时间：2023-06-07 09:39:04
开篇：写作不仅是一种记录，更是一种创造，它让我们能够捕捉那些稍纵即逝的灵感，将它们永久地定格在纸上。下面是小编精心整理的12篇分子遗传学综述，希望这些内容能成为您创作过程中的良师益友，陪伴您不断探索和进步。
关键词：弥漫性大B细胞淋巴瘤；形态学；分子遗传学；免疫表型；预后
弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse largeB-cell lymphoma，DLBCL）占非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lympho-mas，NHL）的31%～34%，在亚洲国家一般大于40%，是NHL中最常见的一个亚型。2008年WHO将DLBCL定义为一类弥漫生长的B细胞性淋巴瘤，瘤细胞核大于或等于正常吞噬细胞核，或大于正常淋巴细胞的2倍[1]。DLBCL在临床特征、侵袭部位、组织形态学、分子遗传学、免疫表型等方面，均表现出明显的异质性。本研究着重从临床、免疫、分子遗传学等方面，对近年来的国内外研究工作及进展进行综述。
1病因学
DLBCL的病因尚不清楚，大多数为原发，也可从慢性B淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、某些霍奇金淋巴瘤等发展和转化而来，这种转化可能与一些染色体结构改变有关。
DLBCL的发生可能与病毒感染、免疫缺陷以及自身免疫有关。EB病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）、人类疱疹病毒8型（HHV-8）等感染与DLBCL的发生有着较为密切的关系。2011年5月第十二届全国淋巴瘤学术大会肯定了我国近年来恶性淋巴瘤发病率逐年上升与环境污染和食品添加剂之间具有密切关系[2]。
2流行性病学与临床特征
DLBCL是成人淋巴瘤中发病最多的一型，多见于60岁以上的老年人，也可见于儿童，男性比女性稍多。DLBCL临床上以迅速增大的无痛性肿块为典型表现，部分患者可有发热、体重减轻等症状。DLBCL的临床过程呈侵袭性，多为单个淋巴结或结外病灶出现迅速长大的局限性肿块，约1/3的患者有全身症状[3]。肿瘤主要原发于淋巴结内，但有约30%～40%的患者首发于淋巴结外，一般呈局限性病灶。结外发生部位常见于胃肠道、皮肤、中枢神经系统、肺、肝、纵隔、骨骼、生殖器、及韦氏环，骨髓和血液的原发或累及少见，最常见的部位是胃肠道（胃和回盲部）[4]。
3分子遗传学
DLBCL具有多种特征性的细胞分子遗传学改变，许多病例往往具有复合性基因异常[5]。DLBCL常见的分子遗传学改变包括1号染色体q2～23、6号染色体q21～25、14号染色体q11～12等区域出现缺失，12号染色体q12～14增多，非整倍体核型（+5，+6，+7，+18）及6q缺失，bcl-1、bcl-2、bcl-6、bcl-10、c-myc基因易位[5]，等等。
20%～30%的DLBCL中可发生bcl-2基因和IgH基因易位，有研究表明多数bcl-2基因易位的DLBCL是由滤泡性淋巴瘤转化而来。DLBCL中常涉及3 q27区域的改变，包括bcl-6基因易位、5'-非编码区高频突变及bcl-6基因内部缺失等，导致原癌基因bcl-6异常。在约30%～40%的DLBCL中可以检测到bcl-6的t（3；14）（q27；q32）易位，该易位与预后不良有关，并且是一个独立的危险因素；40%～70%的DLBCL发生bcl-6突变；此外，MU M-1基因易位到第14号染色体I g H增强位点，即t（6；14）（p25；q32）染色体易位，导致MUM-1蛋白过表达，从而促进DLBCL形成。少数DLBCL中还可检出染色体易位t（1；14）导致的bcl-10基因易位，t（11；14）导致的bcl-1基因易位，8号染色体t（8；14）（q24；q32）导致的c-myc基因易位，等等。
在DLBCL中发现少数的p53基因的失活，p53抑癌基因在细胞增殖和存活的调控中起着重要的作用[6]。在DLBCL病例中因P16基因沉默表达或者表达量减少，从而诱发细胞周期调节失控，发生癌变。有研究发现DLBCL的发病还与原癌基因扩增有关，相关的原癌基因包括：rel、myc、bcl-2、rel基因编码NF-rB信号途径中的转录因子REL蛋白，REL蛋白对于恶性B细胞的增殖与生存十分重要[7]。
4免疫表型特征
DLBCL免疫分型方法有Hans分型、Choi分型、Tally分型[8]，目前国内大多数医院采用Hans的方法，通过免疫组织化学技术检测CD10、BCL-6和MUM-1三种蛋白的表达，从而将DLBCL分为GCB亚型和非GCB亚型，后者包括ABC亚型和少数未分类者，其与基因表达谱分型的符合率可达80%～86%。有研究显示两个亚型间在化疗反应性和预后上与基因表达谱分型相似[8]。
DLBCL分类采用免疫表型、组织学及临床资料相结合，对指导临床治疗和判断预后有重要意义。
由于遗传学在生命科学中具有不可替代的重要作用，其教学方法、教学模式的探索和研究近些年倍受关注。近年来,研究性教学在各高等院校不断地被提出，黑龙江八一农垦大学生命科学学院也把研究性教学改革不断地深入到各学科教学中去。作为遗传学教师,笔者在教学过程中不断地进行着研究性教学的实践和思考。
研究性教学是在‘‘发现学习模式”和瑞士皮亚杰的“认知发展学说”的理论基础上发展起来的，其认为学生学习的过程与科学家研究的过程在本质上是一致的，强调将教学与研究结合作为大学教学的基本思想，注重提高学生发现问题、分析问题和解决问题的能力，对培养创新型人才非常重要。研究性教学模式的核心理念是以实践中的真实问题为基础,将学生置于真实的情境中学习，培养学生的学习能力、创新能力和实践中的动手能力，增强学生对工作的适应能力，使教学与研究相统一m。研究性教学是以学生为主体,以问题为核心（PBL)去获取知识和应用知识的教学模式。研究性教学的内涵主要包括:教师把研究的思想、方法和取得的新进展引入教学活动；教师以研究的形式组织教学活动,打破原有的完整的学科逻辑和机械的顺序；学生积极参与研究之中，在研究中学习、成长，养成独立思考的气质和批判。
笔者根据研究性教学的规律及遗传学学科的特点,在教学过程中对以下几方面的问题进行了探索和实践。
1发挥学生的主动性和创造性，培养学生的思辨能力和独立思考能力
党的十指出，科技创新是提高社会生产力和综合国力的战略支撑,必须摆在国家发展全局的核心位置。要坚持走中国特色的自主创新道路,以全球视野谋划和推动创新，提高原始创新、集成创新和引进消化吸收再创新的能力，更加注重协同创新。这一论述充分体现了科技创新在经济和社会发展中的重要地位,也为高等教育提出了未来人才培养的方向。大学作为本科生培养基地，肩负着培养有创新精神和实践能力的高素质人才的重大历史使命。高校毕业生的质量直接关系到一个国家科技人才的整体实力和水平,高校教师如何改革现有的教学方法和模式,培养具有学习能力、自我创新能力的大学生，是目前教育教学过程中亟待解决的问题。
研究性教学模式具有极强的实践性。研究性教学模式特别注重教学与研究相结合，理论与实际相统一。研究性教学模式不只强调背诵、理解复述和模拟,而是注重培养学生的科学思维、自主意识、团队协作精神和工作责任心,强调培养学生获取与归纳整理信息的能力、分析解决问题的能力、展示成果与表述观点的能力。创新能力的培养不可能仅依靠获得知识,很大程度上还依赖于学生的直接经验的积累，因此切实加强研究性实践教学,对提高学生的实践能力是至关重要的。创新型人才的培养目标要求学生既要学会动手又要学会动脑；因此，教师在教学过程中要树立研究性教学为主的教学观,运用正确的教学法,积极探讨、推动教学研究和改革,培养学生主动探求知识的主体精神,动手、动脑的能力和创造性思维及创造精神。研究性教学过程从讨论问题开始,需要涉猎大量的资料,课程学习本身不仅在于学习知识，还在于掌握学习知识的方法。研究性教学以学生为主体的教学模式强调了学生在学习过程中的核心地位,教师只起引导、示范、鼓励、辅导和监控的作用，这种模式可以最大限度地调动学生学习的主动性和积极性,培养学生自主学习及独立分析和解决问题的能力。在遗传学的教学过程中可以采用问题式、讨论式、互动式课堂教学,从而达到更好的教学效果，在客观上具有一定的可行性。以学生为主体的教学模式关键在于课前的认真准备和教师在课堂上的灵活调控。
2专业知识教学和实验技术教学相结合
遗传学是一门在实验基础上发展起来的学科,尤其是现代遗传学技术的突飞猛进发展和遗传学知识的大量增加,都给学生的学习带来了一定的难度。因此,遗传学采用什么样的授课方法才能使学生掌握基本知识,提高学生的创新能力一直倍受教育工作者的关注。一些遗传学教师的教学经验表明，在遗传学授课过程中，适当地讲授遗传学研究的基本实验技术和遗传学研究材料的获得方法对帮助学生理解遗传学知识是非常重要的。例如，在介绍分子标记选择辅助育种的研究进展时,对分子标记的定义、类型、发展和每种标记的用途进行讲解,对遗传学研究材料如重组自交系和近等基因系群体的构建方法及其在基因定位和育种研究中的应用等知识进行回顾,大大增强了学生对专业知识的理解。在实验技术的教学方面,应不断地给学生介绍最新技术在遗传学研究中的作用以及不同技术在某一研究领域的时效性3。在内容上,尽量安排生动丰富且易于操作的实验项目，增加一些设计性和综合性的实验项目，尤其是近期，随着表观遗传学研究的日渐深入,适当地增加该方面的实验课程对帮助学生理解基于非基因序列改变所致基因表达水平变化,如DNA甲基化和染色质构象变化等表观遗传学对生物性状的改变所起的作用，可以开展表观遗传抑制剂对细胞周期调控的分析及RNA干扰基因沉默的遗传分析等实验。
3为学生提供具有时效性、权威性和新颖性的阅读材料
随着遗传学科的快速发展,研究领域不断拓宽,新技术、新成果不断涌现,任何一部教材都难以跟上遗传学快速发展的步伐，因此必须借助网络等媒体实现知识的不断更新。在教学过程中，教师可适当地借鉴〈(Science〉〉、《Nature》以及分子细胞生物学领域的一些国际权威杂志上的综述性文章作为教学中的补充内容,使学生在学习经典遗传学理论的同时，对分子遗传学和现代遗传学的发展有更深入的理解。如在研究癌症的遗传学基础时发现,一半以上癌症的发生过程中伴有p53突变。p53在正常细胞中寿命短、含量低，与细胞周期控制、DNA修复、衰老、血管生成和细胞凋亡密切相关。当p53发生突变时,细胞逃脱正常细胞生长的限制,使突变从一代细胞传到下一代细胞,这为癌症的发育创造了条件。在给学生授课的过程中，跟踪遗传学的最新研究动态，如引入p53等遗传学研究进展，可大大激发学生学习的积极性?。表观遗传学目前也是遗传学重要的补充,如乙酰化酶家族和染色体易位、转录调控、基因沉默、细胞周期、细胞分化与增殖以及细胞凋亡相关,从而对生物体的性状产生了影响。而非编码RNA不仅能对整个染色体进行活性调节,也可对单个基因活性进行调节，它们对基因组的稳定性、细胞分裂、个体发育都有重要的作用。在教学过程中，适量增加表观遗传学的知识,可以极大地丰富学生的知识量及对科技前沿知识的认识,为提高学生的科技创新能力奠定基础。
4案例式和情境式教学相结合，激发学生内在的学习动力
案例教学法（Casemedthodteaching,CMT)是根据教学目标和培养目标的要求,在学生掌握了有关的基础知识和基本理论的基础上,教师在教学过程中选择典型案例并以恰当的形式给学生展示,把学生带入一个特定情境中，在教师的指引下由学生自己依靠其知识结构和背景,在这种案例情境中发现、分析和解决问题，培养学生运用理论知识并形成技能技巧的一种教学方法5。案例教学法最大的特点就是模拟实践经验,增强学生实践的能力。遗传学教师在注重理论知识讲授的同时,要穿插与实际生活密切相关的大量案例,培养学生分析问题和动手实践等能力。
在遗传学教学过程中，注重教学内容与人类生活及人类疾病相结合,加强学生对教学内容的认识和遗传知识的深化。在讲授单基因遗传病、多基因遗传病和染色体病时,可与临床中真实的遗传病相联系,如常见的单基因遗传性疾病一白化病、苯丙酮尿症、黑尿症、先天性聋哑、高度近视，多基因遗传性疾病一原发性高血压、支气管哮喘、冠心病、青少年型糖尿病、类风湿性关节炎、精神分裂症、癫痫、先天性心脏病，染色体遗传性疾病一“21三体”综合征、猫叫综合征等。针对这些疾病，巧妙设计引导式问题,囊括大纲要求的知识点，突出遗传学的课程特色。在该模式下的教学过程中，学生不是被动地学、记忆和理解教师所教授的知识,而是在教师的指导下,将学生置于可以从不同角度看待事物的环境，问题情境便能够吸引并维持他们的兴趣，使他们积 极寻找解决问题的方法，创造性地得出结论,从而激发学生学习的内在动力。
5加强遗传学教师师资队伍建设，为研究性教学提供人才保障
过去,很多高校过于注重结果性评价而忽视过程评价,无法对教师的研究性教学能力和学生的实践能力作出公正而又科学的评价H。目前，黑龙江八一农垦大学已经非常重视研究性教学的实施,并为此做出很多努力和尝试。遗传学作为生命科学的重要课程,其教师队伍的整体水平是制约教学效果的一个重要因素。没有一支高水平的教师队伍一切将成为空谈。为了提高研究性教学水平,学校组织教师到优秀研究性教学能手的课堂上听课,通过学习其他课程的课堂教学方法、教学模式，为遗传学更好地进行研究性教学提供了教学案例。此外,学校年轻的遗传学教师可以通过培训、进修等形式提高专业水平。最后，如果想成功地进行研究性教学，授课教师必须进行学科专业的科学研究。授课教师要随时关注遗传学领域的最新发展动向，将权威杂志中介绍这门学科研究的新概念、新发现、新思路和新方法的文献综述引入课堂。这些参考文献学术水平高、内容新、难度适中，开阔了学生的视野，对他们很有吸引力。教师只有通过科研,才能真正理解本学科教材的内在联系，把握住本学科的发展趋势,及时吸纳学科内最新科研学术成果,适时地把学生引入本学科知识和科研的前沿,引导学生在科研实践中增长才智、得到锻炼，激发学生的创造欲望，通过科研、实验等手段培养学生的创新能力。
先天性心脏病(congenital heart disease， CHD)是指胎儿时期心脏血管发育异常而致的心血管畸形，是小儿最常见的心脏病。在1000个出生存活的婴儿中，约有8名发生本病，因此产前诊断很受临床重视。目前，对先心病进行产前诊断的主要方法有超声心动图检查、遗传学分析及环境因素调查，本文就产前诊断胎儿CHD的研究进展予以综述。
1 胎儿超声心动图的新技术
1972年Winberg最早报告宫内胎儿心脏超声心动图。虽然多普勒超声最早应用于胎盘血流的检测，M型超声心动图对胎儿心脏的研究已有许多年，但是直到二维超声影像和彩色多普勒超声系统的出现，才使得胎儿心血管的检查进入一个崭新的领域，并有了突飞猛进的发展。目前更多的高新技术进入胎儿心血管检测，如组织多普勒显像、组织速度成像、组织谐波成像、能量多普勒成像、三维超声心动图等。
1.1 组织多普勒成像 1992年， McDicken等首先提出了组织多普勒成像(doppler tissue imaging， DTI)技术。2003年，Tutschek等[1]采用DTI技术对妊娠中晚期的正常胎儿心肌活动研究时发现，该技术能显示所有胎儿的心肌运动，对胎儿心律失常进行分型和定位，从而对心脏整体和局部功能起监测作用。然而，DTI技术还存在一些不足：如对胎儿运动非常敏感，以及受到角度的限制，它要求所检测区域的运动方向与声轴线尽可能平行。
1.2 组织速度成像 组织速度成像(tissue velocity imaging， TVI)是建立在扫描线上采集和分析原始组织速度数据的新技术。Rein等采用该技术对31例妊娠18～38周胎儿进行检查的研究表明，它在诊断各种室上性和室性心律失常方面有较大优势，尤其是那些传统技术难以诊断的心律失常。
1.3 谐波成像 Paladini等[2]进行了探讨组织谐波成像(tissue harmonic imaging， THI)在胎儿超声心动图检查中的作用研究，表明THI的图像质量明显优于常规二维超声心动图，尤其在肥胖孕妇和常规二维超声心动图不能提供诊断信息时应用最佳。
1.4 能量多普勒成像 能量多普勒成像(power doppler imaging， PDI)是彩色多普勒的一项新技术，在评估血流动力学时有着非常重要的作用，但是它也存在一些缺点，如不能显示血流的方向、性质和流速等。
1.5 三维成像 胎儿三维超声心动图经历了从静态、动态到实时的发展过程，大大缩短了图像采集时间，提高了图像质量和重复性，在胎儿先心病的诊断中也起着越来越重要的作用。Meyer等分别应用三维及二维胎儿超声心动图对先心病胎儿进行对比研究，发现大多数先心病胎儿的三维成像是可行的，且能显示二维超声无法获得的切面深部的心脏结构，从而为复杂的先心病提供了额外的诊断信息。Deng等研究证实，实时三维成像可实时显示心脏结构的立体形态以及动态变化，显示出各结构与病变的毗邻位置与空间关系，及早对胎儿先心病作出诊断。
上述技术的综合应用以及新电子技术、图像处理技术的高速进展，使胎儿心血管结构、血流和功能的确认得到清晰显示，并且可以同时获得胎儿心血管解剖形态和血流动力学改变的独特诊断信息，典型的心血管畸形多可依靠超声作出诊断[3，4]。并且，作为一种非侵入性的诊断技术，目前仍然是产前诊断胎儿CHD的主要手段[5，6]。然而，超声诊断受仪器档次和操作人员技术水平的影响比较敏感，病变较小或超声显示不满意时，容易漏诊。
2 遗传学分析
2.1 染色体异常 染色体数目和结构的畸变都能引起各类综合征，如21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征、5p-综合征等，多伴有CHD，约占CHD的5%。近年来的研究表明，CHD与22q11微缺失有关。杜玉荣等[7]对25例不同表型的CHD患者外周血标本进行22q11微缺失的检测，23例单纯性CHD患者发生缺失者为4例;其余2例法洛四联症伴心外多发畸形患者均存在22q11缺失，研究结果表明，CHD与22q11 微缺失有关，国外研究也有类似报道[8]。但22q11微缺失是否与单纯CHD的发生有关还需要进一步的研究，以便为今后产前诊断和遗传咨询提供更可靠的依据。
2.2 单基因遗传性疾病 由单基因突变引起的CHD约占3%，包括常染色体显性、隐性遗传性疾病和伴性遗传病。如Marfan综合征、Hurler综合征、Ellis-Van Creveld综合征、进行性肌营养不良Duchnne型等均常合并CHD。
2.3 多基因遗传 多数为单纯的心血管畸形而不伴有其他畸形，占CHD的90%。临床资料和流行病学研究表明，遗传因素在CHD 的发病过程中发挥重要作用，遗传率约为55%～65%。因此，从分子水平上研究控制心脏发育的相关基因，对于探讨心脏病变的机制及探索人类遗传性心脏病的治疗方案及手段具有重要意义。随着分子生物学的飞速发展，可能与CHD发病有关的基因逐渐被人们所认识。宫立国等[9]研究表明HOXC5基因3侧翼序列的SNP位点A17860G等位基因可能与单纯CHD发病有关，G17860基因型患CHD的危险明显高于A17860基因型。HOXC5基因3侧翼序列的SNP位点rs2071450与单纯性CHD也有明显的相关性，具有G等位基因的人发生CHD的危险性相对增高。MTHFR基因与心脏圆锥动脉干缺损有一定关系，其677TT基因型可能是引起先天性心脏畸形的危险因素之一。Shaw等[10]也报道，NPPA T2238C等位基因的突变可能是圆锥动脉干缺损的危险因素。
3 环境因素调查
3.1 宫内感染 胎儿的心脏胚胎发育的关键时期是在孕第3～8周，在此期间，如果母亲发生病毒感染，导致胎儿患CHD的危险性增加，说明早孕期孕妇的病毒感染与先心病的发病有密切的关系。国内一些研究表明，CHD与孕妇早期风疹病毒、巨细胞病毒、弓形体、微小病毒感染密切相关。目前，对柯萨奇病毒感染及孕早期流感还未得到肯定的答案，在一些研究中存在争议。
3.2 孕期用药 孕妇在妊娠早期服用某些药物可使胎儿患CHD的几率明显增高。近期国外一些研究提示，孕早期使用红霉素类药物、安非他明类药物、非甾体抗炎药物和治疗甲状腺疾病的药物可能增加发生心血管畸形的危险。在动物实验中发现，VEGF和Wortmannin可以造成胚胎心脏发育异常，但还缺乏在人群中的研究[11]。
3.3 理化因素 父母在孕前或母亲在孕早期接触染料、油漆、涂料、有机溶剂等均增加CHD发病的危险，高温可以导致子代患CHD 的危险性增加。近几年，由于视频显示终端工作人员大量增加，人们对电磁场暴露是否增加子代CHD患病的危险尤为关心，但目前绝大多数研究显示电磁场暴露对妊娠结局没有明显不利影响。
3.4 孕妇年龄 孕妇年龄过小，胎儿与发育中的母亲争夺营养，对母亲的健康和胎儿的发育均不利。而孕妇年龄偏大，特别是35岁以上的高龄产妇，卵子质量降低，发生CHD等胎儿畸形的可能性增大[12]，发生难产、剖宫产的几率也会增加。
3.5 个人行为 孕妇在孕期吸烟和饮酒会增加胎儿CHD的危险，国内外都有相关报道。Woods等结果显示吸烟与心血管畸形有关联，Carmichael等[13]的研究指出，孕期定期饮酒可以增加CHD的发生，且其危险程度随饮酒的次数和多少的增加而增加，存在剂量反应关系。
3.6 生活环境 研究还发现CHD的发生与生活环境有一定的关系。高原地区的CHD的发病率高于平原地区，尤其是动脉导管未闭的发生率明显升高。近期国外的一些研究显示，生活在危险的垃圾场周围和一些空气中含有有毒化学物质的区域，CHD的发病率明显增高[14]。
4 展望
综上所述，大多数CHD是各个危险因素综合作用的结果，需要多个学科不断深入探讨，只有进一步弄清病因才能深入研究发病机制，提出更有效的诊断方法和预防措施。就目前的临床诊断水平而言，CHD的产前检出率不高，Yoshio Shima等[15]报道产前检出率约20%。因此，对CHD进行更加广泛的流行病学研究，结合更为细化的遗传学分析和基因检测，将有望为各类CHD补充完备的遗传学资料，以便为胎儿CHD做出准确的分子遗传学及基因诊断，进一步提高产前诊断水平，达到早期治疗和预防的目的。
参考文献
1 Tutschek B， Zimmermann T， Buck T， et al. Fetal tissue Dopple rechocardiography: Detection rates of cardiac structures and quantitative assessment of the fetal heart. Ultrasound Obstet Gynecol， 2003，21(1):26-32.
