时间：2022-04-10 14:30:49
开篇：写作不仅是一种记录，更是一种创造，它让我们能够捕捉那些稍纵即逝的灵感，将它们永久地定格在纸上。下面是小编精心整理的12篇血清学检测，希望这些内容能成为您创作过程中的良师益友，陪伴您不断探索和进步。
方法：对医院送检的383例高胆红素血症新生儿血液标本进行“三项试验”，即直接抗人球蛋白试验、游离抗体试验、抗体释放试验。
结果：383例新生儿溶血病患者中，直接抗人球蛋白试验阳性率为53.12%，游离抗体试验阳性率为71.54%，抗体释放试验阳性率为83.29%。
结论：释放试验敏感度最高，是判定新生儿溶血病最有力的实验室证据。
关键词：幼红细胞增多症 胎儿 血清学 直接抗人球蛋白试验 游离抗体试验 抗体释放试验
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.08.538
【中图分类号】R9 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2013）08-0463-02
新生儿溶血症（hemolytic disease of the newborn，HDN）是指母婴血型不合，母体血液中针对胎儿红细胞的免疫抗体IgG通过胎盘进入胎儿循环，发生同种免疫而引起的溶血。在人类已发现的血型系统中，以ABO血型系统不合引起的新生儿溶血病最常见，其次为Rh血型系统。新生儿溶血病的临床表现轻重不一，取决于抗原性的强弱、个体的免疫反应、胎儿的代偿能力和产前的干预措施等因素。Rh溶血病临床表现较为严重，进展快，而ABO溶血病的临床表现多数较轻。Rh溶血病一般不发生在第一胎，而ABO溶血病可发生在第一胎。HDN的血清学检测对该疾病的临床诊断具有重要的价值。笔者就我市近年来发生的383例HDN的血清学检测结果分析报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源。2010年1月～2013年1月本市4家医院送检的临床高胆红素血症或母亲血型为Rh阴性的HDN患儿383例，标本为患儿及母亲血液。
1.2 试剂。抗-A（B）血清（长春生物制品研究所）；抗-D、抗人球蛋白试剂（广谱）、单克隆IgG、单抗C3（上海市血液中心）；ABO标准红细胞（本站自制）。
2 结果
383例新生儿溶血病患者中，直接抗人球蛋白试验阳性率为53.12%，游离抗体试验阳性率为71.54%，抗体释放试验阳性率为83.29%。
3 讨论
3.1 发病原因。由于母亲的血型与胎儿（或婴儿）的血型不合，如Rh血型不合或ABO血型不合引起同族免疫性溶血病，Rh血型不合所致溶血常较ABO血型不合为严重。
3.1.1 Rh血型不合。Rh血型不合引起的新生儿溶血症在中国的发病率较低。通常是母亲为Rh阴性，胎儿为Rh阳性而血型不合，并引起溶血，一般第一胎不发病，而从第二胎起发病，但如果Rh阴性的母亲在第一胎前曾接受过Rh阳性的输血，则第一胎也可发病。
3.1.2 ABO血型不合。该病以ABO血型不合最常见，其中最多见的是母亲为O型，胎儿（或婴儿）为A型或B型。第一胎即可发病，分娩次数越多，发病率越高，且一次比一次严重。尚可见于母亲为A型，胎儿（或婴儿）为B型或AB型，或母亲为B型，胎儿（或婴儿）为A型或AB型，但少见。胎儿（或婴儿）为O型者，可排除该病。
3.2 发病机制。胎儿由父亲方面遗传来的显性抗原恰为母亲所缺少，胎儿血因某种原因进入母体，母体产生相应的IgM抗体，当胎儿血再次进入母体，母体发生次发免疫反应，产生大量IgG抗体，通过胎盘进入胎儿，使胎儿、新生儿发生溶血。只要0.1～0.2ml的胎儿红细胞进入母体循环就足以使母亲致敏。
