时间：2023-07-13 17:22:35
开篇：写作不仅是一种记录，更是一种创造，它让我们能够捕捉那些稍纵即逝的灵感，将它们永久地定格在纸上。下面是小编精心整理的12篇茶叶的植物学特征，希望这些内容能成为您创作过程中的良师益友，陪伴您不断探索和进步。
关键词：海南 植物学 热带特色 实验教学
引言
植物学是生物科学及相关专业的一门重要基础课，也是一门实践性非常强的学科，植物学实验是植物学教学中的一个重要环节[1-3]。从当今教学改革的发展趋势来看，学生实践能力的培养越来越受到重视。通过实验，不仅能加深学生对理论知识的理解，掌握植物学研究的基本方法和基本技能，提高学生的综合素质，培养学生的观察、思维及创新能力。同时，可以为今后进一步应用植物学知识和技能，解决生产和科学研究中的相关问题打下良好的基础。
海南高校生物类本科专业的植物学实验教学除了可以发扬传统教学内容的优点外，还可以借地处热带地区的优势，积极引入海南热带植物材料到植物学实验教学课堂，打造出海南热带特色的植物学实验教学。
一、传统植物学实验教学
植物学实验往往是生物类本科专业的第一门专业实验课，对大一学生实验技能、实验素质、创新意识等的建立起着重要的作用。由于植物学实验课程是生物类本科专业最经典的课程之一，延用几十年的教学模式、与课程密切相配合的教学内容、约定俗成的教学习惯均是改革中需要突破的瓶颈，所以植物学实验课程也成为教学改革的难点。
植物学理论课的教学内容和教学手段在不断改革和发展，而实验课教学改革滞后。海南高校的植物学实验教学对实验内容不断进行调整，编排了多个综合性实验和设计性实验，但整体思路和教学方式仍是以前的习惯与经验。从植物学实验基本技术所选用的实验材料，到植物形态解剖实验、植物系统分类实验等所选用的实验材料大部分都尽量选用实验指导上的材料。而实验指导书列举的大部分植物材料是北方地区的代表植物实验材料，选用的材料也多以北方为主[7]。这就不利于很多植物学实验项目教学内容的开展。
二、海南高校植物学实验教学材料分析
1.植物形态解剖实验材料的选取
由于植物生长有明显的地域性，有些材料还不易采到， 或因为生长环境的不同，在本地区找不到课本上的植物实验材料。在实验过程中适当加入海南当地的常见植物作为实验材料。如观察细胞后含物的油滴选用油棕果实与花生对照，观察细胞晶体选用紫背万年青与水鬼蕉对照。课本上的大黄（Ligularia duciformis （C. Winkl.） Hand.-Mazz.）、半夏（Pinellia ternata （Thunb.） Breit.）、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）等海南很难找到在课堂应用。
在植物的根系的实验内容中，海南热带植物种类繁多的榕树、热带兰花的气生根，热带雨林中高大乔木的板根，热带雨林中藤本植物的攀援根等可以为植物根系的实验提供丰富而特别的实验教学的素材。在植物茎的实验中，热带植物的茎上生花现象，绝大多数植物都是裸芽的现象等可以作为实验对象，并可以与课本介绍的北方植物做比较，分析各种差异的原因，鼓励学生去探究。热带植物的叶片多样，从肉质到革质，从大的几米到小的毛状，从复杂的构成到简单的条状，其多样性令人惊叹。
2.植物系统分类实验材料的选取
在植物系统分类实验中，藻类植物部分可以分为淡水藻类的观察和海水藻类的观察，取营养化的海水经过过滤浓缩后可以观察到硅藻等十来种热带特性的藻类植物。菌类植物中海南有黑灵芝（Ganoderma atrum J.D.Zhao）、喜热灵芝（海南当地叫竹灵芝Ganoderma calidophilum J.D.Zhao）、鹿角灵芝（Ganoderma amboinense （Lam.Fr.）Pat.）、海南灵芝（Ganoderma hainanense J.D.Zhao）、褐芝（Ganoderma bromnii （Murrill）Gilb.）[4]等在海南市场上常见。
蕨类植物和其他高等植物的野菜种类在海南有几十种，如菜蕨（Callipteris esculenta （Retz.） J. Sm.ex Moore et Houlst.）、田字草（Marsilea quadrifolia L.）、槟榔心（Areca catechu L.）、苋菜（Amaranthus tricolor L.）、落葵（Basella alba L.）、木豆（Cajanus cajan （Linn.） Millsp.）、积雪草（海南当地叫雷公根Centella asiatica （L.） Urban）、革命菜（Crassocephalum crepidioides （Benth.） S. Moore）、闭鞘姜（Costus speciosus （Koen.） Smith）、白花地胆草（Elephantopus tomentosus L.）、刺芹（海南当地叫刺芫荽Eryngium foetidum L.）、地瓜叶（Ipomoea batatas （L.） Lam.）、芭蕉花（Musa basjoo Sieb.）、睡莲梗（Nymphaea tetragona Georgi）、竹笋（Phyllostachys属的多种竹子的初生、嫩肥、短壮的芽或鞭）、蒌叶（Piper betle L.）、马齿苋（Portulaca oleracea L.）、菜（Rorippa indica （L.） Hiern.）、量天尺（海南当地叫霸王花Hylocereus undatus （Haw.） Britt. et Rose）、少花龙葵（Solanum americanum Miller）、黄鹌菜（Youngia japonica （L.） DC.）[5]等。
对常见的热带作物进行整理归类，热带水果种类有腰果（Anacardium occidentale L.）、面包树（Artocarpus incisa （Thunb.） L.）、番荔枝（Annona squamosa Linn.）、橄榄（Canarium album （Lour.） Raeusch.）、黄皮（Clausena lansium （Lour.） Skeels）、柚子（Citrus maxima （Burm.） Merr.）、榴莲（Durio zibethinus Murr.）、枇杷（Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.）、山竹（Garcinia mangostana L.）、荔枝（Litchi chinensis Sonn.）、木瓜（Chaenomeles sinensis （Thouin） Koehne）、香蕉（Musa nana Lour.）、人心果（Manilkara zapota （Linn.） van Royen）、果（Mangifera indica L.）、红毛丹（Nephelium lappaceum L.）、莲雾（Syzygium samarangense Merr. et Perry）、百香果（Passiflora edulis Sims）、甘蔗（Saccharum officinarum Linn.）、椰子、波罗蜜等，热带经济作物有剑麻（Agave sisalana Perr. ex Engelm.）、木棉（Bombax ceiba Linnaeus）、咖啡属（Coffea Linn.）合计有五种咖啡树、茶叶（Camellia sinensis （L.） O. Ktze.）、橡胶树（Hevea brasiliensis （Willd. ex A. Juss.） Muell. Arg.）、苦丁茶（Ilex latifolia Thunb.）、木薯（Manihot esculenta Crantz）、可可（Theobroma cacao L.）、胡椒（Piper nigrum L.）、香荚兰（Vanilla fragrans （Salisb.） Ames）[5]等。
把以上列举的具有热带特色的常见野菜及热带作物种类引入植物学实验教学课堂，引导学生去比较、分析植物的特征，将有利于促进学生对植物学基础知识的掌握和理解。另外教师还可以带领学生在植物学实验教学课堂之外积极采集制作具有热带特征的代表性植物标本[6]，拍摄各种植物及其生态环境的图片，应用到植物学实验教学中，会起到事半功倍的效果。
三、结语
海南有独特而丰富的植物资源，充分利用本地植物资源，建设具有海南热带特色的校园植物生态环境，建立校园热带作物的种植园基地。并在植物学实验教学中把与我们生活密切相关的热带植物引入到植物学实验课堂，对于加强植物学实验教学，节省实验经费，做到因地制宜，丰富实验材料类型，提高学习兴趣，拓宽学生思路，开阔学生视野，充分锻炼学生独立解决问题的能力，培养学生的创新意识等具有积极意义。
参考文献