2 Paladini D， Vassallo M， Tartaglione A， et al. The role of tissue harmonic imaging in fetal echocardiography. Ultrasound Obstet Gyncol， 2004，23(2): 159-164.
3 孙卫平. 胎儿畸形的产前超声诊断价值分析.中国优生与遗传杂志，2009，17(3): 107.
4 臧玲， 吴瑛， 熊奕， 等. 应用超声“三切面”法筛查胎儿心脏异常的价值. 暨南大学学报(自然科学与医学版)，2008，29(2): 199-201.
5 徐燕， 胡娅莉， 茹彤. 胎儿超声心动图的研究进展. 中国妇幼健康研究，2007，18(1): 37-38.
6 王红玉. 超声诊断胎儿先天性心脏病的探讨. 河北医药，2007，29(1): 63-64.
7 杜玉荣， 杨焕杰， 谭震， 等. 22q11微缺失与先天性心脏病的关系的研究. 遗传， 2005， 27(6): 873-876.
8 Oskarsdottir S， Persson C， Eriksson BO， et al. Presenting phenotype in 100 children with the 22q11 deletion syndrome. Eur J Pediatr，2005，164 (3):146-153.
9 宫立国， 邱广蓉， 邱广斌， 等. HoxC5基因内2个SNP位点与单纯性先天性心脏病的关联研究. 中国实验诊断学， 2004，8(6):567-570.
10 Shaw G， Iovannisci D， Yang W， et al. Risks of human conotruncal heart defects associated with 32 single nucleotide polymorphisms of selected cardiovascular disease-related. Genes，2005，138(1):21-26.
11 Wang Y， Zhong T， Qian L， et al. Wortmannin induces zebrafish cardia bifida through a mechanism independent of phosphoinositide 3-kinase and myosin light chain kinase. Biochem Biophys ResCommun，2005，331(1):303-308.
12 王苏. 2008年长春市出生缺陷监测资料分析. 中国妇幼保健，2010，25(5): 636-637.
13 Carmichael S， Shaw G， Yang W， et al. Maternal periconcep tional alcohol consumption and risk for conotruncal heart defects. Birth Defects ResA ClinMol Teratol，2003，67(10): 875-878.
14 Malik S， Schecter A， Caughy M， et al. Effect of proximity to hazardouswaste sites on the development of congenital heart disease. Arch Environ Health，2004，59(4):177-181.
15 Yoshio S， Fumiko S， Mizue N. Prenatal diagnosis of congenital heart disease: clinical experience and analysis. J Nippon Med Sch，2004，71:328-332.
3.3 理化因素 父母在孕前或母亲在孕早期接触染料、油漆、涂料、有机溶剂等均增加CHD发病的危险，高温可以导致子代患CHD 的危险性增加。近几年，由于视频显示终端工作人员大量增加，人们对电磁场暴露是否增加子代CHD患病的危险尤为关心，但目前绝大多数研究显示电磁场暴露对妊娠结局没有明显不利影响。
3.4 孕妇年龄 孕妇年龄过小，胎儿与发育中的母亲争夺营养，对母亲的健康和胎儿的发育均不利。而孕妇年龄偏大，特别是35岁以上的高龄产妇，卵子质量降低，发生CHD等胎儿畸形的可能性增大[12]，发生难产、剖宫产的几率也会增加。
3.5 个人行为 孕妇在孕期吸烟和饮酒会增加胎儿CHD的危险，国内外都有相关报道。Woods等结果显示吸烟与心血管畸形有关联，Carmichael等[13]的研究指出，孕期定期饮酒可以增加CHD的发生，且其危险程度随饮酒的次数和多少的增加而增加，存在剂量反应关系。
3.6 生活环境 研究还发现CHD的发生与生活环境有一定的关系。高原地区的CHD的发病率高于平原地区，尤其是动脉导管未闭的发生率明显升高。近期国外的一些研究显示，生活在危险的垃圾场周围和一些空气中含有有毒化学物质的区域，CHD的发病率明显增高[14]。
4 展望
综上所述，大多数CHD是各个危险因素综合作用的结果，需要多个学科不断深入探讨，只有进一步弄清病因才能深入研究发病机制，提出更有效的诊断方法和预防措施。就目前的临床诊断水平而言，CHD的产前检出率不高，Yoshio Shima等[15]报道产前检出率约20%。因此，对CHD进行更加广泛的流行病学研究，结合更为细化的遗传学分析和基因检测，将有望为各类CHD补充完备的遗传学资料，以便为胎儿CHD做出准确的分子遗传学及基因诊断，进一步提高产前诊断水平，达到早期治疗和预防的目的。
参考文献
1 Tutschek B， Zimmermann T， Buck T， et al. Fetal tissue Dopple rechocardiography: Detection rates of cardiac structures and quantitative assessment of the fetal heart. Ultrasound Obstet Gynecol， 2003，21(1):26-32.
2 Paladini D， Vassallo M， Tartaglione A， et al. The role of tissue harmonic imaging in fetal echocardiography. Ultrasound Obstet Gyncol， 2004，23(2): 159-164.
3 孙卫平. 胎儿畸形的产前超声诊断价值分析.中国优生与遗传杂志，2009，17(3): 107.
4 臧玲， 吴瑛， 熊奕， 等. 应用超声“三切面”法筛查胎儿心脏异常的价值. 暨南大学学报(自然科学与医学版)，2008，29(2): 199-201.
5 徐燕， 胡娅莉， 茹彤. 胎儿超声心动图的研究进展. 中国妇幼健康研究，2007，18(1): 37-38.
6 王红玉. 超声诊断胎儿先天性心脏病的探讨. 河北医药，2007，29(1): 63-64.
7 杜玉荣， 杨焕杰， 谭震， 等. 22q11微缺失与先天性心脏病的关系的研究. 遗传， 2005， 27(6): 873-876.
8 Oskarsdottir S， Persson C， Eriksson BO， et al. Presenting phenotype in 100 children with the 22q11 deletion syndrome. Eur J Pediatr，2005，164 (3):146-153.
9 宫立国， 邱广蓉， 邱广斌， 等. HoxC5基因内2个SNP位点与单纯性先天性心脏病的关联研究. 中国实验诊断学， 2004，8(6):567-570.
10 Shaw G， Iovannisci D， Yang W， et al. Risks of human conotruncal heart defects associated with 32 single nucleotide polymorphisms of selected cardiovascular disease-related. Genes，2005，138(1):21-26.
11 Wang Y， Zhong T， Qian L， et al. Wortmannin induces zebrafish cardia bifida through a mechanism independent of phosphoinositide 3-kinase and myosin light chain kinase. Biochem Biophys ResCommun，2005，331(1):303-308.
12 王苏. 2008年长春市出生缺陷监测资料分析. 中国妇幼保健，2010，25(5): 636-637.
13 Carmichael S， Shaw G， Yang W， et al. Maternal periconcep tional alcohol consumption and risk for conotruncal heart defects. Birth Defects ResA ClinMol Teratol，2003，67(10): 875-878.
摘要:
灯刷染色体是存在于除哺乳动物以外几乎所有动物雌配子减数分裂第一次分裂双线期的一种暂时性巨大转录体，因状如灯刷而得名，但在细胞遗传学三大经典染色体研究中关注度最低。它是研究减数分裂时期染色体的结构、组织形式、转录和转录过程的好材料。本文一方面对以上研究及形成机制作一简要综述，另一方面探讨灯刷染色体可能的作用，也即从已有文献表明卵细胞核的灯刷染色体或多倍化为相关生物胚胎发育提供足够的转录产物。最后探讨将其作为一个案例用于遗传学教学的可能性，以激发学生学习遗传学的兴趣。
关键词:
遗传学；细胞遗传学；灯刷染色体；研究进展；遗传学教学
遗传学是生命科学领域中一门兼具理论性和实验性的基础性学科之一，从遗传学发展史上可以清楚地看到一系列经典的研究案例对遗传学的发展起到巨大的推动作用[1]，赋予遗传学新的内容，使遗传学理论不断地完善和提高，从而在更高水平指导遗传学的发展。例如果蝇和豌豆因其丰富的表型在性状遗传研究上成为经典研究案例，奠定了遗传学的初创和发展；唾腺染色体和灯刷染色体因其形体的巨大性和特异的细胞结构，促进了细胞遗传学的发展；以噬菌体为材料促进了生化和分子遗传学的发展；以大肠杆菌为材料的研究揭示了原核表达调控的机制；以拟南芥和水稻为材料解析了植物基因组的特点并促进了植物功能基因组学的研究[2,3]。这些案例还有很多，限于篇幅不一一枚举。不过，关于遗传学发展史上经典案例的研究和关注并不平衡。例如在细胞遗传学三大经典染色体的研究中，关于唾腺染色体和巴氏小体的研究很多，而灯刷染色体(Lampbrushchromosomes,LBCs)的关注度较低。尽管LBCs因拥有数以万计的正在转录的单位而具有了结构的巨大性，但在过去的130多年中公开发表的文献仅有350多篇（projects.exeter.ac.uk/lampbrush）。究其原因可能有四点：一是分离LBCs技术难度较大；二是所使用的仪器是显微镜，而不是时髦的微量移液器，导致学生的兴趣不足；三是可用分离该染色体的典型材料不易取得，多数动物材料都是各国重点保护的动物；四是可能由于偏重理论研究，无法取得足够的经费支持[4]。尽管如此，LBCs的研究仍然取得了令人兴奋的成绩，本文拟沿着LBCs研究的踪迹，比较系统地综述相关生物卵细胞减数分裂第一次分裂双线期染色体的结构、组织形式以及转录等相关知识。最后探讨将这一被忽视的“明星染色体”案例介绍给学生，以期引导学生对LBCs研究的重视，激发他们学习和研究遗传学的热情。
1灯刷染色体的研究进展
1882年，Flemming首先在蝾螈（Notophthalmusviridescens）的卵母细胞中发现了这种结构[5]，十年之后，Rückert(1892)在狗鲨（Chiloscylliumpunctatum）卵母细胞中再次发现了Flemming所描述的结构，因为其形如19世纪的灯刷或20世纪的试管刷而命名为灯刷染色体[6]。典型的LBCs实质上是存在于除哺乳动物以外几乎所有动物（在两栖类、鸟类和昆虫类都有很好的研究）雌配子减数分裂第一次分裂双线期的一种暂时性巨大转录体,大小可以达到5~6mm。细胞核中每个LBCs是二价体（一对同源染色体），核中有几个二价体就有几个LBCs，每个二价体包含四条染色单体，同源染色体通过交叉（Chiasmata）相连。它们具有独特的染色粒—侧环（Chromomere–lateralloop）结构：染色粒串联形成单体的主轴，是遗传惰性区；显著的侧环结构则为转录活性区，包括了成千上万的活性转录单元[7]。随着转录的进展，RNA链不断延长，外形呈“圣诞树”样结构。除了在以上动物的卵细胞中发现LBCs外，在果蝇细胞Y染色体和植物中也有发现，比如在单细胞藻类（Acetabularia）中发现有典型的LBCs结构[8]，其它所报道的植物LBCs不具有典型结构，只是一条较长的染色体，周围有绒毛状的结构。由于LBCs在普通光学显微镜下可以看到，因而它是研究基因组结构和功能的极为理想的实验材料[9]。
1.1灯刷染色体的基本结构和细胞图在普通光学显微镜下，在外观上看每一个典型的LBCs两个同源染色体依靠几个交叉相连，它们分别由无数致密的染色质颗粒或染色粒串成线状，这些颗粒之间有染色质丝相连，在每一颗粒或染色粒处产生1到数个成对的侧环，这就构成了所谓LBCs上的“刷毛”[10]。这些环之所以成对出现是由于姐妹染色单体之间没有任何联系造成的。利用扫描电镜或电镜技术结合免疫技术对来自不同物种的LBCs进行观察，发现侧环是以纤细的染色质为轴，上面覆盖了无数的核糖白（Ribonucleoprotein，RNP）颗粒。由于RNP颗粒相互聚集和沿侧环轴向的卷曲会将正常状态的侧环一步一步装配形成小颗粒、颗粒球和紧密块状物等更高级的侧环结构[11]，因而形成了光学显微镜下可见的巨大染色体。染色粒和连接它们的染色质丝构成了LBCs的轴，轴上最显著的特点就是染色粒–侧环结构，某些有明显特征的侧环往往成为鉴定染色体特异性的界标（Landmark），比如在两栖类中，几乎大部分灯刷染色体都有巨大的侧环，只是位置不同，所以可以区分不同的染色体；另一类是有特异结构的侧环，分为高密度侧环和块状侧环，也存在于很多染色体不同位置中。轴上除了染色粒和侧环外，还有着丝粒、端粒、球体等结构。这些结构常常出现在特定染色体的固定部位，成为鉴别各条染色体的界标[11]。染色粒(Chromomere)是LBCs轴的主要成分。在配对的同源染色体中，染色体轴上染色粒的数目和分布大体相同，但形状不很规则。在最初形成的LBCs上，单体灯刷染色体染色粒的数目可以达到5000个以上，在光镜下染色粒大小从不可见到可见的1µm。据估算，一个有尾目的两栖动物LBCs的染色粒所包含的碱基数目约5~10Mb，而侧环中仅有50~150kb的DNA[10]。染色粒的数目和大小与物种和减数分裂的推进有关，也随侧环转录活性而变化。随着减数分裂的推进，染色粒逐渐变大，数目减少。在早期的LBCs中侧环转录活性高，这时染色粒小，数目多；随着双线期的推进，侧环因转录活性下降而回缩，染色粒彼此融合最终成一条正常的分裂期染色体[12]。侧环(Lateralloop)是DNA活跃转录的区域，仅占整个LBCsDNA总量的0.2%~0.4%，其与染色粒的边界序列有无特异性现在尚不清楚[10]。在两栖类中，它们的长度与C值呈正相关，平均长度为10~15µm，长的可达200~300µm，这些长的侧环具有染色体的特异性。多数侧环上只有一个转录单位，转录方向可以相同或相反，利用转录抑制子的研究发现，这些转录多数由RNApolII启动。侧环的产生并不同步，某些侧环能贯穿LBCs整个发育期；有些仅在个别时期产生，失去转录活性后回缩到染色粒中。激素处理也能影响侧环的伸展和回缩，这点与果蝇的唾腺染色体的蓬突结构类似，其发生机制和意义有待进一步的研究。由于转录产物的种类、数量和堆积状态不同，在某些染色体轴的特定部位可以形成不同类型的侧环，这成为区分不同LBCs的重要界标[13]。LBCs的着丝粒（Centromere）有二种形态：一种是在某些两栖类中称为着丝粒颗粒，在鸟类中则为蛋白体（Proteinbody）,其大小形态与前后染色粒不易区分，另一种主要在两栖类发现，着丝粒和其两侧相邻的染色粒彼此融合而成染色粒棒（Chromomerebar）。先前的报道表明着丝粒颗粒和染色粒棒上均无侧环，最近的报道称某些鸟类的蛋白体有短的侧环产生[14]。关于端粒（Telomere）的观察主要来自鸟类，在姐妹染色单体的末端分别形成端粒环（由染色单体的末端插入邻近的染色粒所致），通常情况下，端粒环是开放的，也存在一个插入一个开放的形式，其大小和长度具种的特性。两侧无侧环，鸡的端粒环含有2个转录单元[15]，关于LBCs着丝粒和端粒可以转录在欧洲水蛙中也得到证实，一些串联重复序列可以在该类结构中大量转录[7]。球体（Sphereorganelles）是LBCs上另一个重要标志，有染色体的特异性，相当于一般染色体的次级缢痕。其直径一般2~10µm，一般包含2~4个[10]。以上这些结构由于在序列组成、位置、结合蛋白以及形成的高级结构上具有染色体或种的差异，结合LBCs的长度差异，现在已经绘出了多种两栖类和鸟类的LBCs细胞图[7]；利用细菌人工染色体–荧光原位杂交（BAC–FISH）技术绘制了鸡LBCs着丝粒区的精细物理图谱[16]，以上这些工作为利用LBCs进行基因组/杂种鉴定、精细遗传/物理图谱绘制、基因定位、转录和转录机制等研究工作奠定了基础。
