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开篇：写作不仅是一种记录，更是一种创造，它让我们能够捕捉那些稍纵即逝的灵感，将它们永久地定格在纸上。下面是小编精心整理的12篇动物行为学的研究，希望这些内容能成为您创作过程中的良师益友，陪伴您不断探索和进步。
摘 要:目的:以慢性焦虑应激大鼠为载体,探讨其焦虑状态及行为学的变化,旨在探索能较好模拟广泛性焦虑障碍的动物模型。方法:采用慢性情绪应激的方法建立焦虑大鼠模型,以国际公认的高架十字迷宫试验对其行为学进行评价。结果:应激后大鼠处于易激惹的状态,表现出频繁的修饰和攻击行为,经高架十字迷宫测试发现大鼠较少进入并停留于开放臂中,倾向于探究封闭臂,且在封闭臂的停留时间延长。结论:不确定性空瓶刺激作为一种慢性心理应激模型,从病因学上较好模拟了广泛性焦虑障碍的发病状态和行为学表现。
关键词:焦虑模型;行为学;慢性情绪应激;高架十字迷宫
中图分类号:R332 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)04-0711-03
The Changes in Behaviour of Rats with Chronic Stress-induced Anxiety and
Behavioural Evaluation of The Elevated Plus-maze Test System
LI Ning 1,TANG Qisheng2,ZHAO Ruizhen2 , GOU Shengle1
(1. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029,China;
2. The Third Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029,China)
Abstract:Objective:To study the changes in behaviour of rats model with chronic stress-induced anxiety and to explore a appropriate animal model for GAD. Methods:Rats model was established by using chronic emotional stress-induced anxiety method, then researchers observed behavioural changes of model rats and evaluation of elevated plus-maze test system. Results:Rats resceiving emotional stress was in a state of great agitation,who manifested obvious grooming and attacking behaviour.Fewer rats entered and remained in the open arm,and tended to explore and stay in the closed arm.Conclusion:Unpredictable bottle stimulation as a methd of chronic emotional stress better simulated the incidence and manifestation of generalized anxiety disorder from etiology.
Key words:anxiety model; behaviour;chronic emotional stress; elevated plusmaze
收稿日期:2009-11-21
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30772804)
作者简介:李宁(1980-),女,河南许昌人,博士研究生,研究方向:中医药防治脑血管疾病。
通讯作者:唐启盛(1956-),男,黑龙江人,教授,博士研究生导师,研究方向:中医药防治脑血管。
广泛性焦虑障碍(generalized anxiety disorder,GAD)是以过度和持续性焦虑或反复发作的惊恐不安为主要特征的神经症,常伴有植物神经系统症状和运动性紧张。随着临床和基础实验研究的不断深入与完善,人们对于本病也有了较为系统而全面的认识。现代医学研究表明,其发病涉及生物、心理、社会等诸多方面的因素,但确切的病因和发病机制至今尚未彻底阐明。焦虑动物模型作为基础实验研究的平台与载体,在探索焦虑障碍的病因、发病机制以及新药研发等方面发挥着重要作用。因此,选择公认、稳定、重复性好、能反映复杂发病状态的动物模型是深入开展该疾病研究的关键环节。本研究采用慢性情绪应激的方法建立焦虑大鼠模型,观察应激前后自身行为学的变化,且通过国际公认的高架十字迷宫试验对其焦虑状态进行测试与评价,旨在为广泛性焦虑障碍的研究提供较好的动物模型。
1 材 料
1.1 实验动物
健康Wistar雄性大鼠20只,SPF级,2～3月龄,体重(200±10)g。由中国医学科学院实验动物研究所购买,合格证号:SCXK(京)2005-0013。动物购进后预养1周内自由摄食饮水。光照节律12L/12D(6∶00～18∶00),室温(20±2)℃,相对湿度为50%～60%,保持安静。
1.2 行为学测试仪器
高架十字迷宫采用国际通用的方法制作[1],由安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司生产。
2 方 法
2.1 动物分组和焦虑模型的建立
大鼠经1周适应期后随机分为正常组、模型组,每组10只。除正常组外,模型组单笼饲养且接受不确定性空瓶饮水刺激建立焦虑应激模型[2] 。具体方法如下:定时喂水训练7天,即每天早9∶00～9∶10和晚21∶00～21∶10给动物饮水10min,其余时间撤去水瓶不给水。定时喂水期结束后开始应激实验,在上述两个时间段内给予不确定空瓶刺激,维持1天1次或1天2次,持续2周。正常组不接受任何处理,自由饮水和摄食。所有动物在应激结束后进行高架十字迷宫行为学测定,两组交叉进行。动物均提前2h进入测试实验室适应环境。
2.2 行为学观察
行为学观察包括攻击(咬或攻击空瓶和笼子)、探究(前后左右运动和光顾水瓶所在位置)及修饰行为(梳理皮毛和洗脸)。具体方法是将空瓶应激的10min等分10个时间段,在每个时间段内记录每只大鼠上述3种行为,行为出现即为1,否则为0.10min内观察的总分为0～10之间。得分基于2 名观察者的观察结果平均而得,其中一人为双盲控制。14个观察日的前3天和最后3天的平均分用于统计分析。
2.3 行为学测试
实验室内光线昏暗(以1.5m 距离处能区分大鼠细微活动的最低亮度为准)并保持恒亮,室温21℃,安静。测试箱放置于实验室一角,周围布以2m 高黑色单调背景。实验过程中只有一名参与日常处理的人员搬运动物。
迷宫测试前将每只大鼠放入一个60cm×60cm×35cm塑料盒中,任其自由探究5min后迅速置于EPM 的中央平台处使其头部正对其中一个开放臂,释放后即开始记录下述指标: ①进入开放臂次数(open arm entry,OE):进入到任一开放臂的次数,以大鼠4个爪子均进入到臂内为准,中途一个爪子从该臂中完全退出则为该次进入活动完成; ②进入开放臂时间(open arm time,OT):进入开放臂的时间,单位:秒; ③进入封闭臂次数(close arm entry,CE):进入任一封闭臂的次数,以大鼠4个爪子均进入到臂内为准;④进入封闭臂时间(close arm time,CT):进入封闭臂的时间,单位:秒;⑤向下探究次数(head-dipping,HD):大鼠置身于中央平台或开放臂时,一边用前爪握住迷宫边缘一边把头部和肩部伸出开放臂的边缘向迷宫下面探究的行为次数; ⑥封闭臂后腿直立次数(rearing,RR):大鼠在封闭臂前腿抬起以后腿支持使身体竖立的次数。
由①～④分别计算出:①进入开放臂和封闭臂的总次数(OE+CE):表示大鼠的运动活力;②进入开放臂次数比例(OE%):即开放臂进入次数/(OE+CE)×100%;③开放臂停留时间比例(OT%),即开放臂停留时间/(OT+CT)×100%,每只大鼠测试5min。
2.4 数据的统计分析
各组数据用均数±标准差(±s)表示。数据处理采用SPSS 15.0统计软件分析处理,两组间均数比较采用独立样本t检验。以P
3 结 果
3.1 模型组大鼠行为学的变化
如表1所示,空瓶应激期间,模型组大鼠14个观察日的前3天和最后3天相比,探究行为无明显差异(P>005),修饰行为增多(P
表1 模型组14个观察日前3天和最后
3天空瓶应激时行为变化的比较(n=10,±s)
组别探究行为修饰行为攻击行为
起始3天5.22±0.973.22±1.121.29±0.96
最后3天4.64±1.065.58±1.076.08±1.35注:n为动物只数;与起始3天比较,P
3.2 大鼠EPM测试结果
如表2所示,因正常组不施加任何干预因素,故与模型组相比OE+CE、OE%、OT%、head-dipping明显减少,差异明显(P
表2 各组大鼠EPM测试行为学的比较( n=10,±s)
组别OE+CE/次 OE/%OT/%HD/次RR/次
正常组 11.70±1.4934.78±5.89 35.19±4.1514.70±1.9412.50±1.81
模型组8.40±1.7814.42±4.2817.17±6.799.10±1.7913.40±2.17注:n为动物只数;与正常组比较,P
4 讨 论
现代研究发现,应激和焦虑是密切相关的现象,大多数焦虑症患者都曾经历过严重的心理应激事件,因此应激事件可以成为焦虑症发病的原因和诱因[3]。本研究采用不确定性空瓶刺激建立慢性应激焦虑大鼠模型,发现经过几次固定时间的饮水学习之后,在饮水期间给予动物空瓶,能够诱发动物出现攻击,撕咬瓶子和笼子,频繁修饰等焦虑行为。此外,模型组大鼠表现出易激惹的状态,与临床中焦虑症患者的易激惹表现相似。
高架十字迷宫试验(EPM)既可以建立焦虑应激的模型也是国际上公认的经典测量焦虑反应的方法[1-4]。其原理是利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧心理,形成动物的矛盾冲突来考察大鼠的焦虑状态。EPM测试的项目中,焦虑动物的OE%和OT%会明显降低,经典抗焦虑药物则使两者升高,OE+CE反映了动物的运动活性。本研究发现模型组大鼠的OE%和OT%显著下降,运动活性也降低。HD反映了动物在非保护区内的探索行为,代表动物对陌生环境的好奇探究或因恐惧而寻求逃避,与焦虑程度有一定相关性,本研究中空瓶应激后的大鼠HD行为减少;RR可用来观察药物有无镇静作用及镇静强度。上述结果证实,慢性应激后的大鼠明显处于焦虑状态,说明慢性焦虑应激大鼠模型的制备成功,且通过量化的标准客观反映出大鼠的焦虑程度。
GAD作为焦虑症的临床亚型,多呈慢性病程且易复发,症状反复迁延,并与许多躯体疾病相关联,相当比例的患者还共病抑郁和其他精神障碍类疾病,患者不仅存在难以忍受而又无法摆脱的精神痛苦,严重者可导致社会功能受损,甚至出现自杀,给个人家庭和社会造成严重的经济和精神负担。焦虑动物模型作为焦虑症基础研究的载体,在探索其发病机制、新药研发及临床前评估的研究中发挥着重要作用,但目前尚缺乏针对GAD的动物模型。基于此,本研究从病因学的角度出发,建立慢性焦虑情绪应激的动物模型,通过其自身行为学的变化和EPM测试即横向和纵向的比较来评价该模型的可行性和有效性。虽然动物的情绪变化远不如人类丰富,动物身上也较难准确模拟人类发病的心境。但是,他们也存在并非单一的情绪变化,有些情绪变化如焦虑、愤怒、恐惧等与人类存在相似性,在情绪变化时同样也存在行为学和复杂的神经内分泌变化[5-6]。本研究结果提示:不确定性空瓶刺激作为一种慢性心理应激模型,能诱导动物出现明显的焦虑行为,从病因学上较好模拟了GAD的发病状态,与现有的焦虑应激模型相比,该模型在很大程度上避免了掺杂物理(躯体)性应激成分,是一种相对“纯粹”的心理应激模型。本课题组将在此行为学研究的基础上,进一步开展焦虑症神经生物学方面的探索性研究。
参考文献
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[关键词] 二至百合浓缩膏；抗焦虑；雌性大鼠；去势；高架十字迷宫；明暗箱
[中图分类号] R363 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）12-20-03
更年期综合征是妇女在这一时期由于雌激素水平下降所致的以机体内分泌失调、植物神经系统功能紊乱为主，伴有神经心理症状的一组症候群。二至百合组方中包含女贞子、旱莲草、百合、知母、牡蛎等中药组成成分，具有滋阴潜阳，退热安神之功效。主要用于妇女更年期初期，证见阴虚阳亢，阴虚发热，骨蒸潮热，焦虑烦躁，失眠多梦者。本实验通过雌性大鼠双侧卵巢祛除术复制大鼠更年期综合征模型，观察二至百合方对模型大鼠焦虑行为学指标的影响，初步评价药物的改善更年期焦虑作用。
1 资料与方法
1.1 药品及试剂
二至百合浓缩膏，北京中研同仁堂医药研发有限公司（批号20120902）。
1.2 实验动物
Wistar大鼠，75只，雌性，体重（200±20）g，SPF级，购自中国人民军事科学院实验动物中心。许可证编号：SCXK-（军）2007-004。
1.3 仪器
海尔BCD-257SL冷藏冷冻冰箱：青岛海尔股份有限公司；Sartorious BT 124S电子精密天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；明暗穿梭箱、高架十字迷宫、高架十字迷宫实验视频分析系统、SLY-ETS小动物行为活动记录分析系统，均由北京硕林苑科技有限公司生产。
1.4 方法
1.4.1 动物模型制备与分组 在适应性饲养5 d后，将75只大鼠随机分为5组，分别为：假手术空白组，模型组，二至百合高剂量（1.92 g浓缩膏/kg）、中剂量（0.96 g浓缩膏/kg）、低剂量（0.48 g浓缩膏/kg）组，每组15只。