[1]陆时万 徐详生 沈敏健 植物学[M].北京：高等教育出版社，2003。
[2]周仪 植物形态解剖实验[M].北京：北京师范大学出版社，2002。
[3]尹祖棠 种子植物实验及实习[M].北京：北京师范大学出版社，2002。
[4]吴兴亮 戴玉成 中国灵芝图鉴[M].北京：科学出版社，2005。
[5]中国植物志电子版http：///
一
面朝云海，背倚青山，头顶蓝天，脚踏瀑布，大茶树王屹立于天地之间。
我们一行4人，怀着朝圣的心情，踏着青苔和落叶一步步攀登，走近这棵2700年的茶树之王。大茶树王粗壮的茎干竖立在山坡上，树冠部分的枝条指向苍穹，似乎在向我们昭显它的威严；树干上绿色的苔藓和灰白的树皮斑驳分布，似乎在向我们讲述它的沧桑。
这里是普洱市镇沅县九甲千家寨，在这座山头分布着大量的野生古茶树，一些年龄较大的古茶树被专门编号，以利于保护，大茶树王自然是当之无愧的“1号大茶树”。据说约40年前，一位猎人偶然在山间发现了这棵大茶树，消息传出后，引起了外界的不断重视。
1996年，由思茅政府、思茅地区茶叶学会等牵头，召开了“哀牢山国家级自然保护区云南省镇沅千家寨古茶树考察论证会”。应邀参加论证会的专家，经过考察论证得出结论：“九甲千家寨古茶树按其植物学特征，属于野生型茶树。根据已经掌握的有关茶树生理生态资料和南糯山古茶树已知树龄（800年），结合九甲千家寨古茶树的地理纬度、海拔高度与水热状况等资料综合推算，千家寨上坝古茶树树龄为2700年，千家寨小吊水头古茶树树龄为2500年。”
2700年前，这棵大茶树已经在森林中伸展枝条，经历风雨。世界目前已知的野生茶树，年龄都小于千家寨的这棵茶树，都是这棵茶树的晚辈。
3540万年前，世界屋脊青藏高原由于板块挤压，才刚刚从水中露头，由海洋环境变成陆地环境，普洱地区已经孕育出未来将要润泽万世的珍贵物种。此后，茶树从远古走来，一路演化，留下一路茶花香。
在生物分类学上，古木兰是山茶目、山茶科的祖先，是大茶树王的祖先。茶树演化之路延伸到千家寨的野生古茶树，并未就此终止，而是在普洱地区先民的手中散发出更加浓郁的茶香。
从古老的宽叶木兰，到野生茶树、过渡型茶树和栽培型茶树，茶树从远古一步步走来，却始终在普洱大地上繁衍生息。普洱究竟有什么神奇之处，不仅能够孕育沁人心脾的茶香，还能千百年来凝聚这缕香气，使其愈发浓郁呢？
二
茶是什么？谁发现了茶？谁种植了茶？谁开发了茶？谁理解了茶？谁应用了茶？茶的故乡在哪？谁让茶和水相遇，制造了茶杯里的江湖？
邦崴古茶树已经超过1000岁了。1000岁的树，并不像人类想象的那么老，比如，白发苍苍。如果你有机会看到它，就知道什么是绿鬓如云。听风，沐雨，看云，朝日，拜月，然后尽一棵茶树的本分，努力长出新芽嫩叶，开花结果。1000年的光阴，不知不觉就过去了。
世界茶树原产地在中国，在云南，在普洱，邦崴古茶树就是证明。
山中修炼的岁月，在1991年3月的一天被打破。思茅地区茶学理事长何仕华先生找到邦崴古茶树，丈量了树的身高、直径、树冠、分生树干，还收集了落地的茶花、果、壳和晒青毛茶样品。当时，邦崴古茶树被承包给寨子里魏壮和家，魏壮和是哑巴，每年他的妻子赵云花在古茶树身上采摘茶叶。
事实上，1984年，澜沧县开展茶树品种资源普查工作，杨德兴和左文忠对古茶树做过详细记录：邦崴大茶树品种为大叶绿芽茶，树冠挺拔，枝叶茂密，生机盎然，巍然屹立在邦崴村魏四（即魏壮和）家园圃地，海拔1920米，树高11．9米，呈乔木型，基部干径70厘米，基部干围224厘米。主人家在大茶树下间种蚕豆、豌豆耕挖管理，每年采摘茶叶十多斤，自家饮用。这棵茶树的茶特别好吃，回味爽口，清香，茶汤浓。邦崴大茶树，是澜沧县老茶区中栽培型最大的一株。
在邦崴古茶树被山外的人们认识以前100多年间，国际学术界根据印度阿萨姆存活的古茶树，倾向于认为茶叶原产地在印度。考古学专家黄桂枢先生认为布朗族先民濮人是邦崴古茶树的历史主人。华南农业大学学者李斌先生认为：邦崴古茶树是较云南大叶种和印度阿姆种更原始、起源更早的茶树，是野生型向栽培型过渡的类型。
对于过往，古茶树笑而不语。
三
“你们看这两棵古茶树，一棵大叶种，另一棵叶片要小得多，生长在一起。”
李兴昌师傅手指两棵高大的茶树，向我们讲述着他的古茶园，以及他对茶树和茶叶的理解。
这里是困鹿山古茶园，天下闻名的困鹿山贡茶就产于此地。李师傅家世代种茶、制茶为生，从最早迁入此地的祖上算到李师傅这一代，已经有8代人了。李师傅提到自己家族的一个细节，那就是不论迁到什么地方，住处旁边都有古茶树。也许祖上在迁徙的过程中，就随身携带着安身立命的根本——茶树种子或茶树苗。
当然，我妄自揣测，李师傅祖上随身携带的最重要的东西，还不是这些身外之物，而是他们的传统种茶技艺，以及对种茶、制茶技艺的追求和敏感性。
根据李师傅的经验，一般海拔1600米到2000米的山坡地带的茶叶质量较好，而在困鹿山地区，古茶园海拔在1700米到1800米，属于最优的茶树生长环境。由于困鹿山茶叶品质好，很早就被当地官员当做馈赠礼品，赠来赠去，就上贡到了皇帝那里，于是困鹿山的茶园成了皇家茶园。在清代，每到采摘茶叶的季节，政府都会派兵把守，先将上贡皇家的茶叶采足备齐后，才允许当地茶农进来采摘。
贡茶制作工艺一代代传承下来，在李师傅这里继续发扬光大。简略地说，传统的制作工艺流程首先要祭祀茶神，然后是原料采选、萎凋、杀青、搓揉、晾晒、压制成型，最后形成了成品。
坐在古茶园中的木棚子里，我们一边喝着用原始的方式加工的烤茶，一边继续聆听李师傅的“茶经”。我问起他对茶的价值的看法，他说，首先茶是有味道的，这是茶被人饮用的最重要原因；其次，喝酒容易醉，喝茶却不会，茶在人的社会交往中起到了很好的作用。至于那些外界宣传的普洱茶治病、防病等神奇功效，李师傅有意无意地淡化。
茶性本洁，以李兴昌师傅一家为代表的普洱古茶园的茶农，在漫长的种茶、制茶、吃茶的生产生活中，也浸染了茶中那大道至简的本性，他们的人性因为接触茶性而变得平和、洁净。
然而，市面上的有些茶书来历各异，甚至还涉嫌抄袭，诸多观点或异或同，或与实际相差甚大。对茶业危害最大的是脱离实际的技术性观点，因而有必要将这类书籍及观点昭示于商家和消费者。
近期出版的某部普洱茶书，是集中上述诸多问题的书籍典型。
区别茶树品种，太过肤浅
该书说：台地茶与古树茶的区别是古树茶“一般比较粗老，芽头少，多会有茶梗”，而台地茶则“细而紧结。芽头多”。实际这只是表象。不是本质区别，所以“有用台地茶粗老叶仿制的茶饼”和“老树茶一芽二叶制作的条索紧结芽头多的茶饼”。这两类毛茶条索区别不是芽头多少和条索的粗老与细嫩，而是叶片薄厚、色泽、毛度、叶韧度等不同。泡过的新茶叶底。老树茶深绿色或深黄绿色，低龄树茶浅白或浅黄色。陈化老树茶与低龄树茶应综合上述因素以及颜色变深褐色或浅褐色等来分辨。
该书讲：老树茶与低龄树茶毛料气味的区别是“老树茶香要比小树的更深沉和强烈。差别明显”。但是六大茶山倚邦、易武丁家寨等地小乔木茶香度比许多异地老树茶高。这两类毛茶香气区别是老树茶带有特殊的酸气味。此味越浓，其料越纯。这两类茶滋味区别，涩度不是主要因素，还要看茶尖老嫩度、各片区茶味共性并综合甘甜浓厚度等来分辨。这在笔者《老树茶的分离与分辨》中作过阐述。
信口雌黄，污蔑普洱茶
该书说：“普洱茶是不发酵茶。发酵说的误导使普洱茶不能越沉越香”、“自然干燥保存的老茶香气散失严重”、“已经有较好沉香的老树茶出仓后不加以密封香气会很快散失”、“密封保存的老树茶”“3年后茶香入茶汤”、“普洱茶不能透气储存”。必须“封闭储存”、普洱茶不是“越陈越香”。而是“越沉越香”，即“沉积下来之香”。把茶的气味因混杂而不显香误解成“散失香气”。
公认的生物化学理论认定：“广义的发酵是指利用生物体（包括微生物、植物细胞、酵母菌等）的代谢功能，使有机物分解的生物化学反应过程。”可见，普洱茶的发酵属“广义的发酵”。
众所周知。正常普洱新茶汤多显橘黄色。其汤内未溶入茶红素。在适当环境透气保存6年的该茶，汤色明显发红。这证明其汤内已溶入茶红素，该茶细胞或其成份已有分解现象。按上述“发酵的广义概念”，该茶已经发酵了，可是该茶仍散发纯正浓郁的陈旧芳香。凭何说：普洱茶“透气保存”而发酵就“几乎都是越存越不香”呢？普洱茶的储存可以非真空封闭，但不等于“必须”封闭。
该书说“越陈越香”是偶然“巧合”，那么众人透气储存的近十年的众多茶饼，随意抽泡。为何都散发出扑鼻诱人的陈香呢？
除部分茶区古树茶外，多数普洱茶都偏苦涩，须妥善存放六至十年以上，苦涩度降低才饮用。既然其苦涩度降低，证明其细胞或成份发生分解。按上述“发酵的广义概念”，该茶发酵了，但它们仍能发出浓郁陈香！可见该书中的谬论是对普洱茶的歪曲和污蔑！
此人所存茶“几乎都是越存越不香”的原因：或存放不当；或储存被人存坏的二三手茶；或收藏了劣质茶；或收藏了以不适合料（偏北或偏南茶）制作或假冒的普洱茶。
混淆歪曲多个概念