1.2灯刷染色体的转录与转录进程研究表明转录主要发生在LBCs的侧环上，大量的新生转录产物和相关蛋白结合，形成了光镜下可见的RNP基质。每个侧环由1~数个转录单位组成，所以LBCs上单个转录单位是可视的，这使得他们成为在结构和分子水平上研究转录及其调控机制的优异材料[17]。侧环的类型因RNP基质的大小和类型可以大致分为正常的大环型、颗粒型、球型和块状（Lumpy），它们都是以30nmRNP颗粒为基础逐渐装配而成，为了探明不同结构的侧环与转录活性的关联，对典型的侧环如球型侧环利用放射自显影、转录抑制子结合大分子扩散分析技术进行RNA合成的分析[17]，结果表明在这类侧环中，存在RNA的合成；侧环的延伸与转录活性相关，活性高的时候，侧环增大，活性降低时，侧环回缩到染色粒中；有的侧环中存在数个不同外形的转录单元，这几个转录单位的转录存在速度的差异。用RNA前体标记物作为探针进行原位杂交试验，与大环和颗粒状的侧环相比，球型侧环标记的速度和强度均较弱，推测不同侧环可能具有相异的转录模式，这个问题有待进一步阐明[18]。已有的报道表明不同侧环的演化存在关联性，这同样也可以看作是转录后的调控。电镜实验证明了这些类型的侧环都是由30nmRNP颗粒组成的；热休克（Thermicshock）实验结果显示在低温处理下，趋于向高级侧环结构发展，而在高温处理下，则趋于向去凝缩方向发展；免疫实验也证明侧环形态的多样性与特异蛋白存在关联。例如在蝾螈的卵细胞中发现一个82kD白，利用单抗进行原位杂交试验表明可以和所有类型的侧环结合，但是并不同步。比如，当球状侧环被强烈标记时，大环和颗粒环不被标记，当标记出现在核质中时，所有类型的环不被标记，该结果初步证明了特异的蛋白与侧环的结构演变存在关联[18]。
来自鸟类的实验表明，侧环中一个转录单位约长1~40µm，这些被转录的基因包括了编码基因和非编码基因。一个令人吃惊的事实是一些持家基因在LBCs的转录是被抑制的，比如在鸟类中编码18S、5.8S和28S的基因簇是没有活性的，但散布的该类基因仍然可以被RNApolII转录而不是polI[19]。迄今为止，在两栖类和鸟类LBCs的研究中，发现仅有少数单拷贝基因在此时转录。比如在两栖类LBCs中，已经证实细胞角蛋白（Cytokeratin）、核仁蛋白NO38/B23、c–myc和Eg1是转录的，并发现了它们的转录产物向核质转移[20]。基于DNA/RNA杂交技术的染色体涂抹技术（Chromosomepaintingtechnique）使大规模研究LBCs的转录成为可能，利用改良的该技术BAC–FISH发现许多鸟类LBCs单拷贝的基因可能是转录的。但问题是BAC克隆是大片段插入，包含了单拷贝和多拷贝的信息，所以，要验证更多的单拷贝的表达需要进一步的实验。早期的生化实验证明LBCs转录的主要是非编码的串联重复序列[21]，进一步的调查是利用原位杂交实验证明两栖类LBCs转录的主要是一些微卫星序列。值得注意的是来自鸟类的研究结果，如果出现在侧环中的一个微卫星序列是转录的，那么侧环临近的染色粒里面的同类微卫星串联簇是不表达的，这个结果表明存在一种未知的调控机制启动LBCs侧环中微卫星DNA的转录[19]。来自热带爪蟾的研究发现卵母细胞中还储存大量来自LBCs转录子的稳定内含子（StableintronicsequenceRNA），这些内含子一直到囊胚期都可以检测到，说明在胚胎发育的早期可能发挥重要作用[22]。关于侧环上转录调控机制的研究，早期提出了“通读假说”（Read–throughhy-pothesis）[23]，该假说认为侧环上转录起始于结构基因的启动子序列，到了该基因的终止序列后并不停留，而是继续转录下面的非编码序列，现代遗传学的研究结果否认了该假说。结合基因组和细胞学的证据表明位于鸡LBCs侧环微卫星序列中的反转录转座子长末端重复序列（LTR）启动了微卫星序列的转录，这得到了很多来自两栖类实验的证明。如果这个机制是正确的，侧环的平均长度应该与活跃的LTR启动子的数量呈负相关，这是今后需要阐明的问题之一。初生的转录产物被与RNA成熟相关的蛋白包被，成为附着于侧环上的RNP基质，这种独特的结构为在活体条件下研究侧环转录产物的处理和机制提供了平台。来自生化的证据表明，鸟类LBCs侧环中多数RNP基质含有与RNA成熟相关的组件，如snRNPs、SC35、hnRNP和3’末端处理相关因子。有些RNP基质中没有发现snRNPs组件，这可能是由于在相应的微卫星转录产物中缺少典型的剪切位点所致[19]。
1.3灯刷染色体的作用自从发现LBCs后科学家一直试图理解发生在侧环上大量且有点随意转录的意义，很多人认为这种转录或多或少是没有意义的[20]。Davidson于1986年提出了另一个假说[24]，他认为发生在LBCs上的转录为将来卵母细胞的成熟和胚胎发育提供必要的转录产物，这一假说越来越为科学家重视。可能存在这种情况，LBCs上的转录产物在核膜破裂前是隔离的，当核膜解体后进入了转录后的切割程序，形成两类成熟的编码和非编码RNA分子，这种现象在Masi和Johnson研究LBCs组蛋白的转录过程上所证实[25]。据此推测，成熟编码蛋白质RNA分子可以用于在胚胎基因组启动表达之前，早期胚胎发育所必需蛋白质的合成。至于大量的非编码微卫星序列的命运可以用现代分子生物学的信息来解释。在后生动物中，编码微卫星序列的DNA可以转录形成dsRNA前体，成熟后产生siRNA，这些siRNA是形成组成型异染色质所必需的。那么，可以推测，在拥有LBCs的动物中，非编码微卫星序列的转录产物同样可以dsRNA前体形式储存在卵细胞中，为早期胚胎发育提供siRNA以便维持异染色质的稳定，这种假设的前提是要探明微卫星RNA产物能否出现在受精之后胚胎发育的过程中[19]。值得注意的是拥有典型LBCs的生物胚胎发育过程大部分时间是离体发育，这与胎生的哺乳动物在发育环境上存在巨大差异，因此，在这类生物中LBCs转录与离体后胚胎发育过程是否存在更密切的关联性是值得深入探讨的。1.4灯刷染色体的表观遗传修饰与染色质重塑通过对两栖类和鸟类灯刷染色体的深入研究，我们基本了解了其整体表观遗传的状态。来自两栖类的研究发现这类染色体中包括染色粒和侧环不但缺少组蛋白H1，而且组蛋白H4都呈高度乙酰化状态，这是典型基因组DNA转录活化的特点，实验证明，乙酰化和甲基化修饰组蛋白的尾部都会导致侧环相应状态的改变[19]。关于对LBCs表观遗传修饰的理解一个典型的例子是来自于对6种鸟类卵母细胞LBCsZW的研究[26]。鸟类卵母细胞中性染色体ZW是一个仅通过着丝粒处相连的不对称二价体，Z染色体具有正常的LBCs形态，而富含重复序列的W则仅形成几个较大的染色粒，含有少量的侧环。进一步的研究发现W染色体具备了惰性染色体的特点，比如缺少乙酰化组蛋白H4，富含组蛋白H3K9和H3K27的二甲基化，几个大的染色粒都含有大量的异染色质蛋白1。这些因素共同导致了W染色体在鸟类卵母细胞的发育中高度凝缩的状态[19]。
尽管现在从整体上对LBCs的表观修饰有了一定的理解，但对该类染色体的“建立–维持–再凝缩”的机制了解很少。一个重要的事实是在两栖类和鸟类的LBCs上，不但缺少组蛋白H1，而且也未见参与减数分裂染色质凝缩的拓朴异构酶II。另外一个在维持LBCs形态方面发挥重要作用的蛋白是染色体结构维持（Structuralmaintenanceofchromosomes，SMC）蛋白家族，它们参与了黏连（Cohesin）复合体和凝缩（Condensin）复合体的形成。电镜结合免疫试验证明黏连复合体主要出现在姐妹染色单体两条染色质丝形成的轴上，后者主要在染色粒上发现。这说明，这两种复合体可能对维持LBCs的染色粒–侧环结构发挥重要作用[27]。最新的关于LBCs重建的实验来自将人类的注射进两栖类动物非洲爪蟾的卵母细胞中，结果发现染色体形成了典型的LBCs结构，这一方面说明了两栖类动物卵母细胞中含有重塑哺乳动物非活性染色体的所有因素，另一方面也说明哺乳动物卵母细胞染色体的失活并不是永久的遗传或表观遗传机制造成的。这个实验为进一步鉴定染色质重塑相关的顺式和反式作用因子以及解析其机制提供了研究材料[9]。
2灯刷染色体应用于遗传学教学的现状与思考
对于遗传学内容的传授离不开优秀的案例，生命科学的飞速发展也使得这些案例的内涵得到了丰富和扩展。以优秀案例开展遗传学教学工作可以将复杂的遗传学知识形象化和简单化，便于教师的讲授和学生的理解与记忆[3]，同样也可以使枯燥的遗传学学习变得妙趣横生。LBCs就是遗传学的一个优秀经典的案例，但在遗传学教学中出镜偏低。在作者教学所使用戴灼华等编写的《遗传学》课本中，以LBCs为案例介绍的内容很少[28]，仅在第二版第二章《遗传的细胞学基础》中，作为一种特殊染色体形态进行了简单介绍，一句“LBCs是在光学显微镜下直接观察并识别特殊位置上的单个基因转录活性极为理想的材料”让学生对该案例充满了遐想和期待，但本书后面的遗传学内容均没有发现该案例的身影，因此发掘和使用LBCs案例应用于遗传教学有十分重要的意义。
2.1灯刷染色体在遗传学教学中的拓展以LBCs为案例进行相关遗传学内容教学，我们应首先根据高校遗传学的培养目的和教学目标，在学生掌握了一定的细胞、生化和遗传知识的基础上，结合遗传学的进度逐步有序地加以介绍。在我所教授的遗传学课本中LBCs是作为一类特殊的染色体介绍给学生的，除了介绍了一点关于LBCs的发现和特点外，缺少更加详细的资料。正是由于其可视性的特点，学生除了可以容易的掌握其特殊染色体的特点外，也可以掌握一般染色体具有的特点。其实，随着研究的深入，其涵盖的遗传学知识也越来越多，形成和维持该特殊染色体的原因也越来越清楚。我们在教学过程中是这样介绍的：关于LBCs结构的认识是随着相关技术的发展而不断深入的。19世纪末发现LBCs并不偶然，那时的科学家用光学显微镜寻找适合的染色体材料去研究减数分裂和有丝分裂；随着时代的发展，科学家发现LBCs丰富而富有特色的结构适合细胞图的绘制；电镜和扫描电镜的发明更推动了LBCs结构和染色体组织的认识，知道了更细微结构的形态，比如对侧环结构的认识，发现了侧环结构的复杂性；免疫学和电镜技术的结合，使科学家认识到侧环是由最基本的单位RNP颗粒组成的，经过一步步的装配和折叠形成了不同外形特点的侧环；分子技术、免疫技术和电镜技术的综合运用，使人们认识到侧环白体中RNA主要是微卫星序列的转录产物，但也有少量单拷贝的编码序列RNA。由此引导同学们思考：既然LBCs的RNP基质中主要是编码非编码序列微卫星的RNA，它的作用究竟是什么呢？如果同学们已经知道了微卫星序列最终编码的siRNA参与了异染色质的形成和维持的话，自然会想到在LBCs“再凝缩”阶段可能会发挥作用。关于适合进行细胞图的绘制也可以根据技术的发展逐渐深入：在仅有光学显微镜的早期，只能根据大的界标如侧环、染色粒、着丝粒、端粒等进行简单的作图，用于区分不同的染色体、基因组甚至杂种；随着电镜技术的发展，对LBCs结构认识更加细致，可以绘制更加精细的细胞图；随着染色体涂抹技术的发展，可以将DN段定位到LBCs不同结构中，绘制更加实用的物理图，这将为进行全基因组测序更加全面的认识基因组特点奠定基础。关于LBCs形成和维持原因的介绍可以使学生理解和掌握染色质重塑方面的知识。早期在只有光学显微镜的条件下对它的认识一筹莫展，只能提出假说；但随着免疫技术和分子生物学技术的运用，才认识到存在一些事实：LBCs中组蛋白H1缺失，H4高度乙酰化，染色粒处富含组蛋白H3K9和H3K27的二甲基化，鸟类W染色体几个大的染色粒都含有大量的异染色质蛋白1等等。其实这离完全了解其产生机制还有很远的距离。为了让学生直观地掌握转录相关知识，也可以引入LBCs的相关内容。由于单个转录单位可视性的特点，所以可以直观容易地了解单个转录单位的结构、组成、长度、速率和分子互作等方面的知识。为了学生更容易地理解LBCs相关的遗传学知识，开设LBCs分离和鉴定实验是值得考虑的教学内容。现在国内常用的遗传学实验教材没有这个实验，国外也少有开展。我校生命学院关于该实验正在筹划中，所以待有了一定的进展后再向同仁汇报。更加详细的实验程序可以参照相关网站的内容。
1 微卫星不稳定(MSI)
1980年Wyman等[2]首先发现了DNA分子中的一个高度多态性位点,其后人们不断发现这一类由一段核苷酸序列多次串连重复所形成的高变区,称为VNTR。VNTR又进一步分为小卫星和微卫星。小卫星的特点是重复单位长度为8到数10个核苷酸,不同的基因座位有不同的结构,但一般都拥有一段共同的核心序列。1981年Miesfeldd等[3]首次发现微卫星DNA,微卫星DNA由2～6个核苷酸组成,常见的有2、3、4核苷酸重复序列,尤以二核苷酸的重复序列(CA/GT)n最为常见。微卫星广泛存在于原核及真核基因组中,约占真核基因组的5% ,多位于编码区附近,也可以位于内含子、启动子、Alu序列中。微卫星DNA数目巨大,人类基因组中约有5×104 个(CA)n重复序列,重复次数一般15～60次,重复单位结构相同,其长度一般小于200 bp。每个特定位点的微卫星DNA均由中间的核心区和的侧翼区2部分构成。核心区含有1个以上称为“重复”的短序列,一般该重复单位的碱基对数目不变,而串连在一起的重复单位数目是随机改变的,如果用一种不切重复单位的限制性内切酶把DNA分子切割成限制性酶,该限制性酶中位于核心区的即是侧翼区[4] 。
近来分子细胞生物学的研究表明,基因的不稳定性是人类癌症多步骤发生过程中最重要的环节,被认为能增加正常突变速率与导致癌基因及抑癌基因的突变。MSI是指在一些遗传性疾病、炎性疾病和恶性肿瘤中,微卫星的串连序列的重复数目常与正常微卫星DNA不同[5]。微卫星DNA序列的改变使其不能正常地发挥调控作用,使细胞的增殖及分化发生异常,由此导致了肿瘤的发生。MSI指基因组中简单重复序列次数的增加或减少,可表现在多种不同的肿瘤中,且仅在肿瘤中出现。说明MSI与细胞的恶性转化有关。目前,微卫星DNA不稳定性作为肿瘤细胞的基因标志物,在肿瘤研究中愈来愈被人们重视。随着对MSI与肿瘤关系研究的深入,表明很多肿瘤的发生与MSI相关。MSI是继癌基因、抑癌基因发现之后的又一肿瘤发生的新途径,在肿瘤预防、诊断和治疗上有重大意义[6]。MSI在肺癌、食管癌、膀胱癌早期诊断方面具有很高的特异性。研究基因组MSI的发生也助于发现新的抑癌基因(易感基因或疾病基因)。事实上,MSI是遗传性非息肉性结直肠癌(Heredi.Tary nonpolysis colorectal cancer,HNPCC)的特点,并由4种MMR如hMSH2、hMLH1、hPMS1、hPMS2突变所致。
2 结直肠癌与微卫星不稳定
结直肠癌的发生分遗传性和非遗传性2类,遗传因素引起的结肠癌包括家族性大肠腺瘤息肉病(familia1adenomatouspolypo8is,FAP)和HNPCC,非遗传性结肠癌即散发性结直肠癌。近年来研究发现FAP、HNPCC及散发性结直肠癌的发生、发展的分子生物学途径不同。FAP和一些散发性结直肠癌的发生主要由APC基因突变引起,该类肿瘤的发生是按杂合丢失途径进行的,而HNPCC和另外一些散发性结直肠癌的发生主要是MMR基因起决定作用。肿瘤的发生、发展是按照复制错误途径进行的。
2.1 分型 1997年1月,在美国国立癌症研究所组织的“微卫星不稳定和RER表型在肿瘤检测和肿瘤家族性预测中的应用研究会”上决定将结直肠癌按微卫星不稳定发生频率分为3型 [7]。在分析的5个微卫星DNA标记中有2个或2个以上发生微卫星不稳定现象称为MSIH;如1个发生微卫星不稳定现象称为MSIL;如没有发生微卫星不稳定现象称为Mss。在当前的许多研究中,也常将结肠癌统分为微卫星不稳定阳性(MSI+)、微卫星不稳定阴性(MSI)2类。
2.2 MSI与结直肠癌临床病理学意义 错配修复基因bMLH1和hMSH2在结直肠癌病因学中的作用已得到证实。复制期间微卫星不稳定性的特征结果,复制错误表型可见于大多数HNPCC中,而在ScRc中仅占少数[8]。MSI在ScRc中占l2%～15%。目前MSI被认为是错配修复缺乏所致。Aaltonen等[9]研究结直肠癌MSI与临床病理参数的关系发现,MSI与DNA二倍体低分化的肿瘤表型有关,涉及2个以上微卫星标记的MSI的存活期显著长于无MSI肿瘤。Mori等[10]采用PCR技术检测54例结直肠癌,MS1检出率为22%,在MSI阳性病例中42%的患者为结肠多发癌。伴有MSI的结直肠癌预后较好,大量文献报道,MSIH结肠癌与MSS型结肠癌相比具有独特的临床病理学和分子生物学特征,前者预后较好,较多炎症细胞浸润,在Ⅱ、Ⅲ期结肠癌中,MSIH型肿瘤患者5年生存期高于后者;MSIH型肿瘤细胞分化程度低、浸润组织更深、较少淋巴结转移、原发病灶多位于右结肠。