模型组及受试样品3个剂量组制备雌性去势大鼠（双侧卵巢切除术）模型[1-2]：大鼠0.1%戊巴比妥钠0.5 mL/100 g体重（50 mg/kg）腹腔注射麻醉。麻醉大鼠取俯卧位，在背部中1/3处剪毛、备皮，碘伏常规消毒。自腰椎沿背部正中线向下做纵行切口约2～3 cm，切开皮肤，沿肩胛线分别于左右两肋下剪开腰肌，暴露出卵巢及紧密相连的子宫，在子宫角上做两个结扎，结扎后切断，将卵巢摘除，缝合皮肤。术后连续腹腔注射72万U/kg青霉素，以防感染，1次/d，连续3 d。术后第3天开始给大鼠阴道涂片观察，连续5 d，每天1次，以确定卵巢完全切除。实验动物从术后的第5天起全部进入动情间期，但动物不再出现动情前期，动情期的雌激素变化，动物基本上符合“更年期”表现。假手术空白组大鼠除不行卵巢摘除外，其余步骤同模型组。
造模后9 d，除假手术空白组和模型组给予等体积蒸馏水外，其余各组开始灌胃给药，每日1次，连续45 d后分别进行高架十字迷宫和明暗箱行为学实验测试（先开展高架十字迷宫实验，其后间隔1周后开展明暗箱实验）。
1.4.2 大鼠高架十字迷宫实验 末次给药30 min后，进行高架十字迷宫行为学的测评。实验开始时，将大鼠放入高架十字迷宫中央，头朝开臂，观察5 min内大鼠的活动情况[3-5]。观察并记录以下各项指标：进入开臂次数，进入闭臂次数，以及在两臂的滞留时间。分别计算大鼠进入开臂的时间占总时间（开臂和闭臂滞留的时间之和）的百分比（open arm time percent，OT%），以及大鼠进入开臂的次数占总次数（开臂与闭臂之和）的百分比（open arm entry percent，OE%）。观察时以大鼠四爪均进入开臂或闭臂为准。
1.4.3 大鼠明暗箱实验 末次给药30 min后，将大鼠置于明箱中央，背朝通道，观察5 min内大鼠的活动情况并记录明暗箱停留时间和穿箱次数。
以上两种行为学检测实验操作时，应保持外界环境安静，每次放入大鼠前清理干净箱内的排泄物，尽可能保证每批次检测的客观性。
1.5 统计学处理
采用SPSS13.0统计软件进行统计处理，数据以（）表示，数据先进行方差齐性检验。方差齐选用One-Way ANOVA法进行各组间比较；方差不齐选用t检验进行组间比较。
2 结果
2.1 二至百合浓缩膏对去势大鼠高架十字迷宫行为活动的影响
实验结果显示，模型组组大鼠与假手术空白组比较，OE%和OT%显著减小（均P
2.2 二至百合浓缩膏对去势大鼠明暗箱穿梭行为的影响
研究结果显示，模型组大鼠明箱停留时间和穿箱次数均显著降低，与假手术空白组比较差异有统计学意义（分别P
3 讨论
更年期综合征[6]属于中医学“绝经前后诸症”范畴，历代文献关于本病的论述散见于“脏躁”“心悸”“失眠”“眩晕”“头痛”“郁证”等病症中。绝经前后肾脏虚损，肾气渐衰，耗伤，阴阳平衡失调，脏腑功能紊乱而出现绝经前后诸症证候[7]。随着我国人口结构不断老龄化和社会竞争日益激烈，不良的工作环境、家庭关系紧张及精神等因素影响，妇女进入更年期逐渐增加、年龄提早，从而使更年期焦虑症的发病率亦明显增加[8]。因此治疗和缓解更年期综合征焦虑症具有重要的社会意义。
二至百合方由经典方剂“二至丸”和“百合知母汤”合方加减而成，具有滋阴潜阳，退热安神之功效。本研究主要通过雌性大鼠卵巢祛除术复制大鼠更年期综合征模型，进而采用高架十字迷宫和明暗箱实验观察二至百合方对模型大鼠焦虑行为学的影响，评价处方的改善更年期综合征焦虑作用。
高架十字迷宫模型，为抗焦虑研究中公认的非条件反射模型，是抗焦虑研究中应用最广泛的模型之一[9]。它利用动物对新异环境的探究特性相对高悬敞开臂的恐惧心理，形成动物的矛盾行为，进入开放臂的百分数（OE%）和在开放臂停留时间的百分数（OT%）反映的是动物趋近规避冲突的结果，与焦虑程度直接相关。通常抗焦虑药只增加动物对开放臂的探索，使OE%和OT%上升。开放臂和封闭臂总进入次数反映了动物总的运动能力，可用来观察药物有无镇静作用及镇静强度。被保护区的活动性一定程度上与抗焦虑剂的效应相关[10]焦虑动物的OE%和OT%明显降低，经典抗焦虑药物则使两者升高[11]；明暗箱行为实验[12-13]中，明箱活动时间越长，探洞和穿梭次数越多，反映实验动物对新环境的探索欲望水平越高，探索欲越强则代表环境适应能力越强，焦虑水平越低。
本实验以去势大鼠造成更年期模型，考虑动物行为检测的个体差异可能比较大，所以本实验选用了较为经典的2种焦虑行为检测方法进行二至百合胶囊的抗焦虑实验。本研究表明，高架十字迷宫实验中，与假手术空白组比较，去势大鼠进入开闭时间和次数的百分率显著下降，在明暗箱实验中，与假手术空白对照组比较，去势大鼠在明箱停留时间明显缩短，穿箱次数明显减少。由此提示，去势动物处于焦虑状态。高架十字迷宫实验中，二至百合浓缩膏3个剂量组均可增加去势大鼠OE%和OT%值，与模型组比较，中剂量组OE%和OT%值有明显的统计学意义（P
根据相关文献报道含有百合[14-15]、知母[16-17]等药物组方在临床上对更年期综合征具有明显治疗作用，有实验表明含有女贞子[18]的复方药物连续灌胃可明显降低更年期大鼠血清促性腺激素FSH含量，对血清E2含量有显著增加作用，使更年期阴虚内热、烦躁不安、失眠等症状得以缓解。
本实验研究结果表明二至百合方对更年期焦虑症状有明显改善，对更年期综合征有一定的缓解作用，但是二至百合方改善更年期综合征模型大鼠焦虑行为学的作用机理有待进一步深入研究。
[参考文献]
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现在动物行为的研究在我国正处于起步阶段，研究的内容主要为描述性，在理论研究方面，在研究的广度和深度方面，仍与国外存在着较大的差距。
而作为21世纪生物科学专业的一员，更有必要学好这门学科，为我国动物行为方面的研究做出自己的贡献。出于对这个大千世界的好奇，我选择了动物行为生态学这门学科，在老师的带领下，我眼界变得开阔了，我也重新认识了这个世界，感受到了大自然的和谐，重新认识到了自己在这个大千世界中的价值。
在老师的推荐之下我阅读了《小鸟的大道理》这篇短小却饱含动物之间哲理的文章，它不是作家创造出来的世界，它不同于一般的文章，它是最基本的事实！是戴维斯生活的每一天每一夜，是独自的，安静的，几乎与世隔绝的寂寞与艰辛，更是展示给我们的精华。
戴维斯一个将自己的精力放在小鸟身上的伟大科学家，在小鸟的繁殖季节里他几乎每天都要去拜访他们，比如像篱雀这种样子很像麻雀，羽毛颜色黯淡，看上去很单调的不起眼的小鸟，在戴维斯的眼中，它的生活可是一点也不谦逊、正派。
他描述道：
“一对篱雀在一起觅食，安详地跳进树丛中。到那里以后，雄鸟跑到一边，雌鸟去了另一边。一旦出了雄鸟的视线，雌鸟立即飞进附近的矮树丛里，和藏在那里的另一只雄鸟。过后她立即和配偶会合，做出好像什么都没有发生过的样子。”
虽然鸟类常常被当情的象征，天鹅、爱情鸟、鸳鸯这些美丽的鸟儿也经常成为诗人讴歌的对象，但是它们的相亲相爱显然不是出于感情，而只是为了传播基因。它们的生活被达尔文法则决定了：留下尽可能多的后代。雌、雄为此走在了一起，但是它们的利益并不总是一致的，其生理特征导致了它们的目标有所差异：雄性是要尽可能多地播种，雌性则是要尽可能多地养育自己的后代。对雌性来说，对自己最有利的婚姻形式是一妻多夫制，其次是一夫一妻制，第三是一夫多妻制。对雄性来说，则倒了过来，最好的形式是一夫多妻制，其次是一夫一妻制，第三是一妻多夫制。
雌性和雄性在长期进化过程中相互博弈的结果，让大多数鸟类都采用了一夫一妻制，这样做似乎对雌雄双方都很公平。但是篱雀这种外表单调的小鸟却有着最丰富的婚姻形式：一夫一妻制、一夫多妻制、一妻多夫制都存在着，还普遍存在多夫多妻制。
戴维斯发现，那些表面上是一夫一妻制的家庭，雌鸟通常也会主动勾引第三者来，这么做会鼓励第三者为雌鸟的后代提供食物。而雌鸟的原配一旦发觉，会尽力把第三者赶走。根据达尔文法则，第三者应该根据是否与雌鸟成功地来决定要不要为雌鸟的后代服务。如果成功，雌鸟的后代中有可能有第三者的种，第三者去帮忙才会增加自己的基因传播的机会，不然就是在做无偿服务了。
篱雀多姿多彩的家庭生活，其实是两性既合作又冲突的结果，双方都想利用对方来为自己留下尽可能多的后代。这个适用于所有有性生殖的生物的道理，却由一种不起眼的小鸟如此鲜明地证明了。
求偶是动物繁衍的前奏，也是动物种群自我选育、优育的基础。是一方动物向另一方动物炫耀各种信号或做出各种动作的行为方式。求偶行为对保护种群的优良素质，更好地适应自然环境，具有重要的意义，主要表现在以下几点。
（1）每种动物的求偶行为都有物种的特异性，即使是很相近的物种也有细微的差异，这可以避免不同动物的种间杂交。种间杂交在相近物种之间也有时发生，如马和驴杂交生骡，狮和虎也能杂交产仔，但这种情况大多是发生在人工喂养的特殊环境下。
（2）求偶行为使雌雄双方有更多选择机会，使后代获得良好的遗传基因组合。求偶不成的，常常是群体中的弱者。例如鹿科动物，雄性为争夺配偶而斗殴，失败的弱者，多为幼小刚成年或年老体衰者、瘦弱有病者，它们不被雌鹿选中，对物种的繁衍有利。现在就来看看各类动物表现在求偶上的不同现象：
鱼类
很多人肯定都看过电影《海底总动员》，里面奇妙而美丽的世界，色彩斑斓的鱼的色彩，稀奇古怪的鱼的样子。里面我最喜欢的要数小丑鱼了，哈哈。 鱼的求偶有很多种，其中最为精妙杰出的求偶炫耀行为可能是座头鲸的歌声了，每只座头鲸 ，都唱着它们自己的特殊歌曲，这种歌由一系列的长音符组成，而且能不停的重复演唱下去。它们的歌声嘹亮，旋律美妙，以此来吸引异性的注意。
爬行动物
在我看来蛇是很讨厌的动物，我最害怕也最不喜欢。可它们的求偶却也比较好玩。譬如：
1、响尾蛇一旦坠入爱河，它们就会如胶似膝很难再分开，感情深厚吧。
2、罗河雄鳄在期喜欢守护着一段河堤，并大声吼叫，严防其他鳄鱼的闯入。雌鳄听到叫声后就会前来相会。雄鳄就会兴奋的摇头摆尾，并将水从鼻孔射向天空。
鸟类
鸟的求偶行为多种多样
1、孔雀的羽毛很漂亮，但这只是雄孔雀的毛。雌孔雀有点象个丑姑娘，但美丽的雄孔雀还是喜欢追求她们。雄孔雀在求偶时会展开羽毛，变成一把金光闪闪的扇子，在高兴的时候还会发出嘎嘎的响声。
2、雄鹤是最深情的求爱者。它们在求偶过程中会用美妙的舞蹈去打动雌鹤。它们一边上下摆头，快速拍动双翅，突然奔走和停止。舞蹈中的鹤如痴如醉，并常常神魂颠倒的凝视对方。
其他如燕鸥喜欢在求偶时送彩礼；啄木鸟在求爱时通过有节奏的敲打树干，发出爱情电报；信天翁求爱时非常有礼貌，经常以不断弯腰向对方示爱，有趣吧！
哺乳动物
1、大熊猫
一只的雌熊猫，往往会引发数只雄性大熊猫的争斗。最后最厉害的大熊猫将得到雌熊猫，并与之携手而归。
2、大象
处于期的大象总是通过激烈的搏斗来赢得雌大象。大象搏斗的时候用象牙做武器，庞大的身躯互相抵触，扇动着大耳朵，并发出大声的吼叫，直至一方落败。
3、骆驼
骆驼是沙漠之舟。它们为了争夺妻子，常常失去了平时的温和，变得异常凶猛。两只公骆驼在打斗的时候，往往把对方摔倒在地上，并咬住对方的脖子。
【关键词】间充质干细胞；底蜕膜；神经保护；帕金森病
中图分类号：R742.5；R457.7文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2016.05.001
【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of human placental decidua basalisderived mesenchymal stem cells（hPDBMSCs） striatum transplantation in the treatment of Parkinson’s disease（PD） on rat models.MethodshPDBMSCs were cultured in vitro.PD rat models were prepared by 6OHDA and divided into transplantation group，sham operation group and model group.HPDBMSCs transplantation was performed on the right striatum of the transplantation group，and behavioral detection was carried out 1W，2W and 4W after operation.Immunohistochemical method was used to detect expression of tyrosine hydroxylase （TH） in wounded sides among all the groups 1W，2W and 4W after transplantation.Results2W and 4W after transplantation，mean rotational circle induced by apomorphine（APO） in the transplantation group were lower than those in the sham operation group and the model group（P
【Key words】mesenchymal stem cells；decidua basalis；neuroprotection；PD
帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）是一种较为常见的中老年人神经系统退行性疾病。目前临床上尚无有效方法延缓疾病的进展。随着干细胞技术的发展，研究人员开始探索通过细胞移植来延缓或抑制中脑黑质部多巴胺能神经元的凋亡，从而恢复神经环路中多巴胺递质的水平治疗PD。目前已有研究表明骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）移植能够改善帕金森病模型大鼠的行为学症状。人胎盘底蜕膜间充质干细胞（human placental decidua basalisderived mesenchymal stem cells，hPDBMSCs）具有和骨髓间充质干细胞相似的形态学、免疫表型和功能特点[1]。因而，本实验拟通过对PD大鼠纹状体进行hPDBMSCs移植，探讨人胎盘底蜕膜间充质干细胞移植对PD模型大鼠的行为学的影响。
1Y料与方法1.1材料
