时间：2023-06-05 10:16:09
关键词：肿瘤抗原； 免疫治疗； 肿瘤疫苗
中图分类号：R730.51 文献标识码：A 文章编号：1006-3315（2014）07-152-001
肿瘤的免疫治疗与肿瘤抗原息息相关。肿瘤细胞表达的肿瘤抗原，为肿瘤细胞具有免疫原性的蛋白质。肿瘤抗原是这样被发现的：肿瘤病人血液中的T细胞或抗体对肿瘤细胞有一定杀伤作用，提示肿瘤细胞表面有抗原物质，人们进一步分离纯化肿瘤细胞表面的蛋白质或多肽，经过繁琐的T细胞杀伤或抗体结合实验，再利用序列测定手段，参照蛋白质序列数据库，就确定了肿瘤细胞的抗原物质[1]。经过进一步研究，相继发现了许多肿瘤抗原。
深入研究发现，一种肿瘤抗原并非某种肿瘤细胞特有，肿瘤抗原可能表达于某种正常组织细胞中，也可能为曾经出现在发育过程中，但又在肿瘤细胞异常表达。总之，肿瘤抗原都是正常情况下有表达或者曾经有表达的蛋白质，只是在不适当的地点，不适当的时间，或以不适当的量被表达了[2]。肿瘤抗原作为肿瘤细胞的一种标记，使肿瘤细胞可被人体免疫系统识别。当然，正是肿瘤抗原的这种特性，可使肿瘤细胞逃过机体免疫系统的识别，为免疫治疗带来了一定难度。而肿瘤的免疫治疗通过激发和增强机体的免疫功能，控制肿瘤细胞生长或杀灭肿瘤细胞。目前，肿瘤免疫治疗的手段有以下几种：
1.非特异性免疫治疗
通过应用免疫调节剂，增强机体的非特异性免疫，激活机体免疫应答，杀伤肿瘤细胞。
2.主动免疫治疗
肿瘤的主动免疫治疗是指给机体输入某种具有抗原性的瘤苗，刺激机体免疫系统产生抗肿瘤细胞的特异性免疫，以治疗肿瘤的方法。目前用于免疫治疗的瘤苗有以下几种：
2.1以肿瘤细胞作为免疫原的疫苗
肿瘤细胞疫苗是自身或异体同种肿瘤组织经过物理化学生物因素灭活处理后加佐剂后制成的肿瘤疫苗[3]。这种疫苗降低了致瘤性，但却保留了免疫原性，临床上已试用于多种实体瘤的治疗并取得一定成效。
2.2以多肽作为免疫原的肿瘤疫苗
以多肽作为免疫原的肿瘤疫苗又称为肿瘤多肽疫苗，由来自肿瘤特异性抗原、病毒相关抗原、癌基因或抑癌基因突变蛋白的多肽组成的，根据来源不同可分为合成肽类、热休克蛋白类（HSP）和 DNA类等。
2.3异构的肿瘤疫苗
自体或同种肿瘤细胞经过碘乙酸盐，神经氨酸酶等修饰处理，增强了其免疫原性，可作疫苗应用。
2.4抗独特型疫苗
抗独特型抗体是由抗独特型抗体（抗-Id）制成。抗-Id有模拟肿瘤抗原及免疫调节的双重作用，打破机体对肿瘤抗原的免疫耐受状态[4]。抗独特型抗体疫苗有Ab1疫苗，Ab2疫苗，微抗体，单链抗体疫苗等。抗独特型抗体，可模拟抗原的结构，并代替肿瘤抗原成为疫苗，诱发机体特异性免疫应答的产生。制备简便，只需以肿瘤特异性单克隆抗体作为免疫原，制备抗体并筛选抗独特型抗体，不需要分离或鉴别肿瘤抗原。目前已用于治疗B淋巴细胞瘤。
2.5重组DNA病毒疫苗
通过基因重组技术将多种目的基因导入受体细胞制成而不能复制的重组DNA病毒疫苗，无需佐剂，此病毒感染机体时导致炎症反应，激发机体特异性细胞和体液免疫反应。一般痘苗病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒等可作为比较理想的病毒载体，肿瘤抗原、共刺激因子和细胞因子作为插入的外源基因。
3.被动免疫治疗
通过给机体输注外源的免疫效应物质，由这些外源性免疫效应物质发挥抗肿瘤作用。
3.1抗肿瘤导向治疗
免疫导向疗法是将单克隆抗体与具有细胞毒作用的杀伤因子偶联制成“生物导弹”，因单克隆抗体能特异结合肿瘤抗原，将杀伤因子集中到肿瘤病灶，以杀伤肿瘤细胞。常用杀伤因子有：放射性核素（I131）、抗肿瘤药物（氨甲蝶呤、阿霉素）、毒素（蓖麻毒素、白喉毒素等）。
3.2过继免疫疗法
过继免疫疗法是取患者自身的免疫细胞在体外培养后再回输入患者体内，或取对肿瘤有免疫的供者的免疫细胞转输给患者，使这些免疫细胞在患者体内重新发挥抗肿瘤作用。过继免疫疗法的效应细胞具有异质性，如CTL、NK细胞、巨噬细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）等都在杀伤肿瘤细胞中起作用。
综上所述，免疫疗法作为肿瘤治疗的一种新的手段，为临床肿瘤治疗提供了新的思路。但是免疫疗法只能清除少量播散肿瘤灶，对晚期实体瘤疗效有限。故目前只作为一种辅助疗法，在用手术、化疗、放疗等常规疗法清扫大部分瘤细灶后，再用免疫疗法清除残存的瘤细胞，可提高肿瘤治疗的效果。
参考文献：
[1]万谦，张朝良，翟朝阳.生物化学与生物物理进展[J]1999，26（2）
[2]Drew M，Pardoll.A new look for the 1990s. Nature， 1994， 369（6479）：357-358
【摘要】 目的 探讨恶性黑色素瘤患者应用冷冻免疫生物治疗的临床意义。方法 对86例恶性黑色素瘤患者分别采用冷冻免疫生物治疗、常规手术切除或放疗加化疗，观察各组治疗前后免疫功能变化、T淋巴细胞亚群改变，并评价5年生存期。结果 治疗后冷冻免疫治疗组中位生存时间(MST，2年8个月)较标准治疗对照组(MST，1年8个月)明显升高(P均＜0.05)。治疗后冷冻免疫治疗组CD4、CD4/CD8较治疗前及标准治疗对照组明显升高(P均＜0.05)。而治疗后标准治疗对照组较治疗前血CD3、CD4水平、CD4/CD8比值显著下降(P均＜0.05)。结论 冷冻免疫生物疗法可提高患者免疫功能，明显延长患者生存时间。
【关键词】 黑色素瘤；冷冻；生物疗法；瘤苗
恶性黑色素瘤(malignant melenoma，MM)发病率占人体恶性肿瘤的1%～2%，恶性程度较高，即使是Ⅰ期病变，也有11%的患者术后出现局部复发或远处转移［1］。对有复发或转移者应用含氮烯咪胺(DTIC)、顺铂(DDP)、卡莫司汀(BCNU)和三苯氧胺的联合化疗方案，虽有一定疗效，但对远期生存影响不大。近年来我们对恶性黑色素瘤患者应用冷冻免疫生物治疗，疗效较好，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 86例恶性黑色素瘤患者均为2000年4月～2002年4月我院与安阳市肿瘤医院收治的恶性黑色素瘤患者，男60例，女26例。年龄19～78岁，中位年龄45岁。肿瘤部位以头面部和四肢最多见(71.9%)，躯干、消化道和生殖系统分别占11.0%、8.1%、6.5%。临床分期：Ⅰ期28例(32.6%)；Ⅱ期37例(43.0%)；Ⅲ期21例(24.4%)。
1.2 研究方法 随机选35例分入冷冻免疫生物治疗组。方法：(1)冷冻破坏术，采用液氮冷冻破坏术，一般采用接触法、喷射法和倾注浸泡法3种。1次冷冻包括3个快冻慢融周期，冷冻范围超过病灶1～1.5cm。(2)冷冻瘤苗埋藏术［2］，冷冻破坏癌瘤后或切除癌瘤后冷冻灭活制成瘤苗，置无菌液氮罐中冷冻保存，定期进行冷冻瘤苗回植皮下埋藏术。短小棒状杆菌菌苗、卡介苗为佐剂。(3)生物治疗，INFα 300万u，sc，每周一、三、五用药；IL-2 200～400万u，im，每周二、四、六用药，共用药6～8周［3］。51例患者用常规手术切除或放疗加化疗等治疗方法为对照组，化学治疗药物以PDD、CBP和DTIC为主(PDD 100mg/m2，第1天；或CBP 350mg/m2，第1天；或DTIC 125mg/m2，第1～5天)。21～28天为1个周期，2～3周期为1个疗程。
1.3 观察指标 治疗前两组均进行免疫功能检查、T淋巴细胞亚群检测(CD43、CD4、CD48)。2个月后两组同时复查上述指标，并评价5年生存率。
1.4 统计学方法 采用社会科学统计分析软件包(SPSS 10.0)进行数据管理及统计分析。数值变量资料用均数±标准差(2 结果
2.1 冷冻免疫治疗恶性黑色素瘤对生存率的影响 见表1。冷冻免疫治疗组较标准治疗对照组中位存活时间显著延长(P均＜0.05)。
表1 冷冻免疫治疗恶性黑色素瘤对生存率的影响
注：冷冻免疫治疗组υs标准治疗对照组，*P＜0.001
2.2 冷冻免疫治疗恶性黑色素瘤对机体免疫功能的影响 见表2。应用冷冻免疫治疗后恶性黑色素瘤患者血CD3、CD4水平、CD4/CD8水平较治疗前显著升高(P均＜0.001)。治疗后冷冻免疫治疗组较标准治疗对照组血CD3、CD4水平、CD4/CD8比值显著升高(P均＜0.001)。治疗后标准治疗对照组较治疗前血CD3、CD4水平、CD4/CD8比值显著下降(P均＜0.05)。
3 讨论
恶性黑色素瘤是一种少见的高度恶性肿瘤，可发生于身体任何部位，容易发生血行和(或)淋巴结转移，预后较差。恶性黑色素瘤发生发展与机体免疫功能状态有关。Mark［4］发现恶性黑色素瘤患者血清中存在能与自体或异体瘤组织特异性结合的自身抗体，少数患者的肿瘤有自发消退的现象，印证了恶性黑色素瘤与免疫过程的密切关系。因此提高机体的免疫应激能力，尤其是提高细胞免疫系统的功能是治疗恶性黑色素瘤患者的重要环节［2，5］。 表2 冷冻免疫治疗恶性黑色素瘤对机体免疫功能的影响 （x±s）
注：冷冻免疫治疗组υs标准治疗对照组治疗前后差值，*P＜0.001(采用配对样本t检验)；治疗后υs治疗前，#P＜0.05(采用独立样本t检验)
我们采用冷冻免疫生物治疗恶性黑色素瘤治疗效果明显，结果显示此疗法可以提高患者中位生存率、3年生存率，明显优于标准治疗对照组(P＜0.05)。我们的研究还提示冷冻免疫生物治疗恶性黑色素瘤能激发机体产生细胞免疫效应。近期研究发现恶性黑色素瘤患者具有能与其自身肿瘤抗原发生反应的致敏淋巴细胞；特异性主动免疫治疗能增强这种反应性，而不是重新诱导反应。肿瘤疫苗能诱导免疫记忆应答，从而加强对肿瘤细胞的免疫监视，减少显微转移灶形成［5］。汤钊猷［6］研究提示冷冻破坏癌细胞所引起的抗原的释放，比放射线、激光照射损害肿瘤细胞所引起的抗原释放都高，且这种免疫效应具有种属、器官、组织特异性。
本研究表明冷冻免疫生物疗法可提高患者生存率，为治疗恶性黑色素瘤探索出一条新的有效途径。但作为一种主动特异性的治疗手段，仍需进一步探寻免疫原性的特异性更高的疫苗制剂及研究免疫疫苗对恶性黑色素瘤主动特异免疫治疗的机制。
【参考文献】
1 李顺凡(译).人体恶性黑色素瘤.国外医学·皮肤病学分册，1998，2(12)：93-94.