2.3 MSI与癌前病变的关系 在慢性炎性疾病患者中发现MSI可能是发展成癌的早期表现征象。Cravo[11]对26例病史在10年以上的溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)患者进行临床研究,结果发现DNA修复缺陷与低叶酸状态有关,是造成UC的又一病因。他认为这种DNA缺乏与低叶酸状态,促使大范围基因突变,而且不能及时得到矫正,进而向恶性方向转化。
2.4 MSI与HNPCC的关系 近年研究表明,遗传性非息肉病性结直肠癌是由于DNA错配修复基因突变所致,而错配修复(MMR)基因突变则表现为微卫星不稳定,与癌基因和抑癌基因的杂合丢失途径不同。微卫星不稳定的发生系按复制错误(RER)途径进行的[12],是一种新的致癌机制,并且目前MSI不稳定检测作为筛选错配基因突变肿瘤的1个重要方法。从MSI到肿瘤的发生是HNPCC的l条特殊的发生途径,即MSI是错配修复基因突变的1种重要的表型,更准确讲是错配修复基因失活的1个标志,目前发现主要与遗传因素和基因的表型遗传学有关,而且在HNPCC变化过程中,MSI状态存在1个“微卫星稳定(microsatellite stability,MSS)微卫星低度不稳定(microsatellite low stability,MSIL)微卫星高度不稳定(microsatellite high stability,MSIH)”的序列[13]。遗传性非息肉病性结直肠癌是一种常染色体显性遗传性疾病,约占所有结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的5%～10%。已知至少有5种错配修复(MMR)基因(hMSH2;hMLH1,hPMS1,hPSM2和hMSH6/GTBP)与其有关。超过90%的HN.PCC家系是由hMSH2和hMLH1基因突变所致[14]。MSI是错配修复系统异常的表现,存在于90%以上的HNPCC患者和少部分散发性大肠癌患者,因此检测微卫星不稳成为国际上筛选HNPCC患者的金标准,对不符合Amsterdam标准但怀疑为HNPCC的患者,MSI检测可以帮患者仰基因突变的可能性。已发现高度微卫星不稳肿瘤与低度微卫星不稳肿瘤的临床、病理特征有明显差异,高度微卫星不稳肿瘤好发于近侧结肠、多为低分化、双倍体、生存率高等;分子生物学方面,高度微卫星不稳肿瘤与hMLH1和hMSFE突变关系密切,而低度微卫星不稳肿瘤则与hMLH1和hMSH2突变无关。因此,多数学者将低度微卫星不稳与微卫星稳定归于一类(MSI阴性),仅将高度微卫星不稳肿瘤定义为MSI阳性[15]。
综上所述,MSI为大肠癌发生的分子生物学及分子遗传学研究开辟了新途径,有关MSI确切的致癌机制,错配修复基因突变导致结直肠癌MSI的发生,低频率MSI的原因值得进一步深入研究。在MSI基础上,通过查找潜在多态重复基因序列寻找肿瘤的特异性标记,研究各类肿瘤的生物学特征,将有利于推动肿瘤预防和早期诊断以及肿瘤患者的个体化治疗,提高肿瘤患者的生存率。但是也存在不少争议,如在MSIL判定及其临床病理特征是否与MMS存在差异问题上尚没有一致认识,因此有待于进一步深入研究。
参 考 文 献
[1] 谢发君.微卫星不稳定性与结肠癌的研究进展.癌变畸变突变,2007,19(1):82.
[2] Brennetot C, Buhard O, Jourdan F, et al.M ononucleotide repeats BAT26 and BAT25 accurately detect MSIH tumors and predict tumor content:implications for population screening.IntJ Cancer,2008,113(3):446450.
[3] Miesfeldd R,Krystal M ,A rnheim N.A member for a new found between the human D and B globin genes.Neucle.ic Acid R es,1981,9:59.
[3] Knudsen no,nielsen fc,vinther l,et al.Nuclear loca1ization of human DNA mismatch repair protein exonuclease 1(hExo1).Nucleic Acids Res,2007,35:2609.
[4] Youn ck,cho hj,kim sh,et al.Bcl2 expression 8uppressesmismatch repair activity through inhibition of E2F tmnscriptiona1 activity.Nat cell Biol,2005,92:2286.
[5] Boland cr,thibodeau sn,hamii 0n sr,et al.A national cancer institute workshop on microsatellite instability for cancer detection and fami1ial predjspostitjo:development 0f intemaational criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer.cancer Res,1998,58:5248.
[6] Popat S,Hubner R,Houlston RS.Systematic review of microsatellite instability and colorectal can cer prognosis. J Clin oncol,2005,23(3):609618.
[7] Arnold cn,goelam,b0land cr.Role of hMLH1 promoter hypermethylation in drug resistance to 5nuomuraci1 in colorectal cancer cell lines.Int J cancer,2008,106:66.
[8] Aatonenla,peltomaki p,leach fs,et al.C1ues tothepathogenesis of familial colorectal cancer.science,2006,260:812.
[9] Moriy,selaru fm,satof,et al.The impact of microsatellite instability on the molecular phenotype of colorectal tumors.cancer Res,2008,63(15):4577.
[10] Cravo M I,albuquerque C M,salazar de sousa l,el al.Microsatellite instability.nnonneoplastic mucosa of patients with ulceraIive colitis:effect of folate supplementation.Am J Gastroenterol,1998,93(11):2060.
[11] 盛剑秋,田素丽,吕扬,等.遗传性非息肉病性结直肠癌的微卫星不稳定研究.胃肠病学和肝病学杂志,2006,13(5):537.
[12] 金黑鹰,颜宏利.遗传性非息肉病性结直肠癌.上海第二军医大学出版社,2006:80.
[13] 刘善润,王振军,赵博,等.遗传性非息肉病性结直肠癌患者的临床特点及hMSH2与hMLH1种系突变的筛查.中华医学杂志,2007,84(9):714.
[中图分类号]R339.35 R195.4
[文章编号]1000-9817[2011)02-0129-03
[关键词]生长和发育；基因表达；儿童
儿童发育是一个不断变化的过程，发育从受精卵开始，经历胎儿、儿童、青春期直至成年期，整个过程受到遗传和环境多种因素的交互作用。卵子受精时，个体的生长潜力及各组织、器官生长顺序的遗传基因已编码就序，从而决定了生长发育的可能性；神经、激素、生长因子及外界环境因素均可影响遗传基因的表达，决定生长发育的现实性。在生长发育的关键期，环境因素的干扰会产生远期效应。
1 儿童发育“编程”
儿童发育是遗传信息的系统表达和环境信息的综合编程过程(程序化，programming)，使机体形成互相联系的复杂系统，在个体复杂的自组织、自适应过程中，形成全部的生命机能和表征。儿童发育“编程”从胚胎就开始了，称为宫内编程。母体营养缺乏、激素水平改变、感染和损伤等异常环境都会干扰宫内编程的过程，严重时会引起胎儿器官或器官系统结构和功能的改变，进而导致胎儿发育异常或缺陷。出生以后，儿童发育“编程”继续存在，特别是在婴幼儿期。在大脑、神经内分泌和代谢系统的发育方面表现得尤为明显，这些编程的过程也继续受到遗传和环境因素的影响。儿童发育“编程”的影响一直持续到成年，发育“编程”的缺陷也是儿童期，乃至成年期疾病发生的基础。应用基因组学、蛋白组学、生化组学及功能组学研究儿童发育“编程”与疾病发生的相关关系，将为开展成年疾病儿童期预防及儿童保健工作提供理论依据。
近年来，大量流行病学研究及动物实验证明，胎儿在宫内发育时受到遗传因素和宫内环境的影响，如孕妇营养、糖皮质激素暴露等均能影响胎儿发育“编程”，不仅会影响胎儿期的生长发育，还可能产生持续的结构功能改变，导致将来一系列成年疾病的发生。了解成年疾病的发生对开展相关疾病的一级和二级预防具有重大意义。
2 儿童发育“编程”与成年疾病的发生
40年前，Widdowson和MeCanee的动物实验研究开启了成年疾病起源的研究，发现环境因素的干扰只有在生长发育的关键期才能产生远期效应。随后，对不同种系动物采取的干预研究(包括母亲营养、出生前肾上腺激素管理、子宫动脉结扎、贫血模型、改变出生后生长速度)证实，这些发育“编程”可产生有害健康效应，导致器官水平或器官系统的不良发育，进而产生远期效应。许多研究还发现了出生体重和出生后生长模式与成年疾病存在相关，主要包括代谢综合征、卒中、高血压、2型糖尿病、肥胖和心血管疾病等。低出生体重与不同成年疾病的相关程度存在差异。低出生体重与高血压、冠心病、2型糖尿病、卒中、高血脂、凝血因子水平升高、神经发育减弱存在相关关系而被广泛接受，与慢性肺病、抑郁、精神分裂症、行为问题、指纹模式、婚姻、左撇子、子宫和卵巢尺寸小、性发育过早、乳腺癌、癌的相关关系虽曾被报道，但未被证实。出生体重过重与多囊卵巢综合征、前列腺癌、乳腺癌、癌、白血病的相关关系也被报道过。
西方学者提出了多种假设去解释成年疾病起源的相关研究中所观察到的现象，其中最具影响力的是Barker的“成年疾病的胎儿起源”假说(fetal origins ofdisease)。胎儿起源假说认为，胎儿宫内不良反应使其自身代谢和器官的组织结构发生适应性调节，如果营养不良得不到及时纠正，这种适应性调节将导致包括血管、胰腺、肝脏和肺脏等机体组织和器官在结构上发生永久性改变，进而演变为成年疾病。这一发育“编程”过程可被许多环境因素放大，从而增强和加速成年疾病的发展过程。
有关成年疾病与儿童发育“编程”相关关系机制的解释有多种，其中被普遍认同的有胎儿营养改变、类固醇激素水平增加以及DNA表达的表观遗传学效应等。
201 胎儿营养成人疾病胎儿起源学说激发了学者对孕期营养的关注。影响胎儿结局的因素不仅包括母体的饮食，还包括子宫胎盘血流变学、胎盘功能和胎儿的新陈代谢，但大部分研究专注于母亲营养对儿童生长发育和疾病的影响。母亲营养不良对后代的影响可能取决于妊娠的某个特定时期，而这个时期正是胎儿发育过程的关键时间窗。对于一个营养正常的孕妇来讲，改变其营养计划可能对胎儿有害。
202 类固醇激素胎儿产前暴露于类固醇激素水平较高的环境(不论这种激素来源于胎儿还是母体)也决定着个体成年后的不良结局。
203 出生后的快速生长低出生体重的个体成年后发生2型糖尿病、胰岛素抵抗和心血管疾病的风险增加，这种风险被出生后的代偿性生长所增强。出生到出生后2岁的婴儿期生长发育与成年疾病的关系还没有完全阐述。不同研究结果间存在差异的原因可能有BMI不能准确指示肥胖程度、失访、个体间生长发育的差异，还有人群干预研究群体大多是早产儿。
204 DNA表达的表观遗传学效应个体在发育和生长过程中获得的环境影响遗传给了后代。但环境表观遗传修饰通过有丝分裂和减数分裂在细胞或个体世代间遗传的机理目前还不十分清楚。
为促进胎儿健康和疾病的发育起源研究，健康和疾病的发育起源(the developmental origins of health and disease，DOHaD)研究中心于2000年在英国南安普顿成立。DOHaD是指如果人类在发育过程的早期(包括胎儿、婴儿、儿童时期)经历不利因素(子宫胎盘功能不良、营养不良等)，将会影响成年期糖尿病、心血管疾病、哮喘、肿瘤、骨质疏松、神经精神疾病的发病。DOHaD学说认为，除了基因和成年期环境外，宫内和出生早期环境也会对某些成年疾病的发生发展产生关键性影响。DOHaD学说包括3个假说：节约表型假说、发育可塑性假说和预知适应反应假说。节约表型假说是指胎儿在发育过程中，如遇不利的生长环境，将改变其发育轨迹，尤其是降低生长速度来适应此环境，但这种永久性改变是对以后生长发育不利的。发育可塑性是指胎儿在细胞分化的关键期对外界环境变化敏感，并且有适应环境变化的能力。发育可塑性对母体营养敏感，在母体营养缺乏的情况下，可影响胎儿的发育可塑性，进而导致成年疾病。预知适应反应是指发育中的胎儿能预测未来环境变化，并且可以通过改变其发育轨迹以适应所预知的环境。若预知适当，预测环境与未来实际环境匹配，则具有进化优势；若预知不适当，预测环境与未来实际环境不匹配，发育成熟的器官不能适应可塑期以外的环境，则导致将来成年疾病的发生，且不匹配越多，导致的疾病风险越大。
2003年世界卫生组织和粮农组织(WHO／FAO)专家在关于饮食、营养和预防慢性疾病的联合报告中指出：子宫内生长迟缓引起冠心病、卒中、糖尿病和血压升高的危险性升高；最佳的出生体重和身长分布很重要，不但影响近期的发病和死亡，
而且会产生长期结果。这一报告肯定了生命早期发育直接影响成年后健康及疾病的易感性，提示在生命早期发育过程中，表观遗传起了关键作用。表观遗传是指基于非基因DNA序列改变所导致的基因表达的变化，涉及范围包括DNA甲基化、组蛋白修饰以及微小RNA，一个基因型可拥有多个表型。表观遗传过程易受生命早期环境因素的影响，其中孕期营养是影响表观遗传的关键因素。孕期营养对后代的影响不仅在两代之间，还可能传递几代，对后代的患病风险具有深远影响。阐明疾病的发展和起源，确定表观遗传的靶点，探索在生命早期发育可塑窗口期进行营养干预的方法，将是促进人类健康、预防慢性疾病的关键环节。
为揭示儿童发育“编程”与疾病起源的关系，应加强多学科、多中心研究，从基础生物学如分子遗传学到临床流行病学、卫生经济分析学、社会学、临床医学营养学等多方面来研究，对影响成人健康与疾病的从胚胎到出生后各方面因素进行研究。
3 儿童发育“编程”与成年疾病发生研究展望
儿童发育“编程”与成年疾病的发生方面有很多问题有待进一步研究、解决。
301 儿童发育“编程”的效应到底有多大虽然许多研究支持了Barker观点，但仍然存在批评意见。有关出生体重和出生后生长模式与成年疾病相关关系的研究结果存在不一致。有研究认为，出生体重与血压相关性的系统综述存在偏倚，样本量较小的研究阴性结果较多，存在发表偏倚；在控制发表偏倚后，出生体重与血压的相关性减弱，每公斤出生体重的降低导致血压有2 mmHg的上升，这个效应是很小的。许多研究报道了出生体重与糖代谢以及胰岛素代谢紊乱有关，尤其是低出生体重与胰岛素抵抗、空腹胰岛素水平升高和2型糖尿病发生增加有关。也有一些证据认为，低出生体重与胰岛素分泌减弱存在相关关系，但是在各研究结果间不一致。因此，相关研究也应关注儿童发育“编程”的其他生理和病理效应。
302 双生子的发育“编程”现象还不清楚双生子相比单生子出生体重更轻，依据儿童发育“编程”推理，双生子成年疾病的发生率应更高。然而，双生子冠心病死亡率和血压水平与单生子之间是否有差异还没有定论，但绝大部分研究发现双生子胰岛素抵抗发生增加，更易患糖尿病。当前普遍认为，双生子研究能够区分基因和环境因素对疾病发生的影响。该观点的假设前提是认为同卵双生子基因和宫内环境相同，而异卵双生子只有官内环境相同，但宫内环境相同的条件过于理想化。双生子在生长发育过程中使用同一胎盘的不同部分，可产生不同的远期健康效应。也有研究认为，双生子宫内生长发育与单生子不同，两者发育“编程”也有可能存在差异。比较双生子与单生子远期效应的研究较少，因此双生子发育“编程”与疾病起源的研究有待加强。