1.1.1实验动物实验中所用大鼠均为SPF级SD大鼠，雌雄各半，共100只，体重180～220 g，8～12周龄，由广西医科大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK桂2003-0005）。
分组1移植前1移植后1 W12 W14 W移植组111.1±1.8110.3±1.718.8±1.6ab15.8±1.4ab假手术组110.8±1.5111.2±1.4110.9±1.7111.1±2.0模型组111.3±1.7111.2±1.5110.8±2.0110.9±1.6F10.4112.0518.02157.19P10.66710.13910.00091
2.3TH免疫组化染色结果通过TH免疫组化实验我们发现（见表2、图2）：模型组与假手术组手术前后脑黑质部位损伤侧与健侧阳性细胞百分比差异无统计学意义（P>0.05）。移植组中，术后2 W及4 W损伤侧阳性细胞数与健侧阳性数相比明显增加，差异均有统计学意义（P
表2各组大鼠黑质不同观察点TH表达（n=6，%，±s）
分组1移植前1移植后1 W12 W14 W移植组122.1±1.7128.6±1.8ab132.5±2.0ab143.2±1.9ab假手术组121.5±1.4121.6±1.3121.8±1.5120.9±1.4模型组121.7±1.6122.1±1.2121.7±1.6120.8±1.5F10.23143.09178.711383.27P10.8001
A：假手术组1 W时TH表达；B：假手术组2 W时TH表达；C：假手术组4 W时TH表达；D：移植组1 W时TH表达；E：移植组2W时TH表达；F：移植组4 W时TH表达。
3讨论据统计，帕金森病在60岁以上人群中，其发病率超过1%，是中老年人常见的致残疾患之一[3]。现有研究认为，PD的主要病变部位在中脑黑质部以及纹状体区域，主要病理改变是中脑黑质致密部多巴胺能神经元选择性凋亡，使黑质纹状体通路DA释放减少，从而导致基底节神经调节功能的紊乱[4]。若能将合成和分泌多巴胺的细胞移植入黑质纹状体系统，替代已死亡的多巴胺细胞，从理论上讲是最为理想的治疗措施。正因如此，干细胞移植治疗帕金森病被广泛研究。间充质干细胞被认为是一种理想的种子细胞，主要获取来源为骨髓、脂肪、羊膜、脐带等。骨髓是间充质干细胞的最初来源，然而研究发现，骨髓中间充质干细胞含量低，且在衰老或疾病状态下，骨髓间充质干细胞数量及增殖分化能力将进一步下降[5]。此外，目前虽然多数研究表明骨髓间充质干细胞治疗能够延缓PD模型大鼠中脑黑质部位多巴胺能神经元凋亡，从而改善其症状[6]。然而，也有学者发现同种异体骨髓MSC移植后移植灶周围可见明显的免疫反应，并不能阻碍中脑黑质多巴胺能神经元的减少和改善模型鼠的行为学症状[7]。但与BMMSCs相比，hPDBMSCs来源更为丰富，获取方便，培养条件低，体外扩增能力强。研究发现，hPDBMSCs能够表达胚胎干细胞的一些标记物，如SSEA4、TRA160以及TRA181[8]。经传代培养数十次后hPDBMSCs仍维持原有的细胞表型，并具有较强的增殖分化能力[1]，此外，有研究表明，胎盘来源的MSC具有免疫调节作用，且这种效应与MSC的细胞数量呈正相关，无同源性限制[9]。这些结果表明，hPDBMSCs可能是一种更为原始的MSCs，有可能是一种较为理想的移植细胞来源。在本实验中，我们发现，hPDBMSCs作为一种新的间充质干细胞来源，同样能够改善PD大鼠的症状，减少多巴胺能神经元的凋亡。
移植途径是干细胞移植治疗中值得关注的问题，移植后的效果以及移植成功与否在一定程度上取Q于移植途径的正确选择。对于帕金森病而言，细胞移植存在多种移植途径，包括黑质移植、纹状体移植、脑室内移植、静脉移植等。至于何种移植方法更为有效，尚无明确定论。但有学者通过研究发现，在BMMSCs中，纹状体移植效果优于脑室内移植及静脉移植[10]，PD模型大鼠行为学症状改善更为明显。在既往研究中，我们发现，hPDBMSCs静脉移植后PD模型大鼠的行为学症状可以得到改善[11]。但通过对比分析，我们发现采用纹状体移植后，大鼠行为学症状改善更为明显。这些结果提示，纹状体移植可能是一种更为有效的移植方式，这与既往一些学者的研究结果相符[10，12]。此外，我们还发现，细胞移植2周后，大鼠黑质部位TH阳性细胞数量增多。这些数据表明在PD大鼠模型中，hPDBMSCs能够通过某些机制分化为多巴胺能神经元替代受损的多巴胺能神经元，或者抑制多巴胺能神经元的凋亡。
综上所述， hPDBMSCs作为一种新的间充质干细胞来源，通过纹状体移植能够更为有效地延缓多巴胺能神经元的凋亡或者替代受损多巴胺能神经元，改善PD模型大鼠的症状。但其具体机制仍有待进一步研究。参考文献[1]Lu GH，Wang SY，Xu ZM，et al.Human placental decidua basalis-derived mesenchymal stem cells differentiate into dopamine neuron-like cells with no response to longterm culture in vitro[J].Neuroreport，2012，23（8）：513518.
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【关键词】 益智宁神口服液/药理学;抽动—秽语综合征/中药疗法;神经递质;疾病模型，动物;大鼠;色谱法，高压液相
抽动—秽语综合征(Tourette syndrome，TS)，又称多发性抽动症，是一种儿童期发病的慢性神经精神障碍性疾病。临床表现主要为突然、快速、反复、非节律性、不自主和刻板的运动性抽动和发声性抽动，还可能伴有各种行为紊乱、强迫观念与行为、认知障碍等，可不同程度地干扰和损害儿童的认知功能，影响社会适应能力。本病病因尚未明确，具有明显的遗传倾向，多见于4～12岁的儿童，患病率约为005%～3%，近年来发病呈明显上升趋势，男孩多于女孩[1]。广东省中医院儿科在临床实践中运用自拟方益智宁神口服液治疗该病，取得了较好的疗效[2]。本实验应用亚氨基二丙腈腹腔注射建立抽动—秽语综合征模型大鼠，观察该药对模型大鼠行为学和神经生物学的影响，现报道如下。
1材料与方法
11实验动物SPF级SD大鼠60只，28～30d龄，体质量(250±10)g，雌雄各半。由广东省医学实验动物中心提供(许可证号:粤监证字2008D006，批号：0037766)。
12实验药品亚氨基二丙腈(iminodipropionitrile，IDPN)购自Alfa Aesar公司(批号：C7323A)，中药益智宁神口服液(由广东省中医院提供，批号：080201)，对照药物为氟哌啶醇(上海信谊九福药业有限公司，批号：08031121)。
13仪器及试剂LC26A 型高效液相色谱仪、SPD26AV 荧光检测器、C2R4A 数据处理机均为日本岛津公司产品，脱水机、包埋机、切片机和生物显微镜等设备为德国Leica公司产品，微量组织匀浆器为Millipore公司产品，ZH蓝星C/s型脑立体定位仪，高氯酸、乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2)均为分析纯，甲醇为色谱纯，对照品由中国药品生物制品所提供。
14模型复制参考Wakata[3]的方法，将亚氨基二丙腈溶解于生理盐水，稀释成浓度100mg/mL，给药途径为腹腔注射，剂量为150mg·kg-1·d-1，每天1次，共用7d。
15分组及给药选用SD大鼠随机分为4组：空白组和模型组各10只，中药组和西药组各20只，每组均雌雄各半。治疗组在造模后第2天开始给药，中药组按20kg的儿童每天口服20mL益智宁神口服液的比例计算，每只大鼠灌胃约2mL/d;西药组按20kg的儿童每天口服氟哌啶醇片1mg的比例计算，每只大鼠灌胃约015mg/d，连续14d。
16大鼠行为观察[4]采用观察评分，每次至少观察1h，主要诱发症状为运动行为和刻板运动。(1)运动行为评分：0分：安静或正常活动;1分：能过度兴奋;2分：探究行为增加;3分：跑;4分：跑和跳;(2)刻板运动(或定型运动)评分：0分：无刻板运动;1分：旋转行为;2分：头和颈部的上下运动过多;3分：头、颈部的上下运动过多加旋转行为;4分：头向侧摆合并头和颈部的上下运动过多。
17神经递质水平检测[5]第14天将所有实验大鼠迅速断头处死，借助脑立体定位仪，取右脑海马组织及边缘系统(包括纹状体、隔核、层壳核、基底节、齿状回)，精确称质量，置入1mL处理液(含01mol/L高氯酸和05g/LEDTANa2)中，微量组织匀浆器冰溶下匀浆，4℃冰冻离心10000r/min，取上清液置入-20℃保存。采用高效液相色谱法测定多巴胺(DA)和去甲肾上腺素(NE)浓度。测样时，室温下解冻，进样20μL，以峰面积外标法定量。
18统计学方法采用SPSS130和SAS913版本进行统计学处理和分析，各组神经递质水平检测数据分别进行方差齐性和正态分布检验，方差不齐采用秩和检验，检验水平α=005。
2结果
21各组行为学观察和评分各组治疗前后运动行为和刻板运动积分见表1。模型组行为学评分与空白组比较，差异有显著性意义(P
治疗14d后，中、西药组运动行为积分和刻板运动积分降低，与模型组比较差异有显著性意义(P
22各组治疗前后脑组织DA、NE含量变化比较表2结果显示：模型组脑组织DA水平降低，NE水平升高，与空白组比较差异均有显著性意义(P
3讨论
IDPN是一种中枢神经毒素，50年代以后就用于神经病理学的研究，本研究参考Wakata[3]的方法复制模型，从神经生物学和行为学两方面观察药物治疗对TS模型动物临床行为学典型特征的影响。IDPN诱发TS模型大鼠出现明显刻板运动和运动行为异常，如过度兴奋、探究行为、异常跑跳、旋转行为和头颈部上下侧摆等动作均具有TS临床行为学的典型特征，有时出现连续的嗤鼻、抬举上肢等动作，类似于人类TS患儿喉部发声、耸肩等特征行为。本研究通过对药物治疗前后TS模型大鼠运动行为和刻板运动行为评分的比较，发现中药组在改善动物TS典型特征行为方面效果明显，如头部、颈部的抽动减轻，旋转行为明显缓解，每次异常行为发作持续时间缩短，异常抽动次数消失，异常跑动及不规律的弹跳运动明显减少。
虽然目前对TS的神经生物学物质基础还未完全阐明，但基本认为中枢神经递质，特别是DA、NE、5-羟色胺(5HT)等与TS之间关系密切[5]，因此，探讨大脑多巴胺类神经递质及其代谢产物的水平是证明药物神经生物学疗效的主要依据。本研究对大脑海马区DA和NE水平进行测定，结果表明：治疗后中药组DA水平明显升高，而NE水平有所下降，均趋向于正常水平。与TS有关的神经递质包括乙酰胆碱、肾上腺素、5HT、多巴胺等，主要分布于纹状体、隔区、蓝斑、黑质等海马、基底前脑及边缘系统，构成复杂的神经网络[6-8]。有关药物治疗对大脑组织不同部位和核团神经递质水平的影响文献报道并不一致，而且与检测时间点有很大关系[8]。本研究结果初步表明，中药治疗14d后，对大脑组织DA和NE两种神经递质水平的变化产生显著影响，对于治疗过程中以及停药后神经递质的动态变化仍需进一步观察。
益智宁神口服液的主要组成为：熟地黄、黄芪、白芍、龙骨、远志、石菖蒲、五味子。其中熟地，其味甘，性微温，入心、肝、肾经，本品味厚气薄，为补血生精、滋阴补肾之要药，《珍珠囊》曰：“主补血气，滋肾水，益真阴”。黄芪，味甘，性微温，入脾、肺经，质轻升浮，为升阳补气之圣药。可补中气、益元气、温三焦、壮脾阳，选以补脾益气。白芍味苦、酸，性微寒，入肝经，既能养血敛阴，又能平抑肝阳，还能柔肝止痉;而龙骨味甘、涩，性微寒，入心、肝经，专攻平肝潜阳、镇静安神之用，两者搭配，养阴宁心，平肝潜阳。五味子性温，五味具备，酸能收敛，苦能清热，咸能滋肾，温而不燥，既能益气生津，补肾养心，用其养心滋肾安神;远志、石菖蒲有安神益智、化痰开窍之功效。诸药配伍，具有健脾滋肾、平肝熄风、宁神益智、化痰开窍之功效。氟哌啶醇是目前治疗TS的最有效药物之一[9]，疗效确切，但因副作用明显使其临床应用受到限制，通过实验结合临床用药发现，益智宁神口服液的疗效与氟哌啶醇无明显差异，且疗效更加稳定，易为患儿及家属接受。
参考文献
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关键词：慢性疲劳综合征 慢性束缚
Chronicity weary synthesis drafts the big mouse to make mold two method comparison
Mei Rongjun Wei Xiaoli
Abstract:Objective:Discusses the barrel fetter law to send the big mouse chronicity with the fetter law to make the mold wearily the comparison. Methods:30 male Wistar big mice divide into the barrel fetter group stochastically,puts up the fetter group and the control group,each group of each 10,use the chronic fetter the way to establish the big mouse chronicity weary synthesis to draft the model,observes each group of big mouses strength to use up the swimming experiment. Results:The barrel fetter group compares the fetter group big mouses behavior study target closer chronicity state of fatigue,also the death quantity are few. Conclusion :Establishes the more ideal chronic weary animal model support fetter law to surpass the barrel fetter law.