该书说：“一般而言，老树茶强于小树茶：乔木茶强于台地茶；有森林环境的老树茶强于无森林环境的老树茶；纬度低的靠南的茶强于纬度靠北的茶；海拔适度（1400米～1800米）的茶强于海拔过高过低的茶；大叶种茶强于小叶种茶”。但六大茶山多数小乔木茶甚至台地茶的正常存香优于许多地带的老树茶；六大茶山多数生态矮化茶储香优于许多地带乔木茶；无森林的数百年树龄老树茶储香优于有森林的百年老树茶；纬度约11°15’以南或22°20’以北的储香不如纬度11°15’～22°20’之间的茶；海拔1100米～1400米的六大茶山茶的储香优于众多海拔1400米～1800米的它山之茶；倚邦小叶茶的储香优于许多异地大叶茶。
该书对“灌木茶”与“乔木茶”、“台地茶”与“古树茶”、“古树乔木茶”与“矮化茶”、“台地茶”与“乔木茶”、“生态茶”与“非生态茶”等概念与区别含混不清。老树茶与嫩树茶的区别，最初是从同片区这两类茶的苦涩度上发现的，两者的分离。也是由此引发的。同片区近百年或上百年树龄的茶的苦涩度明显比七八十年及其以下树龄的茶清淡。因而它们是以百年左右树龄为界线的。“古树茶”就是老树茶，包括矮化灌木茶和乔木型两类。但前者并非台地茶。
乔木茶和灌木茶的区分，在古六大茶山也是从茶味涩度和厚度上引起的。它有两个本质标准：一是指植物学所指的乔木型和人为重度矮化型（包括老树类和嫩树类）；二是按根系类型化分的有主根的乔木型和仅有须根的扦插类，即有性繁植苗和无性繁苗两类。前者只要不被矮化，可长成高大乔木；后者即使不被矮化也无法长成高大古乔木，其茶涩度偏高而茶味偏薄，故列为灌木茶。
台地茶通常是低龄、矮化、密植的茶，包括无性系苗种的梯式茶林和密植而被重度矮化的有性系梯式茶林。
对于乔木茶与台地茶的分辨，该书说：乔木茶与台地茶。需从乔木茶的分布与产地、山野气韵、乔木茶特征、厂家与价位、干茶特征、试泡、叶底、手感、芽头、叶底香气、杯底香等方面综合分辨。但这样“品鉴”是极不可靠的。知道乔木茶的分布与产地，却存在原料交叉流动；论“山野气韵”，天然生态林的矮化茶也会有；若看厂家，彼地厂家会收购和制作此地茶；若看价位，更会随产主定价信誉度而千变万化；说是按“乔木茶特征”或“干茶特征”分辨，却没介绍两者的特征及本质区别；若看耐泡度、品茶汤苦涩度、回甘度及浓厚度，则嫩树乔木茶的耐泡度也偏低，回甘也偏弱，浓厚度也偏薄，而且不同地域同类茶的耐泡度、苦涩度、回甘度及浓厚度有别；若看叶底颜色深浅，则背阴地的台地茶尤其是重度矮化的老树茶也有似乔木茶那样偏深的；试手感的柔韧度，则只能分辨百年老树茶与低龄树茶，但乔木茶未必是老树茶。低龄乔木茶也有柔韧度较差的；若看芽头多少和粗老度，乔木茶和台地茶都有芽头多的和细嫩的，也都有芽头少的和粗老的；若嗅叶底香和杯底香，则不与天然杂木混生的乔木茶也缺乏植物香型。所以其所介绍的品鉴方法繁杂无效，还明显误导。实际上，矮化台地茶受重度修剪。抽芽较快，韧性偏差，冲泡后顶部嫩梗嫩叶受搓揉易成腐化状；露天暴晒。叶底毛层薄而光泽亮度低。多数色泽浅黄；又与杂草混生，气味几乎不带花香型。叶边齿更细密短浅，多呈倾斜状。这些概念代表的是不同的茶质及价格。该作者信口开河歪曲这些概念，将坑害茶商及消费者。
“存储研究”，漏洞百出
该书的“存储研究”是漏洞百出的“作秀”幌子。请看该书“沉香例证”所列6例（受篇幅限制从略）及对6例的列表“研究”。
由此6例得出：
（1）湿度过大的广东自然存茶香味散失比较快目严重；
（2）云南自然存放香味散失比广东慢；
（3）相对密封的干燥的存储茶香保持得好；
（4）已经有较好沉香的老树茶出仓后不加以密封香气会很快散失；
（5）自然干燥保存的老茶香气散失严重；
（6）密封保存的老树茶香气保存好，而IEI 3年后茶香入茶汤。
其“研究”逻辑漏洞是：
对1～4例茶的初制、复制和前期保存作者不清楚。原料来源？可适合长期存放？毛茶初制工艺如何？前期存放是否有误？这些因素都会影响其储香。多个变因下研究未知问题，凭何判定普洱茶不适合自然存放？第1、2、4例都曾存在湿度大的场所，难免受潮；第3例“有少许霉点”表明也受潮发霉。未必“昆明自然存放”。若严重受潮甚至发霉，固然不香，但自然透气存放未必就会受潮和发霉，也就未必非要“封闭储存”；第4例“失香”原因未必是透气，还可能是该茶存香时限已过，况且还受开封后环境影响？第5例并未透露“自然”和“未密封”使茶香“散失”的信息，反而证明普洱茶适合干燥自然存放，且适宜发酵；第6例似表明“密封保存香气好”的结论。就算这样，部分古树茶以外的普洱茶苦涩度普遍偏高。密封保存，很难让它的苦涩味随时间推移逐渐降低。既然如此，我们存放该茶，除了备用，还有何意义？更何况表中第2、3行的“微香”和“有香”无明显区别，即使有实质性差别，填写未必属实。因为普洱茶有限期间“越陈越香”，是指随时间的延长，茶香由新鲜逐渐转为陈旧。并不是越闭住散出的香气，“沉积”的香气越多，茶品就越香。好茶的香气是内存并不断散出，冲泡时集中散出来，不是靠“沉积”下来的。依靠密封留住的香气，一旦解封就散尽，根本无法让它“沉积”到茶品内。适合长期珍藏的茶，在存香期内因保存不当不显香，不是“茶香散失”。而是气味混杂。“失香”是直接没了气味，这与正常存放的保质期有关，与存放方式无关。茶香早在新茶时就“入汤”，只是那时香气新鲜，“3年后”其香型变“陈旧性”罢了，并非“3年后茶香入茶汤”。
后话
关键词：台茶12号（C. sinensis ‘Taicha 12’）；福鼎大白茶（C. sinensis ‘Fuding-dabaicha’）；花粉；离体萌发；生活力；贮藏力
中图分类号：S571.1；Q944.42 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）24-6067-05
茶树[Camellia sinensis （L.）O.Kuntze]是多年生异花授粉的木本植物，因其叶含有多种对人体有益的功能成分，而被作为一种经济作物广泛栽培。生产上茶树多采用无性繁殖以保持其优良性状，却易导致品种退化和病虫害抗性降低[1]。杂交育种是培育茶树新品种的重要途径之一。但茶树为异花授粉的虫媒花植物，且开花期间气温低、昆虫活动少，导致茶树天然结实率较低[2]。在育种实践中，往往由于茶树亲本的花期不遇给杂交育种工作造成很大困难。茶树花粉的生活力与贮藏力研究为解决这些问题提供了一条思路，对茶树杂交育种以及种质资源保存具有一定的理论与实践意义[3，4]。目前，关于茶树花粉生活力和贮藏力的研究报道较少[4-8]。鉴于此，以华中农业大学校内种植的两个茶树品种为试材，开展花粉生活力与贮藏力研究，以期为茶树杂交育种与优良种质保存提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
以华中农业大学茶园引种栽培的的两个品种为试材。台茶12号（C. sinensis ‘Taicha 12’）：由台湾省茶叶改良场选育，无性系，灌木型，中叶类，中生种[1，2]。福鼎大白茶（C. sinensis ‘Fuding-dabaicha’）：由福建省福鼎市点头镇柏柳村选育，无性系，小乔木型，中叶类，早生种[1，2]。
1.2 方法
1.2.1 花粉采集及贮藏 于2010年12月盛花期间天气晴好的上午，采集生长良好的福鼎大白茶、台茶12号的大蕾期花朵。摊放于白纸上，并置于阴凉通风干燥处放置24 h使花蕾开放、花药开裂。用毛笔轻轻刷下花粉，并置于阴凉通风干燥处，至抖动花粉不结块时收集。取少许新鲜花粉用于筛选适宜萌发的培养基以及检测花粉生活力试验。剩余花粉分别装入离心管中，以脱脂棉封口，置于干燥器中，花粉体积不超过离心管体积的1/3。将干燥器分别置于室温（RT）、4、-20、-70 ℃下避光贮藏。
1.2.2 花粉生活力检测 采用人工离体萌发法检测花粉生活力，具体试验方法及步骤如下。
1）花粉的吸水处理。播种前，取新鲜花粉于4 ℃、暗环境、饱和空气湿度条件下放置2 h，以充分吸水[9]。
2）培养基中各因素对花粉离体萌发的影响。茶树喜酸性土壤，以台茶12号为试材，分别设置琼脂浓度、pH、蔗糖、H3BO3四因素各三个水平，进行正交试验（表1），以初步确定各因素对花粉离体萌发的影响。播种时，用解剖针将充分吸水的花粉均匀播种于培养基，并将培养基置于铺有湿润滤纸的培养皿中，盖上培养皿，于25 ℃暗培养24 h后观察花粉萌况[10]。每个培养皿于10×10显微镜下观察，每个视野不少于50粒花粉，记录每个视野的发芽率（萌发花粉数/花粉总数），以花粉管长度大于花粉直径时记为萌发。取6个视野的平均值作为该培养基的花粉发芽率，初步确定花粉离体培养时各因素适宜的水平。