2 Hausen，Gruis NA，Weaver-Feldhaus J，et al.A cell cycleregulator potentially involveding enesisofmany tuner types.Science，1997，88：110.
3 Legha SS，Ring S，Eton O，et al.Development of a biochemotherapy regimen with concurrent administration of cisplatin，vinblasbine，dacarbazine，interferon alfa，and interleukin-2 for patients with metastatic melanoma.J Clin Oncol，1998，16(5)：1752-1759.
4 Mark J.Howcell scycletowardcancer.Science，1994，263：319.
【关键词】肿瘤;细胞免疫疗法;分子生物学
机体免疫系统能够识别和清除肿瘤细胞已被许多实验明确证实。细胞免疫疗法通过提取人体最有力攻破癌细胞的免疫细胞，对其进行诱导、扩增、激活，使其具有识别和杀死肿瘤细胞的能力后再回输到病人体内，通过增强机体对肿瘤细胞的免疫应答能力的方式来抑制或消除肿瘤的生物细胞免疫疗法。近年来的研究显示，以免疫治疗为主体的肿瘤生物治疗已被公认为继手术、放疗和化疗后的肿瘤治疗的第四模式，其疗效已在多种肿瘤的治疗中得到验证。本文就细胞免疫疗法在临床多种癌症治疗中的应用进行综述。
1过继性细胞免疫治疗白血病
细胞免疫治疗成为白血病治疗中一个迅速发展的领域。Armstrong等曾将白血病的细胞免疫治疗大致分为两类：一是输注可在体内刺激抗白血病活性的细胞，即疫苗治疗；二是输注有内在抗白血病活性的免疫效应细胞，即过继性细胞免疫治疗。有学者用肿瘤特异抗原（TSA）/肿瘤相关抗原（TAA）的某些肽段致敏肿瘤患者缓解期自身T淋巴细胞，诱导产生特异性CTL，在体外可有效杀伤患者自身肿瘤细胞，而对正常造血细胞无毒作用。Sprent等报道了DC来源的exosomes能在体外直接诱导CD8+T细胞扩增，因此认为其在体外扩增抗原特异性CTL方面具有重要的理论和临床应用价值。乔建辉等在国内首次报道DSI能促进异基因造血干细胞移植后供者嵌合体的增加，有利于供者细胞植入，而且具有并发症少，较好的GVL效应等优势。最近一项针对半相合移植后复发患者的DSI临床报道显示，20例复发患者中有8例达到完全缓解，平均生存1118d，治疗效果比较满意。
2肺癌的细胞免疫疗法
免疫治疗是肺癌综合治疗的主要手段之一，细胞免疫治疗通过给机体输注抗肿瘤免疫效应细胞的方法来达到治疗肿瘤的目的。许多动物实验和临床资料表明，IL一2／LAK细胞疗法具有抑制瘤、杀伤瘤作用。近来，Ebina将BAK疗法应用于非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗。该研究提示具有免疫活性的NSCLC患者更适合BAK疗法。BAK细胞治疗可纠正免疫功能低下，有利于延长NSCLC患者的生存期，提高生存质量。TIL细胞治疗结肠直肠癌、恶性黑色素瘤与肾细胞癌已显示一定的临床疗效。近年来，CD3 AK细胞抗肿瘤作用的基础和临床应用研究取得了长足进展。杨新静等将CIK细胞用于肺癌的治疗研究，研究发现经过体外制备的CIK细胞不仅增殖速度快，而且对肺癌细胞体内外均具有高效的杀伤活性。
3卵巢癌的免疫治疗
卵巢癌是女性生殖器常见恶性肿瘤之一，近年来，有关卵巢癌免疫治疗方面的研究较多。Bjorge等指出，因为卵巢癌在远处转移前的相当长一段时间内都存在于腹膜腔内，并且卵巢癌术后遗留微小病变细胞处于休眠状态或至少处于低代谢率，所以卵巢癌非常适用于局部单克隆抗体的免疫治疗。过继细胞免疫治疗，其优点是绕过了机体免疫系统对肿瘤抗原的免疫耐受效应。Lambeck等研究了在卵巢癌患者体内的p53特异性T细胞反应，表明卵巢癌患者体内存在一种弱的混合型辅T细胞，即p53特异性T细胞可以诱导p53特异Thl／CTL免疫，其研究结果支持了使用p53长肽作为瘤苗免疫策略的理论。卵巢癌的免疫治疗仍处于实验室研究阶段和部分临床前期研究阶段，需对肿瘤特异抗原、机体抗肿瘤免疫、肿瘤化疗与免疫治疗的时序等基础和临床问题进行更深入的研究。
4EBV病毒特异性CTL治疗鼻咽癌
鼻咽癌细胞表达HLA I类分子，抗原递呈机制正常。鼻咽癌病人外周血中存在EBV特异性CTL，具备细胞免疫治疗的基础。Chua等报告EBV特异性多克隆CTL(5×107―3x108)治疗4例晚期鼻咽癌病人，除外周血EBV拷贝数降低外，没有观察到肿瘤缩小。Straathof等报告6例复发性／难治性鼻咽癌病人接受EBV特异性多克隆CTL(2×107／m2-2×10S／m2)后，CR 2例，PR 2例，SD l例，PD 1例。5例病人的外周血EBV拷贝数在6周内明显降低，另1例在治疗前没有检测到EBV。EBV特异性多克隆CTL输注没有明显毒副作用。生物治疗技术的进步使鼻咽癌患者获得更多治疗机会，但是，鼻咽癌是地区性疾病。受到国际社会的关注程度有限，需要更多的循证医学证据来证实生物治疗对鼻咽癌的有效性。
随着肿瘤分子生物学和肿瘤免疫学的发展，已能在体外培养出许多种类不同的特异性和非特异性的抗肿瘤效应细胞，尤其是肿瘤抗原的鉴定和合成、四聚体检测及分拣以及DC细胞的培养，使得能在体外成功地培养出大量的肿瘤特异性CTL细胞，真正开始了主动免疫和过继性免疫相结合的肿瘤特异性免疫治疗。细胞免疫治疗将与传统的肿瘤治疗(手术，化、放疗)和新的治疗方法如基因治疗、抗血管生成治疗等相联合，使其在肿瘤治疗中发挥重要的作用。
参考文献
【关键词】 树突活细胞；瘤病毒；尖锐湿疣
由于目前没有特效的抗病毒药物，尖锐湿疣的治疗必须采用综合治疗，本治疗是对HPV病毒感染提出的一套完整的综合治疗方案。随着人类基因组计划的完成，临床医疗模式也发生改革。本治疗是运用分子生物学和生物治疗技术，通过定向提高患者细胞免疫功能，从根本上治疗反复发作性尖锐湿疣的一种新型生物治疗方法。这种疾病采用传统的激光及放化疗均无法治愈，普通理化治疗只消除外在的增生，而非针对特异病毒及特异病理改变，对深部及周围的游离病毒、胞内病毒和潜伏病毒无效，所以要做到根治人瘤病毒(HPV)十分困难。目前主张利用分子生物学及细胞免疫学技术，获得患者被感染病毒致敏的活性免疫细胞，利用免疫细胞的靶向游走及免疫活性，深入到病灶深部及周围病变组织，彻底杀灭感染深层及周围的游离病毒和胞内病毒，并提高针对患者感染病毒类型的免疫功能，对患者实行个体化综合治疗。我们自2004年5月～2005年7月采用该项目用于尖锐湿疣的临床治疗，到目前为止，已有200多例尖锐湿疣患者接受了该技术的治疗，并对其疗效和安全性进行了临床试验，获得满意的预防及治疗效果，复发率由普通疗法的75％降至4％，并为预防泌尿生殖器系癌变的发生提供了有力措施，产生了较大的社会效益。
1 资料与方法
1．1病例入选标准
(1)临床上检查为典型尖锐湿疣及5％醋酸白试验阳性者；(2)患者年龄不限，性别不限；(3)无严重心、肝、肾等器质性疾病；(4)征得患者本人同意，签署知情同意书并按试验方案用药及随访。
1．2病例排除标准
(1)未按规定完成疗程者；(2)未按时复诊者。
1．3对象
随机分为治疗组及对照组。治疗组54例，男26例，女28例，平均发病年龄40．6岁，平均病程8个月。对照组54例，男28例，女26例，平均发病年龄41．2岁，平均病程7、6个月。
1．4治疗和试验方法 两组患者均首先予以激光治疗，去除大部可见的疣体组织，但保留个别典型疣体作为治疗观察的靶皮损。对照组用重组干扰素治疗，300万U／天，肌肉注射，疗程1个月；治疗组采用树突细胞免疫治疗方法，抽患者外周血20ml，留取1ml做流式细胞仪检测，其余提取单个核细胞，用HPV6，11，Ll抗原诱导，常规方法培养树突细胞，培养致敏7天后，离心收集树突细胞，于原发病部位及周围皮下注射，治疗流程第一天取血、第七天回注，重复6～8次为一疗程。疗程次数需据病情而定。治疗期间患者应(1)加强营养，树立信心，按时治疗。(2)避免与他人的性接触，每天换洗内裤，保持个人卫生。(3)保持与医务人员沟通，如有不适，及时报告。注射部位红、痒或轻微烧灼感为正常现象。疗程结束后全部病例随访6个月以上。
1．5．观察项目
(1)临床指标：治疗后复发率，复发时问及次数；复发程度：面积，部位，疣体数量；并发症与转归。(2)实验室检测指标：人瘤病毒PCR检测；病理学检测。
2 结 果
2．1临床病情变化
全部病例随访6个月后，治疗组54例中，未复发者50例，占全部治疗组95％以上。1例复发者在疣体去除后3、4、6周时复发，另1例复发者在疣体去除后3个月时复发，但复发程度较轻，仅又长出1～3个较小疣体。继续治疗后，有一例因在直肠部位无法治疗外，均未见复发。对照组54例中，未复发者13例，占全部对照组25％，41例复发者在疣体去除后4―8周内复发，疣体生长较快，数目多且体积较大，随访观察期间需多次切除。两组复发例数差异有显著意义(P
2．2副反应
治疗组患者主诉注射部位红、痒或轻微烧灼感，一般在注射细胞1天后即消失，无其它不适。对照组因多次反复切除，局部易感染，并可出现注射干扰素的副作用等。
3 讨 论
3．1有利于实行个体化综合治疗
国内外目前对HPV感染的治疗普遍采用激光、高频电刀、冷冻、放射线照射等物理治疗，或外涂抗代谢药物等化学治疗乃至手术治疗，治疗目的都只限于消除外在的增生，仅针对表面已形成的病理改变，而非针对特异类型的病毒及其所造成的特异病理及免疫改变，可谓治标不治本，所以不可能做到根治HPV感染及其病变，更不能阻断HPV感染的传播及预防相关癌变的发生。因此临床上良性增生特别是尖锐湿疣的复发率居高不下，慢性感染潜伏、迁延，导致多种相关癌肿发生率提高并容易合并其它感染。利用分子生物学及细胞免疫学技术，获得患者被感染病毒致敏的活性免疫细胞，利用免疫细胞的靶向游走及免疫活性，深入到病灶深部及周围病变组织，彻底杀灭感染深层及周围的游离病毒和胞内病毒，并提高针对患者感染病毒类型的免疫功能，有利于对患者实行个体化综合治疗。
3．2与传统治疗技术比较优点显著