Keywords:The chronic weary synthesis drafts The chronic fetter
【中图分类号】R-3 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1879(2010)12-0002-01
本课题组［1］确立较为理想的动物模型是研究CFS的基础，本观察通过对两种常见慢性束缚造模方法的比较，寻找更合理的造模方法。
1 材料与方法
1.1 材料。
1.1.1 动物。健康雄性Wistar大鼠30只,清洁级,体重160g~200g，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供。动物饲养环境:清洁级实验室饲养,温度20℃~28℃,湿度35%~70%,噪声
1.1.2 主要仪器及造模用具。仪器：水迷宫（研究室设备）。桶束缚法:用硬塑料瓶特制束缚筒，管状,长18 cm直径5.2 cm,其瓶口为通气口。大鼠头向通气口置入后,调节封口束缚大鼠活动空间。大鼠束缚架：为木制，底座宽10cm、长20cm、厚1cm，四角铁钉、大鼠四肢捆绑弹力带。
1.2 方法。
大鼠适应性饲养3d后,随机分为桶束缚组、架束缚组与正常组，每组10只，10只/笼,自由进食饮水。造模期间,桶束缚组与架束缚组每天各束缚1次,晚上六点开始。束缚时,使桶束缚组大鼠钻进束缚筒内,调节到其不产生强烈反抗的紧张程度,平放在大铁台上。将架束缚组大鼠束缚于特制的鼠束缚架上。桶束缚时间为4小时，架束缚时间为3小时。束缚过程中,正常组动物在同一环境,不予以进食水。造模2周，桶束缚组死亡2只。结束后,立即开始行为学的测定。
2 力竭游泳实验观察
3组动物均于造模前一天及造模的第14天(造模最后1d)进行,记录大鼠从入水到游泳至力竭的时间(2次游泳法,取均值)。力竭游泳时水深为50cm、水温(28±1)℃,将事先标记好的大鼠同时置入游泳池,记录大鼠从入水到游泳至力竭(头部沉入水中10秒中不能浮出水面为力竭标准)的时间。
3 结果
本观察选择力竭游泳实验评定动物模型,造模后架束缚组大鼠力竭游泳时间时间明显减少,与正常组对比有明显统计学意义(*P
[关键词] 阿尔茨海默病; 胰高血糖素样多肽1; 链尿佐菌素
[中图分类号] R749.16 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)07-07-03
Protection of GLP-1 on STZ-induced Dementia Rat Model in Morris Water Maze Behavior
ZHANG Zhifeng1 LI Lin2 GAO Ying2 ZHU Baozhong2
1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.Geriatrics Institutes,the College of Basic Medicine of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China
[Abstract] ObjectiveTo study protective effect of GLP-1(glucagon-like peptide-1) on behavior and pathology in Alzheimer disease(AD)rats induced by streptozocin(STZ). MethodsTwenty-four rats were randomly divided into three groups:control group,AD model group and GLP-1 protection group. The control group received intracerebroventricular injection of saline. The AD model group received intracerebroventricular injection of STZ,and the GLP-1 protection group received intracerebroventricular injection of STZ plus GLP-1. The capacity of learning and memory of the rats was detected by Morris water maze. ResultsIn Morris water maze place navigation test,the escape latency of the AD model group was longer than that of the control group and GLP-1 protection group each day(P
[Key words]Alzheimer disease; Glucagon-like peptide-1; Streptozocin
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的中枢神经系统进行性的退行性疾病。其病因学和发病机制极其复杂,其中糖代谢病因紊乱学说在近年来备受关注。2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)和AD共同的病因学显示出相同治疗技术的可能性[1]。AD最赋特征性的病理学改变是β-淀粉样肽(β-amyloid peptide,Aβ)聚集而成的老年斑;脑神经细胞内Tau蛋白异常磷酸化诱导的神经纤维缠结。
STZ一般是用来诱导T2DM实验动物模型的[2],但由于其能诱导多种AD病理学变化,所以也可被用于诱导AD实验动物模型[3]。而GLP-1是一种由36～37个氨基酸组成的内源性胰岛素样肠肽,具有血糖调节作用,且已有多种长效GLP-1商品剂型应用于临床治疗T2DM[4]。研究还显示GLP-1具有神经保护和抑制Aβ表达的作用[5-7],提示GLP-1可能成为防治AD的药物。在本研究,我们用STZ诱导实验动物脑损伤,同时用GLP-1进行治疗,以实验动物Morris水迷宫行为学变化为观察指标,来初步研究GLP-1对STZ诱导的AD样实验动物脑损伤的保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性Wistar 大鼠24只(由山西医科大学实验动物中心提供),体重(250±10)g,随机分为对照组、AD模型组和GLP-1保护组,每组8只。
1.2 实验动物模型
动物禁食不禁水12h后,10%水合氯醛(3mL/kg)腹腔麻醉,立体定位仪固定,侧脑室注射定位:前囟后1.0mm、矢状缝侧1.5mm处,深度3.5mm。AD模型(北京博奥森生物技术有限公司)组注射STZ(3mg/kg,10μL)[3];对照组注射10μL的生理盐水;GLP1保护组注射10μL STZ半小时后再注射((Val8)GLP-1(一种长效GLP-1,10μL(Val8)GLP-1,50μM,由英国Dr.Christian H?lscher实验室赞助)[9]。每次注入时间为10min,留针5min,缓慢出针。在第1、3天注射,共2次。
1.3 Morris水迷宫检测
术后3周进行Morris水迷宫行为学测试[3]。Morris水迷宫是由一圆柱形不锈钢水池、一可移动的平台和一套图像自动采集、处理系统等组成。水池直径150cm,高70cm;平台直径15cm,高40cm。实验内容包括定位航行实验(连续5d,每天上、下午各2次)和空间探索实验(第6天进行,上、下午各1次)。定位航行实验是用大鼠在水中寻找平台的逃避潜伏期来检测大鼠的学习能力;空间探索实验(取走平台后)则是通过原平台象限游泳时间与总时间之比来测试大鼠的记忆能力。我们设定,每次定位航行的时间最长为120s,当大鼠在120s内找到平台后可停留10s;每次空间探索的时间也是120s。
1.4 统计学方法
结果以均数±标准差表示。多组均数间的比较使用的统计方法是重复测量方差分析和单因素方差分析,两两比较采用Bonferroni检验,且均是用SPSS 11.5统计软件来处理。P
2 结果
GLP-1对AD模型大鼠空间学习记忆能力的影响。定位航行实验示,各天AD模型组分别与对照组和GLP-1保护组大鼠相比,其逃避潜伏期明显延长,差异有统计学意义(P
空间探索实验示,对照组、GLP-1保护组与AD模型组相比,其在原平台象限的时间比例明显都比AD模型组大,差异有统计学意义(P
3 讨论
直接用GLP-1来进行实验有一缺陷就是其半衰期短,所以我们就选用了Christian H?lscher教授提供给我们的(Val8)GLP-1作为GLP-1的替代物来进行此实验。
有关细胞培养与神经电生理研究显示,GLP-1有抗Aβ、抗神经细胞凋亡的保护作用[5-7],但无研究GLP-1在动物行为学作用的报道。所以本实验采用了Morris水迷宫实验技术,来检测GLP-1对STZ所诱导的AD模型大鼠在Morris水迷宫中行为学的作用。
Morris水迷宫是英国心理学家Morris于20世纪80年代初设计并应用于脑学习记忆机制研究的一种实验手段,其在AD研究中的应用非常普遍[3]。较为经典的Morris水迷宫,测试程序主要包括定位航行试验和空间探索试验两个部分。其中定位航行试验(place navigation)历时数天,每天将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中若干次,记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间(逃避潜伏期,escape latency)。空间探索试验(spatial probe)是在定位航行试验后去除平台,然后任选一个入水点将大鼠放入水池中,记录其在一定时间内的游泳轨迹,考察大鼠对原平台的记忆[12]。
我们的Morris水迷宫实验结果显示,在定位航行实验中,5天里AD模型组的逃避潜伏期均比另两组的长,而且GLP-1保护组与对照组的逃避潜伏期基本上无差异,这不仅提示造模是成功的,而且也提示GLP-1对STZ所诱导的痴呆大鼠的损伤在学习功能方面有一定的保护作用。但是在第3天的实验中,GLP-1保护组的潜伏期(28.1±2.3)s与对照组的(22.0±1.8)s有差异(P=0.02),这提示GLP-1虽对STZ所诱导的痴呆大鼠的损伤在学习功能方面有一定的保护作用,但未完全达到正常水平。在空间探索实验里,也得到类似于上面的结果。
综上所述,GLP-1对链尿佐菌素诱导的痴呆大鼠在Morris水迷宫中的行为学方面是有明显保护作用的。
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【关键词】老年痴呆 行为学指标 脑内有关物质含量检测指标 脑组织形态学观察指标 血液检测指标
中图分类号：R592文献标识码：A文章编号：1005-0515（2010）12-030-03
【ABSTRACT】Objective To sum up and appraisal the evaluating indicators and methods of treating senile dementia. Methods Former indicators were summarized from four aspects of the behavior indicator, the examination indicator of related material content in brain, the brain tectology observation indicator and the blood examination indicator and other indicators were carried on the forecast. Results Through the discussion of drug efficacy targets and the methods,it provides newly and important data for the senile dementia mechanism and the treatment research. Conclusion There is a very important significance to find the effective mathods to prevent and treat the senile dementia by intensively studing main evaluating indicators and methods of treating senile dementia .