3）两种花粉最适离体萌发培养基的筛选。为了筛选两种花粉最适离体萌发培养基，在上述试验的基础上，设置10种固体培养基，pH 5.4，基本成分为1.0% 琼脂 + 300 mg/L Ca（NO3）2 + 200 mg/L MgSO4 +100 mg/L KNO3，设置3种添加量的蔗糖（5%、10%、15%）和3种浓度的H3BO3（50、100、200 mg/L）进行完全组合，以不添加蔗糖和H3BO3的基本培养基为对照（表2）。
4）萌发温度对花粉离体萌发的影响。茶树于冬季低温期开花。以台茶12号新鲜花粉为试材，对萌发温度、培养基琼脂含量与pH对花粉离体萌发的影响进行了研究。将花粉吸水后播种于最适培养基上，分别置于4 ℃、室温（16～21 ℃）、28 ℃、37 ℃下进行暗培养，培养8、24 h后进行花粉生活力测定。
1.2.3 贮藏期间花粉生活力的测定 以福鼎大白茶和台茶12号花粉为试材，取出4种温度下贮藏0、7、15、30、60、120、180 d的花粉，置于4 ℃下吸水2 h后播种于上述试验筛选的最适离体萌发培养基，进行生活力测定，以此确定两种供试花粉的贮藏力。
1.2.4 数据分析 方差分析、多重比较采用SAS 8.1统计软件分析。所有百分数都进行反正弦转换后再用于数据分析。
2 结果与分析
2.1 培养条件对茶树花粉离体萌发的影响
2.1.1 培养基各因素对台茶12号花粉离体萌发的影响 从表1和表2可以看出，琼脂、pH、蔗糖、H3BO3 4个因素均对台茶12号花粉的萌发产生了明显的影响，各因素对茶树花粉离体发芽率的影响从大到小为 pH、H3BO3、琼脂、蔗糖。pH的影响最为明显，因此，合适的pH对花粉离体培养成功与否至关重要。1.0%的琼脂更有利于花粉的离体萌发。随着H3BO3和蔗糖添加量的增多，花粉发芽率总体呈现先升高后降低的趋势，说明低于和高于最适宜的H3BO3和蔗糖浓度均会对花粉萌发产生一定的抑制作用。根据以上结果，筛选出最适宜台茶12号萌发的培养基组合为：1.0%琼脂+10%蔗糖+100 mg/L H3BO3+300 mg/L Ca（NO3）2+200 mg/L MgSO4 +100 mg/L KNO3，pH 5.4。
2.1.2 最适离体培养基的筛选 由表2可以看出，H3BO3、蔗糖及其交互作用对两种茶树花粉的发芽率均有明显影响。添加蔗糖和H3BO3后，两种花粉的发芽率均明显高于对照。当蔗糖添加量一定时，花粉发芽率随H3BO3浓度增加呈不同的变化趋势；当H3BO3浓度一定时，花粉发芽率也随蔗糖添加量的增加呈不同的变化趋势。可见，适宜浓度的蔗糖、H3BO3对供试茶树花粉离体萌发有明显的促进作用。在培养基S2B2上，福鼎大白茶和台茶12号的花粉发芽率均达到了最大值，分别为54.09%和64.02%，明显高于其他培养基上的发芽率。可见，培养基S2B2适合茶树花粉离体萌发。此外，对各种培养基上福鼎大白茶与台茶12号的花粉发芽率进行比较，两种茶树花粉发芽率差异明显，说明茶树花粉发芽率存在种间差异。
综上所述，供试培养基中，最适宜的福鼎大白茶和台茶12号花粉离体萌发的培养基组成均为：基本成分+10%蔗糖+100 mg/L H3BO3，这与正交试验结果一致，说明正交试验结果较为可靠。
2.1.3 培养温度对茶树花粉萌发的影响 从表3可以看出，台茶12号花粉在 4～37 ℃均可萌发。花粉培养8 h后，4 ℃、室温（16～ 21℃）、28 ℃、37 ℃下的花粉发芽率差异显著。其中室温条件下花粉发芽率最高，为37.56%，其次为28 ℃和4 ℃，37 ℃条件下花粉发芽率最低，为11.70%。
随着培养时间的延长，各温度条件下的花粉发芽率均有所增加。其中，37 ℃下花粉发芽率始终最小，培养24 h发芽率为14.03%，说明高温不适宜茶树花粉的离体萌发。4 ℃下的花粉发芽率增长最快，培养24 h后发芽率已超过室温和28 ℃，增至最大，达到45.46%。多重比较结果显示，培养24 h时4 ℃与室温、28 ℃下的花粉发芽率差异显著。由此可见，4～21 ℃下茶树花粉都可以充分萌发，但以低温下萌况较好，可能跟台茶12号于冬季低温期开花、授粉的习性具有一定的关系。
2.2 贮藏时间和温度对茶树花粉生活力的影响
2.2.1 贮藏时间对花粉发芽率的影响 随着贮藏时间的延长，各贮藏温度下福鼎大白茶、台茶12号花粉的生活力总体呈逐渐降低的趋势，即贮藏时间越长花粉发芽率越低。对福鼎大白茶而言，整个贮藏期内，不同温度下贮藏花粉的发芽率呈现很大的差异，但是在贮藏前60 d内，仅有小幅度降低，仍均保持在40%以上。多重比较结果表明，此时不同温度之间的发芽率无显著差异。但是在随后的贮藏时间里，各贮藏温度之间的发芽率开始呈现显著差异。其中室温下发芽率急剧降低，至180 d时，花粉已完全失活；4℃下贮藏60 d后也开始大幅度下降，至180 d时发芽率仅有20.45%；而在-20 ℃和-70 ℃下，在整个贮藏期间花粉发芽率仅有小幅度下降，至180 d时发芽率仍分别有46.88%和50.61%（图1）。
对于台茶12号而言，不同温度下贮藏花粉的发芽率降幅亦呈现很大的差异，但是在贮藏前30 d内降幅均较小，发芽率仍均保持在60%以上。多重比较结果显示，此时不同温度之间的发芽率无显著差异。但是在随后的贮藏期间，各贮藏温度之间的发芽率开始呈现显著差异。其中室温下贮藏30 d后花粉发芽率开始大幅下降，至180 d时花粉已完全失活；4 ℃下贮藏120 d后开始大幅度下降，至180 d时发芽率仅有18.79%；而在-20 ℃和-70 ℃下，在整个贮藏期间花粉发芽率仅有小幅度下降，至180 d时发芽率仍分别有60.16%和71.12%（图2）。
综上所述，随着贮藏时间的延长，福鼎大白茶和台茶12号花粉活力均呈现下降的趋势。但是通过采取降低贮藏温度的措施可有效延长花粉贮藏期，保持花粉活力在较高水平，同时也说明两种供试花粉有长期贮藏的潜能。
2.2.2 贮藏温度对花粉发芽率的影响 从图1和图2 可以看出，在相同的贮藏期内，贮藏温度越低越有利于茶树花粉活力的保持；贮藏时期越长，贮藏温度越低越有利于花粉活力的保持。对于福鼎大白茶，短期贮藏（60 d以内）时，4种贮藏温度之间的发芽率差异不显著，因此可采用4 ℃或者-20 ℃进行花粉贮藏，简便易行。在长期贮藏中（180 d）-20 ℃和-70 ℃效果最好，二者之间发芽率差异不显著，因此亦可采用-20 ℃进行贮藏，以节约成本。对于台茶12号，短期贮藏（30 d内）各贮藏温度之间的发芽率差异不显著，于室温、4 ℃和-20 ℃下贮藏均可；贮藏120 d内，4 ℃、-20℃和-70 ℃之间差异不显著，因此，采用4 ℃和-20 ℃下贮藏即可；贮藏180 d时，以-70 ℃贮藏的效果最好，且-20 ℃和-70 ℃之间差异不显著，因此采用-20 ℃下贮藏亦可较大程度保持花粉的活力。
2.2.3 不同贮藏温度下花粉颜色的变化 贮藏期间两种供试花粉的颜色均呈现由金黄色、明亮黄色、明亮淡黄色灰白色不同程度的变化（图3）。其中，金黄色、明亮的茶树花粉发芽率高，活力强，随着颜色变暗，其活力也逐渐降低。当颜色呈灰白色、光泽偏暗时，生活力即丧失。同一品种花粉在不同温度条件下贮藏180 d后颜色变化差异较大，贮藏温度越低，颜色保持得越鲜亮，花粉发芽率越高；而贮藏温度越高，颜色逐渐呈现灰白色，无光泽，花粉发芽率越低，甚至丧失活力。说明茶树花粉颜色变化与其活力变化具有一定的相关性。因此，在生产实践中，可根据贮藏花粉的色泽来初步判断花粉活力的有无，大大简化了花粉活力检测手段，提高了工作效率。
3 小结与讨论
花粉是种子植物的雄配子体，在有性繁殖中发挥着重要作用。而对新鲜花粉和贮存期间的花粉生活力进行检测，则可以掌握花粉的形态及生理特征，评估花粉是否有受精能力等[11]。目前，可用于检测新鲜花粉及贮藏期间花粉生活力的方法有多种[12]，其中花粉离体萌发法因简便快捷，直观可靠，花粉发芽率被认为是评估花粉活力的最佳指标[13]，因此，花粉离体萌发法不仅成为最常用的花粉生活力检测手段，也是分析有性繁殖基本问题的主要思路[14]。
3.1 影响茶树花粉生活力的因素
在离体培养的各因素中，H3BO3及蔗糖的浓度对花粉离体萌发影响较大[15]，适量的蔗糖和H3BO3有利于花粉的萌发[10，16]。试验中不同蔗糖、H3BO3添加量对茶树花粉萌发有明显的影响，且H3BO3与蔗糖之间存在明显的交互作用。两种茶树花粉萌发的最佳蔗糖、H3BO3添加量均为10%、100 mg/L；适量的蔗糖与H3BO3明显促进了茶树花粉的萌发。
其次，培养温度、pH、琼脂含量都对花粉离体萌发具有一定的影响。极端培养环境如高温和高湿胁迫，不仅使花粉萌发受到抑制，而且花粉形态也有可能发生改变[13，17]。本研究中，4 ℃和室温（16～21℃）下较适宜茶树花粉的离体萌发，花粉形态和花粉管生长均正常。而在37 ℃下，花粉呈褐色，部分花粉干瘪开裂。此外，在28 ℃和37 ℃下培养的茶树花粉，其花粉管长度明显短于其他温度下的，说明高温不利于茶树花粉管伸长，这可能与茶树盛花期间气温低、日温差大等环境因素具有一定的相关性。