本疗法与传统的治疗技术比较，具有如下特点：(1)个体化治疗。在传统医疗过程中，无论是外科手术或内科用药，都是病理形态相同就采用相同的治疗方案，这就导致如HPV病毒感染这类因基因而异的疾病只能缓解，无法根治。个体化治疗则有的放矢，为人瘤病毒感染的治疗提供了新的技术和治疗模式。(2)分子生物学与细胞免疫综合治疗。通过特异抗原及其可体内表达的DNA与具有记忆功能的免疫细胞充分接触，免疫系统具有了特别针对患者感染病毒的活性免疫细胞，彻底消灭清除病毒。精确长久的免疫记忆，为防止复发、再感染或癌变提供了长期保护。(3)靶向清除。利用免疫细胞的靶向游走治疗疾病，能产生特异性的靶向免疫杀伤力，只清除癌变或被感染的异常细胞，对正常细胞无毒无害。(4)安全。采用患者自体细胞可避免血源叉感染。采用经抗原致敏的树突细胞为主的主动免疫治疗方法，对人瘤病毒感染导致的反复复发、难治型生殖器尖锐湿疣有满意的治疗效果，显著降低复发率。且在治疗中采用患者自身细胞作为效应细胞，副作用小、费用低。我们的研究再次证明，细胞免疫功能在人瘤病毒感染的转归中起着至关重要的作用，可改善细胞免疫功能，有助于清除病毒，提高疗效。纠正HPV感染引起的机体特异免疫缺损，特别是感染局部皮肤粘膜特异免疫缺损，不仅可祛除外在的增生，而且可破坏清除潜伏的病毒感染，从而达到根治及防止复发、防止合并其它病原体感染的疗效。
关键词：结核； 免疫治疗
【中图分类号】R52 【文献标识码】B 【文章编号】1672-3783(2012)09-0534-01
1 概述
关于结核病免疫治疗的研究，主要是集中在几个方面（1）增强TH1型免疫反应和抑制TH2型免疫反应及抑制B细胞免疫反应的免疫调控因子代替治疗。（2）分枝杆菌及其提取物的疫苗治疗。（3）基因疫苗或基因工程疫苗治疗。（4）增强非特异性免疫力和免疫制剂（非分枝杆菌苗、中草药、化学制剂）治疗（5）基于BCG在结核病疫苗预防中的肯定作用。（6）干细胞免疫重建。
（一）结合分枝杆菌感染的特殊性：结合分枝杆菌感染宿主后，不仅可被吞噬细胞吞噬、杀灭或抑制，还可在免疫吞噬细胞内寄生，这一特殊性决定了结核病免疫中抗原处理和抗原识别的特殊性。（二）结核分歧杆菌的抗原处理和抗原呈递细胞的人体免疫的第一个环节通过抗原呈递细胞或靶抗原呈递细胞来实现。1.结核病免疫抗原呈递细胞有两类，一类为具有免疫活性的单核—吞噬细胞，树突状细胞—呈递外源性抗原之APC。2.抗原处理，呈递和识别途径（1）外源性抗原处理（2）内源性抗原处理。（三）非特异性免疫调节和效应细胞，1.巨噬细胞：是自然免疫中抵抗结核分枝杆菌感染的重要免疫细胞2.自然杀伤细胞（NK细胞）：是参与对细胞内病原体免疫的重要成员。3.中性粒细胞：结核分枝杆菌感染后，中性粒细胞的趋化作用增强，并且在结核结节中聚集。（四）获得性免疫记忆，调节和效应细胞。1.免疫记忆性T细胞2.抗结核免疫调节T细胞3.抗结核免疫效应细胞。（五）参与免疫调节的细胞因子。（六）参与抗结核分枝杆菌免疫的效应分子。（七）免疫反应终结效应点简单明确。
2 免疫治疗途径和治疗方法
（1）因子替代治疗:1）增强Th1型免疫反应的细胞因子代替治疗。2）抑制Th2型免疫反应的细胞因子代替治疗。3）细胞毒性细胞分子。4）小分子细胞因子代替治疗。（2）非特异性免疫治疗：1)非分枝杆菌菌苗治疗：金葡菌素，短小棒状杆菌菌苗等。2)中草药免疫治疗：主要为非特异性调节人体免疫功能，如黄芪多糖、枸杞多糖等。3)化学药物免疫佐剂的应用。（3）分枝杆菌及其代谢产物及基因疫苗治疗。1)卡介苗免疫治疗：应注意免疫治疗时机的选择，单独使用或过早使用可能加重病理损害，但在有效治疗1个月后再在与治疗药物同时使用是安全的。2)它对Th1免疫途径和细胞毒免疫途径有增强作用，尤其对细胞毒免疫途径的增强作用明显，可提高结核病临床治疗效果和细菌学治愈率，降低5年远期复发率，降低耐多药结核病发生率。3)其他分枝杆菌免疫治疗：包括耻垢分枝杆菌菌苗，草分枝杆菌制剂等，均对增强Th1型免疫和提高结核病临床效果有较好的作用。4)灭活菌苗或分枝杆菌提取物疫苗治疗，包括母牛分枝杆菌菌苗、卡介苗多糖核酸注射液等，与化疗联用能使结核病患者体重增加，加快痰菌阴转，病灶吸收及空洞缩小，闭合的速度，缩短短程化疗疗程，提高了联合化疗的疗效。5)基因疫苗的治疗：DNA疫苗在细胞内表达的内源性抗原，不仅能诱导体液免疫和Th1型细胞免疫应答，还能诱导特异性细胞毒淋巴细胞应答，这对于巨噬细胞内寄生的分枝杆菌疾病更有意义。（4）免疫重建：通过自体干细胞移植技术自身可塑性免疫原始细胞输入体内，补充免疫细胞，恢复或增强患者细胞免疫功能的免疫治疗方法。
3 结论
开展结核病免疫治疗，既是时代的需要，也是社会发展的需要，今后研究工作要注意以下几个方面：1.选择适合于免疫治疗效果考核的细胞因子。2.寻求即增强Th1型免疫力有增强细胞毒途径免疫力的免疫治疗剂3.充分应用卡介苗4.认识免疫治疗的负反应。5.重视免疫治疗的时机选择。6.免疫治疗与化疗联合应用的必要性。
参考文献
[1] North RJ, Jung YJ. Immunity to tuberculosis[J]. Annu Rev Immunol, 2004,22 (4): 599-623
[2] Tomioka H. Adjunctive immunotherapy of mycobacterial infection[J]. Curr Pharm Des,2004,26(10):3297-3312
[3] Hiraki A, Aoe K, Matsuo K, et al. Simultaneousmeasurement of T2-helper 1 cytokines in tuberculous pleural effu-sion[J]. Int J Tubere Lung Dis,2003,7(12):1172-1177
[4] Jalapathy KV, Prabha C, Sulochana D, et al. Correlates of protective immune response in tuberculosis pleurits[J]. FEMS Immunol Med Microbiol,2004,40(2):139-145
[5] Wilkinson KA, Aung H, Wu M, et al. Modulation of transforming growth factor β-1 gene expression by interleukin-12[J]. Scand J Immunol, 2000,52: 271-277
恶性肿瘤的临床治疗中，以细胞毒性药物为基础的化疗是重要的方式。但由于该药物多缺乏选择性，导致对肿瘤细胞杀伤的同时，对快速增值的正常细胞也存在一定的杀伤作用[1]。因此，相关研究认为，化疗会使机体的免疫功能受到损伤，对抗肿瘤免疫应答产生不利的影响。为分析抗肿瘤化疗与肿瘤免疫的关系，本研究以在我接受治疗的肿瘤患者为例，进行分析，现将结果报道如下。
1.资料与方法
1.1 临床资料
以2016年1月至2017年1月在我院接受治疗的50例患者作为研究对象，入选患者经临床病史影像病理诊断后均确诊为恶性肿瘤，同意接受抗肿瘤化疗。其中男性患者28例，女性患者22例，年龄34-81岁，平均年龄（49.5±6.7）岁，肿瘤种类为肺癌14例，直肠癌7例，恶性淋巴瘤9例，鼻咽癌5例，胃癌15例。
1.2 方法
入选患者均进行抗肿瘤化疗，在化疗前后，在患者清晨空腹的情况下，采取静脉血，检查T淋巴细胞（CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）、NK细胞（CD3/CD16+56+），使用液相平衡竞争放射免疫分析法测定IL-2、IL-6。
1.3 统计学处理
经统计学软件SPSS19.0统计分析，计量资料以平均值±标准差（±s），t检验，计数资料以百分率（%）表示，检验，若P
2.结果
2.1 治疗前后入选者免疫细胞情况比较
治疗后患者的免疫细胞CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、NK均高于治疗前（P0.05）
2.2 治疗前后IL-2、IL-6情况变化
IL-2治疗后高于治疗前，Il-6治疗后低于治疗前，治疗前后比较存在统计学差异（P
3.讨论
威胁人类健康和生命的重要疾病中，肿瘤是其中的一种，对于肿瘤的临床治疗，抗肿瘤化疗药对肿瘤细胞具有杀伤力，因此成为了常用的治疗方法[2]。而抗重力化疗与肿瘤免疫有密切的关系。本研究以我院患者为例，对抗肿瘤药物治疗前后，免疫免疫指标进行分析，发现T淋巴细胞群中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、NK均高于治疗前，这是因为，当CD4+细胞是免疫应答的主要反应细胞，活化、增值和分化为效应辅助细胞，产生IL-2、TNF等淋巴因子，或者分化成杀伤T细胞，或产生B细胞辅助效应，促进体液免疫免疫功能，表现出强大的抗肿瘤效应。CD8+对靶细胞发生细胞介导的细胞毒作用，能够直接杀伤肿瘤细胞，而结果中的显示肿瘤患者在治疗后，肿瘤细胞大量的坏死，生成了免疫抑制因子，肿瘤免疫功能得到恢复[3]。而NK细胞通过释放细胞毒性杀伤靶细胞是清除肿瘤细胞的防线，本研究中患者治疗后CD3+上升后的免疫应答增加了NK细胞的活性，因此，NK细胞有所上升。IL-2是辅T细胞分泌的因子，能够保证T细胞的存活和增加，IL-2的增加刺激T细胞的生长，具有较强的免疫调节作用，而IL-6则能够促进多种细胞的生长和分化，增加肿瘤细胞的活动性，使肿瘤细胞转移或浸润，其升高时表示肿瘤诱发机体产生了免疫抑制，而本研究中治疗后IL-2升高，IL-6降低则表现出抗肿瘤化疗后，增加了免疫调节，降低了免疫抑制，进而提高了抗肿瘤化疗的效果。
C上所述，抗肿瘤化疗与肿瘤免疫关系密切，临床中对患者的肿瘤免疫状态了解，能够提高患者抗肿瘤化疗的效果。
参考文献
[1]张睿，高石磊，王娟，马洪玉，赵芳. 化疗联合免疫治疗对急性白血病患者T淋巴细胞亚群、白介素-6、肿瘤坏死因子-α的影响[J]. 医学理论与实践，2016，15（20）：3499-3500.
