李宝宝，等. 牛羊乳混掺检测鉴别技术研究进展[J]. 食品安全质量检测学报，2015，6（9）：3594-3601.
[9]Ferreira I M， Caote H. Detection and quantification of bovine， ovine and caprine milk percentages in protected denomination of origin cheeses by reversed-phase high-performance liquid chromatography of beta-lactoglobulins [J]. J. Chromatogr. A， 2003， 1015（1/2）：111-118.
[10]Mu～ller L， Barták P， BednrˇP， et al. Capillary electrophoresis-mass spectrometry-a fast and reliable tool for the monitoring of milk adulteration [J]. Electrophoresis， 2008， 29（10）：2088-2093.
[11]王宁，刘佳，李书文，等. 毛细管电泳-质谱联用技术研究进展[J]. 氨基酸和生物资源，2015，37（2）：1-5.
[12]李亮，丁武.掺有植物性填充物牛奶的近红外光谱判别分析[J].光谱学与光谱分析，2010，30（5）：1238-1242.
[13]邵碧英，杨婕，张体银. 动物产品的DNA提取方法[J] .畜牧与兽医，2005，37（9）：47-49.
[14]曾少灵，秦智锋，花群义，等.多重实时荧光PCR检测牛、山羊和绵羊源性成分[J].生物技术与方法，2009，25（1）：139-146.