3.2 花粉离体萌发的通用培养基
试验筛选的最适培养基组合（1.0%琼脂 + 300 mg/L Ca（NO3）2+ 200 mg/L MgSO4 +100 mg/L KNO3 +10% 蔗糖+100 mg/L H3BO3）与Brewbaker等[18]报道的适合39科79属86种植物花粉萌发的培养基组合基本一致。说明该培养基适合于多数植物的花粉生活力检测，可作为植物花粉离体萌发的通用培养基。在对某种植物首次进行花粉生活力测定时，可先采用该培养基进行探索，从而简化了培养基筛选过程，加快了试验进度，保留了新鲜花粉的活力，保证了试验的可靠性。
3.3 温度对茶树花粉贮藏的影响
花粉活力保持时间由基因型决定[19]，同时植物花粉小，贮藏的营养物质有限，而其呼吸作用又比较强烈。因此，花粉生活力会因高强度呼吸导致花粉养分消耗过度而降低[20]。而贮藏前对花粉进行干燥处理降低花粉含水量，贮藏时选取低温、低O2含量、避光等条件将使花粉细胞内部各种代谢活动减缓，在相同时间内即可减少花粉有机物质消耗，利于延长花粉的寿命[21]。已有研究证实温湿度对茶树花粉贮藏影响较大[4-7]，本研究探讨了4种温度下贮藏两种供试花粉的活力变化。
贮藏温度对两个茶树品种的花粉生活力保持具有显著影响，且品种间受贮藏温度的影响也存在差异。温度越低越有利于花粉活力的保持，室温条件下，花粉贮藏120 d生活力即降低至50%以下，180 d后即完全失活。4 ℃可应用于两种花粉的短期贮藏（60 d内），贮藏60 d时，台茶12号、福鼎大白茶的花粉发芽率分别为65.60%、45.14%，这为解决茶树育种授粉时花期不遇提供了较为简单的解决方案。-70 ℃最适于茶树花粉的长期贮藏（180 d）；贮藏180 d后，台茶12号、福鼎大白茶的花粉发芽率分别为71.12%、50.61%；而-20 ℃贮藏180 d后，台茶12号、福鼎大白茶的花粉发芽率分别为60.16%、46.88%，仍具有一定的杂交可行性，可用于杂交育种工作的开展。因此，可根据实际的贮藏条件和贮藏所需天数制定两种供试花粉的贮藏方案，巧妙安排，合理利用。由于时间限制，本研究仅进行了180 d，展现了不同贮藏温度下两种供试花粉的活力变化趋势，可以满足当季杂交工作的开展，但仍有必要探讨贮藏360 d时花粉活力的保持情况。此外，贮藏后的花粉能否完成受精作用尚需进一步试验探讨。
参考文献：
[1] 骆耀平.茶树栽培学[M].第四版.北京：中国农业出版社，2008.
[2] 江昌俊.茶树育种学[M].北京：中国农业出版社，2005.
[3] AMMA S， WATANABE A. Long-term storage of germ plasm of tea（Camellia sinensis（L.） O. Kuntze）[J]. Japan Agricultural Research Quarterly，1985，19（3）：196-201.
[4] 杨素娟，王玉书，王 立，等.茶树花粉的超低温保存[J].茶叶科学，1993，13（1）：27-30.
[5] 陈国本.茶树花粉生活力及其贮藏[J].茶叶通讯，1963（4-5）：23-28，15.
[6] 梁月荣.茶树花粉贮藏的研究[J].中国茶叶，1985（3）：6.
[7] 应华军.贮藏时间对茶树花粉生活力的影响[J].中国茶叶，1992（2）：24-26.
[8] 杨盛美，宋维希，唐一春，等.茶组植物花粉生活力测定及种间杂交研究[J].中国农学通报，2010，26（8）：115-118.
[9] 黄意欢.茶学实验技术[M].北京：中国农业出版社，1997.
[10] 杜克兵，沈宝仙，许 林，等.不同贮藏条件下杨树花粉生活力变化及隔年杂交授粉应用的可行性研究[J].华中农业大学学报，2007，26（3）：385-389.
[11] 王钦丽，卢龙斗，吴小琴，等.花粉的保存及其生活力测定[J].植物学通报，2002，19（3）：365-373.
[12] STANLEY R G， LINSKENS H F. Pollen： Biology， Biochemistry and management[M].New York，Springer. 1974.
[13] SHIVANNA K R， LINSKENS H F， CRESTI M. Responses of tobacco pollen to high humidity and heat stress： viability and germinability in vitro and in vivo[J]. Sex Plant Reprod， 1991， 4（2）：104-109.
[14] JAYAPRAKASH P， SARLA N. Development of an improved medium for germination of Cajanus cajan（L.） Millsp. pollen in vitro[J]. J Exp Bot，2001，52（357）：851-855..
[15] ACAR I， EROL B A K， SARPKAYA K.Effects of boron and gibberellic acid on in vitro pollen germination of pistachio（Pistacia vera L.）[J]. African Journal of Biotechnology，2010， 9（32）：5126-5130.
[16] 许 林，杜克兵，陈法志，等.川鄂连蕊茶花粉的形态、生活力及贮藏力研究[J]. 园艺学报，2010，37（11）：1857-1862.
[17] JOHRI B M，VASIL I K. Physiology of pollen[J]. The Botanical Review，1961，27（3）：325-381.
[18] BREWBAKER J L， KWACK H K. The essential role of calcium ion in pollen germination and pollen tube growth[J].American Journal of Botany，1963，50（9）：859-865.
[19] 宜.被子植物胚胎学[M].北京：高等教育出版社，1982.
关键词:山药(Dioscorea batatas Decne);内生菌;抑菌活性;分离;筛选
中图分类号:S432.4+2文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)10-2318-04
Isolation and Screening of Endophytes with Inhibition Activity
from Chinese Yam Rhizomes
ZHAO Long-fei
(College of Life Sciences, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China)
Abstract: A total of 34 endophytes were isolated from different parts of Chinese yam rhizomes by grinding method and spread plate method. Inhibition activity against pathogens and its biological characteristics were analyzed. The results showed that four strains preliminarily screened had obvious inhibition to Bacillus subtilis, with inhibition rates of above 24%. Strain HNSQSY04 had the maximum inhibition rate of 52%. One strain had inhibition activity to Escherichia coli. Gram staining, spore staining, growth curve of four strains screened were analyzed. Results showed that HNSQSY14, HNSQSY24, and HNSQSY31 had Bacillus genus features. HNSQSY04 had the features of the genus Gracilibacillus.