一、猪病治疗难的原因
1、疾病表现复杂多病原混合感染已成为猪病发生的主要形式，使得临诊表现和病理变化不及单纯感染典型同时，非典型化病例的出现。使猪病诊断更加困难。基层兽医常用的方法仍是流行病学诊断、临诊诊断或病理学诊断，有些甚至不会病理剖检。因此，疾病诊断是治疗的前提，当前猪病治疗难的主要原因之一就是诊断困难。
2、免疫抑制病危害严重
免疫抑制是由于免疫系统受到损害。导致机体对抗原应答能力下降对疾病敏感性增强的一种免疫异常状态。引起免疫抑制的病因有非传染性因子和传染性因子两大类。非传染性因子有霉菌毒素、营养缺乏、药物因素及应激因素等。传染性因子有猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪蓝耳病病毒等。免疫抑制因子破坏机体免疫系统，使免疫应答紊乱，增加了对某些疾病的易感性。因此，在治疗时。除应对症治疗外。提高机体免疫力也尤为重要。
3、混合感染
当前猪病流行特点之一是多病原引起的混合感染。如细菌与细菌、细菌与病毒、病毒与病毒或与寄生虫等。猪一旦发病多为混合感染。多重感染带来的后果就是增加诊断和防制的难度。同种治疗方法在单纯感染和混合感染病例上呈现出的疗效存在差异。原因在于细菌混合共存，更为重要的是混合感染常使抗生素活性受到干扰，增加了治疗难度。
4、兽药质量存在问题
我国有1600多家生产企业通过GMP认证，但兽药质量仍不容乐观。在农业部每期公布的不合格兽药企业名单里有些知名企业。在每次兽药监察中经常有不合格产品出现。目前。兽药存在的问题主要有：某些兽药厂以及兽药经销商为了自己的利益生产和流通假冒兽药；添加违禁药物成分，如抗病毒西药；药物含量不足，有些甚至查不到药物成份；包装标示药物与实际所含药物不同从而影响治疗效果，耽误治疗时机。
5、猪病防治观念不正确
猪传染病控制原则是：预防为主，治疗为辅，防重于治，防治结合。其中预防是根本，治疗是在前期预防效果不佳的前提下采取的一种补救措施。但许多人对传染病的防治认识存在偏差，割裂了预防与治疗之间的关系和区别，把平时的工作重点放在治疗上。淡化了饲养管理、生物安全等综合措施。
6、兽药的滥用
控制猪病，诊断是基础，药物是关键，治疗是目的。药物是治疗疾病的武器，但若用法不科学，不但起不到良好效果，还会增加治疗难度。一是给药途径不当。当前以“高热”为症侯群的猪病，发病后多减食或拒食，此时若以拌料方式给药，肯定达不到预期的治疗效果。但若改为注射加饮水的方式，则效果较好；--是疗程不够。在治疗时。部分养殖户往往是猪病情稍好转即停止用药，导致有效浓度维持时间较短。治后又复发，同时，还会产生耐药性；三是盲目联合用药。药物之间存在协同、拮抗等作用，配合得当，增强疗效，相反，降低疗效；四是耐药菌株不断产生，严重影响治疗效果，增加了治疗难度。
二、防控猪病的对策
1、掌握猪病诊断方法，拓宽疾病诊断思维
在掌握传统诊断方法同时，猪病实验室诊断技术将是今后猪病诊断的重要方向。因此，建议有条件的猪场或兽医门诊最好设猪病诊断实验室，进行快速检测即可。
2、合理防控免疫抑制病危害
做好免疫抑制病的预防接种；禁喂发霉变质饲料。饲料中添加霉菌毒素吸附剂，使用免疫增效剂提高机体免疫力，目前，使用的免疫增效剂有中药制剂，如黄芪多糖、香菇多糖等；细胞因子制剂，如干扰素、白细胞介素、植物血凝素等；此外，还有左旋咪唑、维生素类等，均可激活细胞免疫活性，调节免疫功能，增强机体免疫力；加强饲养管理，减少应激，给猪只创造一个良好的生长环境。
3、科学用药
使用兽药时要严格按照药物特性、作用机理、适应证、作用用途、剂量、方法、疗程及禁忌来选择合理的药物，保证以合格的药物，合理的用药次数，充足的疗程，合理的配伍进行合理治疗才能提高治疗效果。有条件时，最好做药敏试验，在药敏结果的基础上合理选择药物，会大大提高治疗效果。降低治疗难度。无条件时。最好选择平时场内不常用或少用的药物，或注意各地对分离菌株所做的药敏试验。
三、总结
摘要：
免疫疗法是目前肿瘤治疗的一种新方法，应用前景广阔，在治疗相关毒性和疗效方面较传统疗法均具有明显优势。免疫检查点抑制、克服肿瘤免疫逃逸和重建抗肿瘤免疫机制是肿瘤免疫治疗的关键。在肝细胞癌中，免疫治疗尚处于初级阶段，免疫治疗单独或联合其他治疗方法可能有利于控制肿瘤进展，但总体疗效仍然有限。本文结合免疫治疗在肿瘤中的研究和应用进展，分析了肝细胞癌免疫治疗研究现状以及面临的挑战。
关键词：
癌,肝细胞；免疫系统；免疫疗法
肝细胞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率在世界上位居恶性肿瘤的第五位，在肿瘤相关死亡原因中位列第三位[1-2]。经HCC早期治疗预后较好，5年生存率大于70%。但由于缺乏有效的筛查机制和早期诊断方法，我国大多数HCC患者发现时已经处于中晚期，失去根治性治疗的机会。加之HCC对传统放疗、化疗均不敏感，目前用于HCC治疗的靶向药物索拉非尼客观有效率仅为3.3%，临床有效率也仅为30.0%左右[3-4]。近十年来HCC的治疗几乎未取得任何实质性的突破，迫切须要探索新的治疗方法。
基于HCC发生的病理机制，免疫治疗被认为是HCC治疗的潜在有效方法。某些治疗方法如经导管动脉化疗栓塞、射频消融等也能够诱导机体抗肿瘤应答，为临床上免疫联合局部治疗HCC提供了依据[5-6]。多种免疫效应机制能够靶向肿瘤细胞，包括细胞因子、多肽疫苗、单克隆抗体以及细胞介导的疫苗都可以成为激发抗肿瘤免疫应答的潜在治疗方法，而且在治疗相关毒性和疗效方面，免疫治疗都具有其独到的优势。
1HCC的免疫缺陷
肝脏的长期慢性炎症诱导了HCC的发生，其中HBV和HCV慢性感染是HCC发生的主要危险因素，其他因素包括肥胖、糖尿病、酒精性和非酒精性脂肪肝以及其他慢性肝脏疾病。大多数患者从慢性肝炎、肝硬化最终发展成HCC是一个动态发展过程，其中肿瘤特异性细胞免疫和体液免疫应答贯穿着HCC的发生发展过程。在HCC患者体内存在着针对多种肿瘤抗原如AFP、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、纽约食管鳞癌蛋白-1滑膜肉瘤X断裂点基因-2黑色素瘤相关抗原A10和P53的自发性T细胞免疫应答[7-13]。但是，由于肿瘤自身调节的多种免疫抑制机制的存在，导致这些T细胞应答并不能抑制肿瘤的进展。首先，正常参与免疫应答的分子，例如主要组织相容性抗原，其作用在肿瘤中常常出现下调，导致肿瘤抗原呈递障碍。共刺激分子B7-1和B7-2在HCC中的表达也是减少的，在缺乏共刺激分子的作用下，MHCⅡ类分子诱导了CD4+T细胞的无应答，可导致肿瘤发生免疫逃逸[14]。最终，免疫抑制性淋巴细胞数量升高、NK细胞功能抑制以及免疫检查点上调使HCC细胞免疫应答的效应功能受损[15-17]。免疫抑制细胞，如调节性T细胞与骨髓来源的抑制细胞是免疫逃逸发生的关键细胞。HCC患者外周血和肿瘤组织中Tregs细胞数量增加[18]。MDSCs是骨髓来源的一群异质性细胞，是树突状细胞、巨噬细胞和/或粒细胞的前体，具有显著抑制免疫细胞应答的能力，能够抑制NK细胞的细胞毒作用和CD4+、CD8+T细胞的获得性免疫应答，促进Tregs细胞扩增，诱导程序性死亡配体-1分子表达，抑制抗原提呈。而肝癌患者的外周血、脾脏、骨髓以及肝脏可见MDSCs汇集。最近，在HCC患者中发现一种调节性DCs细胞，体外能够产生IL-10，从而抑制T细胞活性。另外，多种免疫关键点分子，如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原、PD-L1在肿瘤微环境中常常出现过表达[19-20]。因此，克服HCC的体液免疫和细胞免疫缺陷，提高机体抗肿瘤免疫应答，是HCC治疗领域一直探索和寻求解决的问题。
2HCC免疫治疗的分类
传统的免疫治疗包括疫苗治疗和细胞因子诱导的杀伤细胞治疗。而在过去十年中，随着对肿瘤生物学认识的加深和生物技术的发展，对肿瘤产生免疫逃逸的关键决定分子——免疫检查点分子的识别，全基因组测序对特异性分子变异的快速检测，为肿瘤免疫治疗提供了可用的分子靶点。基因治疗技术的发展，使体外基因修饰的或外源性的基因能够转导到体内肿瘤细胞，以再次激发免疫应答。上述主要进展改变了既往肿瘤免疫治疗的格局。
2.1细胞因子治疗
IFN能够抑制慢性HBV、HCV相关HCC的发生以及HCC的复发。IFN-α通过增强淋巴细胞增生、肿瘤抗原提呈和细胞毒反应诱导机体抗肿瘤应答，能够阻断或延缓根治性切除或消融术后HCC复发[21-22]，有效延长进展期HCC生存期，延缓肿瘤进展[23]。IFN-α也可以与化疗药物如顺铂、5-FU联合用于进展期肝癌[24]。IFN-γ能够诱导HCC细胞凋亡，与5-FU联合用于具有门静脉侵犯的HCC患者，其完全应答率为16%，部分应答率为36%[25]。但是目前对于IFN在HCC中的使用尚存在争议[26]，还不能作为HCC的常规治疗。IL-2作为免疫刺激因子，在免疫系统中具有重要功能，在多种肿瘤，尤其在黑色素瘤和肾细胞癌中具有抗肿瘤作用。
2.2疫苗治疗
肿瘤疫苗治疗的目的是诱导肿瘤特异性免疫应答，利用效应性T细胞特异性降低肿瘤负荷，诱导免疫记忆，控制肿瘤复发。疫苗治疗主要针对肿瘤相关抗原或者肿瘤新生抗原。TAAs是在肿瘤细胞异性表达、发生突变或异常表达的抗原，能被后天免疫系统识别，可以应用于免疫治疗的新方法中。肿瘤特异性CD8+T细胞在肿瘤的控制中起着十分重要的作用，这些特异性的T细胞可以识别TAAs中8～11个氨基酸肽链，并与MHCⅠ类复合物相关。TAAs可作为特异性人源单克隆抗体的靶点或用于设计人源化或嵌合单克隆抗体。肿瘤靶向抗体包括淋巴瘤中的利妥昔单抗，乳腺癌中的曲妥珠单抗，转移性结直肠癌和肺癌中的贝伐单抗，以及转移性结直肠癌和进展期头颈部癌中的西妥昔单抗已经被证实有效并且目前已部分应用于治疗。在HCC的免疫治疗中，某些TAAs已经被作为治疗靶点。AFP是HCC特异性抗原，作为潜在的肝癌肿瘤特异性抗原已被充分研究。然而在现已报道的几种基于AFP的免疫治疗方案中，并没有发现十分有效的临床获益[27-28]。GPC3是硫酸乙酰肝素蛋白多糖磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族一员，通过糖基磷脂酰肌醇附着于细胞表面。GPC3不仅具有肿瘤特异性，而且在细胞增殖的过程中起着一定作用。因此，GPC3成为治疗HCC的一个较有希望的靶点。在早期肝癌国际指南中，GPC3可作为血清标志物结合免疫组化染色用于HCC早期诊断。多个临床研究已证实多肽疫苗以及GPC3靶向抗体免疫治疗的可行性[29]，表明GPC3多肽疫苗可作为全新的免疫治疗方法应用于HCC患者中，有提高总生存期的可能。其他TAAs，如MAGE-A1、MAGE-A3、NY-ESO-1在HCC患者中过表达率分别约为65%、70%和45%[30]，并且都有很高的免疫原性，可能成为疫苗靶点，但尚缺乏在肝癌治疗方面的临床研究。DCs细胞接种是HCC免疫治疗的较好方法[31]。肿瘤环境中，由于IL-6、VEGF、IL-10等细胞因子的释放，使DCs细胞活性受到抑制。通过体外活化DCs细胞、体内刺激DCs细胞成熟以及肿瘤相关抗原优化等策略，DCs疫苗能够启动强的针对TAAs的细胞毒性T淋巴细胞应答，诱导肿瘤细胞死亡。DCs细胞接种也可以联合其他治疗方式如TACE或分子靶向治疗，提高抗肿瘤治疗疗效。DCs疫苗联合酪氨酸激酶抑制剂如索拉非尼也可能会提高疗效[32]。在异源性造血干细胞移植的免疫应答中，DCs细胞接种取得了安全而且令人鼓舞的结果[33]。在肝癌行肝移植治疗的患者中，其有望有效控制肿瘤高复发率并改善预后，但还须要临床研究进一步证实。总之，从目前的临床研究结果来看，DCs疫苗治疗安全性比较高，但是其整体临床疗效尚不满意并有待提高。
2.3细胞治疗