303 早产儿的发育“编程”现象早产儿的发育“编程”现象可能不但受到胎儿生长影响，而且与怀孕周期相关。由于缺乏早产动物模型，绝大部分动物研究都专注于胎儿生长的影响。有人群研究发现，怀孕周期本身也能影响某些疾病的风险，但胎儿生长和怀孕周期对相关疾病的影响大小仍然不清楚。如果怀孕周期与成年疾病的关系确定，那么将对产科临床实践产生新的挑战，提示选择生产时间也会对儿童远期健康产生影响。
4 儿童发育“编程”的不良效应是否可逆
热性惊厥（Febrile seizure FS）是儿科常见的急症，5岁以下儿童2～3%有热性惊厥史，在小儿各类惊厥中占30%，约有15～20%可转为癫痫。长时间的热性惊厥可引起缺氧缺血性脑损伤，重者影响智力发育，特别是对学习记忆有影响【1】， 甚至遗留神经系统后遗症。本文就热性惊厥的相关诊治进展综述如下。
1 定义和分型
目前对FS的定义尚未完全统一，1993年国际抗癫痫联盟将FS定义【2】为：发病前没有无热惊厥且大于1个月的患儿出现的与热性疾病相关的惊厥，排除了中枢神经系统感染和电解质紊乱。左启华教授提出的FS概念为：1个月～6岁儿童起病的有热惊厥，体温在38℃以上，既往无无热惊厥史，不包括急性CNS感染以及脑部其他器质性疾病合并的发热伴惊厥。目前比较公认而广泛的概念是：是指发生在小儿发热性疾病时的惊厥，一般体温在38℃以上，先前无癫痫发作，多见于6个月至5岁的婴幼儿，但不包括急性中枢神经系统感染（如脑炎、脑膜炎等）以及脑部其他器质性疾病合并的发热性惊厥【3】。
传统根据起病年龄、惊厥的严重程度、神经系统体征等热性惊厥分为单纯性热性惊厥和复杂性热性惊厥两型。单纯性FS应具有以下特征：①惊厥呈全身性发作，通常为强直阵挛发作；②发作持续时间不超过15min；③24小时内无反复发作。复杂性FS的临床特征：①一次惊厥发作持续15分钟以上；②24小时内反复发作≥2次；③限局性发作；④反复频繁的发作，累计发作总数5次以上。
2 病因与发作机制
感染为FS的主要诱发因素，各种原因导致前炎性细胞因子和IL-2和前列腺素E2的合成和释放，不但可启动发热，也可增强神经元的兴奋性、降低惊厥阈值和放大谷氨酸受体作用。
FS的机制尚未完全明确，一般认为是由遗传因素与环境因素共同决定，但主要与遗传、脑发育未成熟和发热有关【4】。
3 临床表现
多数病例以发热为首发表现，FS多发生于体温的上升阶段甚至是初始阶段。20-50%的病例以惊厥为首发症状，惊厥出现的时间多在发热开始以后12h之内。在一次发热中，一般只发作1次惊厥，1/4～1/3的患儿发生2次或以上。惊厥发作的形式大多数呈全身性发作，表现为强直-- 阵挛发作、强直性发作或阵挛性发作或极少数呈失张力性发作，也有部分FS呈局限性发作或半身性发作。FS发作持续时间短暂，多数发作仅数分钟、发作时间在10min以内者占绝大多数，仅少数发作长达0.5h以上呈FS持续状态。FS发作后不遗留神经系统异常体征。
4 诊断和鉴别诊断
FS的诊断应具备以下条件：①首发年龄多在6个月～3岁。②惊厥发作时伴有发热。③既往没有无热惊厥史。④除外颅内感染和其他原因所致的惊厥。
鉴别诊断：①中枢神经系统感染（脑炎、脑膜炎、脑囊虫病、脑脓肿等）；②中枢神经系统其他疾病如颅脑损伤、颅内出血、占位病变、脑水肿和癫痫发作等；③遗传代谢病、出生缺陷或神经皮肤综合征；④全身性生化代谢紊乱，如缺氧、水电解质紊乱、低血糖、低血钠、低血钙、低血镁、维生素B6 缺乏（或依赖） 症、中毒等；⑤新生儿期惊厥。
辅助检查 ：①惊厥发作2周后脑电图正常；②脑脊液常规检查正常；③智力体力发育正常；④有遗传倾向。
5 治疗及预防
FS的治疗，要兼顾止惊、退热、治疗原发病和预防复发。
5.1 一般治疗：①保持安静，禁止一切不必要的刺激；②保持呼吸道通畅，及时吸取咽喉部分泌物，头侧向一侧，以免将呕吐物、分泌物等吸入，能引起窒息或吸入性肺炎；③严重者给氧，以减少缺氧性脑损伤。
5.2 控制惊厥：大多数FS的发作短暂，数分钟内自行终止，不需应用止惊药。但对长时间或正要发作中的惊厥，应立即置患儿于侧卧位以防止呕吐物吸入，适当吸氧，立即静脉缓慢注射安定（地西泮），剂量每次0.25～0.5mg/kg ，速度1 mg/min，必要时20min后可重复给药，24h内可重复应用2～4次。惊厥控制后，仍应继续应用抗惊厥药物，直至热退为止。苯巴比妥是维持治疗的首选药物。
5.3 预防治疗：目前对FS有2种有效的预防性治疗方法：①持续给予苯巴比妥（ PB）或丙戊酸钠（VPA）；②短程给予（DZP）栓剂、糖浆或片剂。有证据显示苯巴比妥和丙戊酸钠能有效阻止复杂性FS再发，但无证据表明抗癫痫治疗能阻止随后的癫痫发生，复杂性FS也多随年龄增长消失，加之抗癫痫药物的不良反应，如肥胖等，因而不推荐应用抗癫痫药物。短程DZP预防FS已为众多儿科医师接受，目前在预防对象的选择和DZP的使用剂量上尚有争议。大部分学者认为选择2次以上FS患儿为预防对象比较合理。
关于每次使用DZP的剂量，大部分学者主张每次使用0.5mg/kg，对初发年龄在2岁以上及既往复发2次以下的FS患儿，每次DZP0.2mg/kg间隔使用是安全有效的预防方法。对首次单纯性FS可不进行预防性治疗。但对具有多种复发危险因素的FS患儿，即使是首次，也应考虑预防性治疗；对复发2次以上，同时又存在数种危险因素的FS患儿，应使用较大剂量DZP。在使用DZP时应同时使用退热剂并积极有效地控制原发病。
参考文献
[1] 程淑华.小儿惊厥发作迁延和群发的临床观察[J].中国误诊学杂志，2007，7（7）：1470.
[2] ILAE.Guidelines for epidemiologic studies on epilepsy. Epilepsia1993；34：5926.
【关键词】 维生素基因表达与沉默调控
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2012.08.554 文章编号：1004-7484（2012）-08-2858-02
作为外部因子的各种营养成分与人类基因的表达与沉默，它们之间相互作用主要表现在两个方面：一方面营养成分的摄入量影响了人类基因的表达与沉默；另一方面基因表达结果又影响了营养成分的代谢途径和代谢效率，并决定了个体对营养物质的需要量。随着二十世纪后半叶分子生物学、分子遗传学、细胞营养学等理论的迅速发展，科学界对维生素调控基因表达的方式、途径和作用机制都得到了不断揭示，其重要性受到了人们越来越多的关注。
维生素调控和影响基因表达的主要方式是维生素作为酶的辅助因子参与基因表达，作为酶的辅助因子参与基因表达的维生素中最典型的维生素莫过于VH，又被称为辅酶R或者生物素，除了直接参与D-C6H12O6异生作用的代谢外，VH还可以参与合成脂肪酸或者氨基酸的代谢过程。在参与四种羧化酶催化作用时，VH主要起到辅基的作用，即乙酰辅酶AacetylCoA辅酶A、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶、丙酮羧化酶、羧化酶丙酰辅酶A。饮食是哺乳动物VH的唯一来源，肠粘膜内存在的辅酶R酶能够进行蛋白结合VH切分。Maeda等（1996）试验报道，大鼠辅酶辅酶R充足组中OTC的活力明显高于辅酶R缺乏组，辅酶R充足组肝脏内的氨基酸转氨甲酰酶OTC在基因表达过程中比辅酶R缺乏组高40%。这就说明在缺乏VH的条件下会导致OTC活力降低和OTCm核糖核酸数量减少。
维生素作为一些蛋白质转录因子的组成部分，调控多种基因的表达，对基因的表达产生重要影响，这里以维生素A在脱氢酶作用下氧化代谢产物视黄酸为例子。视黄酸受体是能够和视黄酸进行特异结合的细胞核内受体，是类固醇激素类细胞核受体中的一种，存在于细胞核内基因转录调节控制范围内，目前，已知受其调节控制的基因数量已经达到五十多种，视黄酸可以调控基因表达，减弱上皮细胞向鳞片状的分化，增加上皮细胞生长因子受体的数量，它与脱氧核糖核酸连接及调节基因表达的受体结合以维持上皮组织和各种其他组织的导向分化，其中相当重要的就是生长因子IGFs和生长激素，视黄酸受体和视黄酸结合后能够启动调节相关基因的转录，从而控制细胞的分化与细胞的生长。
VA氧化分解产生的视黄醛与细胞核的视黄酸受体结合可以调节特异基因的表达。视黄醛的受体主要有三种，并且其受体的基本结构相同，受体蛋白都存在着A、B、C、D、E、F等模式不同的结构区域，A区、B区是不依赖配体就可以进行特异性转录激活的自调节功能区，其中C区为脱氧核糖核酸结合域，重点参与脱氧核糖核酸的顺序的识别，E区是配体结合区。
Hox基因（同源异性盒基因）是发育基因，从时间以及空间上协调和调控生物体的生长与发育，视黄酸能够通过控制Hox基因来影响生物胚胎的发育。笔者对脊椎动物中同源异性盒基因（Homeoboxgenes）研究中发现，Hox同源异性盒基因编码的脱氧核糖核酸有与视黄酸受体结合点位，在胚胎发育过程中起着非常重要的作用。目前脊椎动物发育过程的分子机制已取得了长足进展，常借助随机或定标导入基因的方法，引起生物体“获得”或“失去”功能的突变，来研究同源异性盒基因的功能，这些研究有望揭开胚胎发育过程中分子调控的机制。一个受精卵如何发育分化成个体？CRABP（视黄酸结合蛋白），可以在细胞浆内和细胞核之间自由来往，并且把视黄酸运送到细胞核内染色体的受置上，然后再返回细胞浆内，视黄酸和其受体在进行结合后就具有了启动和调节基因转录的功能，从而控制细胞的生长和分化，并最终分化形成不同的组织和器官。这样，就按照遗传图谱的指令形成了完整的生物体。此时，具有一维结构的脱氧核糖核酸的遗传信息就成为了具有三维结构的胚胎，并最终发育成为具有思维结构的生命。在生物发育中，作为蛋白质转录因子的重要组成，视黄酸可以影响相当多的基因表达。作为细胞核内的受体，视黄酸可以和染色体脱氧核糖核酸结合从而进行调控基因表达，视黄酸受体通过结合视黄酸被激活，然后针对受到调控的遗传信息产生“扳机”效应。动物实验表明，维生素A可以对IGF系统产生影响，饲喂缺乏维生素A的饲粮一段时间，1日龄的日本公鹌鹑与对照组相比，血清中IGF-Im核糖核酸的水平下降了22%，同时，、肺、肝脏和心脏中的IGF-Im核糖核酸水平也下降了21%-52%。
VC可以影响阿朴蛋白A-Ⅰ基因的表达：Ikeda（1996）实验表明，VC缺乏组血清阿朴蛋白A-Ⅰ浓度降低，VC正常组肝脏内阿朴蛋白A-Ⅰm核糖核酸水平比VC缺乏组升高了40%。在实验中对VC缺乏组与VC充足组进行比较，肝脏内阿朴蛋白A-Ⅰ基因进行转录的速率没有明显的区别，这说明VC是在转录后影响阿朴蛋白A-Ⅰ基因的表达。由于肝脏阿朴蛋白A-Ⅰm核糖核酸与肝脏VC浓度之间存在着非常密切的关系，因此VC能够促进肝脏阿朴蛋白A-Ⅰm核糖核酸的稳定。目前，人类还没有弄清楚VC缺乏调节肝脏阿朴蛋白A-Ⅰ合成的原理。但是无论其原理怎样，人类已经通过实验证明了VC确实可以对肝脏阿朴蛋白A-Ⅰm核糖核酸的水平产生一定的影响，并且使针对转录之后的水平起到一定的作用。
VD是通过脱氧核糖核酸结合蛋白在基因水平上对蛋白质的基因进行调节的。在细胞核内和VDR（VD受体蛋白）相结合，VDR大于包含100个左右的氨基酸残基。目前VDR主要存在在34种结构和功能不相同的细胞内部，并且很可能参与构成了细胞核。这是由于每一个细胞都必须通过二价钙离子的转运对其新陈代谢进行调节，而合成钙结合蛋白就必须VD参与其中，VD还能调控其他诸如降血糖素、白细胞介素Ⅰ、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白等基因的转录。VD的活性形式是1，25（OH） 2D3。1，25（OH）2D3是一种固醇类激素，该激素的生物学活性通常受到细胞内特定的受体进行介导。VD对相关基因的调控表现在：①维生素D对骨代谢具有调控作用。1，25（OH）2D3可以对靶细胞核内具有高度特异性的VDR产生作用，从而实现对血钙以及骨正常钙化进行调节。VDR是目前已经知道的调节OC（骨钙素）的组成单位，通过1，25（OH）2D3进行介导的骨钙素转化与表达是通过VDR上的脱氧核糖核酸结合区以及靶基因启动子旁边的反应元件，也就是VDRE（VD反应元件）之间的相互作用，这样就可以改变部分位置的超螺旋状态控制基因的表达来完成的（Staal等，1996）。②水平比较高的1，25（OH）2D3能够抑制甲状旁腺素进行基因转录。在1，25（OH）2D3的作用下，原代培养鼠甲状旁腺主细胞中甲状旁腺素m核糖核酸水平以及甲状旁腺素的分泌水平明显降低。1，25（OH）2D3能够通过降低P2增强子活性降低PTHR（甲状旁腺素受体）基因表达为m核糖核酸的水平（Amizuka等，1999）。
VE又称生育酚，是人类必需的维生素之一，VE生物活非常重要。α-生育酚是VE主要活性形式之一，在人的肝脏内α-TTP（α-生育酚转运蛋白，α-tocopherol transfer protein）在基因表达过程中不会受到日粮α-生育酚影响，但是，日粮中的蛋白质不充足常常会影响到这种基因的表达（Huang和Shaw，1998）。α-生育酚能够通过抑制自由基的生成，使核算内切酶难以活化，从而加快清除受损脱氧核糖核酸等一些复杂的途径，减轻自由基对于细胞膜中的多种物质造成损伤，如：不饱和脂肪酸、细胞骨架、膜内含有丰富巯基的蛋白质成分、核酸等细胞膜内物质（于芳，2002）。α-生育酚对部分基因的调控表现在：①在日粮中加入α-生育酚能够降低活性氧的水平，降低由于活性氧诱发引起的脱氧核糖核酸损伤。α-生育酚可以抑制CD36基因m核糖核酸以及蛋白质的表达，能够降低动脉平滑肌内脂蛋白的氧化，抑制泡状细胞的形成，因此可以有效抑制动脉硬化（Ricciarelli等，2000）。②α-生育酚能清除细胞内NO和OH，从而阻止它们对碱基的破坏。③α-生育酚可以通过降低金属离子对脱氧核糖核酸的加合作用抑制染色体变化，铬离子能够引起脱氧核糖核酸和核糖核酸单链断裂，α-生育酚可以抑制铬引发的脱氧核糖核酸和核糖核酸损伤。另外，α-生育酚能够诱发角质细胞内热蛋白基因HSP70的正确表达，这说明α-生育酚对由铬离子引发的基因毒性存在着保护作用，如果存在铁离子，VE可以减少双氧水诱发的脱氧核糖核酸的加合作用。④α-生育酚还可以抑制c-Myc基因表达，从而诱导导致白血病细胞的凋亡，从而抑制导致白血病细胞的增多繁殖等多项功能。
VK族化合物是2-甲基-1，4-萘醌系列衍生物，包括VK1、VK2、VK3。VK对部分基因的调控表现在：①VK在体内可以以辅酶的形式发挥作用，来完成对凝血因子的调控。VK辅酶活性的形式是KH2（氢醌），可以被分子氧氧化，生成KO（环氧化合物）提供能量，从而使底物蛋白谷氨酸残基的γ位和CO2结合，生成γ-羧化谷氨酸，KO类型的VK在二硫醇依赖性还原酶的作用下，会重新生成KH2的形式，这样就可以构成体内”VK2循环”。凝血抑制因子蛋白C，X，Z以及肝源性凝血因子Ⅱ，Ⅻ，Ⅳ，Ⅹ等物质肝脏内翻译合成后并没有活性，在VK与谷氨酸羧化酶的共同作用下，其分子结构内的谷氨酸残基被转化为γ-羧化谷氨酸残基，凝血因子等蛋白被激活γ-羧化谷氨酸残基与Ca2+化合后可以引发Ca2+，磷脂，蛋白质三者之间的相互作用，进而激发凝血反应。②VK和可以调控VK依赖性骨蛋白。VK依赖性骨蛋白中骨钙素的合成受VK与VD的共同调节，VK参与蛋白质的翻译后羧化修饰过程。
所有的维生素对基因表达都会产生一定的影响，而且有些是直接参与基因表达的调节，维生素对基因表达的调控作用汇总如下：VA作用于VA受体基因位点，促进蛋白转录与翻译；VB1作用于所有基因，作为TPP的组成部分，参与生物能量代谢；VB2作用于所有基因，作为FAD的组成部分，参与ATP合成；VB3烟酸作用于所有基因，作为NAD的组成部分，参与ATP合成；VB6作用于所有基因，促进转氨酶表达，促进嘌呤和嘧啶合成；VC作用于羟化酶受体基因转录，促进原胶原蛋白转录；VD作用于类固醇受体基因转录，促进钙结合蛋白转录；VE作用于所有基因，保护脱氧核糖核酸，防止被自由基破坏；VK凝血酶原，促进转录后谷氨酸残基羧化；叶酸促进脱氧核糖核酸，核糖核酸转录与翻译，促进嘌呤和嘧啶合成。
综上所述，多种维生素对人类基因组中的成千上万个基因的表达与沉默所产生的影响进行了初步的阐述，笔者认为将来对维生素影响基因表达相关的研究，主要从以下三个方面入手：①维生素影响基因表达，从而影响人类新陈代谢途径及生理机能，其中包括其缺乏症和中毒症的具体分子作用机制；②维生素影响基因表达进而影响人类健康水平的具体分子机制；③维生素与其他营养素（如蛋白质、必需氨基酸、必需脂肪酸、碳水化合物、微量营养元素等）的共同作用，影响基因表达过程中的相互作用关系的具体分子机制。
参考文献
[1] 李殷.植物维生素E生物合成途径及调控.复旦大学；发表时间：2009-05-18.