Key words: yam rhizome; endophyte; inhibition activity; isolation; screening
基金项目:国家自然科学基金项目(31204301);河南省高校青年骨干教师资助项目(2012GGJS166); 河南省科技厅科技攻关项目(112102110177);河南省教育厅科学技术研究重点项目(12A210019)
植物内生菌（Endophyte）是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物各种组织内部或细胞间隙，而不使宿主产生明显病理症状的微生物［1］。植物是内生菌的宿主并给内生菌提供营养，内生菌则产生具有一定生物活性的次生代谢产物，如植物生长调节剂、抑菌剂、杀虫物质、抗病毒成分等［2］，与植物形成共生互利关系，产生一定的生物防治和稳定生态环境的作用［3］。将植物内生菌作为生物防治菌不仅可避免因使用化学农药给环境带来的污染，还可避免杀死非靶标微生物和破坏植物根际土壤的微生态平衡，在防治植物病害方面有较大的应用潜力，成为国内外微生物研究的热点之一［3-5］。
山药（Dioscorea batatas Decne）为薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属（Dioscorea）多年生草质藤本植物薯蓣的块根，是中国传统的药食同源植物。它含有丰富的DHEA、蛋白质、糖类、黏液质、皂苷、维生素、胆碱、淀粉酶、糖蛋白、氨基酸、多酚氧化酶等成分。一些研究对山药的内生细菌和真菌进行了分离和筛选［2，6-8］，但鲜见对河南山药病原菌拮抗性内生菌系统研究的报道。本研究以河南山药为试验材料，筛选对细菌具拮抗作用的内生菌，并进行微生物学鉴定，以获取其基本信息，为山药拮抗菌的利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1山药惠楼山药,来自于河南省商丘市虞城惠店集乡楼村(砂壤土);铁棍山药,来自河南省焦作市温县(黏土)。
1.1.2试剂草酸铵结晶紫、卢戈氏碘液、番红、次氯酸钠、无水乙醇、孔雀石绿等。
1.1.3培养基 LB固体培养基:NaCl 10 g,酵母膏5 g,蛋白胨10 g,琼脂10 g,补水至1 000 mL,pH 7.2~7.4,121 ℃灭菌 20 min [9]。液体培养基不加琼脂。
牛肉膏蛋白胨液体培养基:牛肉膏3.0 g,蛋白胨10.0 g,NaCl 5.0 g,补水至1 000 mL,pH 7.2~7.4,121 ℃灭菌20 min[9]。固体培养基另加琼脂10 g。
高氏1号培养基:可溶性淀粉20 g,KNO3 1.0 g,NaCl 0.5 g,K2HPO4・3H2O 0.5 g, MgSO4・7H2O 0.5 g,FeSO4・7H2O 0.01 g,琼脂20 g,补水至1 000 mL,pH 7.4~7.6,121 ℃灭菌30 min[9]。
1.2方法
1.2.1材料的表面消毒分别取山药的底部、中部、上部,先用无菌水冲洗2~3次;把山药放入75%乙醇中30 s,迅速取出再放入5%的次氯酸钠中3~8 min,然后用无菌水冲洗5~8次。最后一次冲洗过各部位的水用移液枪分别吸取500 μL涂平板,检测表面消毒是否彻底。
1.2.2内生菌的分离、纯化和保藏经表面消毒的山药组织2 g放入无菌研钵中,研磨至黏稠浆状[6],向研钵中加入18 mL无菌水,搅拌均匀,即制成10-1的菌悬液。取不同部位的山药研磨液,分别稀释成10-2、10-3、10-4 3个梯度。分别取山药不同部位研磨液的稀释液500 μL涂布平板,3个重复。置入恒温恒湿培养箱中30 ℃倒置培养,观察、记录结果。挑取单菌落,以划线分离法接种到培养基上28 ℃倒置培养24 h后镜检观察。重复操作,直至获得纯菌株。
1.2.3拮抗菌的筛选和鉴定
1)病原菌的活化。大肠杆菌(Escherichia coli CGMCC1.1103)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CGMCC1.769),为商丘师范学院生命科学学院微生物学教研室保藏。
将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌以平板划线法转接到牛肉膏蛋白胨培养基上,置于培养箱中28 ℃倒置培养,活化后分别转接到牛肉膏蛋白胨斜面上,待斜面长饱满后暂时保藏于4 ℃冰箱备用。
2)拮抗菌筛选。采用滤纸片法[10]筛选对病原菌有抑制作用的内生菌。制备大肠杆菌菌悬液,用移液枪吸取200 μL涂布牛肉膏蛋白胨平板。在平板上均匀放置4个直径1.00 cm的圆形滤纸片,在滤纸片上加10 μL内生菌悬液,以滴加10 μL无菌水的作为空白对照,30 ℃恒温倒置培养。枯草芽孢杆菌的操作方法同大肠杆菌。观察并记录试验结果,选取具有抑菌效果的菌株复筛。复筛以相同方法进行,培养72 h后测抑菌圈直径(含滤纸片),每株菌3个重复。
3)抑菌效果的计算。病原细菌抑菌效果用抑制率衡量,抑制率=(处理抑菌圈直径-滤纸片直径) /滤纸片直径×100%[11]。
4)拮抗菌株形态学鉴定。参照参考文献[9],对内生菌分别进行革兰氏染色、芽孢染色、菌体形态和大小等的测定。
5)拮抗菌的生长特征。把筛选出的内生细菌接种到灭菌的LB液体培养基中,恒温振荡培养箱28 ℃ 130 r/min培养,每隔2 h取样一次,持续44 h。在波长为600 nm处测光密度。以光密度值(OD600 nm)为纵坐标、对应的培养时间(h)为横坐标绘制生长曲线。
2结果与分析
2.1内生菌的分离情况
铁棍山药和惠楼山药的不同部位共分离34株菌株,根据菌落特征初步判断其32株为细菌,2株为放线菌。
2.2拮抗菌的筛选和鉴定情况
对山药中分离的34株菌株进行抑菌筛选试验(图1、图2),筛选出4株拮抗菌株,其抑菌情况见表1。
从表1可见, HNSQSY04、HNSQSY14、HNSQSY24、HNSQSY31对枯草杆菌都有抑制作用,抑制率均在24%以上,其中HNSQSY04的抑制率最大,达52%。HNSQSY31对大肠杆菌表现出抑制作用且效果不明显,抑制率仅为12%,其他3株对大肠杆菌没有抑制作用。
2.3菌株形态学鉴定情况
菌株形态学鉴定结果见表2、表3、图3。由表2、表3可知,拮抗菌分别分离自惠楼山药的底部、上部以及铁棍山药的中部。筛选出的4株菌株的颜色不一致,菌落都较为湿润、易挑取;菌株HNSQSY04和HNSQSY31来自惠楼山药,菌落较小,边缘不规则,且菌落较薄,革兰氏染色分别呈紫色、红色,细胞都呈杆状,且前者有芽孢(图3);HNSQSY14和HNSQSY24来自铁棍山药,菌落较大,边缘规则,呈乳白色和浅棕色,革兰氏染色呈红色,为革兰氏阴性菌,无芽孢。
2.4拮抗菌的生长特征
拮抗菌的生长特征见图4。菌株HNSQSY04和HNSQSY24的潜伏期较短,4 h开始进入对数生长期,可见这2株的适应能力均较强,但后者的对数生长期较短,培养9 h已进入稳定期;而HNSQSY14和HNSQSY31在培养8 h后进入对数生长,14 h后进入稳定期,约31 h后,4株菌株可能因产生的次生代谢产物或营养匮乏开始进入衰亡期。
根据菌株的菌落特征,革兰氏染色、芽孢染色和菌体形态、大小特征,根据参考文献[12,13]进行鉴定,HNSQSY04符合芽孢杆菌属特征,HNSQSY14、HNSQSY24和HNSQSY31均有杆菌的特征。
3小结与讨论
1)以山药为材料,在从山药中分离出的34株菌株中发现有4株对枯草芽孢杆菌有抑菌作用,占总菌数的11.76%,抑菌率均在24%以上,其中菌株HNSQSY04对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最为明显,抑菌率达52%。而对大肠杆菌仅有1株有抑制作用。说明来自同一种宿主的内生菌对不同病原菌有不同的抑菌活性。但是内生菌在活体上对病原菌的抑制能力是否和体外一致,还需进一步的验证。
2)植物内生菌与寄主植物经长期的协同进化,形成互相依赖、和谐共处的关系,寄主植物为内生菌提供生境和生长发育所需的营养,植物体内有些内生菌对病原物具有拮抗作用或诱导寄主植物产生抗性,从而提高寄主植物的抗病性[14],能控制作物病害的内生菌是一种潜在而丰富的生防资源。内生菌在植物体内长期进化,可能拥有部分与宿主相同的基因,也可产生与宿主相同或相似的活性成分[15],宿主可为进行内生菌代谢产生活性成分的机理研究提供材料。
3)本试验从铁棍山药和惠楼山药中分离得到的内生菌株都属于杆菌,但具体的种属划分还需对内生菌进行生化试验、16S rDNA序列测定等进一步研究。这些菌株能否增加山药的抗病性,能否对除试验所用病原菌以外的病原菌有抑菌作用,还需进一步研究。
参考文献:
[1] PETRINI O.Fungal endophytes of tree leaves[A]. ANDREWS JH. HIRANO S S. Microial Ecology of Leaves[M].New York:Springer Vedag,1991.
[2] 张建新, 刘起丽, 赵丹丹,等. 铁棍山药内生菌的分离及对白菜软腐菌拮抗菌的筛选[J]. 河南农业科学, 2009(10): 94-96.
[3] 冉国华,张志元.植物内生菌研究及其应用[J].海南大学学报(自然科学版),2004, 22(4):366-370.
[4] FIORE S D, GALL M. Endophytic bacteria: Their possible role in the host plant[A]. FENDRIK I. Azospirillum VI and Related Microorganisms[M]. Berlin: Springel Vefiag, 1995.
[5] 朱育菁, 陈璐, 蓝江林,等. 茶叶内生菌的分离鉴定及其生防功能初探[J]. 福建农林大学学报(自然科学版), 2009, 38(2):129-134.
[6]赵龙飞. 惠楼山药内生细菌的分离和特性研究[J].食品工业, 2012,33(4): 79-82.
[7]张志东, 谢玉清, 楚敏, 等. 山药内生菌的分离及菌种鉴定研究[J]. 新疆农业科学,2010, 47(1):126-129.
[8] 詹寿发, 彭琴,甘金莲,等. 野生山药与栽培品种内生真菌多样性研究[J].广东农业科学,2012,39 (21):170-172.
[9] 黄秀梨. 微生物学实验指导[M]. 北京: 高等教育出版社, 1999.
[10] 徐亚军,赵龙飞.野生艾蒿浸提物对大肠杆菌的抑制作用[J]. 江苏农业科学,2012,40(4):306-308.
[11] 范青,田世平.B-912对桃和油桃褐腐病的抑制效果[J]. 植物学报,2000,42(11):1137-1143.
[12] 布坎南R E, 吉本斯N E.伯杰细菌鉴定手册[M].第八版.中国科学院微生物研究所,译.北京:科学出版社,1984.
[13] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.