过继细胞治疗是利用肿瘤患者自身具有抗肿瘤活性的淋巴细胞，在体外扩增后再回输人体。ACT对多种类型的肿瘤治疗有效，例如黑色素瘤、肾细胞癌和神经母细胞瘤[30,34-35]。目前常用于肿瘤患者的ACT包括：CIKs、DCs细胞以及肿瘤浸润的淋巴细胞和基因修饰的T细胞。CIKs是在体外使用多种细胞因子和抗CD3抗体共同培养人外周血单个核细胞，细胞中包含活化的NKG2DhighT细胞、活化NK细胞和NKT细胞。CIKs细胞易于活跃增殖并大量获得，不须依赖TCR-MHCⅠ类分子相互作用而对多数肿瘤细胞都有杀伤活性。在一项肝癌切除治疗的随机对照研究中，IL-2与抗CD3刺激PBMC作为术后辅助治疗，发现肿瘤的复发率降低了41%[36]。RFA后序贯ACT治疗也能降低HCC的复发[37]。Kamiya等[38]应用K562-mb15-41BBL细胞系刺激健康供者的外周血细胞，获得大量活化扩增的NK细胞，并且发现通过这种方法扩增的NK细胞比IL-2活化的NK细胞对HCC细胞系具有更明显的细胞毒作用，能够明显降低免疫缺陷荷瘤鼠的肿瘤生长，提高生存时间。这种扩增活化的NK细胞在临床HCC患者中的应用尚须进一步研究。在基于DCs细胞的HCC免疫治疗中，刺激DCs细胞的方法有多种。使用AFP多肽刺激的DCs细胞治疗的Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，疾病控制率达到28%[39]。另外还有使用肿瘤裂解液刺激DCs细胞，部分应答率达到10%。OK432，一种来源于链球菌的抗肿瘤免疫治疗药物，在肝癌的TACE治疗中或治疗后导入肿瘤组织[40]，较对照组表现了较长的无瘤生存期。肿瘤浸润性淋巴细胞，是从肿瘤的手术标本中分离出的浸润淋巴细胞，用抗CD3抗体培养扩增后可产生几十亿细胞回输给患者，与IL-2同时注入可以促进T细胞的生长。一项肿瘤浸润淋巴细胞治疗转移性黑色素瘤的数据显示，48%患者获得总体应答，13%获得持久完全应答[41]。随着生物技术的不断发展，以嵌合抗原受体为基础的免疫治疗已被证明成为治疗恶性肿瘤的有效手段之一。CAR的作用原理是利用基因工程技术，以非MHC限制性的方式识别目标抗原的嵌合受体，使免疫细胞具有特异性识别和杀伤肿瘤的能力。使用CAR-T细胞治疗恶性肿瘤有多重优势：靶抗原的非人白细胞抗原依赖，对多数患者具有广泛适应性，可以规避肿瘤逃逸并能短时间内扩增肿瘤特异的T细胞群。CAR-T细胞技术在血液系统恶性肿瘤治疗中已有了成功应用，如何将该技术用于实体瘤的治疗尚待进一步研究。该技术不但须要稳定产生肿瘤靶向的T细胞，还须要克服抵抗肿瘤微环境中免疫效应分子对CAR-T细胞的抑制和对其凋亡的诱导，调动内在抗肿瘤反应的功能。利用CAR-T细胞来激活内源抗肿瘤反应（如：TILs、NK细胞、先天免疫系统）也是重要的研究方向。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性都是关键的决定因素。理想的目标抗原是仅在肿瘤细胞表面表达的肿瘤特异性抗原，但是肿瘤细胞表达的大多数抗原不具备肿瘤特异性，因此大多数的CAR都以TAAs作为靶点，往往会有“脱靶”的可能。现阶段常用的靶点除CD19以外，也有相关报道以ERRB2（雌激素受体β2）、HER-2/neu治疗肺部和前列腺癌，针对前列腺特异性抗原治疗前列腺癌、碳酸酐酶-IX治疗肾细胞癌，LewisY治疗肺癌和卵巢癌等。近年来，CAR-T细胞在实体瘤的治疗上也显示了广阔的前景。在治疗淋巴瘤的临床试验中，使用CD20特异性CAR-T细胞表现出了良好的抗肿瘤活性和耐受性[42]。由于肝癌细胞相对缺乏肿瘤特异性抗原，限制了CAR-T细胞在肝癌治疗中的研究和使用。2014年，上海交通大学和第二军医大学的研究人员开发了GPC3特异性CAR-T细胞[43]，评估了GPC3-特异性CAR-T细胞对HCC的治疗作用，发现GPC3靶向CAR-T细胞能够有效消除GPC3阳性HCC细胞，从而为GPC3阳性HCC提供了一种很有前途的治疗方法。另外，在某些实体瘤中，TAAs特异性CAR-T细胞治疗表现出比较严重的毒副反应，可能是由于TAAs在正常组织中也存在低水平表达。这也一定程度上限制了这种治疗技术的临床使用。
2.4免疫检查点抑制剂
免疫检查点是共抑制分子，能干扰免疫应答，避免T细胞过度活化和组织损伤。主要成员包括CTLA-4、PD-1，T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3，淋巴细胞活化基因-3及B和T淋巴细胞弱化子。抗-CTLA-4能够阻断CTLA-4对效应性T细胞和Tregs细胞的作用，发挥抗肿瘤活性。2种抗-CTLA-4单克隆抗体在某些肿瘤，如黑色素瘤中的使用已经表现出作用。Ipilimumab是抗-CTLA-4单克隆抗体，可以明显延长转移性黑色素瘤的生存时间（治疗与未治疗患者的2年生存率分别为18%和5%）[44]；替西木单抗是另外一种抗-CTLA-4单克隆抗体，与CTLA-4结合可以阻止其与B7配体相结合，从而抑制B7-CTLA-4所介导的T细胞活性下降。替西木单抗也是第一个在慢性HCV感染相关HCC患者中进行临床验证的关键点阻断单克隆抗体[45]。研究发现替西木单抗可以抑制HCV相关的晚期肝癌进展。该研究纳入了21例晚期肝癌患者，给药方式为每90d接受15mg/kg静脉注射1次，每例患者约接受2个疗程治疗。其中2名患者出现了肿瘤缩小，11例患者肿瘤稳定超过1年。平均肿瘤进展时间接近7个月。免疫检查点抑制剂在肝癌中的应用值得进一步探讨。PD-1是T细胞应答的潜在抑制子，阻断PD-1分子成为HCC的一种治疗选择。Nivolumab是一种完全人类IgG4单克隆抗体PD-1抑制剂，在转移性黑色素瘤、肾细胞癌和非小细胞肺癌中的应答率分别为28%、27%和18%[46]。2015年5月，在第51届美国肿瘤学会年会上[47]，公布了一项有关nivolumab的临床Ⅰ/Ⅱ期研究结果，表明nivolumab治疗晚期肝癌是安全有效的。47例有效患者12个月的总存活率为62%，25%的患者出现部分应答或完全应答，更重要的是，有4例患者应答超过12个月。研究数据令人振奋，提示免疫检查点抑制剂介导免疫治疗在肝癌治疗中的有效性，但是尚需要更大型的临床研究验证。
2.5免疫联合治疗
免疫治疗可以联合使用于肿瘤的治疗，例如免疫检查点PD-1与CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和LAG-3抑制剂的联合使用等，在HCC中的应用也将会有更多的研究报道。另外，免疫治疗也能够与外科手术、局部治疗和分子靶向治疗等联合使用，进一步激发抗肿瘤免疫。单独化疗对肿瘤不一定有效，但是化疗可以诱导肿瘤细胞死亡，阻断肿瘤诱导的免疫逃逸[48]，例如降低免疫抑制细胞如MDSCs和Tregs的数量，因此可以作为免疫治疗的辅助治疗。在结肠癌肝转移模型中，Oxaliplatin联合腺病毒介导的肝内IL-12表达明显提高了抗肿瘤应答反应。酪氨酸激酶抑制剂如索拉非尼联合免疫治疗是否有效目前还不明确。
3免疫治疗面临的挑战和前景
免疫治疗是目前进展期肿瘤最有前景的治疗策略之一，但是仍然面临种种挑战。首先，免疫治疗缺乏有效的疗效预测分子标志物，不能很好地确定哪些患者能从治疗中受益；另外，虽然几种免疫治疗均表现了其可行性和安全性，但其抗肿瘤活性尚不充分，联合其他免疫治疗或传统的化疗、放疗等方法，可能会增加对免疫治疗的应答，因此须要研究哪种联合治疗方案更为有效。另外一个亟须解决的重要问题是肿瘤对免疫治疗的疗效目前很难评估，还没有标准用以充分评估免疫治疗的疗效。由于免疫治疗的疗效滞后，目前既有的2种HCC应答评估工具：实体瘤的疗效评价标准和mRECIST在免疫治疗中并不适用。以上问题的解决将有利于促进这种方法在HCC中的应用，全面实现其疗效。
4小结
摘 要 目的：评价疣体埋藏联合转移因子及安达芬软膏治疗扁平疣的临床效果。方法：将60例扁平疣患者随机分为两组，对照组口服转移因子10ml或3mg，2次/日，外用安达芬软膏，2次/日，治疗组在此基础上加用疣体埋藏。结果：治疗组总有效率86.7%，对照组总有效率63.3%，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。结论：疣体埋藏联合转移因子及安达芬软膏治疗扁平疣疗效显著，不良反应小。
关键词 疣体埋藏 转移因子 安达芬 扁平疣
关键词 疣体埋藏 转移因子 安达芬 扁平疣
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.05.101
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.05.101
扁平疣是由人瘤病毒感染所引起的皮肤科常见病、多发病之一，好发于青少年，影响美观，2009年6月～2011年6月采用自体疣埋藏联合转移因子口服及重组人干扰素a-2b软膏外用治疗扁平疣患者30例，取得了较好的效果，现报告如下。
扁平疣是由人瘤病毒感染所引起的皮肤科常见病、多发病之一，好发于青少年，影响美观，2009年6月～2011年6月采用自体疣埋藏联合转移因子口服及重组人干扰素a-2b软膏外用治疗扁平疣患者30例，取得了较好的效果，现报告如下。
资料与方法
资料与方法
本组患者60例，男28例，女32例，年龄16～25岁，病程2周～3年，所有患者均有典型皮疹，主要发生于面部、手背，少数累及前臂、小腿，多数入选患者采用过常规治疗，疗效欠佳。
本组患者60例，男28例，女32例，年龄16～25岁，病程2周～3年，所有患者均有典型皮疹，主要发生于面部、手背，少数累及前臂、小腿，多数入选患者采用过常规治疗，疗效欠佳。
治疗方法：将患者依就诊先后顺序随机分为两组，治疗组30例和对照组30例，对照组口服转移因子，3mg/次或10ml/次，2次/日，安达芬软膏外用，2次/日，共4周。治疗组在此基础上加用疣体埋藏，具体操作如下：选取患者面部以外的皮疹1个，最好是新发皮疹，常规消毒，在20g/L利多卡因局麻下使用眼科剪刀从疣体基底部快速剪起。创面用消毒棉球覆盖，将剪下的疣体剪碎，放入已消毒的16号腰穿针中备用，常规消毒三角肌处，20g/L利多卡因局麻后，拿出事先准备好的腰穿针将取下组织推入局部皮下，无菌棉球覆盖，1个月后复查，疣体未消退着可重复治疗1个疗程，随访3个月并判定疗效。
治疗方法：将患者依就诊先后顺序随机分为两组，治疗组30例和对照组30例，对照组口服转移因子，3mg/次或10ml/次，2次/日，安达芬软膏外用，2次/日，共4周。治疗组在此基础上加用疣体埋藏，具体操作如下：选取患者面部以外的皮疹1个，最好是新发皮疹，常规消毒，在20g/L利多卡因局麻下使用眼科剪刀从疣体基底部快速剪起。创面用消毒棉球覆盖，将剪下的疣体剪碎，放入已消毒的16号腰穿针中备用，常规消毒三角肌处，20g/L利多卡因局麻后，拿出事先准备好的腰穿针将取下组织推入局部皮下，无菌棉球覆盖，1个月后复查，疣体未消退着可重复治疗1个疗程，随访3个月并判定疗效。
疗效判断标准：①痊愈：皮损全部消退，无新发疹；②显效：皮损消退＞70%；③有效：皮损消退＞30%；④无效：皮损无变化或＜30%，总有效率以痊愈率加显效率计。
疗效判断标准：①痊愈：皮损全部消退，无新发疹；②显效：皮损消退＞70%；③有效：皮损消退＞30%；④无效：皮损无变化或＜30%，总有效率以痊愈率加显效率计。
结 果
结 果
临床疗效：治疗组的疗效显著高于对照组，治疗组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。
临床疗效：治疗组的疗效显著高于对照组，治疗组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。
讨 论
讨 论