【KEY WORDS】Senile dementia; Behavior indicator; Examination indicator of related material content in brain; Brain tectology observation indicator ; Blood examination indicator
众所周知，人类社会己经逐渐进入老龄化社会，老年痴呆已成为威胁人类晚年身心健康的主要疾病之一，患病率呈逐年上升趋势。资料显示，研究者已针对脑的结构、功能和信息传递的新认知开发出了许许多多的治疗药物，且防治效果显著，但相关药效评价指标多散在于浩如烟海的文献中，为此本文总结相关文献，从行为学指标、脑内有关物质含量检测指标、脑组织形态学观察指标、血液检测指标四个方面对药物治疗老年痴呆进行药效评价，为老年痴呆机理和治疗的研究提供新的、重要的数据源。
1 行为学指标
1.1 水迷宫指标
20世纪80年代初，Morris发明了水迷宫，它是一种测量空间学习和记忆能力的实验方法，可用来评估啮齿动物由于老年痴呆等因素所造成的学习记忆的影响，目前已被认为是此类研究的经典。
Morris水迷宫实验由两个主要的实验组成，分别是定向航行实验和空间探索实验。
定向航行实验时，将动物从之前划分好的四个象限中随机放入，在最大游泳时间内，可以记录并作为评价指标的主要是逃避潜伏期（指大鼠自进入迷宫开始至找到平台所需的时间，经典的水迷宫实验以此作为主要指标进行统计分析），除此之外还有游泳路程长度（指大鼠自进入迷宫开始至找到平台游过的总距离。它是逃避潜伏期和平均游泳速度的乘积，是一个综合指标，受两者共同的影响，既可以反映大鼠对平台位置的学习记忆能力，又反映了大鼠的运动能力）、游泳速度（指大鼠进入水迷宫运动的快慢，速度的快慢，一般并不反映大鼠的学习记忆能力，仅反映大鼠的游泳能力。但在某种程度上，大鼠的逃避潜伏期短，那么相对消耗的体力也会少，速度也可能会较快。速度较快，那么，行程也可能会较长）、入水角度（指大鼠进入水迷宫后开始运动的方向与入水点和平台连线的夹角。如果与逃避潜伏期结合分析，在某种程度上可以弥补单纯考虑时间的不足）、搜索策略等可作为评价指标的补充，在分析过程中起参考作用，这个实验主要用于评价动物的空间学习能力。对于最大游泳时间，各实验人员有不同看法，通常选择 120s，90s或60s。最大游泳时间会在统计中由于个别动物而影响整组数据，特别是选择较大的游泳时间时，因此，应该在实验前做好动物的筛选工作，并在统计数据时去掉异常值。
定向航行实验进行几天后（按动物学习情况定），开始空间探索实验，将平台撤去，一般探索时间在90s或60s内[2]，可以记录并作为评价指标的主要有寻求原平台的次数（也就是跨平台次数：是在撤去平台后，动物穿越原平台所在位置的次数，反应动物寻找平台的能力，与原平台象限停留时间结合起来考虑更能反应大鼠的学习记忆能力的变化）、原平台象限的游泳时间，原平台象限游泳时间占总时间百分比，这个实验主要用于评价动物的空间记忆能力。
水迷宫实验作为老年痴呆动物的评价指标来说充分而又准确的，是最常用的评价治疗老年痴呆药效的指标，但是它也有不足之处，Graziano [3]认为简单地使用目前常用的观测指标不能准确的反映真实的搜索策略，于是选择了一些自定义的行为种类、大量的数值变量和重要区域，使用判别式分析的方法来获得较高的准确率。Graziano的这种方法虽然准确但是种类繁多比较复杂，所以我们进行日常实验时，只要选择主要的评价指标补充几个次要指标就可以清楚地反映实验的结果了。
1.2 跳台实验指标
跳台实验是药理学常用的评价动物对药物及其他给予的干预后的神经行为学中一个测试现象较为明显的实验，也就是测量大小鼠记忆能力的变化的实验。跳台实验指标是评价药效常用的指标之一，从文献的记录中看实属完善成熟。
检测方法：将大鼠或小鼠放入跳台仪内适应环境,然后通电,大多数跳上跳台逃避电击。从通电到完全稳定上台所用的时间为潜伏期,跳下时大鼠双足同时接触铜栅视为错误反应,训练并记录训练时间内的潜伏期和错误次数作为学习指标。24h后重测,先将大鼠或小鼠放在跳台上,记录第1次跳下跳台时间为潜伏期,并记录错误次数作为记忆能力指标。
2脑内有关物质含量检测指标
老年痴呆发病机制复杂，多种信号通路参与此过程，许多信号分子在其中发挥重要作用[4]。目前已公认，学习记忆与中枢胆碱神经系统关系极为密切。研究还表明，患者的痴呆程度与皮质和海马中信号分子的缺失程度密切相关，在患者脑中，基底前脑的胆碱能神经细胞明显丢失，胆碱能神经纤维发生退变，AchE、谷氨酸、p-KER2等在脑内的表达出现异常，尤以皮质和海马显著。
2.1 胆碱酯酶（AchE）活性的检测
胆碱酯酶是胆碱能神经递质乙酰胆碱的水解酶直接参与自主神经功能调节、肌肉运动、大脑思维记忆等重要功能。研究证实老年痴呆患者中枢胆碱能系统损伤，AchE活性和突触前胆碱能标志在多处脑区均显著降低或缺失患者基底前脑区胆碱能神经元丢失，从基底节到皮质，胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性降低和乙酰胆碱酯酶(AChE)活性明显升高，造成乙酰胆碱 (ACh)的合成、储存和释放减少，皮质 ACh受体数目减少，产生痴呆症状 [5]。总的来说，老年痴呆患者脑组织中胆碱乙酰化酶活性明显降低，胆碱酯酶活性显著升高，造成 ACh含量不足，导致中枢神经系统功能障碍，出现学习记忆及认知功能下降，甚至智力丧失[6]。因此AchE活性的检测作为评价老年痴呆药效的主要指标，且在药效评价中的使用甚为频繁。
检测方法：断头法处死实验动物后，迅速取脑，用预冷的生理盐水冲净表面血液，用滤纸吸干，去除软脑膜血管。取右脑称重，置微型匀浆器中，加无水乙醇研磨，再加生理盐水充分研磨制成匀浆。冷冻离心机离心，取上清液。用羟胺比色法测定AChE活性(可按照试剂盒说明书进行操作)。
2.2 谷氨酸含量的测定
谷氨酸是脑内主要的兴奋性神经递质，介导兴奋性突触传递，并与长时程增强（long term potentiation LTP）的形成密切相关 [7]，也作为老年痴呆药效的相关评价之一。
检测方法：在海马组织中加入HCL溶液，冰浴下超声匀浆，低温离心，取上清液加入正亮氨酸为内标物，利用异硫氰酸苯酯衍生，用内标法测定谷氨酸含量[8]。
2.3 p-KER2含量的测定
p-KER2含量测定：将海马组织放到预冷的裂解液中。低温超声粉碎后，离心，取上清液分装。用Braford法测定蛋白质含量，以牛血清白蛋白为标准品。用磷酸化抗体，常规Western蛋白印迹法测定p-KER2含量[9]。扫描蛋白条带，进行吸光度分析，吸光度值代表p-KER2含量。
2.4 Aβ和S.P含量的测定
Aβ由分泌酶水解β淀粉样前体蛋白产生，称为β-淀粉样肽，Aβ生成的增多对神经元有毒性作用[10]，大脑海马组织形态也发生明显的变化。而Aβ被认为是导致神经元损伤及认知功能衰退的主要致病物质[11]。
S.P是世界上发现最早的神经肽，研究表明，S.P与学习记忆功能有关，且对中枢神经系统具有保护作用，向人们提示了其对老年性痴呆等神经系统疾病具有潜在的防治价值[12]。
因此Aβ和S.P含量的测定对药效的评价有着重要的作用。
2.5 皮质的蛋白含量的测定
检测方法：分离脑皮质，称重，组织加入磷酸盐缓冲液（PBS）液，在组织匀浆器中充分研磨后，离心，吸取上清液，用PBS按1:4的比例配成组织匀浆液。最后用酶标仪微量比色法测定皮质匀浆液的蛋白含量。
3 脑组织形态学观察指标
3.1 海马病理形态观察
海马组织主要负责存储信息,是人学习和记忆的关键部位。海马结构的整合是空间学习的基础，海马区的受损影响大鼠学习行为的实验结果，和临床患者健忘、痴呆等表现是一致的[13] 。海马萎缩被看成是与记忆损伤相关的重要指标，也是评价药效的主要指标之一。
检测方法：断头处死，开颅取出完整的脑组织，用10%的福尔马林固定，切取脑组织，石蜡包埋，连续切片，行HE常规染色，进行细胞形态学观察。
3.2 检测海马及边缘系统的胆碱能神经元丢失状况
老年痴呆患者的病理学特征是大量神经细胞内神经纤维缠结、细胞外老年斑和弥漫性脑萎缩[14]。计算神经元数目检测海马及边缘系统的胆碱能神经元丢失状况可以直观简单地推测出患者的生理状态，是评价药效的重要指标。
3.3 病理组织切片及免疫组织化学染色
病理组织切片及免疫组织化学染色只要在光学显微镜下，老年痴呆动物模型内部结构的病理变化就一目了然，从而透彻地解析老年痴呆的病因和发病机制。
检测方法：开颅取脑后固定、脱水等过程后，进行冠状冷冻切片。切片PBS冲洗，经过溶于 PBST进行过氧化反应，封闭处理后，加入鼠抗摇匀、孵育过夜。然后，在室温下加入生物素化羊抗鼠IgG摇匀、孵育，室温摇匀、孵育，显色。最后，经过常规粘片、干燥、脱水、透明、封片，光学显微镜下观察并拍摄。
4 血液检测指标
近年来的研究表明，血液指标的检测不仅可预测患上老年痴呆的风险，其准确率高达90%，还可以作为不可或缺的药效评价指标，专家认为，血液检测有望为人类防治老年痴呆症带来革命性变化。
4.1 血清β淀粉样蛋白、转化生长因子及类胰岛素样生长因子Ⅱ水平检测
分泌酶水解β淀粉样前体蛋白产生Aβ,而Aβ又是导致认知功能衰退的主要致病物质，所以老年痴呆伴有β-淀粉样蛋白沉积，可通过检测血清β淀粉样蛋白的水平来估计Aβ的含量。
检测方法：取血分离血清,血清β淀粉样蛋白、转化生长因子及类胰岛素样生长因子Ⅱ检测采用放免法。
4.2 超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)羟自由基的含量检测
检测方法：快速开胸，心脏取血，离心取血清，置于低温保存，按试剂盒说明书，紫外分光光度法检测超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)羟自由基的含量观察动物脑组织形态学的病理变化。
4.3 血液流变学检测
研究表明，血液流变学异常是导致血液成分改变的主要因素之一。有研究认为，高黏血症是痴呆的危险因素之一。其机制可能与血液黏滞度异常则血流变慢，血液黏稠度增加而致脑血流量下降，脑部缺血缺氧，损害大脑的学习记忆功能有关[15]。血液流变学检测也可以评价药物疗效的好坏。
5 小结
到目前为止，各种药效评价指标层出不穷，除了上述常用的指标外，按照每种治疗方法或者药物对此疾病改善的不同，检测的指标也会有所不同，如晚期老年痴呆存在严重氨基酸代谢障碍，脑脊液，血浆中兴奋性氨基酸谷氨酸、天门冬氨酸含量的测定具有重要价值；老年痴呆能引起nNOS和NO表达增加，而MTPG(代谢型谷氨酸受体阻断剂α-甲基-（4-四唑基-苯）甘氨酸能阻断老年痴呆诱导的nNOS表达增加[16]，因此nNOS含量的检测在MTPG这种受体阻断剂的影响下有相对重要的意义等。还有血糖指标，海马颞叶中D2受体变化、载脂蛋白E的含量等等都与老年痴呆的机理息息相关，由于这些指标多而杂是近几年的研究发现，还未得到广泛的应用及证实，还未成熟，故本文只选取了一些成熟、常用、重要且有效的指标及其检测方法进行整理归类，为以后的研究提供更方便的查找途径，但是归类的指标中也还很多细节到现在为止还没有透彻，值得进一步研究、完善，使其更加适用于老年痴呆的机制探讨和药理研究。
这些评价指标的整理与总结以老年痴呆药理学的研究为基础，以评价药效为目的，从而为多层次、多角度深入研究老年痴呆的发病机理奠定了基础，为药物治疗老年痴呆提供更多的途径，有利于进一步提高药物治疗老年痴呆的疗效以及临床价值，并为研究开发疗效更高、毒性更小的治疗老年痴呆的药物提供更多思路。
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【摘要】
目的：观察大鼠急性脊髓损伤后大剂量甲基强的松龙（methylprednisolone，MP）冲击疗法对大鼠骨密度及生物力学的影响。方法: 46只成年健康SD大鼠随机分为对照组、模型组、治疗组等3组。按改良Allen's法建立大鼠急性脊髓损伤模型。治疗组伤后 30min 经腹膜腔注入MP30mg／kg，以后每小时注入 MP5.4mg／kg，维持24h；模型组应用生理盐水替代 MP，处理方法同治疗组。观察模型组与治疗组大鼠在伤后1、3和6个月 BBB 运动功能评分、各组L4椎体、股骨不同部位骨密度及生物力学参数的变化。结果: 术后各时间点模型组与治疗组BBB 评分总体呈增高趋势，治疗组在各个时间点BBB 神经行为学评分均优于模型组（P
【关键词】 急性脊髓损伤；甲基强的松龙；骨质疏松；骨密度；生物力学
［ABSTRACT］ Objective: To investigate the effect of high dose MP on bone density and biomechanics changes after acute spinal cord injury（ASCI）．Methods: A total of 46 adult rats were randomly pided into three groups， namely， the control group (CG)， the model group (MG)， and the experimental group (EG). After anesthesia， T8 vertebrae plate resection were performed to rats in both CG and EG with spinal cords injury by Allen method. Thirty minutes after ASCI， the subjects in experimental group received MP injection through intraperitoneal with dosage of 30 mg/kg. Then a dosage of 5.4 mg/kg of MP was given through intraperitoneal injection every hour in 24 hours. The subjects in the model group received normal saline instead of MP with the same method. A detection of both Basso， Beattie and Bresnahan (BBB) locomotor rating scaling， bone density and biomechanics was performed to the L4 vertebral body and the femur of rats 1， 3 and 6 months following operation， respectively. Results: BBB scale: after operation， the scale of groups MG and EG was increased over time; group EG was significantly higher than group MG from 1， 3， 6 month (P< 0.05， P
［KEY WORDS］ Acute spinal cord injury；MP；Osteoporosis；Bone density；Biomechanics
急性脊髓损伤（acute spinal cord injury，ASCI）是一种严重的损伤，其病死率、致残率很高。伤后大剂量甲基强的松龙（methylprednisolone，MP）冲击是目前急性脊髓损伤公认治疗方法，它的作用机制复杂。甲基强的松龙早期可以显著增加神经系统兴奋性，改善脊髓血流量，减轻组织损伤［1，2］，但其远期对患者的影响不明确。笔者以通过改良Allen’s法［3］建立大鼠脊髓损伤动物模型，研究大鼠脊髓损伤MP治疗前、后骨密度及生物力学改变情况，推测大剂量 MP 治疗对患者远期疗效的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
46只雌性 SD 大鼠，体质量（250±10）g；4％多聚甲醛 PBS（磷酸缓冲液）固定液；甲基强的松龙注射用粉剂（法玛西亚普强有限公司）；DPXL型双能 X 射线骨密度仪（美国Lunar 公司）；858 Mini Bionix 型生物材料力学实验机（美国MTS公司）等。
1.2 实验方法
1.2.1 分组与造模
46只雌性SD大鼠随机等分为对照组（control group，CG）6只，模型组(model group，MG)20只，治疗组（experimental group，EG）20只。造模：将大鼠腹腔麻醉后，常规消毒，以T8棘突中心作长约3cm切口，暴露硬脊膜，采用改良Allen’s装置制备脊髓急性打击伤动物模型，损伤力度为10g×2.5cm。模型制作成功判定标准：打击后损伤处脊髓出血、水肿，大鼠出现摆尾反射，双下肢及躯体回缩样扑动，麻醉清醒后双下肢呈弛缓性瘫痪。治疗组伤后30min 腹膜腔注入MP30mg/kg， 以后每小时注入MP5.4mg/kg，连续注射24h。 模型组以生理盐水替代MP，按治疗组同样方法给药。致伤后每日按压大鼠膀胱促进排尿，定时喂食。
1.2.2 神经行为学评分
评分观察者为非本试验组员。在损伤后1、3、6个月参照 BBB(basso beattie bresnahan locomotor rating scale，BBB) 神经行为学评分法［4］综合评定MG组和EG 组的功能。最小值为 0 分，表示神经行为功能完全丧失；最大值为 21 分，表示行为功能完全正常。
1.2.3 骨密度及生物力学检测
分别于术后1、3、6个月，在麻醉状态下对各组大鼠用双能X射线骨密度仪的小动物测量软件测定右股骨、腰4椎体的骨密度。术后6个月处死大鼠后取各组大鼠的右侧股骨及腰4椎体，去除表面附着软组织，用生理盐水浸湿的纱布包裹后置于20℃冰箱保存。力学检测前室温解冻标本，使用生物材料力学实验机进行股骨3点弯曲和腰椎结构强度实验。股骨3点弯曲实验跨距2mm，加载速度为2mm/min，腰椎结构强度实验加载速度为1mm/min，匀速加载直至标本断裂。每个样本放置在仪器上的位置及方向保持一致。
1.3 统计学处理
采用 SPSS 12.0软件进行统计，计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P
2 结果
2.1 动物一般情况
模型组和治疗组造模后，大鼠双侧下肢瘫痪，模型组及治疗组各有5只在造模1个月内死亡，模型组有1只在第60天死亡，故均未列入统计。
2.2 大鼠神经行为学评分
治疗组在1、3、6个月 BBB 神经行为学评分均优于模型组，两组相比较差异有统计学意义(P< 0.05，P < 0.01)，见表1。 表1 各组大鼠脊髓损伤后后肢功能 BBB 评分 （略）
2.3 各组骨密度测定
术后1、3、6个月，模型组及治疗组大鼠右侧股骨、第4腰椎骨密度明显下降，与对照组相比差异均有统计学意义(P< 0.05，P
2.4 各组大鼠股骨3点弯曲和腰椎结构强度测定
术后6个月，模型组及治疗组大鼠右侧股骨、第4腰椎骨结构强度均显著降低，与对照组相比有极显著性差异(P
3 讨论