关键词： 草莓； 指纹图谱； 分子标记； SSR
中图分类号：S668．4 文献标识码：A 文章编号：1009－9980?穴2011?雪06－1032－06
Establishment of SSR fingerprinting database for 38 cultivars of strawberry (Fragaria ananassa) native to Europe and America
WANG Zhuang-wei，ZHAO Mi-zhen， YUAN Ji，WU Wei-min， QIAN Ya-ming
（Institute of Horticulture， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing， Jiangsu 210014 China）
Abstract: The total DNA of 38 strawberry cultivars originating in Europe and America ，such as Earliglow， Induka， Darselect ，Senga， Litessa， were amplified by 44 pairs of SSR primers. The PCR products were separated in 8% polyacrylamide sequencing gels. Some factors which affected amplified products，such as dNTPs，Taq DNA polymerase，primer and so on were also studied. Optimum condition was as follows：25 μL PCR reaction system consisted of 1×PCR Buffer， 2.5 mmol・L-1 MgCl2， 0.4 μmol primer， 0.2 mmol dNTP， 1.5 U Taq polymerase and 60 ng DNA. The amplification conditions were 94 ℃ for 1 min，35 cycles of 94 ℃ for 30 s，annealing temperature for 30 s ，72 ℃ for 30 s and a final extension step at 72 ℃ for 7 min． Ten pairs of primers which could amplify stable and distinct band were selected. The electrophoresis results of the 38 strawberry DNA samples were evaluated and analyzed. Eventually， 29 cultivars could be distinguished by the fingerprint map constructed by only 4 pairs of SSR primers．
Key words: Strawberry； Fingerprinting； Molecular marker； SSR
草莓在世界上广泛种植，是重要的经济果树。全世界草莓属约20个种，2 000多个品种。草莓通过匍匐茎营养繁殖，容易造成种质资源圃或育苗地品种混杂。长期以来，人们主要根据形态特征来鉴定区分草莓品种。草莓育种往往集中利用少数优良亲本，遗传基础狭窄，栽培草莓多为八倍体，众多农艺性状为数量性状，且草莓的植物学性状易受环境、栽培、气候等影响，传统的形态学方法常常难以区分相近的草莓品种[1-2]，品种的纯度及品种权保护需要可靠的种质鉴定方法。
近年来，分子生物学技术发展迅速，它具有快捷、简便的特点，极大弥补了传统方法的缺陷，日益成为品种注册登记、品种权保护和解决种苗纠纷的重要依据，涉及到RFLP、RAPD、AFLP及SSR等不同类型的标记[3-6]。RFLP技术多态性表现稳定，但需经酶切、DNA分子杂交、放射自显影等过程，步骤繁琐而费时，而且在草莓种间特别是与栽培品种关系最密切的多倍体种间RFLP多态性很低[7]。RAPD具有快速、简便、多态性丰富的特点，因而已成为至今草莓上研究应用最多的分子标记。但RAPD-PCR技术对试验条件控制要求较高，标记稳定性较差，重复性欠佳，且在八倍体草莓中扩增还存在剂量效应，扩增带的出现与该位点在基因型中的拷贝数有关，给实际应用带来一定困难[2，8]。AFLP多态性丰富可以很好地区分鉴定草莓品种，但AFLP技术对DNA提取质量要求很严格，在草莓不同生长阶段或者不同组织提取的DNA难以获得重复性结果[9]。且八倍体栽培草莓品种多为杂合体，而RAPD和AFLP都非共显性标记，难以检测位点的纯合与杂合[2]。
SSR标记，是一类由几个核苷酸（一般为2~5 bp）为重复单位组成的简单串联重复序列，其重复次数在物种间、品种间甚至个体间具有非常大的变异性，很多作物的研究表明，SSR标记分布于整个基因组，具有数量丰富，等位变异高，共显性，检测简单，结果稳定可靠等优点，得到了广泛应用[10-11]。多倍体草莓中显性标记呈现剂量效应，SSR稳定性好且呈共显性遗传，作为草莓分子标记技术方法更为理想[2]。近年来草莓SSR引物数据不断增加，得到广泛的研究应用。
近年来，国外科研工作者开发了大量的草莓SSR引物，并已应用于遗传多样性分析、指纹图谱构建等方面[1，12-13]。但国内还未见草莓SSR分子标记的研究报道，指纹图谱构建的研究也很少。我们以栽培品种为试材，建立了草莓SSR-PCR反应体系，并利用SSR标记建立了草莓38个欧美品种指纹图谱数据库，以期为鉴定品种，保证品种的真实性和纯度，维护生产者和育种家的利益奠定基础，并为进行草莓种质的指纹图谱鉴定和数据管理提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 供试品种加拿大、因都卡、达赛莱克特、森加拉等38个欧美草莓种质均取自江苏省农业科学院国家果树种质南京桃草莓圃（表1）。
1.1.2 试剂及设备 TaqDNA聚合酶、dNTP等购于MBI Fermentas公司， 常规试剂均为分析纯。PCR反应在德国生产的Biometra T1上进行，离心机使用BACKMAN X-22R。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 参考陈大明等[14]方法，略作修改，提取草莓叶片基因组DNA并进行DNA样品的浓度和纯度的测定，将DNA样品稀释至10 mg・L-1备用。
1.2.2 引物合成 根据参考文献[15-16]，选择了来自草莓属的44对SSR引物，由英骏生命技术有限公司合成（表2）。
1.2.3 SSR-PCR扩增 （1）PCR反应体系。为获得稳定可靠的试验结果，在25 μL反应体系中对各个成分进行优化，以期最终确定PCR的最佳反应体系。（2）PCR反应程序。 94 ℃预变性1 min；94 ℃ 30 s，Ta 30 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环；最后72 ℃延伸7 min，扩增产物4 ℃保存待电泳检测。
1.2.4 PCR产物的检测 采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，电泳后银染染色。 1.2.5 引物筛选及指纹图谱的构建 利用白灯箱观察电泳结果，进行数据统计并拍照。从44对引物中筛选出条带清晰、扩增结果稳定的引物对品种进行试验，根据组合鉴别结果确定核心引物构建指纹图谱。
2 结果与分析
2.1 草莓SSR反应体系的建立
由图1可知，dNTP浓度从0.15～0.4 mmol・L-1 5个浓度梯度中均得到相同扩增产物，但相比之下，当dNTP用量为0.2 mmol・L-1 时，可以得到理想的扩增效果，因此，确定dNTP适宜用量为0.2 mmol・L-1 ；随着引物浓度的增加，扩增条带亮度增加，浓度为0.2 mmol・L-1 时，条带很弱，浓度为0.5 mmol・L-1 时可能是引物过量引起引物与模板非特异性配对增加，浓度在0.3～0.4 mmol・L-1 时，扩增结果条带清晰，基本一致，确定引物适宜用量为0.4 mmol・L-1 ；随着Mg2+浓度的增加，扩增条带逐渐加深，当Mg2+浓度为3.0 mmol・L-1 时，扩增的特异性降低，条带产生弥散现象。选用条带最清晰2.5 mmol・L-1 为适宜浓度。由图2可知，当Taq酶浓度在0.5～1.5 U时，扩增带清晰一致，浓度为2.0、2.5 U时，扩增带有弥散现象，背景模糊，不易观察，故选用1.5 U为适宜浓度。DNA浓度为10、20 ng时，扩增带较浅；浓度为80 ng时，扩增带弥散不清；浓度为40、60 ng时条带清晰，60 ng的条带最为清晰，故确定60 ng为最佳浓度。最终确定25 μL PCR的反应体系中各成分为： 1×Buffer；2.5 mmol・L-1 MgCl2；0.4 μmol・L-1 引物；1.5 U Taq酶；0.2 mmol・L-1 dNTP；60 ng DNA。
2.2 SSR引物的筛选
利用44对SSR引物，对10个随机试验样本进行SSR-PCR扩增分析。44对SSR引物扩增结果的多态性水平有较大差异，条带数最少为3条，最多的达到19条，片段大小为93～298 bp。从中筛选了扩增带型稳定、多态性丰富、重复性较好、带型清晰的P7、 P16、 P18、 P19、 P20、 P22 、P26 、P33、 P34、 P35 10对引物（表3），对38份草莓品种正式进行SSR-PCR扩增分析。
2.3 DNA指纹图谱的构建
从10对引物的扩增结果看，10对引物都能将38份品种区分为几个类型，但单一引物都无法区分所有品种。6、15与27；11与35；13与25；26与31；10对引物扩增结果的带型都相同，无法相互区分开来。根据10对引物扩增的组合鉴别结果，最终确定了P18、P22、P33 、P35 4对SSR引物为本研究的核心引物，进行DNA指纹图谱的构建。
根据引物P18的扩增结果，品种2、14、16、17、23、30、37具有特异性带型，可以与其他品种区分开，品种1、3、6、15、18、27、28、32、34、38带型相同，品种8、9、10、19、24带型相同，品种12、22带型相同，品种4、21、33带型相同，品种5、20带型相同，品种7、29带型相同，品种11、35、36带型相同，13、25带型相同，品种26、31带型相同（图3）。
根据引物P22的扩增结果，品种17具有特异性带，可以与其他品种区分开，品种2、5、11、16、35带型相同，4、8、12、19、22、23、32带型相同，13、25带型相同，9、24、33带型相同，10、36带型相同，1、3、6、7、14、15、18、20、21、26、27、28、29、30、31、34、37、38带型相同（图4）。
根据引物P33的扩增结果，品种37具有特异性带型，可以与其他品种区分开，品种2、3带型相同，品种1、4、6、8、13、15、19、22、23、24、25、27、30、32、33带型相同，品种7、9、16、18、20、29、34、36带型相同，品种5、10、11、12、14、21、26、31、35、38带型相同，品种17、28带型相同（图5）。
根据引物P35的扩增结果，1、2、7、12、34、37具有特异性带型，可以与其他品种区分开，品种3、4、5、9、13、14、16、17、18、19、20、21、23、24、25、33、36带型相同，品种6、15、22、27、28带型相同，品种8、10、11、26、29、30、31、32、35、38带型相同（图6）。
由4个核心引物扩增条带的组合鉴别结果看，6、15与27为一类；11与35为一类；13与25为一类；26与31为一类；其他29个品种都可以根据4个引物的扩增结果相互区分开来，建立有效的指纹图谱。
3 讨 论
从研究SSR-PCR体系的优化过程可知SSR对反应条件要求不严格，各反应成分均具有较大的适宜范围，大多数都能扩增出稳定清晰的带型；在体系优化、引物最初筛选、指纹构建3个过程中，同一引物扩增结果一致，表明SSR标记结果稳定、重复性高。SSR分子标记操作过程经济实用，简单便捷，准确可靠，对试验要求不高。国际植物新品种保护联盟（UPOV）已将SSR标记技术和单核苷酸多态性技术（SNP）推荐为适合构建指纹图谱数据库的两种技术，认为SSR标记技术是目前最为成熟的技术[17]。