扁平疣是由于机体免疫功能低下感染人瘤病毒所致，人类是它的惟一宿主。扁平疣的病程与机体免疫有重要关系，当机体处于免疫缺陷状态时，扁平疣发病率增高，尤其细胞免疫在防御中起主导作用［1］。目前，扁平疣的治疗方法很多，全身疗法有抗病毒药物或免疫调节药物。局部治疗有冷冻、激光、电灼、外用药物等，但这些方法疗效不确切。对于扁平疣的治疗，原则上尽可能温和，避免造成瘢痕。转移因子能选择性地激发和增强机体的细胞免疫反应，调整机体的免疫状态［2］。干扰素具有广谱抗病毒作用，可与细胞表面受体结合发挥抗DNA和RNA作用，阻止受感染细胞的病毒复制，抑制细胞增殖，并具有免疫调节作用［3］。重组人干扰素α-2b软膏外用皮肤刺激小，无不良反应。自体疣埋藏是一种免疫疗法，自体疣植入能够刺激机体产生特异性抗体或特异性免疫应答，释放细胞因子，激活自然杀伤细胞及吞噬细胞［4］。
扁平疣是由于机体免疫功能低下感染人瘤病毒所致，人类是它的惟一宿主。扁平疣的病程与机体免疫有重要关系，当机体处于免疫缺陷状态时，扁平疣发病率增高，尤其细胞免疫在防御中起主导作用［1］。目前，扁平疣的治疗方法很多，全身疗法有抗病毒药物或免疫调节药物。局部治疗有冷冻、激光、电灼、外用药物等，但这些方法疗效不确切。对于扁平疣的治疗，原则上尽可能温和，避免造成瘢痕。转移因子能选择性地激发和增强机体的细胞免疫反应，调整机体的免疫状态［2］。干扰素具有广谱抗病毒作用，可与细胞表面受体结合发挥抗DNA和RNA作用，阻止受感染细胞的病毒复制，抑制细胞增殖，并具有免疫调节作用［3］。重组人干扰素α-2b软膏外用皮肤刺激小，无不良反应。自体疣埋藏是一种免疫疗法，自体疣植入能够刺激机体产生特异性抗体或特异性免疫应答，释放细胞因子，激活自然杀伤细胞及吞噬细胞［4］。
使用自身疣体埋藏联合转移因子口服，安达芬软膏外用治疗扁平疣，有效率达86.7%。与对照组比较，差异有统计学意义。此三联疗法可达到协同作用增强疗效，明显提高机体的细胞免疫功能，有利于疣体消除或显著降低复发率，疗效肯定，方法简单，不良反应小，是目前治疗扁平疣行之有效的方法之一。
使用自身疣体埋藏联合转移因子口服，安达芬软膏外用治疗扁平疣，有效率达86.7%。与对照组比较，差异有统计学意义。此三联疗法可达到协同作用增强疗效，明显提高机体的细胞免疫功能，有利于疣体消除或显著降低复发率，疗效肯定，方法简单，不良反应小，是目前治疗扁平疣行之有效的方法之一。
参考文献
参考文献
1 赵辨.临床皮肤病学［M］.南京:江苏科学技术出版社,2001:313.
1 赵辨.临床皮肤病学［M］.南京:江苏科学技术出版社,2001:313.
2 梁虹,熊腊元,付继成,等.自体疣移植术治疗疣患者临床及免疫学观察［J］.中国皮肤性病学杂志,2000,16(4):240.
2 梁虹,熊腊元,付继成,等.自体疣移植术治疗疣患者临床及免疫学观察［J］.中国皮肤性病学杂志,2000,16(4):240.
3 张象麟.药物临床信息参考［M］.成都:四川科学技术出版社,2005:873
3 张象麟.药物临床信息参考［M］.成都:四川科学技术出版社,2005:873
4 张海军.康体多、转移因子治疗多形性日光疹疗效观察［J］.临床皮肤科杂志,2003,32(10):578.
【关键词】 乙型肝炎病毒 多表位 治疗性疫苗
乙肝是严重危害人类健康的疾病之一， 但目前的乙肝治疗药物如IFNα和拉米夫定（lamivudine）疗效都不很理想。治疗性疫苗作为一种新的治疗途经， 是乙肝治疗的理想方向之一。我们基于HBV表位的现有资料及前期工作， 从HBV基因组中筛选出5个高度保守的HLA识别表位肽， 串连拼接成乙型肝炎多表位抗原基因， 并在大肠杆菌中得到克隆表达。
1 材料和方法
1.1 材料 质粒pBAD/gIIIA及大肠杆菌BL21、 Top10由南方医科大学分子生物学院保存。T4连接酶购自Promega公司， IPTG及T载体购自天象人生物工程公司， DNA标志物及限制性内切酶EcoR I、 BamH I购自华美生物工程公司， HRP标记的羊抗鼠IgG购自武汉博士德生物工程公司。复合多表位抗原基因片段的选择见文献［1］。引物合成由上海生工生物工程公司合成， 浓度2OD/管， 工作浓度6 μmol/L。
1.2 方法
1.2.1 HBV复合多价抗原基因的设计与合成 参照文献［1］。
1.2.2 基因的克隆及阳性重组子的筛选 根据pMD18T载体和pBAD载体的结构特征， 设计两端带有Nco I和EcoR I酶切位点的引物: 5′GCCCATGGCAATGCAGTG GAACTCC3′（上游引入Nco I酶切位点）; 5′GCGAAT TCCACCCAGACGAGCTAC3′（下游引入EcoR I酶切位点）。以CAG176为模板［1］， PCR扩增出乙型肝炎预防治疗性疫苗基因BPT(扩增条件: 94℃变性5 min， 94℃ 1 min， 55℃ 50 s， 72℃ 55 s， 扩增30个循环， 最后72℃延长10 min)。PCR扩增产物以冻融法割胶回收， 与T载体15℃连接过夜后转入大肠杆菌DH5α， 涂板培养， 挑取单菌落培养， 抽提质粒T/BPT， 以Nco I和EcoR I酶切T/BPT及载体pBAD， 冻融法回收小片段和大片段， 两者15℃连接过夜， 转化入大肠杆菌Top10， 涂板培养。挑取单菌落抽提质粒， 以Nco I和EcoR I双酶切， 并以该质粒为模板， 上述引物和PCR扩增条件进行扩增， 酶切产物及扩增产物均以10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定， 以筛选出阳性重组子。
1.2.3 BPT原核表达载体的构建和表达 筛选出的阳性重组克隆转化入大肠杆菌Top10， 涂板培养， 挑取单菌落在LB培养基中培养过夜后， 按1％接种量接种到2 mL LB培养基中， 培养4 h后加200 G/L的阿拉伯糖至质量终浓度为0.2 g/L诱导表达， 3 h后收菌， 取菌液0.5 mL， 离心后去上清， 沉淀中加入100 μL pH=8.0的TE和100 μL 2×SDS蛋白上样缓冲液， 混匀后沸水中煮10 min， 取20 μL 上样， 行150 g/L SDSPAGE蛋白电泳。
1.2.4 蛋白的纯化 使用SPSepharose阳离子柱层析纯化HiTrap ， SPSepharose HP 5 mL 预装柱经20 mmol/L、 pH9.0的Tris.CL缓冲平衡液， 将透析液上SP柱， 用20 mmol/L、 缓冲液及含1 mol/L NaCl的 TrisHCl缓冲液（ pH9.0）进行梯度洗脱并分步收集洗脱峰。
1.2.5 Western blot检测融合蛋白与HBV患者血清反应的免疫特异性 Western blot方法参照《分子克隆实验指南》第2版进行， 一抗为BPT基因在原核融合表达蛋白P/BPT的小鼠免疫血清［2］， 1∶20稀释。二抗为辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗鼠IgG， 1∶300稀释， DAB显色。
2 结果
2.1 pBAD/ BPT重组表达质粒的构建 以CAG176为摸板， 按材料和方法所示引物及扩增条件行PCR扩增出BPT基因。扩增产物的20 g/L琼脂糖凝胶电泳在400 bp处可见扩增条带， 如上述方法所述， 该基因克隆入表达载体Pbad， 行PCR鉴定可扩增出400 bp片段（图1）， Nco I和EcoR I双酶切该质粒可切出400 bp片段（图2）， 与设计完全相符， 成功构建了重组质粒pBAD/BPT。
图1 重组质粒pBAD/BPT的PCR扩增图（略）
Fig 1 The PCR amplification of recombinant pBAD/BPT
1， 2: The PCR amplification of different recombinant plasmids; 3: 100 bp DNA ladder.
图2 重组质粒pBAD/BPT双酶切鉴定图谱（略）
Fig 2 Enzymatic analysis of pBAD/BPT
1: Recombinant pBAD/BPT digested with Nco I/EcoR I; 2: Vector pBAD digested with Nco I/EcoR I; 3: 100 bp DNA ladder.
2.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达 重组质粒pBAD/BPT转入大肠杆菌Top10， 挑取单菌落阿拉伯糖诱导表达， 行SDSPAGE电泳， 在Mr 15 000处见一表达带， 符合设计分子量， 空菌及空载对照皆无表达（图3）。
图3 SDSPAGE(150 g/L)电泳分析BBPT蛋白（略）
Fig 3 SDSPAGE(150 g/L) of BBPT expressed in E.coli
1: Lysate of BL21 without plasmid; 2: Lysate of pBAD/BL21;
3-5: Expression of BBPT protein in different recombinant transformants; 6: Low molecular weight protein marker.
2.3 表达产物的纯化 SPSepharose为强、 阳离子型交换树脂， 其树脂基为X连接琼脂， 吸附容量3～120 g/L， 是较为理想的交换树脂。利用该层析柱透析平衡后上样， 于1 mol/L NaCl阶段洗脱得到乙型肝炎多表位抗原蛋白， SDSPAGE分析显示， 在Mr约15 000处有一单一的蛋白条带， 纯度可达90%。获得较纯重组蛋白， 命名为BBPT（图4）。
图4 BBPT表达蛋白纯化图（略）
Fig 4 Purification of BBPT protein
1， 2: The second elution of supernatant; 3: Low molecular weight protein marker; 4， 5: The first elution of supernatant; 6， 7: Purified BBPT protein.
2.4 Western blot结果 BPT基因在原核融合表达蛋白P/BPT 的小鼠免疫血清可特异识别B/BPT蛋白， 而不可识别空载体pBAD表达蛋白（图5）， 提示该重组蛋白具有较理想的免疫原性。
3 讨论
乙型肝炎是严重危害人类健康的病毒性传染病。但是， 以干扰素和核苷类似物为主的抗病毒药物治疗， 效果不尽人意。免疫耐受是造成慢性乙肝病毒携带者呈持续病毒感染状态的主要原因之一， 也是现有的抗病毒药物对慢性乙肝病毒携带者疗效不佳的主要原因。治疗性疫苗属于特异性主动免疫疗法， 国内外的研究初步证明， 治疗性疫苗可以打破慢性乙肝病毒感染患者最主要的免疫学反应紊乱， 即对乙肝病毒及其抗原不产生免疫应答免疫耐受状态［3］。
图5 BBPT蛋白的SDSPAGE及Western blot结果（略）
Fig 5 Analysis of production of BPT in E.coli by SDSPAGE and Western blot
1， 3: SDS PAGE of purified BBPT protein; 2: SDS PAGE of control vector without exogenous gene; 4: Low molecular weight protein marker; 5， 7: Western blot of purified BBPT protein; 6: Western blot of control vector without exogenous gene.