[2] 朱晓海，何清濂，林子豪，赵耀忠，吴建明.常用维生素对人前脂肪细胞增殖和分化的作用.中华医学美学美容杂志，2003年第06期.
【关键词】 脊柱炎，强直性；遗传；人类白细胞抗原B27；肿瘤坏死因子-α；内质网氨基肽酶；白细胞介素；综述
doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2016.02.019
强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种类风湿因子阴性的慢性炎症性疾病，同时也是一种系统性、自身免疫性疾病。AS主要引起包括中轴骨、外周关节、消化及心血管系统等多个器官、系统功能障碍，疾病晚期更可致脊柱、关节强直畸形，致残率高，严重影响患者生活。目前，本病的发病机制尚不十分清楚，可能与遗传和环境等多种因素有关。自1973年Breweton等[1-2]证实人类白细胞抗原B27（HLA-B27）基因与AS呈强相关性后，对AS遗传因素的研究就越来越多。随着家族性发病研究的深入，Brown等[3]发现，AS发病危险性下降比单基因显性遗传性疾病要快得多，理论上，单基因显性遗传性疾病每增加一代，其子代的发病概率会减半，而AS的发病率下降的速度要快得多，据此认为，AS发病可能存在其他基因参与。随着分子遗传学技术的发展，全基因扫描证实AS是以HLA-B27为主要易感基因的多基因遗传病。关于AS遗传相关基因的研究进展，前人已有较为详尽的论述，本文在前人基础上总结近些年来的研究成果及新观点，做进一步论述。
1 HLA-B27分子
HLA-B27基因属于人类MHC-I类分子B位点上的等位基因，位于第6号染色体短臂上，表达于所有有核细胞的表面。HLA-B27是人类基因组中的一个等位基因，具有高度多态性。通过流行病学调查及家族聚集现象分析发现，在AS患者中，HLA-B27阳性率为80%～95%，而在一般人群HLA-B27的阳性率仅为5%～10%[4]；AS患者常常出现家族聚集的现象，双生子研究结果显示，AS遗传度高达90%；Brown等[3]在欧洲人群中进行双生子研究发现，同卵双胞胎AS的发病一致率为63%，而异卵双胞胎的发病一致率则降至12.5%；另外还发现在不同亲缘关系的亲属中AS的再发风险也不相同，一级亲属的再发风险率为8.2%，二级亲属的再发风险率降为1.0%，三级亲属的再发风险率则低至0.7%。根据这些流行病学与家系分析结果，有理由相信HLA-B27是AS的致病基因。
HLA-B27与AS发病的高度相关性已得到证实，也被学者们广泛认同，甚至有学者在AS的诊断[5]与治疗方面对HLA-B27进行深入研究，以期达到对AS患者早发现、早治疗的目的。
虽然HLA-B27被认为与AS的发病呈强相关性；但HLA-B27如何导致AS发病，至今仍没有统一的认识。近年来，威康信托基金会病例控制协会（WTCCC）的一项全基因组关联分析提示，ANTXR2、PTGER4、CARD9及TBKBP1等基因很大可能参与此过程的发生[6]。国内学者古洁若研究团队针对青少年发病的AS（JAS）的研究发现，基质金属蛋白酶-3（matrix metallopeptidase-3，
MMP-3）、可溶性核因子κB受体活化因子配基（soluble receptor activator of nuclear factor-κB ligand，sRANKL）在HLA-B27阳性的活动性JAS患者的血清中明显增高，而骨保护素（osteoprotegerin，OPG）也有轻微升高，从而得出MMP-3、sRANKL及OPG参与HLA-B27阳性的活动性JAS发病的结论，并认为炎症反应在破坏JAS病程中sRANKL/OPG系统平衡起到了关键作用[7]。目前，HLA-B27导致AS发病的相关发病机制有如下假说。①连锁不平衡假说：认为HLA-B27不是AS的直接致病基因，仅与致病基因处于连锁不平衡状态，即为遗传标志。但随着生物信息、全基因组关联等技术在该领域的应用，目前主流观点还是认为HLA-B27是AS的主要遗传易感基因。②分子模拟假说[8]：认为微生物的某些生物分子与人体自身抗原具有同源或相似的抗原表位，HLA-B27识别微生物肽抗原表位并呈递给毒性T淋巴细胞，致使部分T淋巴细胞发生交叉免疫，从而导致自身损害及炎症反应。尽管以往对于AS发病的遗传因素，特别是HLA-B27的研究较多，但近些年感染及环境因素对AS发病影响的研究也渐见端倪。不少学者在这种微生物与遗传因素相结合的致病途径方面做了大量工作[8]，通过人体及动物实验证实，肠道细菌产生的多肽类抗原可诱导HLA-B27生成，生成的HLA-B27可交叉识别致脊柱关节炎类的细胞角化蛋白，从而引起疾病发生。该模式以多因素致病思路考虑AS的发病原因，为AS发病机制的研究提供新思路。③错误折叠蛋白应答假说[9]：认为HLA-B27分子的重链常易发生错误折叠，错误折叠的重链可在内质网内聚集形成二聚体甚至多聚体，致使NF-κB活化并诱导炎症因子产生。该机制试图从分子水平阐明AS的发病原理，由于HLA-B27重链折叠速度较慢，很容易发生错误折叠；而错误折叠的原因很可能与环境、微生物抗原刺激及细胞因子[如肿瘤坏死因子-α（tumor nerosis facter-α，TNF-α）及γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）]密切关系。相关研究有待进一步开展。此外，T细胞受体库假说、免疫耐受失败假说[10]、重链结构重组假说[11]、致关节炎肽假说[12]、同源二聚体假说等，各种假说试图从不同角度、不同机制阐述AS的发病机制，可能其中某些机制之间存在相互联系，共同导致AS的发病，最终机制还有待进一步验证。
2 TNF-α分子
TNF是由单核-巨噬细胞及T淋巴细胞分泌产生的，参与多种免疫疾病及炎症反应的一类细胞因子[13]，其基因位于6号染色体短臂p21区域内，包含于HLA-Ⅲ基因中。TNF-α主要通过炎性蛋白S100 A8和A9抑制一些髓源性细胞的分化及其活性，致使体内部分炎症细胞（T淋巴细胞和NK细胞）功能失调[14]，从而引起免疫介导炎性过程，TNF Ⅰ型受体和TNF Ⅱ型受体在此过程中参与免疫调控及细胞分裂等生物学行为。1995年，Braun等[15]通过对AS患者关节液的研究发现，AS患者骶髂关节液中TNF-α mRNA明显高于正常人群，开启了AS与TNF-α之间联系的研究。随着分子生物学技术的发展，陈蕊雯等[16]2004年通过直接测序和PCR技术对TNF-α基因启动子SNPs进行基因分型，首次报道了中国汉族人群中AS患者的TNF-α-857C/T（rs179 972 4）的等位基因、基因型与正常人存在着显著性差异，而且TNF-α-857T对AS的致病性为不依赖于HLA-B27独立易感因素。相似的结果也被朱小泉等[17]报道，TNF-α-850C/T基因为中国汕头人群AS发病的易感基因。有学者认为，TNF-α-850C/T很可能与TNF-α-857C/T（rs179 972 4）是同一个基因位点。随后，学者们各自通过不同方法证明了TNF-α与AS发病的关联性。梅永君等[18]通过PCR技术对TNF-α启动子进行扩增并测序，结果TNF-α调控区域-857位点CT等位基因变异显著增多，从而也证明TNF-α启动子基因多态性可能与AS的发病有关。张璐
等[19]通过ELISA及RT-PCR技术对外周血单核细胞中TNF-α mRNA表达量进行测量，结果发现AS患者的TNF-α表达量高于健康人群，提示TNF-α是AS发病机制中的重要细胞因子。近年来，临床上应用TNF-α IgG1单克隆抗体infliximab以及受体融合蛋白etanercept改善AS患者脊柱活动度、脊柱与关节功能及肌肉附着点炎症[20]，从而提高患者生活质量，取得了良好的临床效果，进一步证明TNF-α在AS的发病过程中发挥着重要作用。WTCCC的全基因组关联研究[6]及动物实验[21]提示，TNF通路参与AS发病可能与淋巴毒素β受体（lymphotoxin beta receptor，LTBR）、1型肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）（rs116 161 88）及TBKBP1或LTBR-TNFRSF1A有关，而非TNF基因直接作用所致；但LTBR、TNFRSF1A基因多态性与AS发病机制中的作用有待进一步证实。当然，对于TNF-α与AS发病的研究，不同学者的研究结果并不完全一致，有时甚至出现相反的结果[22]；但多数研究支持TNF-α为AS的致病基因[13-18]。陈银河等[23]通过对9篇国内外相关研究结果的Meta分析得出结论，TNF-α基因启动子-857位点CC基因型、C和T等位基因与AS易感性有关联性，携有T等位基因者患AS的风险明显增高。
3 内质网氨基肽酶1（endoplasmic reticulum aminopeptidase 1，ERAP1）
ERAP1是近些年对AS发病研究的一项重要发现，ERAP1有2种主要的生理功能：①参与内质网内抗原肽的修饰，使其易于被MHC-I类分子提呈[24]；②参与解离细胞表面的前炎症因子白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6和TNF的膜受
体[25]，使之脱离胞膜形成可溶性细胞因子受体，改变细胞因子、细胞因子膜受体以及可溶性体三者之间的相对浓度和数量，从而调节免疫平衡[26]。
天然的TNFR有2种存在形式，即mTNFR和sTNFR，sTNFR主要为mTNFR的胞外结构区部分在ERAP1的作用下脱落而来，sTNFR与TNF具有高亲和力而不具有信号转导功能，因而天然的sTNFR是TNF-α的强抑制剂。同时，sTNFR也可作为TNF-α的载体或缓冲剂以稳定TNF-α活性，甚至增强其功能。可见，体内TNFR、mTNFR和sTNFR三者之间的动态平衡有赖于sTNFR的性质及其对TNF-α的双重影响，ERAP1在该动态平衡系统中起到了关键作用。多数学者认为，ERAP1与银屑病等免疫疾病的发病有关[27-28]。Wall等[29]在AS、Crohn病、溃疡性结肠炎患者及正常人群的对照研究中发现，ERAP1基因的某些SNPs与AS呈明显相关性，这些SNPs在Crohn病、溃疡性结肠炎患者及正常人群中也能被检测出；但结果证明两者间没有相关性，从而得出ERAP1为AS患者的一个发病因素的结论。WTCCC全基因组关联分析[6，30]提示，ERAP1基因可能是AS的致病基因，研究表明，ERAP1基因与HLA-B27阳性的AS患者发病呈明显正相关性，而在HLA-B27阴性患者中无该相关关系。该结果提示ERAP1基因与HLA-B27基因在AS发病过程存在着协同作用，在HLA-B27阳性AS患者病程中，ERAP1可能对抗原肽发挥剪切与呈递作用；而HLA-B27阴性AS患者的发病模式可能存在着不同的机制。Armaka等[21]动物实验也证实TNF过度表达足以引起脊柱关节病，表明促炎性细胞因子过度表达即可引起AS的发病。近年来，基因间交互作用在研究ERAP1引起AS发病方面应用较多，除HLA-B27外，还有HLA-Cw等，为进一步研究AS发病机制的研究提供了新的研究思路[31]。
4 IL与辅T细胞17（helper T cell 17，Th17）通路
IL是一类由多种细胞产生并可作用于多种细胞的炎症因子。Th是体内一类重要的免疫调节细胞，对机体的特异性免疫和非特异性免疫都具有重要的调节功能。Th17是Th细胞的一个亚群，可分泌释放IL-17、IL-6、IL-22、IL-26、IFN-γ及TNF-α等细胞因子；而IL-17被认为是Th17最为特异的免疫应答产物。近年的研究证明，IL-17与IL-23联合Th17免疫通道在免疫性疾病，如AS、银屑病等的发病过程中起着重要作用[32]；而通过药物阻断IL-17、IL-23通道对AS的治疗有效[33]。据此可认为，IL-17和IL-23在AS等免疫性疾病的发病过程中发挥着重要的调控作用。体内外实验证明，人类Th17细胞的分化很大可能是在IL-6、IL-21、
IL-23的调节下被IL-23、IL-1β及TGF-β诱导分化产生，生成的Th17细胞可在IL-17F、IL-22、IL-26等调节下产生IL-17A，IL-17A是导致AS发病最直接的细胞因子[32]。Lories等[34]研究也认为，人体在微生物抗原、肠道菌群的改变、HLA-B27未折叠蛋白反应，以及来自生物力学的压力等因素的作用下可导致IL-23的表达。IL-23的表达刺激机体Th17等特异性T细胞的分化，Th17进一步分泌释放IL-17、IL-22等炎症介质。其中，IL-17引起机体的一系列炎症反应，如骨的侵蚀，皮肤、滑膜的炎症；而IL-22则可引起AS等疾病骨质增生的病理过程。这一发病模式可以合理解释AS等脊柱关节病骨破坏与骨质增生2种病理过程同时存在的临床表现。Shen等[35]研究认为，编码前列腺素E受
体4（encoding prostaglandin E receptor 4，PTGER4）可通过诱导产生IL-23、IL-17及促进Th17细胞生成引起AS，而该过程可能还包括TNF通路的参与。全基因组关联研究已经证明，IL-23R编码基因的变异是AS等自身免疫性疾病的重要致病因素[36]。WTCCC的一项病例对照研究发现，IL-23R的7个SNPs与AS呈现明显相关性，其中rs112 090 32、rs112 090 26及rs104 896 29显示出与AS的发病呈强相关性[37]。Duan等[38]也认为，IL-23R基因内的多个SNPs参与AS的发病。近几年，国内很多学者对IL-23R做了大量研究。张吉林等[39]采用PCR-RFLP方法对吉林人群AS患者的IL-23R基因SNPs进行检测及其与AS发病之间的关系分析，得出结论，IL-23R基因rs751 784 7和rs104 896 29位点的多态性与吉林人群AS发病有关。多区域、多人种及更大样本量的研究将为IL-23R对AS的致病位点的寻找与确定提供更有力的支撑，也是AS致病机制研究所必须的步骤。
随着对AS发病原因的研究越来越多，学者们先后研究了一些可能与AS发病有关的基因：参与调控破骨细胞分化成熟的OPG系统基因[40]；调节多种免疫性疾病的Toll样受体4（TLR4）基
因[41]；免疫球蛋白超家族成员Fc受体同系物（FcRL）[42]；参与免疫反应的微小RNA（micro
RNA），如microRNA-181及microRNA-495[43]。
此外，还有转化生长因子-β1（TGF-β1）、RUNX3、
KIF21B，以及细胞色素P450 2D6（CYP2D6）等。但是，这些基因目前还处于小范围内研究，可靠性有待于进一步验证。
5 结 语
AS可能是由多种病因共同导致的结果，遗传、环境、感染、免疫功能紊乱、药物等因素可能都是AS的致病原因，而遗传因素被认为是致使AS发病最重要的因素；但其具体机制至今仍不十分清楚，各种假说也未被充分证明。生物技术的不断发展，研究方法的逐步更新，将为病因研究提供更多思路和途径，为各种分子生物学与遗传学机制及信号通路的研究提供技术支撑。各学科之间合作的日益加强，使更大样本与多人种的研究与对比成为研究趋势，将为各种致病基因的寻找提供更有说服力的证据。病因与发病机制的研究最终将使降低发病率、早诊断、早治疗成为可能。
6 参考文献
[1] Breweton DA，Hart FD，Nicholls A，et al.Ankylosing spondylitis and HLA-B27[J].Lancet，1973（1）：904-907.
[2] Schlosstein L，Terasaki PI，Bluestone R，et al.High association of an HLA antigen，W27 with ankylosing spondylitis[J].New Eng J Med，1973，288（14）：704-706.
[3] Brown MA，Pile KD，Kennedy LG，et al.A genome-
wide screen for susceptibility loci in ankylosing
spondylitis[J].Arthritis Rheum，1998，41（4）：588-595.
[4] Rostom S，Dougados M，Gossec L，et al.New tools fordiagnosing spondyloarthropathy[J].Joint Bone Spine，2010，77（2）：108-114.
[5] 刘永杰，张小芳，张运刚，等.HLA-B27检测对强直性脊柱炎诊断的临床意义[J].国际检验医学杂志，2014，35（10）：1285-1286.
[6] Evans DM，Spencer CC，Pointon JJ，et al.Interaction between ERAP1 and HLA-B27 in ankylosing spondylitis implicates peptide handling in the mechanism for HLA-B27 in disease susceptibility[J].Nat Genet，2011，43（8）：761-767.