RAPD、AFLP、SSR等分子标记手段在国外已成功地用于指纹图谱和品种鉴别[18-20]，我国草莓分子标记方面的研究起步较晚，研究报道不多，主要是利用RAPD和AFLP技术手段进行亲缘关系分析或杂种的鉴定[21-23]，草莓SSR分子标记及指纹图谱构建研究很少。本研究应用SSR技术，初步构建了草莓基因组DNA指纹图谱构建的技术体系，最终利用4对SSR引物能完全区分亲缘关系较近的29个欧美品种，为草莓DNA指纹图谱的构建奠定了基础。SSR标记技术还可以利用多个引物进行多重PCR扩增，这将可以大大节省时间和成本，该技术在国外已有成功报道[1]，本单位将进一步优化建立多重SSR标记技术。
本研究中的欧美草莓品种材料采自国家草莓种质资源圃，最初来源都是国内各单位从国外引入，在草莓引种过程中，由于引种单位不同，或引种地区不同，或最初引种记录不详等原因，造成一些品种名称、来源等资料不详或不准确，存在同物异名和同名异物的情况。在本研究中，维斯托尔、S1和里瓦；加拿大四季和波波拉特卡；加拿大和MSU4359；早光和B2；用筛选的条带清晰多态性好的10对引物都未能区分开来，该结果有可能是因为亲缘关系很近难以区分，亦有可能是因为引种过程中造成的同物异名，这还需筛选更多的SSR引物进一步扩增验证，或结合其他分子标记手段，并根据植株形态特征来进一步验证。
参考文献 References:
[1] GOVANL C L， SIMPSONL D W， JOHNSONL A W， TOBUTTL K R， SARGENT D J. A reliable multiplexed microsatellite set for genotyping Fragaria and its use in a survey of 60 F. × ananassa cultivars[J]. Mol Breeding， 2008， 22（4）: 649-661.
[2] MA Hong-xiang. Review of molecular markers and their application in strawberry[J]. Biotechnology Bul letin， 2006（Supl.）: 184-190.
马鸿翔. 草莓DNA分子标记及其应用[J]. 生物技术通报，2006（增刊）: 184-190.
[3] DEGANIC C， ROWLAND L J， LEVI A， JERZY A， HORYNSKI， GENE J， GALLETTA. DNA fingerprinting of strawberry（Fragaria×ananassa）cultivars using randomly amplified polymorphic DNA（RAPD）markers[J]. Euphytica，1998， 102（2）: 247-253.
[4] KORBIN M， KURAS A， ZURAWICE E. Rruit plant germplasm characterisation using molecular markers generated in RAPD and ISSR-PCR[J] .Cell Mol Biol Lett， 2002，7: 785-794.
[5] MILELLA L，SALUZZI D，LAPELOSA M，BERTINO G，SPADA P， GRECO I，MARTELLI G. Relationships between an Italian strawberry ecotype and its ancestor using RAPD markers[J]. Genet Resour Crop Evol，2006，53: 1715-1720.
[6] TYRKA M， DZIADCZYK P， HORTYNSKI J A. Simplified AFLP procedure as a tool for identification of strawberry cultivars and advanced breeding lines[J]. Euphytica，2002，125: 273-280.
[7] HARRISON R E， LUBY J J， FUNIER G R， HANCOCK J F. Morphological and molecular variation among populations of octoploid Fragaria virginiana and F. chiloensis （Rosaceae） from North America[J]. American Journal of Botany，1997，84: 612-620.
[8] ZHANG Ying-jun. Studies on the relationship of strawberry （Fragaria）by using RAPD[D]. Baoding: Hebei Agricultural University， 2003.
张颖君. 草莓属（Fragaria）植物亲缘关系的RAPD研究[D]. 保定:河北农业大学， 2003.
[9] AMAU G， LALLEMAND J，BOURGOIN M. Fast and reliable strawberry cultivar identification using inter simple sequence repeat （ISSR） amplification[J]. Euphytica， 2002，129: 69-79.
[10] LI Li， WANG Hai-gang， ZHANG Xiao-li， PENG Suo-tang. SSR marker and its application to plant genetics and breeding[J]. Journal of Shanxi Agricultural Sciences， 2008， 36（3）:15-18.
李丽，王海岗，张晓丽， 彭锁堂. SSR分子标记在作物遗传育种中的应用[J]. 山西农业科学，2008， 36（3）: 15-18.
[11] TAN Yue-ping，HUANG Jian-an，LIU Zhong-hua，YIN Zhong. SSR molecular labeling and its application in plant genetic analysis[J]. China tea，2009，31（3）: 7-9.
谭月萍， 黄建安， 刘仲华， 尹钟. SSR分子标记及其在植物遗传分析中的应用[J]. 中国茶叶， 2009，31（3）: 7-9.
[12] HOKANSON K E， SMITH M J， CONOR A M， LUBY J J， HANCOCK J F. Relationships among subspecies of new world octoploid strawberry species，Fragaria virginiana and Fragaria chiloensis， based on simple sequence repeat marker analysis[J]. Canadian Journal of Botany， 2006，84（12）: 1829-1841.
[13] HADONOU A M， SARGENT D J， WILSON F， JAMES C M， SIMPSON D W. Development of mirosatellite markers in Fragaria， their use in genetic diversity analysis， and their potential for genetic linkage mapping[J]. Genome， 2004，47: 429-438.
[14] CHEN Da-ming，ZHANG Shang-long，JIN Yong-feng. A method for genomic DNA preparation of woody fruit crops[J]. Journal of Zhejiang Agricultural University，1997，23（6）: 621-624.
陈大明，张上隆，金勇丰. 一种木本果树基因组DNA提取方法研究[J]. 浙江大学学报，1997，23（6）: 621-624.
[15] BASSLN V，GUNN M， FOLTA K， LEWERS K. Microsatellite markers for Fragaria from Strawberry Festiva expressed sequence tags.Molecular[J]. Ecology Notes，2006（6）: 473-476.
[16] MONFORT A， VILANOVA S， DAVIS T M， ARUS P. A new set of polymorphic simple sequence repeat（SSR） markers from a wild strawberry（Fragaria vesca） are transferable to other diploid Fragaria species and to Fragaria ×ananass[J] . Molecular Ecology Notes，2006（6）:197-200.
[17] GAO Hua. DNA fingerprinting and genetic diversity in apple cultivars[D]. Yangling: Northwest A & F University，2010.
高华. 苹果栽培品种的DNA指纹图谱构建及遗传多样性分析[D]. 杨凌: 西北农林科技大学，2010.
[18] CHERMDA D， ROWLAND L J， JAMES A. A comparison of genetic relationship measures in strawberry （Fragaria×ananassa Duch.） based on AFLPs， RAPDs， and pedigree data[J]. Euphytica， 2001，117: 1-12.
[19] SUAZO， HALL A H. Modification of the AFLP protocol applied to honey bee （Apis mellifera L.） DNA[J]. Biotechniques，1999，26: 704 -709.
[20] MIROSLAW T， PIOTR D， JERZY A. Simplified AFLP procedure as a tool for identification of strawberry cultivars and advanced breeding lines[J]. Euphytica， 2002，125: 273-280.
[21] WANG Zhi-gang，ZHANG Zhi-hong，LI He，GAO Xiu-yan，DU Guo-dong， TAN Chang-hua. Identification of strawberry cultiars by RAPD and SCAR markers[J]. Acta Horticulturae Sinica，2007，34（3）: 591-596.
王志刚，张志宏，李贺，高秀岩，杜国栋，谭昌华. 利用RAPD和SCAR标记鉴定草莓品种[J]. 园艺学报，2007，34（3）: 591-596.
[22] ZHANG Yun-tao， FENG Zhi-guang， LI Tian-zhong， DONG Jing， WANG Gui-xia， ZHANG Kai-chun， HAN Zhen-hai. Genetic relationships of strawberry cultivars by AFLP analysis[J]. Acta Horticulturae Sinica，2006，33 （6）: 1199-1202.
张运涛，冯志广，李天忠，董静，王桂霞，张开春，韩振海. 草莓品种亲缘关系的AFLP分子标记分析[J]. 园艺学报，2006，33 （6）:1199-1202.