海南医学院学报 Vol.16 No.7 Jul.2010ASCI是一种严重的中枢神经系统损伤。目前临床治疗急性脊髓损伤均按全美急性脊髓损伤随机受控临床试验的方案进行治疗。糖皮质激素药物MP是目前临床上用于干预性治疗急性脊髓损伤的首选药物，其防止继发性脊髓损伤的作用机制可能与抑制脂类过氧化有关物，中和氧自由基，防止神经细胞的凋亡，促进神经系统的复苏［1，57］。文献报道［8］大部分患者都能耐受大剂量MP冲击治疗，部分患者治疗时短时间内可能出现激素应用的不良反应，但其对患者的远期影响还有待进一步研究。本实验通过脊髓损伤后模型组与治疗组神经行为学评分、骨密度及生物力学的测定，对2组骨大鼠骨质疏松的差异进行分析，了解ASCI早期大剂量应用甲基强的松龙对患者的远期影响。
本实验发现，模型组大鼠神经功能受损后随着时间延长有所恢复，但比治疗组差，大剂量MP可以提高运动和感觉恢复，特别是不完全脊髓损伤患者，这也与目前临床应用结果相一致［9，10］。本实验发现造模后1、3、6个月，模型组及治疗组的骨密度明显下降，这与国内外研究相同［1113］。实验也发现造模6个月后，治疗组股骨及腰椎的骨密度要低于模型组，具有显著性差异，这说明大剂量MP远期有可能会加快骨质疏松的进程。
骨生物力学反映骨对抗外力作用的强度，集中体现了骨的材料特性和结构特性，骨质疏松时由于骨量减少与骨结构的改变，直接影响骨的生物力学性能，使骨强度降低［14］，增加骨折的危险性。因此，测定骨的生物力学性能的变化是评价骨质疏松症的一个重要和特殊的指标。本实验发现术后6个月，模型组右侧股骨的3点弯曲试验、第4腰椎压碎试验结果要优于治疗组，说明大剂量MP对大鼠远期骨的生物力学有影响。
以上结果表明，早期大剂量MP治疗ASCI对于阻止或减少脊髓继发损伤，保留脊髓残存功能，提高患者生存质量有重要意义，是治疗急性脊髓损伤的一项有效措施，值得进一步的深入研究和应用。但大剂量MP治疗过程中，有可能加重骨量丢失，加速患者骨质疏松的进程，应建议患者尽量早期进行各种功能锻炼，配合预防骨质疏松药物的长期应用，这样才能提高冲击疗法的安全性和有效性。
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[关键词] 血管性认知障碍；行为学障碍；康欣胶囊；Morris水迷宫
[中图分类号] R743 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2011）12（b）-024-03
Study of invigorating kidney and strengthening spleen, nourishing blood and promoting blood method in improving the behavior of rats with vascular cognitive impairment
SHEN Shuanghong1, SHEN Xiaodong2, WU Tongyu1, GONG Degui3, MAO Jingjie1, DU Jian1
1.Research Institute of Traditional Chinese Medicine and Western Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fujian Province, Fuzhou 350108, China; 2.Department of Traditional Chinese Medicine, the Second Hospital of Agricultural Reclamation in Heilongjiang Province, Jiamusi 150007, China; 3.Department of Rehabilitation, the Second People's Hospital of Fujian Province, Fuzhou 350003, China
[Abstract] Objective: To observe the impact of invigorating kidney and strengthening spleen, nourishing blood and promoting blood method on behavior of rats with vascular cognitive impairment (VCI). Methods: 10 rats were chosen randomly as sham operation group before operation, the left rats were caused by the reformed method of lowering blood pressure by clipping two sides of total artery in neck repeatedly combined with Sodium Nitrate of intraperitoneal injection to make vascular cognitive impairment model, which were randomly divided into four groups, namely Kangxin capsule compound group (compound group), Kangxin capsule simplified group (simplified group), western medicine control group and model group, with 10 rats in each group. After treatment for 3 weeks, the escape latency, the times of crossing platform and the learning and memory capacity of the model rats were observed by morris water maze. Results: Compared with model group, the escape latency of rats in Kangxin capsule group, compound group, simplified group and western medicine control group were shortened obviously [(14.57±3.99), (16.93±2.54), (18.42±7.35) s] and the times of crossing platform were increased obviously [(6.90±1.86), (7.20±1.75), (6.10±2.46) times], the differences were significant (P＜0.05). Conclusion: Kangxin capsule made by invigorating kidney and strengthening spleen, nourishing blood and promoting blood can improve behavior of VCI model rats.
[Key words] Vascular cognitive impairment; Behavior impairment; Kangxin capsule; Morris water maze
血管性认知障碍（vascular cognitive impairment，VCI）是由脑血管病危险因素明显的脑血管病（如脑梗死、脑出血）或不明显的脑血管病（如白质疏松、慢性脑缺血）引起的认知功能障碍[1]。采用血管性认知障碍的概念，极大地提高对由血管病变或血管危险因素引起的各种认知障碍的认识，防治痴呆的发生。既往研究表明，补肾健脾养血活血法治疗血管性痴呆取得了良好效果，本研究探讨补肾健脾养血活血法立方的复方中药对VCI大鼠行为学障碍的影响，揭示其对VCI的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物与药物
动物选用6个月龄雄性SD大鼠（购自上海斯莱克实验动物有限公司），体重为250～300 g，共70只。
复方中药康欣胶囊由福建屏山制药有限公司（批号：900418；规格：0.3 g/粒）提供。复方由女贞子、枸杞子、菟丝子、何首乌、黄精、黄芪、羊藿、当归、丹参、丹皮、酸枣仁、、山楂等药物组成。简化方由黄芪、羊藿、丹参、当归组成。各组用药量2.43 g/kg，相当于人常用剂量。西药喜得镇由瑞士山德士药厂与天津华津制药厂合作生产[（91）卫药准字X-156号，1 mg/片]，混悬液浓度为0.027 mg/ml，相当于人常用剂量。硝普钠，由北京双鹤现代医药技术有限公司生产，批号：0305072。
1.2 血管性认知障碍动物模型的建立
VCI大鼠的造模方法：采用王蕊等[2]造模方法并加以改进：分将大鼠用10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉，仰卧固定在手术台上，常规消毒，取颈正中切口，钝性剥离结缔组织和颈前肌群，分离双侧颈总动脉，腹腔注射硝普钠2.5 ml/kg后，无创微动脉夹夹闭双侧颈总动脉10 min，再通10 min，再夹闭10 min，再通后，永久结扎右侧颈总动脉，并剪断。伤口洒青霉素粉适量，缝合伤口。假手术组手术过程同模型组，但不阻断双侧颈总动脉，不注射硝普钠，在手术过程中，保持动物肛温（37.0±0.5）℃。
1.3 分组与给药
造模前按随机数字表随机抽取10只为假手术组。其余大鼠进行造模。在造模后存活（术中死亡20只）的40只大鼠随机分为康欣胶囊复方中药组（复方组）、康欣胶囊简化方中药组（简方组）、西药对照组、模型组，每组10只。造模后第2周予以每日胃灌注（4.5 ml/kg各种液体），假手术组和模型组用生理盐水灌胃，复方组、简方组和西药对照组分别予康欣胶囊全方、康欣胶囊简化方和喜得镇混悬液，均每日给药1次，连续灌药3周。给药两周后开始Morris水迷宫实验，共6 d，期间继续给药，次日处死动物。
1.4 行为学观察
Morris水迷宫[3]：水迷宫的水池直径100 cm，深50 cm，水深30 cm，水温（26±2）℃，水面覆一层泡沫塑料屑，池壁上4个等距离点分水池为4个象限，池壁外标4个入水点，任选一象限在其中央放置平台。平台无色透明，直径6 cm，高28 cm，平台没于水面下2 cm，水池周围参照物保持不变。Morris水迷宫主要包括定位航行实验和空间探索实验两个部分。
定位航行实验：检测大鼠对平台位置的学习和记忆的能力。连续训练5 d，每日上午、下午两个时段，两次间隔8 h以上。在每个时间段训练4次，分别从4个象限的入水点将大鼠放入水中。如果大鼠在60 s内爬上平台，并停留3 s以上，则认为大鼠找到平台，此为潜伏期。如果60 s内大鼠未能找到平台，则拖拽其尾部，将其引导到平台，熟悉10 s，此时潜伏期按60 s计算。每次训练间隔为5 min。计算每一时段4个方向潜伏期的平均数，然后把每一日上午、下午两个时段潜伏期的平均数作为该日的游泳结果。
空间探索实验：测试大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的能力。定位航行实验后，即在第6天上午，撤去平台，取任意一个入水点将大鼠放入水中，观察并记录60 s内大鼠穿过原平台区域的次数。
1.5 统计学方法
使用SPSS 11.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，组间比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 造模后血管性认知障碍大鼠一般情况
苏醒后大鼠活动能力下降，自发运动减少，少数大鼠自发运动增加。48 h内所有存活大鼠都逐渐恢复正常饮食及大便。
2.2 各组大鼠Morris水迷宫试验比较
与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少（P＜0.05）；复方组、简方组、西药对照组与模型组比较，逃避潜伏期明显缩短，穿越平台区域的次数明显增多（P＜0.05）；复方组、简方组、西药对照组两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。
表1 各组大鼠逃避潜伏期及穿越平台区域次数比较（x±s）
注：与模型组比较，P＜0.05，P＜0.05
3 讨论
临床和神经心理学研究表明，按照痴呆的诊断标准不能发现许多血管因素导致的认知障碍，尤其是未达到痴呆标准者，也就不能实现早期发现和早期预防。因此，一些学者提出应该用更宽泛的VCI概念来代替血管性痴呆，目的是将血管性痴呆的诊断从传统的痴呆标准中摆脱出来。VCI是一种可以预防的痴呆，早期治疗具有可逆性[4]。因此，广泛采用VCI诊断标准，对处于早期或症状前期的患者进行治疗及Ⅱ级预防和Ⅰ级预防，意义深远。
中医学认为，本病的发病与肾精不足、五脏亏虚、气血不足有密切关系。康欣胶囊以补肾健脾、养血活血为立法，方中女贞子、黄精等补肾填精，羊藿温肾壮阳，当归养血活血，佐以丹皮、山楂等药。药理研究表明，方中诸药多具有清除氧自由基、抗衰老、增强免疫力、抗动脉粥样硬化、减轻脑缺氧缺血后再灌注损伤等多种作用。既往的研究显示，康欣胶囊有效增加海马、下丘脑等部位乙酰胆碱（Ach）、多巴胺（DA）的合成；防止神经细胞凋亡，从而保护神经细胞，改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力[5-6]。
Morris水迷宫实验是检测空间方向、反射时间、视知觉和结构应用等空间学习记忆能力。本实验选用逃避潜伏期、通过平台次数等指标，来反映大鼠学习记忆能力。大鼠空间记忆力越好，其逃避潜伏期越短，通过平台次数也越多。本实验研究结果显示，假手术组大鼠的各指标均明显优于模型组，说明模型组大鼠出现明显的学习记忆障碍，造模成功。复方组、简方组、西药对照组与模型组比较，逃避潜伏期明显缩短、穿越平台区域的次数明显增多，说明各用药组均能明显改善大鼠学习记忆能力。
对于血管性认知障碍这个新概念，目前中医、西医都处于探索研究阶段。中医药在改善症状，延缓病程进展，减缓长期服用西药的不良反应，提高疗效等方面有一定的优势，因此通过本次动物实验观察，以期能为中医药对VCI的深入研究有所裨益。
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【摘要】 目的 观察异丙酚预处理对拟AD模型大鼠的学习记忆功能和海马损伤神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT）和bcl2表达的影响，分析异丙酚的脑保护作用。方法 大鼠海马CA1区微量注射冈田酸（Okadaic acid，OA），建立拟AD大鼠模型。异丙酚预处理组大鼠于拟AD模型制作前30 min，腹腔注射异丙酚100 mg/kg。然后用Morris水迷宫观察大鼠行为学变化，Bielschowsky染色观察NFT及免疫组化方法观察bcl2表达的变化。结果 与对照组大鼠相比，模型组大鼠学习记忆能力显著降低；Bielschowsky染色观察海马CA1区域出现大量NFT的特征性病理变化，免疫组化bcl2表达明显减少（P＜0.05）。与模型组大鼠相比，异丙酚预处理组大鼠学习记忆能力明显提高；海马CA1区NFT明显减少或消失，免疫组化bcl2表达明显增多（P＜0.05）。结论 拟AD模型建立前30 min异丙酚预处理能改善拟AD模型大鼠学习记忆能力，能降低NFT的表达，增高bcl2表达，有明显的脑保护作用。
【关键词】 阿尔茨海默病；异丙酚；冈田酸；学习记忆；神经原纤维缠结；bcl2
【Abstract】 Objective To study the effects of propofol pretreatment on learning and memory ability，and to investigate the expression of neurofibrillary tangles(NFT) and bcl2 of hippocampus tissues in Alzheimer’s diseaselike model rats，and to analyze the protective effects of propofol on brain. Methods Okadaic acid (OA) was injected into hippocampal CA1 region of rats in model group and pretreatment group to establish Alzheimer’s diseaselike model. Rats in the pretreatment group were abdominally injected with propofol (100mg/kg) before making ADlike model. The learning and memory abilities of rats were assessed through Morris water maze behavioral test. NFT were the characteristic pathological changes of AD，examined by Bielschowsky stain of hippocampus，and the expressions of bcl2 were examined by immunohistochemistry in hippocampus CA1 region of the rats. Results Compared with control group rats， the abilities of learning and memory decreased. Many NFTs were observed in hippocampal CA1 region. The expression of bcl2 in the CA1 region decreased (P＜0.05). Compared with model rats，the abilities of learning and memory of propofol group rats improved. NFT was reduced in hippocampal CA1 region. The expressions of bcl2 in the CA1 region increased(P＜0.05).Conclusion Treated with propofol at 30 minutes before injecting OA can ameliorate the neurobehavioral score of rat with hippocampus injury，reduce the level of NFT and increase the expression of bcl2 in brain tissues of rats with OA injury，which has significant protective effects on brain.