我们在多年表位疫苗研究的基础上， 设计了预期同时具有预防和治疗作用的HBV多表位疫苗基因， 并在大肠杆菌BL21中表达和纯化出含外源蛋白和β半乳糖酐酶部分氨基酸的融和蛋白PBPT（Mr 75 000）［1］， 但是融合蛋白在实际应用中存在着一定的缺陷， 所以我们尝试在游离表达载体中pBAD中表达并纯化该基因序列的蛋白产物BBPT， Western blot结果显示BBPT具有较理想的抗原性， BPT基因在原核融合表达蛋白P/BPT的小鼠免疫血清可特异识别B/BPT蛋白， 而不可识别空载体pBAD表达蛋白， 提示该重组蛋白具有较理想的免疫原性， 为该多表位疫苗应用于临床实践奠定了初步基础。
从发展趋势来看， 乙肝病毒治疗性疫苗将成为本世纪对慢性乙肝病毒感染特别是慢性乙肝病毒携带者治疗研究领域的热点， 它与现有抗乙肝病毒药物的联合应用， 将成为一种新的治疗方法。DNA疫苗因其与宿主整合的危险性而受到应用限制， 多肽疫苗虽已在实验研究中表现出理想的效果［4， 5］， 但是多肽合成价格昂贵且无法再生。我们设计的HBV复合多表位疫苗基因， 从理论上讲更符合机体抗HBV免疫机制， 并在大肠杆菌中表达和纯化出具有特异性抗原活性的重组融合及游离蛋白， 为HBV多表位治疗性疫苗的研究奠定了初步基础。
参考文献
［1］ 骆利敏， 李 明， 夏 虎， 等. 乙型肝炎病毒多表位疫苗基因的设计、 合成及表达［J］. 中华微生物学和免疫学杂志， 2004，24(6): 426 -431.
［2］ 骆利敏， 李 明， 夏 虎， 等. 乙型肝炎病毒多表位抗原DNA疫苗的免疫原性研究［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2004， 20(5): 517-520.
［3］ Cohen J. Vaccine get a new twist［J］. Science， 1994， 264: 503-505.
［4］ Vitiello A， Ishioka G， Howard M， et al. Development of a lipopepetidebased therapeutic vaccine to treat chronic HBV infection［J］. J Clin Invest， 1995， 95: 341-349.
［5］ Brian D， Livingston， Crimi C， et al. The hepatitis B virusspecific CTL responses induced in human by lipopeptide vaccination are comparable to those elicited by acute viral infection［J］. J Immunology， 1997， 159: 1383-1392.
Fig 4 Purification of BBPT protein
1， 2: The second elution of supernatant; 3: Low molecular weight protein marker; 4， 5: The first elution of supernatant; 6， 7: Purified BBPT protein.
2.4 Western blot结果 BPT基因在原核融合表达蛋白P/BPT 的小鼠免疫血清可特异识别B/BPT蛋白， 而不可识别空载体pBAD表达蛋白（图5）， 提示该重组蛋白具有较理想的免疫原性。
3 讨论
乙型肝炎是严重危害人类健康的病毒性传染病。但是， 以干扰素和核苷类似物为主的抗病毒药物治疗， 效果不尽人意。免疫耐受是造成慢性乙肝病毒携带者呈持续病毒感染状态的主要原因之一， 也是现有的抗病毒药物对慢性乙肝病毒携带者疗效不佳的主要原因。治疗性疫苗属于特异性主动免疫疗法， 国内外的研究初步证明， 治疗性疫苗可以打破慢性乙肝病毒感染患者最主要的免疫学反应紊乱， 即对乙肝病毒及其抗原不产生免疫应答免疫耐受状态［3］。
图5 BBPT蛋白的SDSPAGE及Western blot结果（略）
Fig 5 Analysis of production of BPT in E.coli by SDSPAGE and Western blot
1， 3: SDS PAGE of purified BBPT protein; 2: SDS PAGE of control vector without exogenous gene; 4: Low molecular weight protein marker; 5， 7: Western blot of purified BBPT protein; 6: Western blot of control vector without exogenous gene.
我们在多年表位疫苗研究的基础上， 设计了预期同时具有预防和治疗作用的HBV多表位疫苗基因， 并在大肠杆菌BL21中表达和纯化出含外源蛋白和β半乳糖酐酶部分氨基酸的融和蛋白PBPT（Mr 75 000）［1］， 但是融合蛋白在实际应用中存在着一定的缺陷， 所以我们尝试在游离表达载体中pBAD中表达并纯化该基因序列的蛋白产物BBPT， Western blot结果显示BBPT具有较理想的抗原性， BPT基因在原核融合表达蛋白P/BPT的小鼠免疫血清可特异识别B/BPT蛋白， 而不可识别空载体pBAD表达蛋白， 提示该重组蛋白具有较理想的免疫原性， 为该多表位疫苗应用于临床实践奠定了初步基础。
从发展趋势来看， 乙肝病毒治疗性疫苗将成为本世纪对慢性乙肝病毒感染特别是慢性乙肝病毒携带者治疗研究领域的热点， 它与现有抗乙肝病毒药物的联合应用， 将成为一种新的治疗方法。DNA疫苗因其与宿主整合的危险性而受到应用限制， 多肽疫苗虽已在实验研究中表现出理想的效果［4， 5］， 但是多肽合成价格昂贵且无法再生。我们设计的HBV复合多表位疫苗基因， 从理论上讲更符合机体抗HBV免疫机制， 并在大肠杆菌中表达和纯化出具有特异性抗原活性的重组融合及游离蛋白， 为HBV多表位治疗性疫苗的研究奠定了初步基础。
参考文献
［1］ 骆利敏， 李 明， 夏 虎， 等. 乙型肝炎病毒多表位疫苗基因的设计、 合成及表达［J］. 中华微生物学和免疫学杂志， 2004，24(6): 426 -431.
［2］ 骆利敏， 李 明， 夏 虎， 等. 乙型肝炎病毒多表位抗原DNA疫苗的免疫原性研究［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2004， 20(5): 517-520.
［3］ Cohen J. Vaccine get a new twist［J］. Science， 1994， 264: 503-505.
全球乙型肝炎病毒感染者超过3.5亿，每年死亡人数约100～200万。我国为慢性乙型肝炎的高发区。约占全球感染者的1/3。其防治研究一直是我国的重点课题治疗关键是抗病毒治疗，干扰素是目前抗病毒的有效药物之一，但其疗效只有30～40%，干扰素，主要是聚乙二醇干扰素，是治疗慢性丙型肝炎惟一有效的抗病毒药物，同时也是治疗慢性乙型肝炎的首选药物之一。但由于干扰素在临床上规范化应用的时间并不太长，加之远期疗效的评价指标较难确定，因此有必要对其治疗慢性肝炎的远期疗效做出正确评价，使其更好地应用于临床。现报告如下。
1资料与方法
1.1临床资料：选择2010年6月至2012年6月我院住院治疗的患者120例。男76例，女44例 年龄18～68岁。所有患者均符合第十次全国病毒性肝炎会议修订的诊断标准。同时符合下列条件 ①清乙型肝炎病毒表面抗原乙型肝炎病毒抗原乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸持续阳性6个月以上 ②丙氨酸转氨酶高于正常2倍，小于10倍的无黄疸患者；③除外其他肝炎病毒感染及其他严重并症；④6个月内未进行任何抗病毒及免疫调节治疗。
1.2方法：给予干扰素a300万U隔日1次，肌肉注射，同时给予乙型肝炎基因疫苗10ug肌肉注射。治疗前及治疗后每3个月检测1次肝功能、乙肝五项，根据病情需要定期检测血、尿常规及做肝、胆、脾超声检查。
2结果
2.1临床疗效：治疗6个月时阴转率为63%，治疗12个月时阴转率76.2%。
2.2不良反应：肌肉注射干扰素最初次患者有不同程度的发热，肢体酸痛，以后逐渐缓解，半数患者出现白细胞下降，其中12例因白细胞绝对值降至而停药。
3讨论
干扰素是细胞在病毒感染或其他诱导因素作用下产生的具有广谱抗病毒、抗肿瘤、抑制细胞增殖和免疫调节作用的细胞因子。目前，多数专家和学者认为乙型肝炎是一种免疫性疾病。机体免疫系统在清除HBV感染的肝细胞过程中引起的免疫反应导致肝脏的持续损伤，造成肝脏病变，因此持久免疫控制是实现慢性乙型肝炎治疗目标的关键。通过大量关于慢性乙型肝炎病程中免疫功能的变化及急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎免疫功能差异的研究，我们发现抗病毒免疫应答功能缺陷是慢性乙型肝炎的重要特征，比较急性乙型肝炎与慢件乙型肝炎的CD8+与CD4+T淋巴细胞应答可以帮助我们理解免疫控制在慢性乙型肝炎中的重要作用。形成特异性免疫耐受是病毒持续感染的主要原因目前对感染主要给予抗病毒和免疫调节治疗。国内外公认的抗病毒药物是干扰素和核苷类似物核苷类似物只能抑制病毒复制。干扰素有抗病毒和调节免疫力的作用。最终清除病毒要靠自身的免疫功能，如何提高患者对的特异免疫力，打破免疫耐受是治疗的关键。免疫疗法包括特异性治疗和非特异性治疗，特异性免疫治疗指使用能产生特异性细胞免疫应答的治疗性乙型肝炎疫苗，以促进树突细胞功能为主，包括疫苗，多肽疫苗，复合和蛋白疫苗。
目前国内外均处于研制阶段，非特异性免疫治疗包括多组分胸腺肽，胸腺肽a，白细胞介素和其他免疫调节剂以及与免疫调节有关的中草药，以促进细胞功能为主预防性乙型肝炎疫苗具有抗原性和免疫原性，可刺激机体免疫功能和改善机体的免疫状态。国外文献报道其抑制复制率可达到30～40%。作用机制是通过特异的细胞介导的免疫反应来抑制复制乙型肝炎疫苗中的佐剂在疫苗的免疫作用方面起了重要的作用 本研究所用疫苗的佐剂为铝剂佐剂的作用为①增强抗原的免疫原性；②增强机体对抗原刺激的反应性，可提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度；③改变抗体类型，使由免疫球蛋白转变为产生免疫球蛋白；④引起或增强迟发型超敏反应，佐剂的作用机制包括 ①佐剂与抗原物质一起注入机体后，可改变抗原的物理性状形成抗原储存库，有力于抗原的缓慢释放延长抗原在体内的滞留时间；②被佐剂吸附的抗原易被巨噬细胞吞噬促进对抗原的处理，在局部形成炎症反应；③刺激淋巴细胞增生和分化从而增强和扩大免疫应答的效应干扰素治疗，具有直接抗病毒和免疫调节双重作用，其抗病毒机制主要是通过与靶细胞表面特异性受体结合后，激活抗病毒蛋白的产生阻止病毒的合成，抑制病毒复制，同时还通过增强自然杀伤细胞，巨噬细胞和淋巴细胞的活力等起免疫调节作用增强抗病毒能力。
本研究结果显示，干扰素联合大剂量乙型肝炎疫苗治疗，疗效较好且延长疗程效果更好疗程应1年或1年以上，因为感染的肝细胞不断产生病毒，不仅血流中病毒高负荷而且肝脏的绝大多数肝细胞均被感染本身不致细胞病变 感染的肝细胞仍是长寿命的 半寿期6～12个月或更长.与干扰素联合其他免疫调节剂比较此种方法经济实用且不良反应少，停药后是否反弹需进一步观察。
参考文献
[1]中华医学会传染病与寄生虫学分会。肝病分会病毒性肝炎防治方案。中华肝脏病杂志.