[7] Mou YK，Zhang PP，Li QX，et al.Changes of serum levels of MMP-3，sRANKL，and OPG in juvenile-onset ankylosing spondylitis patients carrying different HLA-B27 subtypes[J].Clinical rheumatology，2015，34（6）：1085-1089.
[8] Frauendorf E，Von Goessel H，May E，et al.HLA-B27-restricted T cells from patients with ankylosing spondylitis recognize peptides from B*2705 that are similar to bacteria-derived peptides[J].Clin Exp Immunol，2003，134（2）：351-359.
[9] DeLay ML，Turner MJ，Klenk EI，et al.HLA-B27 misfolding and the unfolded protein response augment interleukin-23 production and are associated with Th17 activation in transgenic rats[J].Arthritis Rheum，2009，60（9）：2633-2643.
[10] Breban M，Hacqard-Bouder C，Falgarone G.Animal models of HLA-B27-associated diseases[J].Curr Mol Med，2004，4（1）：31-40.
[11] Luthra-Guptasarma M，Singh B.HLA-B27 lacking associated beta2-microglobulin rearranges to auto-display or cross-display residues 169-181：anovel molecular mechanism for spondyloarthropathies[J].FEBS Lett，2004，575（1-3）：1-8.
[12] Atagunduz P，Appel H，Kuon W，et al.HLA-B27
Restricted CD8+T cell response to cartilage-derived
self poptides in ankylosing spondylitis[J].Arthritis Rheum，2005，52（3）：892-901.
[13] Clark IA.How TNF was recognized as a key mechanism of disease[J].Cytokine Growth Factor Rev，2007，18（3-4）：335-343.
[14] Sade-Feldman M，Kanterman J，Ish-Shalom E，et al.Tumor necrosis factor-α blocks differentiation and enhances suppressive activity of immature myeloid cells during chronic inflammation[J].Immunity，2013，38（3）：541-554.
[15] Braun J，Bollow M，Neure L，et al.Use of immunohistologic and in situ hybridization techniques in the examination of sacroiliac joint biopsy specimens from patients with ankylosing spondylitis[J].Arthritis Rheum，1995，38（4）：499-505.
[16] 陈蕊雯，段世伟，蔡青，等.肿瘤坏死因子α单核苷酸多态性与中国汉族人强直性脊柱炎的关联分
析[J].第二军医大学学报，2004，25（2）：120-124.
[17] 朱小泉，曾庆馀，孙亮，等.强直性脊柱炎的新易感基因识别研究[J].遗传，2005，27（1）：1-6.
[18] 梅永君，李志军，陈琳洁，等.TNF-α启动子基因多态性与强直性脊柱炎的易感性[J].中华临床免疫和变态反应杂志，2009，3（3）：173-177.
[19] 张璐，邹红云，余伍忠，等.强直性脊柱炎患者TNF-α表达水平测定分析[J].中国实验诊断学，
2014，18（4）：589-592.
[20] Paul S，Keat A.Assessment of patients with spondyloarthropathies for treatment with tumor necrosis factor α blockade[J].Rheumatology（Oxford），2005，44（1）：17-23.
[21] Armaka M，Apostolaki M，Jacques P，et al.Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases[J].J Exp Med，2008，205（2）：331-337.
心音的非线性时间序列分析董筠楼正国(6)
麻醉期心率变异性的分形特性分析刘晓芳叶志前刘群芳(10)
全血胆固醇生物传感器廖静敏胡贵权李光(14)
灌流肾脏的生理功能动态变化殷胜勇葛霁光郭淼(18)
灌流过程中胞内Ca^2＋动态变化研究郭淼葛霁光(22)
物质经角质层转运的唯象分析包家立葛霁光王红(26)
基于模型的乳腺X线图像胸肌分割算法研究徐伟栋严勇夏顺仁(29)
5公斤以下婴儿先天性心脏病体外循环的探讨胡建玲杨秀月林茹朱雄凯舒强(43)
人工晶状体调制传递函数研究金成鹏刘晓玲王小娟陶育华周传清(36)
国产久灵全热解碳双叶瓣膜跨瓣压差的研究徐嗣卫陈如坤陈芳董爱强(39)
检验医学
浙江省350所医院检验科出、凝血检测概况和存在问题及对策张伟民王伯昌(47)
测定肾小球滤过率的灵敏指标：ChstatinC李清华(49)
综述
血清胆红素浓度与冠心病关系的研究进展陈清江施步程程心培(53)
对确定我国电磁场暴露限值依据的探讨许正平姜槐(56)
讲座
遥测心电图和电话心电图的临床医学与工程 应用
浙江省卫生信息化建设简介葛忠良(3)
韩国推行PACS系统的现状与经验KimJongHyo(7)
北京大学人民医院网络系统管理整体解决方案研究何雨生(8)
信息整合与信息孤岛姚志洪(10)
福州总医院数字化建设的经验与体会陈金雄刘雄飞王庆森(14)
马来西亚医院信息化介绍及数据仓库黄来恩BrianBong(18)
远程医学的发展应用和展望蒋金根(24)
数字化医院建设中信息交换的标准问题徐庐生(32)
PACS的科学评估宋健宁(37)
PACS及支撑硬件评估叶志前(42)
数字化放射科成本／效益分析——三年数字化运行和管理结果缪竞陶(48)
PACS项目评估标准敬晏郝富德(51)
医学信息学—本体与解决问题方法—知识整合论包含飞(56)
医学图像分析罗永刚宋余庆(62)
临床实验室信息系统的研究与开发杨大千徐根云朱阳军(70)
医院综合网络系统的设计与实现周庆利(74)
PACS建设的应用体会林海涛(78)
我院RIS／PACS系统建设体会王晋宏陈再智(79)
数字化医院中的PACS系统定位鲍旭东董明(81)
杭州市SARS疫情监测报告与控制指挥系统的研发唐建华项海青孙炜陈卫永(87)
厂商论文及介绍
PACS构成与应用(90)
PACS就绪网络先行(96)
数据安全（备份）重要性(101)
数字化医院存储子系统的建设(102)
PACS建设中的存储技术(106)
医学与工程 MRO软件公司(110)
美国StorageTek公司(111)
中程科技医疗信息系统产品简介(112)
仪器用多微处理器系统信息交换机制的设计与实现刘峰吴越等(3)
基于COTS的分布式仪用监控系统刘峰葛霁光(7)
心电监护分析软件设计徐旋唐斌等(11)
一个生物医学信号的无损压缩算法杨胜天童勤业(16)
离体肾脏灌流液成分研究殷胜勇葛霁光等(19)
线粒体Ca^2＋超载在离体肾脏保存中的作用机制研究郭淼葛霁光等(23)
心率变异性慢性实验研究徐征葛霁光(26)
麻醉期心率变异性的复杂度分析刘晓芳周海燕等(29)
FCM算法在脑肿瘤MRI图像分割中的应用刘建武叶志前等(33)
化合物构效关系的模糊极小极大神经网络识别研究李永武叶志前等(36)
胰岛素磁性微囊体外释放规律的研究吴阿富沈继峰(40)
中枢组胺对学习记忆的作用黄育文余建等(44)
血管内皮生长因子（VEGF）治疗冠心病的现状陆传新赵峰(47)
调脂治疗对冠心病的疗效与意义黄元伟(52)
永久性心脏起搏引起上腔静脉综合征的发病原因及治疗进展周建光黄亚莉等(55)
高压氧治疗作用下机体的氧化适应周建光刘长云等(58)
新生儿机械通过的技术探讨沈云明沈云明(60)
定量药理学的剂量级序和片剂含量改革石之琳(62)HttP://
多参数医疗仪器仲裁器设计吴越刘谋用等(3)
CT检查的窗宽窗位设置田培林(6)
常温电化学式氧传感器的研究叶学松沈义民(11)
医用生化仪器串口通讯系统的设计陈如汉马炜斌等(14)
γ干扰素基因修饰疫苗的抗肿瘤作用刘祥麟胡伟恩等(17)
胃癌微血管密度与增殖细胞核抗原的相关性研究王晓熙王英等(21)
辛伐他汀与脂必妥对老年人高脂血症的疗效比较黄亚莉王毛山等(24)
基因组生物信息学与中国的发展战略包这立医学与工程 葛霁光(28)
人工血管基因工程改造研究的进展郑毅雄陈力(33)
基因芯片在感染性疾病中的应用朱海红(38)
基因芯片在肿瘤研究中的应用许沈华(40)
磁共振脑功能成像的临床应用邹煜(43)
脑磁图的研究动态何文焱徐磊等(47)
多普勒组织声像图的新进展郑哲岚(49)
ECG—6511心电图机走纸电路与检修程序付欹(52)
医院检验科质量考核分析与整改张伟民(54)
计数资料的2×C表线性回归及其显著性检验张国祥成军(56)
嗜血杆菌对15种常用抗生素药敏结果分析程刚沈良明等(60)
柱凝集技术在交叉配血试验中的比较李育(62)
糖试剂盒在自动生化分析仪上使用比较胡守岳庄起骏等(64)
传染性海绵状脑病忻亚娟毛子安(3)
操作系统研制中虚拟硬件的实现刘谋用葛霁光(6)
经皮给药电穿孔技术的研究包家立胡巧红(11)
MEFV曲线形态参数测定曾碧新陈式苏(15)
37例前列腺癌的超声诊断效果分析戴元颖(17)
化合物致癌模糊极小极大神经网络识别研究李永武陆金芳(19)
冷冻治疗探杆的高真空绝热毛欣欣章忠敏(22)
NSJ—1尿失禁治疗仪研制王越黄钢妹(25)
兔子呼吸急促后呼吸肌电信号变异特征的小波变换分析沈宏龙胜春(28)
经皮神经电刺激研究王永国庄传健(31)
根据分子遗传学发病机制治疗QT延长综合征（附一例报告）林晓耘蒋逸风(33)
麻醉机潮气量补偿原理分析及对婴儿手术的影响郑黄煌(36)
设备综合管理信息系统的研究与开发王燮臣祁建伟(38)
医学与工程 CT应用质量管理和质量控制吴伯卿(41)
医学数字图像及其通信的标准祁建伟(44)
医院信息管理系统开发模式虞峥嵘(47)
医院的医疗卫生计量管理罗安东(49)
双极起搏钢丝的临床应用前景程心培蒋逸风(51)
血糖自我监测与实用血糖计顾维正(52)
宽谱双能X线数字减影技术应磊胡红杰(55)
药物电穿孔与离子导入疗法徐昕洪修鄂(58)
深静脉血栓 (DVT) 指深静脉管腔内血液的异常凝结，常见于创伤或手术后患者，好发于下肢，若不及时发现并对其进行有效治疗，早期可因血栓栓塞局部深静脉管腔导致疼痛性股青肿，或血栓脱落继发致命性肺栓塞；晚期遗留深静脉瓣功能不全，成为严重危害患者健康的疾病之一。血液中存在一套相互拮抗的凝血和抗凝血系统，在正常情况下，通过复杂而精细的调节保持动态平衡，既维持血液在血管内呈液体流动状态，又在一旦出现血管破裂的情况下迅速在局部凝固形成止血栓，防止出血。若凝血和抗凝血过程中出现调节障碍或凝血系统在心血管内被不适当激活，从而造成血栓形成。因此，研究血栓形成的分子机制，明确其核心调控因素，找到特异、灵敏、快速早期预测诊断DVT形成的分子标记物并明确有效的药物靶点将对DVT高危患者进行更有针对性、个性化防治具有重大现实意义。组织因子途径抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）为库尼(Kunitz)型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白，分为TFPI1和2。但二者在基因序列、组织来源、分布及其生理作用等方面存在较大差异。TFPI1作为外源性凝血途径的特异性抑制物，在抑制血栓形成和血管重塑等方面发挥重要作用；还与炎症、动脉粥样硬化（AS）、肿瘤、败血症等疾病相关〔1〕，其重要的生理学意义和对血栓性疾病的治疗价值引人关注。本文主要综述TFPI1在DVT相关方面的研究进展。
1 TFPI1来源与分布
TFPI1主要由微血管内皮细胞合成，血管平滑肌细胞、成纤维细胞、单核/巨噬细胞、肾小球细胞、心肌细胞以及血小板、T淋巴细胞等其他细胞也有少量表达〔2〕。TFPI1在体内的分布大致分为3部分：①结合于内皮细胞腔面，占总量的50%～80%；②血液中占10%～50%，大部分与脂蛋白结合，小部分以游离形式存在；③血小板中约占8%。Dahm 等发现总TFPI1和游离型TFPI1减少是DVT的危险因素〔3〕。正常人血浆TFPI1含量为54～142 ng/ml，在体内由肝和肾负责清除，凝血酶和肝素可改变体内TFPI1分布。
2 TFPI1结构特点
2.1 基因结构
TFPI1的编码基因定位于2q312q32，基因全长70 kb，包括9个外显子和8个内含子。外显子1和2编码 TFPI mRNA 的5′端非翻译区，外显子3编码信号肽及N末端，外显子4、6、8分别编码TFPI的K1、K2和K3结构域，外显子5和7编码K1、K2和K3之间的两段连接区，外显子9编码C末端和3′端非翻译区。TFPI1 mRNA启动子没有典型的TATA盒和CAAT盒，而是在5′侧区的508和521胞嘧啶上有两个转录起始点〔4，5〕。
2.2 蛋白结构
TFPI1是276个氨基酸残基组成的耐热单链糖蛋白，由3个重复的Kunitz结构域(K1、K2和K3)、一个富含酸性氨基酸的N端和一个富含碱性氨基酸的C端构成。TFPI1所含18个半胱氨酸残基构成9对二硫键，参与维持其二级结构。结构域K1和K2是 TFPI 发挥抗凝活性的关键部位，分别与TF/VⅡa复合物和FⅩa发生静电相互作用，最后形成TFFVⅡaTFPIⅩa四聚体，中断外源性凝血途径级联反应〔6〕。结构域K3和C端可以和肝素、膜表面糖蛋白及多糖结合〔7〕，无直接抑制蛋白酶的功能，但它和C端对于肝素和细胞表面的结合是必需的，对TFPI1的整体抗凝活性具有重要意义，并对K2结构域结合到FⅩa上可能起定位作用〔8〕。
3 TFPI1生理功能
3.1 TFPI1与外源性凝血途径
1964年，MacFarlane和Davie等分别同时提出了凝血瀑布学说。随后，逐渐形成了凝血理论的传统瀑布学说，认为凝血过程由外源途径（extrinsic pathway）、内源途径（intrinsic pathway）和共同途径（common pathway）组成，其中外源性凝血途径是生理性止血的主要途径。血管内皮细胞受损时，内皮下细胞表面组织因子（TF）暴露于血液，外源性凝血途径立即启动。TF与血液中少量的FⅦ（FⅦa）结合，形成FⅦa/TF复合物，而后活化FⅩ和少量FⅨ，活化的FⅩ（FⅩa）激活凝血酶原变为凝血酶，从而引起凝血，少量FⅨa对FⅩ的激活则产生放大作用。Lu〔9〕等人通过反应动力学实验发现，生理条件下 FⅦa/TF 活化的产物中，FⅨa 的活性明显超过 FⅩa 的活性，提出外源性凝血途径的早期是以 FⅨ 活化为主，而 FⅩa 则更倾向于是FⅨa 的活化产物。
外源性凝血途径主要受TFPI1抑制调节，其对FVⅡa/TF复合物的抑制作用是通过两步完成：①TFPI1通过K2与活化的FⅩa结合，形成FⅩa/ TFPI1复合物，竞争性地抑制FⅩ的活性，该过程是一个 Ca2+非依赖的可逆性过程，但必须有因子Ⅹa的活性基团及TFPI1的K2抑制区的作用；②FⅩa/TFPI1 复合物中的TFPI1通过K1与FⅦa/TF复合物中的FⅦa 活性部位结合，从而实现对 FⅦa/TF 复合物的抑制。FⅩa轻链中谷氨酸残基上的γ羧基与Ca2+结合，并通过“钙桥”结合于FⅩa/FⅦa/TF复合物中TF附近的磷脂表面，使得 FⅩa/TFPI1与Ⅶa/TF形成稳固的FⅩa/TFPI1/Ⅶa/TF复合物，该复合物可以被单核细胞和内皮细胞等吞噬清除。TFPI1对VⅡa/TF的抑制反应是一种化学定量反应，并且每一步都是可逆的。TFPI的K1与K2抑制区是其发挥作用的主要位点，在抑制过程中具有重要意义。FⅩa/TFPI1复合物在外源性凝血途径活化的起始阶段对FⅦa/TF进行抑制，从而在根本上阻断FⅩ和FⅨ的大量活化，避免了凝血因子及抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）等抑制因子的大量消耗。由此可见，TFPI1在外源性凝血途径的负反馈调节中发挥重要作用。
3.2 TFPI1与肝素的抗凝作用
肝素是临床上应用最多的抗凝药物，其通过与ATⅢ结合，增强后者的抗凝活性而发挥间接抗凝作用〔10〕，同时还抑制凝血因子FⅨa、FⅩa、FⅪa和FⅫa的活性。Hansen等〔11〕研究结果表明，肝素可以促进培养的人血管内皮细胞TFPI1的分泌。
王建文等〔12〕研究结果表明，无肝素连续血液净化治疗过程中，TFPI1呈上升趋势，而使用肝素抗凝其上升幅度更为显著，且呈剂量依赖性增加，说明肝素可通过增加血管内皮细胞分泌TFPI1而增强其抗凝作用。此外免疫阻断TFPI1，肝素的抗凝效果明显下降，表明肝素的抗凝作用有赖于TFPI1。体外实验还发现，肝素和TFPI1还具有协同作用。故可以认为肝素的抗凝作用与TFPI1有密切的关系。
Vignoli等〔13〕研究显示，肝素可抑制炎症介质(脂多糖)诱导的内皮细胞组织因子mRNA表达量及活性。Mousa等〔14〕发现不同分子量的肝素对血浆TFPI1的影响不同，低分子量肝素可使内皮细胞TFPI1的合成和分泌增加。
4 TFPI1研究进展
4.1 TFPI1基因多态性与DVT DVT受多因素、多系统调控，调控机制复杂。是凝血抗凝、纤溶抗纤动态平衡破坏的最终结果。一方面由于体内异常凝血的复杂性，另一方面是由于缺少合适的动物模型和前沿研究手段，致使DVT的机制研究滞后。其病因和发病机制尚未清楚，但大量流行病学研究结果表明，遗传基因在DVT发病过程中可能起着重要的作用。TFPI1基因存在着基因变异及基因多态性，目前许多国内外学者试图从分子遗传学角度探讨TFPI1基因多态性是否与DVT相关，从而进一步揭示DVT的发病机制。
Miyata等〔15〕首次报道TFPI1 C399T(CTTTTT)转换，并认定该突变并不改变TFPI1蛋白的表达，亦与静脉血栓形成无关。Kleesiek等〔16〕发现静脉血栓形成患者P151L多态性的频率高于志愿者，认为P151L与易栓症显著相关，并与静脉血栓形成危险性有关。Amezianne等〔17〕认为内含子7CC基因型是静脉血栓形成的独立危险因素，可能是介导TFPI1水平升高的作用。Sidelmann等〔18〕临床试验结果表明，急性DVT形成患者较无血栓患者TFPI1的浓度显著升高，而此与33T/C多态性、内皮细胞炎症等无关，可能与纤维蛋白沉淀中TFPI1的释放有关。姜剑军等〔19〕采用聚合酶链反应单链构象多态性分析及DNA测序，对比了62例DVT患者和50例正常汉族人的TFPI1基因序列，认为TFPI1基因可能不是中国汉族人DVT的主要易感基因，但5号内含子中单核苷酸“G”插入有深入研究价值。刘秀娥等〔20，21〕实验结果表明，TFPI1基因C399T多态性与静脉血栓形成易感性有关，纯合突变基因型可能是静脉血栓栓塞的重要危险因素；T287c与TF启动子1208 I/D基因多态性与我国人群静脉血栓栓塞发病没有显著相关性，该基因可能不是中国汉族人的易感基因。
目前TFPI1基因多态性与DVT形成的关系研究仍处于初始阶段，对其是否是DVT的遗传性危险因素尚无定论，可能存在基因多态性之间的相互作用或连锁不平衡等机制，尚有待于进一步多地域、多种族、大样本量广泛深入研究，从而可能为DVT的风险预测、防治提供一条新的线索和途径。
4.2 重组TFPI1对DVT的防治
TFPI1与DVT关系密切，天然TFPI1在正常人体内含量极少、提取率很低较难获得，目前国内外已有多种生产重组TFPI1(rTFPI1)的方法，也已有相应产品面市，并陆续开展临床试验。通过动物实验已经证明，rTFPI1能明显提高或延长大鼠、小鼠、猪等感染性休克和弥散性血管内凝血(DIC)模型动物的存活率，减轻炎症反应、抑制凝血反应和防止血栓形成，减轻肺、脾、肝、肾等脏器损伤〔22，23〕。Yin等〔24〕报道，在血管壁进行TFPI1基因转移可防止局部血栓形成和狭窄而无出血危险。Chen等〔25〕通过对小鼠模型的研究，推测靶向应用rTFPI于内皮细胞，可改善全身抗凝治疗，同时尽量减少潜在出血的副作用。Holst等〔26〕证明使用重组人TFPI1161（即缺乏K3和C末端的TFPI）治疗兔颈静脉血栓时，有着与肝素同样的效力，但出血等不良反应明显减少。因此，rTFPI1有可能取代肝素应用于术后DVT的预防和治疗。Klement等〔27〕认为虽然rTFPI1等抗凝药物部分在临床试验中显示了良好的效果，但大部分仍处于动物动/静脉血栓模型阶段，抗凝血过程同时会影响到伤口愈合、炎症、血管生成、细胞分裂、凋亡等过程，所以需进一步发展和严格的审核。
5 展 望
随着分子生物学与基因工程的发展与应用，人们将会进一步了解TFPI1的抗凝作用机制，明确其基因多态性与DVT的联系，TFPI1有望作为一种简便、安全、快速、特异性和准确性高的DVT预测诊断分子标记。而安全、高效的rTFPI1药物也将研制成功并应用于临床，在测DVT的防治、降低DVT危害性、减轻传统抗凝治疗出血副作用等方面发挥积极作用，具有极大的社会效益和经济效益。
参考文献
1 DelGiudice LA，White GA.The role of tissue factor and tissue factor pathway inhibitor in health and disease states〔J〕.J Vet Emerg Crit Care (San Antonio)，2009；19(1):239.