【Key words】 Alzheimer’s disease，propofol，Okadaic acid，learning and memory， neurofibrillary tangles，bcl2
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年人中发病率高、危害性大的中枢神经系统退行性疾病。到目前为止，其确切病因和发病机制尚不完全清楚，临床上首先表现为近期记忆力减退，继而表现为持续性智能衰退、失语、判断推理能力丧失以及运动功能障碍。脑药物预处理是通过药物激发或模拟机体自身内源性保护物质而呈现的脑保护作用，药物性预处理具有相对安全、方便、易于控制剂量等优点。异丙酚（propofol）为目前最为常用的静脉全麻药物，因其苯环上的结构与天然的抗氧化剂维生素E相似，因而具有了一定的清除自由基和抑制脂质过氧化作用［1］，一些在体动物实验证实了异丙酚具有脑保护效应［2～5］。本实验利用拟AD大鼠模型，观察了用异丙酚预处理海马组织中NFT及bcl2含量的变化，并结合学习记忆能力的改变，评价异丙酚的脑保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 3～5个月龄健康雄性SD大鼠36只，体重200～250 g，均购自山东大学实验动物中心。随机分为3组：正常对照组（简称对照组）、拟AD模型组（简称模型组）、异丙酚预处理组(简称异丙酚组)，每组12只，自然条件下饲养，自由饮食，光线湿度适中。
1.2 实验试剂和仪器 实验试剂：Okadaic acid（OA）粉剂购自美国sigma公司，临用前溶解于10%二甲亚砜（DMSO），配制成0.4 mmol/L溶液；抗bcl2抗体、DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；静安（异丙酚），北京尤费森尤斯卡比制药有限公司分装（批号UI 152，进口编号H20060427）。主要仪器：研究用生物显微镜（带摄像装置及图像分析系统）为德国Leica公司产品；全自动Morris水迷宫，上海吉量软件科技有限公司；脑立体定位仪DYTⅠ，中国天津生产。
1.3 实验方法和步骤
1.3.1 拟AD模型制作：模型组、异丙酚组大鼠称重，选择右侧海马为注射靶区，10%水合氯醛腹腔麻醉（300 mg/kg）后，固定于脑立体定位仪上，颅顶皮肤常规消毒，剪去头皮，充分显露颅骨，参照George等［6］的《大鼠脑立体定位图谱》，于前囟后（A）3.6 mm，中线右侧（R）旁开2.4 mm处用直径1 mm的颅骨钻钻一小孔，垂直插入自行设计的十字形管，牙科水泥固定。通过十字形管用微量注射器进行海马CA1区微量注射（深度2.7 mm），模型组、银杏内酯组、联合组大鼠均经纵管缓慢注射0.4 mmol/L的OA 0.5 μl，5 min注射完毕，留针10 min。每隔2 d按同样方法剂量注射1次，共5次。对照组用同样方法注入等体积的对照液10% DMSO。术后大鼠肌注青霉素10万单位预防感染，连续5d。
1.3.2 异丙酚腹腔注射：异丙酚预处理组大鼠于拟AD模型制作前30 min，腹腔注射异丙酚100 mg/kg，对照组、拟AD模型组用同样方法腹腔注射生理盐水。
1.3.3 大鼠行为学检测：大鼠行Morris水迷宫定向航行实验（place navigation test）和空间探索实验（spatial probe test），Morris水迷宫由周围水池和自动录像、记录系统两部分组成。Morris水迷宫水池直径160 cm，深50 cm，摄像镜头安放于水池中心上方2 m高度。将各象限水池壁中点标为入水点，标记4个象限。站台直径12 cm，高30 cm，固定于第3象限，水池中水面高出站台平面1 cm。水中加入适量黑色素，以肉眼看不见站台为宜，保持水温（25±1）℃。周围环境安静，恒定光源。实验开始前1 d将每只大鼠单独放入未放站台的水池中2 min，使其适应水迷宫环境及学习游泳。实验时将大鼠分别从4个象限的固定入水点放入水池，自动录像系统记录大鼠找到平台的时间和游泳路径。水迷宫实验于海马CA1区首次注射后的第4周开始进行，共7 d。第1～6天进行定向航行试验：每日将大鼠按顺序ⅣⅢⅡⅠ象限从各入水点靠池壁放入水中（鼠头朝向池壁，鼠尾没入水中），记录60 s内大鼠从入水到爬上站台所需时间即逃避潜伏期（以在站台上停留达到或超过10 s为上台，不足10 s不作为上台）。每只大鼠每天训练4次，上下午各2次，每只每次间隔时间15 min，中午间隔2 h。训练过程中，若大鼠60 s内找到站台，让其在站台上停留10 s，若未找到站台，引导大鼠上站台，并停留10 s，潜伏期记为60 s；第7天进行空间探索实验：撤去站台，将大鼠从第1象限入水点放入水池，记录120 s内大鼠在各象限的游泳时间和穿越站台次数，作为评价大鼠学习成绩的指标。
1.3.4 灌注取材：水迷宫试验结束后，将各组大鼠经10%水合氯醛（按体重450 mg/kg，腹腔注射）深麻后，快速灌入生理盐水150 ml，然后改用10%中性缓冲甲醛（4℃）150 ml灌注，断头取脑，置10%中性缓冲甲醛中浸泡固定7 d。取海马注射点前后约3 mm厚标本，经脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋后行大鼠海马冠状位切片，片厚4 μm。同时观察每只大鼠标本海马注射轨迹，注射深度或位置未达要求者不纳入统计处理。
1.3.5 Bielschowsky染色：切片脱蜡至水化，用2 %硝酸银水溶液避光浸染于37℃水浴箱内孵育30 min；10%福尔马林液还原数秒钟至切片呈现黄色为止；用氨银溶液滴染20～40 s，倾去染液，直接用10%福尔马林液再次还原1～2 min，使切片呈棕黄色；用0.2 %氯化金溶液调色2～5 min；5 %硫代硫酸钠水溶液固定3～5 min；然后脱水、透明，中性塑胶封固。
1.3.6 免疫组织化学两步法：切片常规脱蜡至水；滴加3%H2O2，以阻断内源性过氧化物酶；热修复抗原：将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液（TBS，pH 6.0）中，微波炉“高火”加热至沸腾3 min，后改为“保温”10 min。冷却后磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2～7.6）洗涤2次；滴加适当稀释的一抗（兔IgG）， 37℃恒温水浴箱孵育30 min，PBS洗涤2 min×2次；滴加通用型IgG抗体（Fab段）HRP多聚体，37℃恒温水浴箱孵育20 min ，PBS洗涤2 min×2次；DAB溶液显色：使用DAB显色试剂盒，取1 ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片；室温显色，镜下控制反应时间，一般5～30 min；蒸馏水洗涤；苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。
1.3.7 显微镜观察 采用Leica摄像显微镜观察并照像。NFT可在海马CA1区形成并在轴突和胞体处染色较深并呈拖尾形状，bcl2免疫组化阳性细胞在光镜下可见胞质、胞膜和突起呈棕黄色或棕色。计数每张切片4个随机高倍视野中阳性细胞数后取平均值作为计数结果，每组10张切片计数结果取平均值作为最后结果。
1.4 统计学处理 应用SPSS11.5统计分析软件包，数据先进行单因素方差分析，多组之间差异两两比较采用SNK检验进行分析，P＜0.05有统计学意义。统计结果以x±s表示。
2 结果
2.1 实验动物数量分析 共有36只健康雄性SD大鼠接受实验，顺利接受麻醉、异丙酚预处理、拟AD模型建立、神经行为学评分和海马损伤NFT、bcl2测定的有33只。在接受海马CA1区OA注射和异丙酚预处理时，有2只大鼠死亡、1只出现偏瘫无法进行余下实验，这可能与动物的个体差异不能耐受实验有关。随机取30只作为实验样本，每组10只。海马注射深度或位置未达要求者不纳入统计处理，故剔除不合标准的，在测定海马组织损伤表达的时候，每组选取8只大鼠作为实验样本。
2.2 大鼠行为学检测 各组大鼠在Morris水迷宫中定向航行实验结果见表1。对照组及异丙酚预处理组的平均逃避潜伏期均渐缩短，从第1天开始，模型组与对照组比较，平均逃避潜伏期均明显延长（P＜0.05）；异丙酚预处理组与模型组比较，平均逃避潜伏期明显缩短（P＜0.05）。撤去站台后，以在原站台象限（第3象限）的活动时间和穿越站台次数为指标，模型组与对照组比较，第3象限活动时间明显缩短（P＜0.05），穿越站台次数明显减少（P＜0.05）；异丙酚预处理组与模型组比较，第3象限活动时间明显延长（P＜0.05），穿越站台次数明显增多（P＜0.05）（见表2）。在第7天撤去平台之后，对照组、异丙酚预处理组大鼠以绕平台游泳和穿梭游泳方式为主，有少量环池游泳；模型组以穿梭游泳和环池游泳为主，有少量绕平台游泳。结果表明，与对照组相比较，模型组大鼠行为模式发生了改变，异丙酚预处理组的行为模式更接近于对照组。表1 各实验组大鼠定向航行实验中每日平均逃避潜伏期表2 各实验组大鼠空间探索实验第3象限活动注：*与对照组比较，P＜0.05；与模型组比较，P＜0.05
2.3 海马CA1区NFT表达 对照组大鼠海马CA1区神经细胞未见明显改变（图1A）；拟AD模型组大鼠海马CA1区锥体细胞层细胞神经原纤维增粗、粗细不等、排列紊乱，有的密集成团块状，呈编织状遍布细胞质并深入到细胞突起，形成NFT（图1B）。模型组与对照组比较，NFT明显增多（P＜0.05）；异丙酚预处理组同模型组比较，NFT明显减少（P＜0.05）（见表3，图1C）。 表3 各实验组大鼠海马CA1区NFT神经元计数
2.4 海马CA1区bcl2的表达 正常对照组大鼠海马CA1区bcl2阳性细胞表达较多，可见胞质、胞膜和突起呈棕黄色或棕色（图2A）；模型组大鼠海马CA1区bcl2阳性细胞表达明显减少（图2B），与正常对照组相比有显著性差异（P＜0.05）；异丙酚预处理组表达增多，与模型组相比有统计学意义（P＜0.05）（见表4，图2C）。 注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，P＜0.05
转贴于 3 讨论
众所周知，海马作为边缘系统的重要组成部分，是近期记忆回路的重要结构，是学习记忆的重要解剖基础和神经中枢，在学习、记忆、情绪反应及植物神经功能等方面发挥着重要作用［7］，更因其结构上具有高度的序化板层构筑和神经元相对独立分布等特点而成为最理想的学习记忆的研究模型［8］。许多研究表明，海马与机体衰老、阿尔茨海默病及癫痫发作有着非常密切的关系。由于海马不同区域的功能不尽相同，其中CA1和CA3区在学习、记忆中担负重要作用［9］。海马CA1区发育最晚，但是最早出现老化的部分。故本实验将注射部位定位于海马CA1区。我们评价学习记忆的设备是带摄像装置及分析软件的Morris水迷宫，实验数据不受人为因素的影响，结果更为客观、真实。本实验发现模型组大鼠在注射OA结束后的水迷宫行为学实验从第1天起就出现学习记忆能力下降。模型组海马CA1区GFAP免疫阳性神经元显著增多，银染结果显示模型组海马CA1区出现较多的NFT，这与AD的主要病理变化相吻合。
我们通过改进的Bielschowsky染色发现，OA可导致大鼠海马和皮层神经元内产生大量的NFT。异丙酚预处理组海马内NFT数量减少，与拟AD模型组比较差异显著（P＜0.05）。NFT是导致神经元纤维退化的主要原因［10］，目前认为NFT的形成与AD病人的认知功能障碍呈明显的正相关。NFT主要成分是过度磷酸化的tau蛋白和少量微管蛋白。正常tau蛋白是可溶性的，可将营养物质从胞体输送到突触末端，而过度磷酸化的tau蛋白则是不溶解的，扭曲变形的微管蛋白不能正常输送营养物质，导致神经元末端的树突和轴突发生营养不良性萎缩。我们推测异丙酚可能影响tau蛋白的异常磷酸化，减少NFT的形成，从而保证轴浆的正常运输。异丙酚组海马CA1区bcl2阳性细胞表达数量明显增加，表明bcl2在拟AD大鼠学习记忆改善过程中发挥作用。目前研究认为bcl2基因及其蛋白bcl2可以抑制或阻断多种因素引起的细胞凋亡，并认为bcl2抑制细胞凋亡的机制与bcl2能抑制Caspase的基因表达 ［11］，并具有稳定线粒体外膜，调节线粒体功能，阻止细胞色素C的释放［12］，降低钙离子从内质网的释放［13］，以及抑制自由基产生，抗氧化等作用有关。