[2]王景叶.α一2b干扰素治疗慢性乙型肝炎5l例远期疗效观察[J].陕西医学杂志，2009.38：874-875
[3]Yang YF，Zhao Zhong YD，et al.Interferon thempy in chronichepatitis B reduces progression to cirrhosis and hepatoceilularcarcinoma：a meta-analysis.J Viral Hepat，2009，16：265-271
通讯作者：段玉玲
【摘要】 目的 旨在通过主动免疫疗法联合中药治疗习惯性流产，探讨临床治疗习惯性流产的有效方法。方法 将60例习惯性流产患者随机分为A组及B组，A组（试验组）30例，采用主动免疫疗法联合中药补肾汤治疗，B组（对照组）30例，采用主动免疫疗法。比较两组的临床疗效。结果 A组的治疗效果要优于B组，两组比较差异有统计学意义（P
【关键词】 主动免疫疗法； 中药； 习惯性流产
The evaluation of treatment of recurrent spontaneous abortion by active immunization combined with chinese herbs DUAN Yu-ling,CHEN Miao-hua,LI Hua-wei,WANG Xue-lan.People's Hospital of Huiyang in Huizhou, Huizhou 516211,China
【Abstract】 Objective To compare the clinical effective method of treatment Recurrent spontaneous abortion（RSA） by active immunization combined with Chinese herbs of busen Decoction.Methods 60 cases with primary or secondary RSA were randomly divided into two groups: 30 cases （ group A） were treated with active immunization combined with Traditional Herb，30cases（ group B） simply with active immunization.Results There were no significant differences between group A and B （P
【Key words】 Active immunization; Traditional herbs; Recurrent spontaneous abortion
习惯性流产又称复发性自然流产，指自然流产连续发生3次或以上者，其发病率约占自然流产病例的3%～5%［1］。习惯性流产是妊娠常见的一种并发症,其病因十分复杂,主要有遗传、内分泌、感染、子宫和免疫等原因。近代生殖免疫研究表明，40%～50%的习惯性流产与免疫因素有关［2］，尤其自身免疫因素，如抗子宫内膜抗体（ EMAb ）、抗心磷脂抗体（ACLA）、抗抗体（AsAb）、抗卵巢抗体（AovAb）等。因其影响妊娠结局，其病因及治疗越来越受到人们的重视［3］。本研究采用特异性抗原作为致敏原，通过致敏反应促使患者产生个体特异性因子，提高患者的免疫反应性，防止了胚胎或胎儿父系抗原被母体免疫系统识别和杀伤。另一方面，流产的治疗中医以补肾为主，辨证用药；在免疫治疗基础上，选方用药的同时选择既符合中医辨证用药规律，又符合现代药理研究的药物，提高妊娠成功率。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2010年1月～2011年2月就诊于本院的习惯性流产患者。患者月经规律，抗核抗体及抗心磷脂抗体阴性，无染色体异常，无解剖、内分泌、感染等病因，封闭抗体阴性的原因不明复发性流产患者60例，且丈夫常规检查正常的患者，年龄最小23岁，最大37岁，平均28.3岁。两组患者年龄、健康状况、流产次数差异均无统计学意义（P>0.05）。
1.2 方法 将60例习惯性流产患者随机分为A组及B组，A组（试验组）30例，采用主动免疫疗法联合中药治疗，B组（对照组）30例，采用主动免疫治疗。（1）淋巴细胞主动免疫治疗：孕前进行丈夫的淋巴细胞接种，抽取丈夫的血液肝素抗凝外周静脉血18 ml，用淋巴细胞分离液提取淋巴细胞，生理盐水洗涤3次，加2 ml生理盐水稀释，分离其中的淋巴细胞，淋巴细胞总数（20～30）×106，前臂内侧为皮内注射区，每侧纵列3个点皮下注射，间隔3周。从孕前开始，孕前主动免疫2 次为一个疗程，孕后再主动免疫一个疗程，每3周进行1次。第一疗程结束后，鼓励患者在3个月内妊娠，如获妊娠则再进行1 个疗程，如未妊娠则在排除不育症的情况下再重新进行1 个疗程免疫。（2）口服中药补肾汤治疗：熟地黄10 g、当归10 g、香附10 g、黄芪10 g、丹参10 g、赤芍10 g、川续断10 g、菟丝子15 g、苎麻根15 g、益智仁12 g，水煎服，每日1剂，连服15剂，停服1天为1疗程，至孕20周。
1.3 结果判定 妊娠成功标准：两组方法均以妊娠超过12周为成功。
1.4 统计学处理 数据采用SPSS 13.0统计软件进行处理，采用卡方检验，α0.05。
2 结果
A 组30例均妊娠，2例妊娠12周内再次发生流产，其妊娠成功为28例，妊娠成功率为93.33 %。B 组30例，妊娠成功21例，9例妊娠12周内再次发生流产，妊娠成功率为70.00%，A 组成功率明显高于B 组，差异有统计学意义 （P
表1 两组疗效比较（n，%）
3 讨论
习惯性流产是妊娠常见的一种并发症，其病因十分复杂，一般公认的相关病因包括：免疫因素、遗传因素、内分泌因素、子宫解剖异常等。实质上，这些病因在相当多的患者中是复合存在的。据保守估算，该类患者在我国生育期妇女中约有百万之众。目前认为该病更主要的是与免疫因素特别是免疫耐受失衡密切相关，对该病治疗新策略的探索始终是医学免疫学和临床产科学致力于研究并努力攻克的世界性难题。自1981年Beer及Taylor创立了对习惯性流产的主动免疫疗法后，该法已为世界多中心采用。根据国内外文献报道，采用丈夫或者第三方淋巴细胞的主动免疫治疗后妊娠成功率可达70%～96%［4～6］。这引起围产医学界的广泛关注，并激发了人们对该疗法的不断探索。带有父方异体抗原成分的胚胎，对母体来说是一个移植物，在母胎界面上，母体与胚胎细胞之间存在相互识别。母体识别胚胎的抗原并产生封闭抗体，封闭抗体是一组能够防止辅助T细胞识别胎儿抗原的特异性IgG抗体。正常妊娠时，存在于孕妇的血清中，能覆盖滋养细胞上的HLA抗原，抑制混合淋巴细胞反应，防止母体免疫系统对胚胎的攻击，以维持妊娠。封闭抗体既可与母体淋巴细胞表面抗原结合，又可与滋养细胞本身结合，从而阻断母儿之间的免疫识别和免疫反应［7］。RSA夫妇由于DR抗原共有比例增高，故母体难以产生封闭抗体，致使母体免疫系统把胎儿当作异物排斥而发生流产。林其德等［8］经过10 余年的观察，未见主动免疫对母体及后代产生明显的副反应。本研究结果与国内外大多数的报道一致。同时他们还对主动免疫治疗后妊娠妇女的后代出生体重、生长发育和智力情况进行随访，发现与正常对照组无明显差异，这说明主动免疫疗法是安全、有效的。因此，本研究采用主动免疫疗法联合中药补肾汤（熟地黄、当归、香附、黄芪、丹参、赤芍、川续断、菟丝子、苎麻根、益智仁）治疗习惯性流产，通过致敏反应促使患者产生个体特异性因子，提高患者的免疫反应性，防止了胚胎或胎儿父系抗原被母体免疫系统识别和杀伤，提高妊娠成功率。另一方面，习惯性流产属祖国医学滑胎范畴，几千年来，对于滑胎，中医积累了丰富的经验，滑胎的治疗中医以补肾为主，辨证用药。近代药理研究发现，如在此基础上选方用药的同时选择既符合中医辨证用药规律，又符合现代药理研究的药物，可明显提高疗效［9，10］。根据免疫功能亢进、低下、紊乱等，中医辨证治疗有独特疗效。免疫功能亢进者，患者多表现为阴虚火旺之征，中药治疗选用凉血清热药物，可以抑制免疫功能亢进，对抗变态反应性病变。另外，湿热、血瘀亦可使免疫功能亢进，通过清热利湿、活血化瘀也可降低或双向调节免疫功能，常用中药黄芩、丹参等既活血又止血，可以改善血液循环，增加血液速度，改善高凝状态，防止血栓形成，促进宫内胎儿生长，同时还可止血，避免胎盘剥离。免疫功能低下者，患者多表现为脾肾阳虚之征，予益气健脾、温肾助阳之品，可提高免疫功能，常用中药：黄芪、川断、鹿角等。川断补肝肾、固冲任，其药味平和，经现代药理研究，川断含有大量维生素E，可促进子宫及胚胎的发育；杜仲补肾安胎，药理研究证实杜仲还有镇痛、镇静的作用，可抑制子宫收缩，缓解滑胎患者的紧张情绪。所以这些补肾药安胎效果显著可靠，临床实践也证实这一点［11］。中医治疗本病具有独特的优势，不仅有明显的疗效，且无副作用，经临床辨证施治，总有效率在90% 左右［11，12］。研究表明，补肾安胎方（菟丝子、桑寄生、川续断、黄芪、当归、丹参等）能提高吲哚美辛诱导着床障碍小鼠的妊娠率和着床点数，其机制可能与该方能改善甾体激素水平，促进子宫内膜雌、孕激素受体的表达有关。胡氏等［13］研究显示，莲地合剂（旱莲草、生地、元参炭、阿胶珠、太子参、菟丝子、桑寄生等）能增强妊娠大鼠体内黄体和胎盘功能，提高孕激素和胎盘催乳激素含量。同时能降低妊娠大鼠外周血NK细胞活性，增强机体免疫抑制的作用而起到保胎作用。李氏等［14］认为肾虚是导致反复性自然流产的重要因素，故将补肾调周法运用于该病。因此在今后的临床实践中，应进一步以调整免疫机能为主，筛选有效方药，深入研究治疗机理，寻求更佳的治疗效果。本项研究在免疫治疗基础上，选方用药的同时选择既符合中医辨证用药规律，又符合现代药理研究的药物，可明显提高疗效。
参 考 文 献
［1］ 张永凤.主动免疫联合hCG治疗原因不明习惯性流产的临床疗效评估.中国妇幼保健,2008：24.
［2］ 齐瑞莹，侯灵彤.主动免疫治疗原因不明习惯性流产后细胞免疫功能的变化. 中国妇幼保健，2007：21.
［3］ 孔令红,刘忠，李红，等.异源淋巴细胞免疫结合IVF-ET治疗伴不孕症的习惯性流产.南方医科大学学报,2008：7.
［4］ Daya S,C anby I,C lard DA,et al.In travenous immunoglobu in therapy recurrrent spon taneous am eta-analysis.Am J Repord Immuno,1998, 39（5）: 6967.
［5］ Pandey MK，Thakur S，Agrawal S. Lymphocyte immunotherapy and its probable mechanism in the maintenance of pregnancy in woman with recurrent spontaneous abortion.Arch Gynecol Obstet，2004，269:161.
［6］ 黄振球,陈巧儿,叶嘉玲,等.原因不明性习惯性流产与免疫疗法的现状.国外医学.计划生育分册，1995，14（4）:196.
［7］ 陈巧儿,秦卫兵.免疫治疗原因不明习惯性流产后外周血T 淋巴细胞亚群的变化.实用妇产科杂志,2005,21（2）:24.
［8］ 林其德，汪希鹏.原因不明复发性流产的病因病理生理机制与治疗研究进展.中国实用妇科与产科杂志,2007,23 （1）: 5.
［9］ 蒋莉，高仁美.补肾抑抗汤治疗免疫性不孕72例.医学杂志，2003，21（4）：51-52.
［10］ 刘瑞芬.中西医结合治疗免疫性不孕26例临床观察.中国中西医结合杂志，2002，22（1）：68-69.
［11］ 于荣.温针治疗习惯性流产41 例.陕西中医,1993,14（6）:273.
［12］ 归绥琪,许钧,俞而概,等.封闭抗体缺乏性自然流产者中药治疗.上海医科大学学报,1997,24（3）:217-219.
［13］ 胡也莉,何嘉琳.莲地合剂治疗先兆流产作用机理的实验研究.中国中医药科技,2005,12（5）:288.