2 刘 伟，朱广瑾.组织因子途径抑制物1与临床疾病的相关性研究〔J〕.国外医学·输血及血液学分册，2004；27(3):2169.
3 Dahm A，Van Hylckama Vlieg A，Bendz B，et al.Low levels of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) increase the risk of venous thrombosis〔J〕. Blood，2003；101(11):438792.
4 Bajaj MS，Birktoft JJ，Steer SA，et al.Structurc and biology of tissue factor pathway inhibitor〔J〕.Thromb Hacmost，2001；86(4):95772.
5 Bajaj MS，Tyson DR，Steer SA，et al.Role of GATA motifs in tissue factor pathway inhibitor gene expression in malignant cells〔J〕.Thromb Res，2001；101(3):20311.
6 Golino P.The inhibitor of the tissue factor:factor VⅡ pathway〔J〕. Thromb Res，2002；106(3):25765.
7 Piro O，Broze GJ Jr.Role for the Kunitz3 domain of tissue factor pathway inhibitoralpha in cell surface binding circulation〔J〕.Circulation，2004；110(23):356772.
8 Lockett JM，Mast AE.Contribution of regions distal to glycine160 to the anticoagulant activity of tissue factor pathway inhibitor〔J〕.Biochemistry，2002； 41(15):498997.
9 Lu G，Broze GJ Jr，Krishnaswamy S.Formation of factors Ⅸa and Ⅹa by the extrinsic pathway:differential regulation by tissue factor pathway inhibitor and antithrombin Ⅲ〔J〕.J Biol Chem，2004；279(17):172419.
10 Brodin E，Appelbom H，Osterud B，et al.Regulation of thrombin generation by TFPI in plasma without and with heparin〔J〕.Transl Res，2009；153(3):12431.
11 Hansen JB，Svensson B，Olsen R，et al.Heparin induces synthesis and secretion of tissue factor pathway inhibitor from endothelial cells in vitro〔J〕.Thromb Haemost，2000；83(6):93743.
12 王建文，彭佑铭，刘伏友，等.肝素在连续性血液净化治疗中对TF、TFPI及PAI1的影响及机制研究〔J〕.中华血液学杂志，2007；28(11):7735.
13 Vignoli A，Marchetti M，Balducci D，et al.Differential effect of the lowmolecularweight heparin，dalteparin，and unfractionated heparin on microvascular endothelial cell hemostatic properties〔J〕.Haematologica，2006；91(2):20714.
14 Mousa SA，Bozarth J，Barrett JS.Pharmacodynamic properties of the low molecular weight heparin，tinzaparin:effect of molecular weight distribution on plasma tissue factor pathway inhibitor in healthy human subjects〔J〕.J Clin Pharmacol，2003；43(7):72734.
15 Miyata T，Sakata T，Kumeda K，et al.C399T polymorphism in the promoter region of human tissue factor pathway inhibitor (TFPI) gene does not change the plasma TFPI antigen level and does not cause venous thrombosis〔J〕.Thromb Haemost，1998；80(2):3456.
16 Kleesiek K，Schmidt M，Gtting C，et al.A first mutation in the human tissue factor pathway inhibitor gene encoding ［P151L］ TFPI〔J〕. Blood，1998；92(10):397677.
17 Amezianne N，Seguin C，Borgel D，et al.The 33T>C polymorphism in intron 7 of the TFPI gene influences the risk of venous thromboembolism，independently of the factor Ⅴ Leiden and prothrombin mutations〔J〕.Thromb Haemost，2002；88(2):1959.
18 Sidelmann JJ，Bladbjerg EM，Gram J，et al.Tissue factor pathway inhibitor relates to fibrin degradation in patients with acute deep venous thrombosis〔J〕.Blood Coagul Fibrinolysis，2008；19(5):4059.
19 姜剑军，张柏根，张 皓.中国汉族深静脉血栓形成患者与组织因子途径抑制物基因多态性的关系〔J〕.中华实验外科杂志，2005；22(6):6767.
20 刘秀娥，杨林花，侯丽虹，等.静脉血栓栓塞症组织因子途径抑制物C399T和T287C多态性的研究〔J〕.山西医科大学学报，2009；40(2):13841.
21 来晓炜，杨林花，刘秀娥，等.组织因子启动子1208 I/D基因多态性与静脉血栓栓塞的相关性研究〔J〕.中国实验血液学杂志，2009；17(4):10369.
22 Matyal R，Vin Y，Delude RL，et al.Extremely low doses of tissue factor pathway inhibitor decrease mortality in a rabbit model of septic shock〔J〕.Intensive Care Med，2001；27(8):127480.
23 Opal SM，Palardy JE，Parejo IVA，et al.The activity of tissue factor pathway inhibitor in experimental models of superantigeninduced shock and polymicrobial infraabdominal sepsis 〔J〕.Crit Care Med，2001；29(1):137.
24 Yin X，Fu Y，Yutani C，et al.HVJAVE liposomemediated tissue factor pathway inhibitor (TFPI) gene transfer with recombinant TFPI (rTFPI) irrigation attenuates restenosis in atherosclerotic arteries〔J〕.Int J Cardiol，2009；135(2):2458.
25 Chen D，Giannopoulos K，Shiels PG，et al.Inhibition of intravascular thrombosis in murine endotoxemia by targeted expression of hirudin and tissue factor pathway inhibitor analogs to activated endothelium〔J〕. Blood，2004；104(5):13449.
[关键词]生物学科 本科生毕业论文 实践和体会
[中图分类号] G642.477 [文献标识码] A [文章编号] 2095-3437（2013）20-0028-02
在我国高等教育规模连续多年扩大的情景下，如何更好地开展本科生毕业论文的实践教学工作，确保本科生毕业论文的质量，是每一所高校教学管理部门和每位指导教师认真思考和完成的一项重要任务。目前，已有许多学者对如何提高本科生毕业论文质量进行了分析。笔者作为一名从事生命科学教学科研工作不长时间的青年教师，结合自身指导的4届本科生毕业论文的教学实践， 从以下几方面提出一些体会和思考。
一、时间是前提
大学期间的第八学期是本科毕业生完成毕业论文的时期，但第八学期又是本科生入学研究生面试、考试或找工作的阶段。这种时间上的冲突，导致大多数学生没有足够的时间和精力完成毕业论文。因此，时间短促是目前影响本科生毕业论文完成的普遍原因，尤其对于实验性和探索性很强的生命科学学科来说，每一个实验步骤的完成都需要一定的时间周期。
在条件允许的情况下，尽早让学生开始毕业论文是相对必要的。笔者指导的2010届2名本科毕业生，由于在大三年级的时候参加了“内蒙古大学生命科学学院本科生科研训练基金开放项目”，2011届被保送上研究生的1名本科生在第七学期开始进行毕业论文，因此完成的时间相对较充足，论文水平也很好。但2012届的2名毕业生，由于忙于找工作、考公务员，使得毕业论文的完成时间仓促，最后只能撰写文献综述，且质量极差，根本没有起到预期的培养目标。鉴于以上的经历和体会，笔者组织了4名2011级的学生申请了“内蒙古大学2013年校级创新创业训练计划项目”，并获得批准，现在已安排他们正式进入实验室，相信通过该项目的实施和完成，必定对他们的毕业论文有很好的促进和提高作用。
二、科研项目是依托
生命科学是当前发展最快的学科领域，而科学研究是学科建设和发展的基础，也是提高教学质量的保证。因此，指导老师将实施科研项目过程中发现的新问题或需要进一步验证的实验内容转化为指导本科生参加国家级、校级创新训练项目或毕业论文，积极指导本科生尽早参与到科研项目中，这样既可以培养本科生的科研兴趣、接受科研训练，又可以让学生准备或完成毕业论文，保证毕业论文的顺利进行和高质量完成。
笔者指导的2013届本科生毕业论文是依据本课题组的科研工作，需要对几个不同品种紫花苜蓿的抗逆性（抗旱、耐盐性）进行基础性分析，以此为后续科研工作受体材料的选择提供依据，安排了2名毕业生分别通过NaCl胁迫和PEG模拟干旱胁迫处理不同品种紫花苜蓿种子，比较分析NaCl胁迫和PEG模拟干旱胁迫对不同品种种子发芽及幼苗生长的影响，得出不同品种间的抗逆特性及差别。这样既为本课题组的科研工作提供了基础信息，促进了科研工作的进展，又将此部分内容作为一个完整的小课题，通过本科生毕业论文完成，训练了本科生的独立科研能力，也顺利完成了毕业论文。
三、选题要适中
用于毕业论文的课题应符合毕业生具备的基本能力的要求，难度适宜、分量合理，课题涉及的知识范围和理论深度要符合学生所学理论知识和实践技能训练的实际情况，要有利于巩固和深化毕业生所学的知识，使其受到科学研究（设计）能力的基本训练，学生通过努力能在规定的时间内完成课题研究或取得阶段性研究成果。而许多学者提出本科生毕业论文选题要新颖、有创新，这样确实能够培养学生的创新意识和创新能力，但笔者认为本科生毕业论文的选题要适中，兼顾新颖即可。
首先，由于多年扩招以及学生对大学校园开放式的学习方式适应能力不同，使得在校毕业生的自身知识结构和能力参差不齐，因此以相同难度要求他们完成毕业论文似乎不太可能实现。指导老师要和学生沟通交流，针对其自身情况选择合适的毕业论文题目。其次，作为指导老师的科研项目的一个小课题的毕业论文很难体现出新颖性和创新性，但其必定是具有学术价值的。
四、指导教师的角色
目前，在论文选题、实验方案的设计上多数毕业生还不能够独立完成，需要在指导老师的指导下，选定3-5个关键词，学生通过查阅相关文献，并从中筛选出能直接辅证拟定毕业论文题目的文献，以此为依据提出实验设计方案，并由指导老师指导修改。实验的实施过程是本科生第一次真正亲自从事科研工作的经历，尤其是在生物学科相关专业的实验过程中实验操作是否规范、实验结果或数据的合理分析和推理、仪器设备的安全使用、实验废弃物的安全处置都将会影响其将来从事科研工作的兴趣、激情和安全性。因此，整个实验实施过程中指导老师都要耐心地跟踪指导，言传身教，以此培养学生实事求是的态度和习惯，培养学生的基本科研素养。在跟踪指导的过程中，也要“放手”，给学生留有自由实验和探索的空间，营造严谨而又宽松的环境。另外，生物学科实验本身就是探索性的工作，任何一个实验步骤在重复3次都没有达到预期结果或结果不理想时，指导老师就需要鼓励学生，并认真分析原因，指导学生寻求其他可能的解决思路和办法，指导学生通过阅读文献对其进行科学、合理的解释，培养学生探索和解决问题的能力。
毕业论文的撰写是培养学生提出问题、对所得实验结果进行分析、讨论并得出结论的能力的过程。毕业论文是具有学术规范的科学性、总结性的学术论文，既要严谨、通俗易懂，又要具有专业性。因此，在指导过程中，首先要求学生严格依据本科毕业论文（设计）撰写规范的要求，本着严谨求实的态度，用词准确，科学、真实地表述实验结论及其学术意义。凡引用他人的观点或结论，均应按论文中所出现的先后次序列于参考文献中。而学生第一次接触学术性论文写作时常常出现的共性是：口语化用词太多，经常使用第一人称表述；推断性结论太多，缺乏严谨性；结构、层次不清晰，缺乏逻辑性；物种拉丁名、基因和蛋白质的书写不规范，缺乏专业性等。针对这些普遍存在的现象，指导老师必须认真指导，严格要求，培养学生规范写作的习惯。
不难看出，本科生毕业论文的整个过程都需要指导老师的精心指导，因此，有学者提出了“教师在本科毕业论文教学环节中的主导作用”的观点，但也有学者不完全认同此观点。笔者认为考虑的角度不同，指导老师在本科毕业论文教学环节中的角色就有所不同。对于大多数初次接触并亲自完成一个相对独立、完整的研究工作的本科生，是不可能完全独立完成的，指导老师必须进行全面的指导，起主导的作用。对各方面能力都很优秀的学生，指导老师只需给予引导，在条件允许的情况下，完全“放手”，由学生独立完成，增强培养学生独立工作的能力。
五、学生的自主性
学生是毕业论文的主体，其在思想上对毕业论文的重视程度和态度直接影响着毕业论文的完成。因此，提高学生思想认识是毕业论文顺利进行的保障，要让学生在思想上高度重视，明白拟开展的毕业论文的研究目的和学术意义，消除“毕业论文肯定能通过”的消极态度，并强调解决好就业或研究生入学与毕业论文在时间上冲突的实际问题，避免“老师比学生着急”的现象。
学生在思想上重视毕业论文的同时，在实验实施或论文撰写的过程中也要尊重事实、实事求是，培养严谨的作风。实验过程不顺利的时候，学生也要保持积极的心态，不要轻易放弃，更不要急于完成工作任务而编造实验结果或篡改实验数据，要在指导老师的指导下，认真分析和寻求原因，或许可能发现未曾预想到的现象，提出新的科研内容或问题，这也是生物学科实验性和探索性的特点。
六、结束语
本科生毕业论文是本科教学计划任务的最后环节，是集学习、实践、探索和写作为一体的综合性教学任务，是指导老师和学生共同合作完成、教学互长的教学活动。指导老师既要严格要求，全面地指导、点拨，又要“放手”给学生独立思考和工作的空间，给学生提供从单纯学习过渡到实践学习的过程，并培养学生的科研兴趣或增强学生的专门技能。毕业论文的完成过程是一个真实的科研或专门技能工作的过程，是即将成为研究生或专门技能工作者的一次“实战”和“练兵”的经历，相信毕业论文过程中培养的基本科研素养或增强的专门技能必将影响着毕业生以后的科研或专门技能工作。
[ 参 考 文 献 ]
[1] 张芳萍，任志峰，赵春江.关于提高本科生毕业设计（论文）质量的研究[J].大学教育，2013，（2）.
[2] 谢吉琴.提高本科生毕业论文质量的思考[J].中国校外教育，2012，（21）.
[3] 李海燕，俞金梅，高志红等.高校本科毕业论文（设计）中存在的问题及解决途径[J].实验技术与管理，2012，29（12）.