近年来，静脉麻醉维持和诱导药物异丙酚的脑保护效应尤为引人注目，大量动物实验和人体试验都发现异丙酚具有脑保护效应，它有良好的对抗应激性血糖升高作用，同时能保证脑氧供需平衡，通过阻滞或减轻继发性脑损害，改善脑创伤后的神经功能而产生脑保护作用。其脑保护机制可能是：①钙通道阻滞药作用：研究表明，异丙酚可其直接或间接地抑制Ca2+经NMDA受体耦联Ca2+通道和电压依赖性Ca2+通道进入胞内，减少自由基的产生［14］，通过解除缺血区脑微循环灌注，减少线粒体和内质网钙离子活化产生的细胞损伤。②自由基清除剂作用：异丙酚的活性成分的化学结构和已知的氧自由基清除剂丁羟基甲苯和维生素E一样具有酚羟基结构［1］，可有效地防止甲基（酰）门冬氨酸积聚，与氧自由基反应生成酚基氧自由基，从而抵抗氧自由基的作用。③激活γ氨基丁酸A受体：异丙酚可以增强氟硝基安定与中枢苯二氮艹卓类受体的结合，从而增加开启Cl通道的频率，增强γ氨基丁酸的效应；还可以下调NMDA受体拮抗剂所诱导的cfos基因和HSP70基因在后扣带皮质回的表达，从而阻断NMDA受体拮抗剂所致的神经毒性，减轻后扣带皮质回神经元的组织病理损害［15］。
本实验结果，异丙酚预处理的拟AD模型大鼠，空间学习记忆能力明显改善，海马CA1区少见或未见NFT，bcl2表达增高。表明拟AD模型建立前30 min异丙酚预处理能改善拟AD模型大鼠学习记忆能力，降低NFT的表达，增高bcl2表达，有明显的脑保护作用。
参考文献
［1］ Murphy PG，Myers PS，Davise MJ，et al.The antioxidant potential of propofol （2，6-diiosoproopylphenol）［J］.Br J Ansesth，1992，68（6）：613618. ［2］ 杨静，李天佐，张炳熙，等. 异丙酚对谷氨酸诱导大鼠海马神经元损伤的影响［J］.中华麻醉学杂志，2005，25（12）：917918.
［3］ Kodaka M，Mori T，Tanaka K，et al. Depressive effects of propofol on apoptotic injury and delayed neuronal death after forebrain ischemia in the ratcomparison with nitrous oxideoxygenisoflurane［J］. Masui，2000，49：130138.
［4］ 甘国胜，姜立，陈利民，等.异丙酚预处理对全脑缺血再灌注大鼠损伤和神经行为学的影响［J］.中国临床康复，2006，10（38）：7981.
［5］ 陈婷婷，王刚，周琪，等.异丙酚和异氟烷在瓣膜置换术中对脑保护作用的比较［J］.中国体外循环杂志，2007，5（2）：9193.
［6］ George P，Charles W.The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates［M］.Fifth Edition.San Diego:Elsevier Academic Press，2004：98116.
［7］ 罗焕敏.海马结构从形态、功能到可塑性、衰老性变化［J］.神经解剖学杂志，1996，12（2）：177184.
［8］ 姚志彬.海马——研究神经科学的理想模型［J］.广东解剖学通讯，1989，11（1）：1721.
［9］ Kins SM，Zinnerman M，Garner C，et al.Modulation of tau phosphorylation and intracellular localization by cellular stress［J］.Biochem J，2000，345：264.
［10］ 吕心瑞，潘娅，李清春，等.神经生长因子对拟AD大鼠脑内神经原纤维缠结的影响［J］.贵阳医学院学报，2006，31（3）：211215.
［11］ Gagliardini V，Fernandez PA，Lee RK，et al.Prevention of Vertebrate neuronal death by the crma gene［J］.Science，1994，263：826828.
［12］ Golstein P.Controlling cell death［J］.Science，1997，275：10811082.
［13］ Lam M，Dubyak G，Chen L，et al. Evidence that Bcl2 represses optosis by regulating endoplasmic reticulum associated［J］. Calcium luxes，1994，91：65696573.
［14］ 秦晓辉，米卫东，张宏，等.异丙酚对神经元缺氧损伤的保护及其作用机制［J］.中国药理学通报，2003，19（9）：10241027.
关键词：文化；人类学；危机；生命文化学
众所周知，人类学家宣称，人类学是关于人类历史的科学。美国的人类学研究传统分为四支（特别是在Boasians的研究推动之后）：生物人类学、考古人类学、语言人类学和文化人类学[1]。Robert Borofski（2002）的研究揭示出来，在文化人类学的子分支之间的联系已经非常薄弱[2]。人类学的分支越来越专一化。过度的专业化是人类学面临的一个问题。
人类学面临的第二个问题是“文化”这个词本身。20世纪初，人类学家把人类学界定为关于文化的科学，而现在人类学家逐渐变为文化研究方面的专家[3]。人类学家把文化界定为他们用来研究世界上不同人类群体的生活方式的理论、认识论和方法论的工具。大量关于文化的概念起源于20世纪的上半个世纪[4]。尽管文化的概念众多并且没有确立一个统一的标准，但是人类学家普遍承认这样的假设：文化是后天习得的，基于符号的历史产物。换句话说，文化与自然相对，拥有自己存在和进化的方式。
而到了20世纪下半叶，文化达到了一种滥用的程度，尤其是被“种族中心论”的人误用。Adam Kuper陈述了它的成功：“现在每个人都进入到文化中来。”[5]换句话说，我们正在见证这个世界的文化膨胀。
Keesing在1974年预测了未来的研究热点：“‘雅诺马米文化’、‘日语文化’、‘文化的发展’、‘自然与文化’：我们的人类学家仍然使用这个词，我们仍然认为这意味着什么。但是从灵长类动物存在的学习传统，使用工具和操纵符号，我们再也不那么肯定文化符号的习得性遗传是人类所独有的了。”
仅仅一年后，Edward Wilson出版了《社会生物学：新的综合》。他定义社会生物学为“所有社会行为生物学基础的系统研究。[6]”同时，他宣称社会生物学的目的是“利用当代综合进化论的成果重新规划社会科学。[7]”
自从70年代以来，所谓的进化派社会科学一直在学术界中发展和传播。我用“进化的社会科学”这一标签来称谓用进化论的方法来研究人类文化的那一派研究。这个标签反映了在科学和社会科学研究前沿的交叉，现在有很多学者使用这个词。在进化的社会科学领域最先进的无疑是社会生物学、进化心理学、人类行为生态学，人类行为学，模因论、以及“基因――文化”共同进化的的方法。上述学科的代表发展了他们自己关于文化的概念，我们称之为文化进化论。
那么，早期文化人类学家把文化定义为一种后天习得的基于符号的历史产物，而社会生物学家的定义则是完全对立的，他们认为文化是一种生物学上的适应性，或者说文化是符合“自私的基因”的利益的。进化心理学和人类行为学中也有关于文化的类似表达。
人类行为生态学和“基因――文化”共同进化理论，都在文化人类学对立的角度使用文化的概念，但是在研究方法上两者有所不同。他们认为文化不是生物适应的产物，基因并不能操纵文化。
在行为生态学中文化是在某种特定的生态环境下生物最大化自己繁殖度的适应性策略。他们在人类行为的水平上研究文化；他们认为文化是一种对于当地生态环境和社会文化环境的适应型策略（SmithWinterhalder1992）.那么，文化是一种行为的适应性。
共同进化方法包括基因和文化之间的相互动力系统。例如，William Durham已经列出了基因与文化作用的五种关系（1991）：cultural mediation（文化调节），genetic mediation（基因调节），enhancement（增强），neutrality（中立）and opposition（反对）.前三种是互动的，后两种是比较的（Durham 1991，205207）。总之，他认为两者在互动中可能会影响到对方。基因与文化的关系将参照：（1）相同的目标（增强）；（2）矛盾的目标（反对）；（3）不同，但目标并不矛盾（中立）。文化不能解释为基因进化的产物。在协同进化理论中，文化是基因与社会文化环境协同进化的产物。
在前面的论述中，我概述了目前的被看作是整体科学的人类学中的危机。首先是，人类学的过度强调分支化和跨人类学的薄弱的合作性。其次，危机的根源是，文化概念在人类学中的滑坡，它被指责将西方的工具加在非西方的社会中的一种中心主义的建构。第三个根源是，“文化”这个概念的膨胀，人类学成功地给出“模因”，并认为它承载了一个更为宽泛的意义，它最终将涵括任何东西。并且如果是在这种意义上，文化实际上是一个空洞的词汇。危机的最后一个根源是，在进化社会科学中对文化这个概念的宽泛的讨论。它的表征是从人类学意义上来使用这个概念，但是一般来说，这并不是一个合适的背景。
基于文化学理论框架的生命文化学，方便了人们对进化社会科学和人类学的理解，生命文化学是一个文化学的分支。生命文化学这个概念是由美国人类学家伊诺・若斯在1980年提出的，它是一个物理人类的分支的标签，主要是从文化人类学的观点，来关注文化和生物现象。生命文化进化从文化属于非生物学的适应性这个前提出发，将人类与其它生物区分开来，但是它并不意味着，人类独立于他过去的进化。
相反，文化有它进化的根源，人类是被他的特征所决定的，并且建立在人类基因的生物进化过程中。另外，生命文化学处理一种更为宽泛的主题包括动物和人类的不同。生命文化学进一步研究的是生物和文化适应性及进化之间的关系，分析社会生活的主要因素，并关注后天PK先天讨论的结论。生命文化学可以从文化人类学的传统这一方面和从进化社会学另一方面，为了支持人类作为生命文化个体的整合性研究。简单来讲，生命文化学采用了从科学和社会科学中认识的相关的发现并从文化角度来进行解释。
生命文化学对于目前的人类学在三个方面的难题起作用。首先，生命文化学支持科学和社会科学的交叉性学科的合作性研究。其次，它将文化看作是在科学对人的研究中理论上、认识论上和方法论上的工具。最后，它方便了对人类学和进化论方法在文化的研究上，对人类本质的二分的难题的克服。
[参考文献]
[1]Kuper，Adam（2000）：Culture：Anthropologists’Account.Cambridge：Harvard University Press.
[2]Kuper，Adam（2000）：Culture：Anthropologists’Account.Cambridge：Harvard University Press.
[3]Borofski，Robert（2002）：The Four Subfields：Anthropologists as Mythmakers.American Anthropologist，104（2），s.463480.