3.2.1 Rh血型不合溶血病。多数是母亲为Rh阴性，但Rh阳性母亲的婴儿同样也可以发病。第一胎发病率很低，因为初次免疫反应产生IgM抗体需要2～6个月，且较弱，不能通过胎盘进入胎儿体内，而胎儿红细胞进入母体多数发生在妊娠末期或临产时，故第一胎常处于初次免疫反应的潜伏阶段。当再次妊娠第2次发生免疫反应时，仅需数天就可出现，主要为IgG能通过胎盘的抗体，并能迅速增多，故往往第二胎才发病。Rh系统的抗体只能由人类红细胞引起，若母亲有过输血史，且Rh血型又不合，则第一胎也可发病。母亲的母亲（外祖母）为Rh阳性，母亲出生前已被致敏，则第一胎也可发病，此即外祖母学说。
3.2.2 ABO血型不合溶血病。多数是母亲O型、胎儿A型或B型；少数为母亲A型、胎儿B型或AB型，或母亲B型、胎儿A型或AB型时发病。因为A或B型母亲的天然抗A或抗B抗体主要为不能通过胎盘的IgM抗体，而存在于O型母亲中的同种抗体以IgG为主，因此ABO溶血病主要见于O型母亲、A或B型胎儿。ABO溶血病可发生在第一胎，这是因为食物、革兰阴性细菌、肠道寄生虫、疫苗等也具有A或B血型物质，持续的免疫刺激可使机体产生IgG抗A或抗B抗体，怀孕后这类抗体通过胎盘进入胎儿体内可引起溶血。由于A和B抗原也存在于红细胞外的许多组织中，通过胎盘的抗A或抗B抗体仅少量与红细胞结合，其余都被其他组织和血浆中的可溶性A和B血型物质的中和和吸收，因此虽然母婴ABO血型不合很常见，但发病者仅占少数。
在383例新生儿溶血病患者中，抗体释放试验阳性率（83.29%）、游离抗体试验阳性率（71.54%）与文献报道的释放试验阳性率为88.0%、游离试验阳性率为69.16%大致相同，但直接抗人球蛋白试验阳性率（53.12%） 高于文献报道（39.12%），可能与所用试剂、仪器及血样采集时机和来源不同有关[1]。研究结果证实释放试验是“三项试验”中敏感度最高，也是判定HDN 最有力的证据[2]。抗体释放试验操作比较繁琐，耗时较长，在实际工作中应仔细认真，否则可能得到错误的结论。研究结果还表明，直接抗人球蛋白试验比游离抗体试验更具有诊断价值，因为，直接抗人球蛋白试验阳性说明红细胞已经被血清中的游离抗体致敏。在383例的HND患者中，“三项试验”结果分布规律为直接抗人球蛋白试验、游离抗体试验、抗体释放试验同时呈阳性所占比例较低；游离抗体试验、抗体释放试验均阳性所占比例次之，抗体释放试验阳性者占比例最高。单是直接抗人球蛋白试验阳性者，就可以确认HDN。如果单是直接抗人球蛋白试验阴性，还需要做游离试验或者释放试验进一步确诊。
参考文献
方法：选取我院2010年5月至2012年5月38例正定型为O型的待检标本，分别对其血型亚型的血清学检测结果进行统计学分析。
结果：检出A亚型占26.2%；B亚型占73.8%，两组检出率对比差异明显（P
结论：对ABO血型亚型进行血清学检测和鉴定，可以有助于降低对亚型患者进行输血时的风险性。
关键词：ABO血型亚型血清学检测输血安全
【中图分类号】R-1【文献标识码】B【文章编号】1671-8801（2013）04-0307-01
ABO亚型由于红细胞上的A或者B抗原相对较弱，往往在献血者/患者交叉配血不相合或者正反定型不相符的情况下方才发现。本文通过观察分析ABO血型亚型检测及血清学特点，总结其临床意义如下：
1资料与方法
1.1一般资料。选取我院2010年5月至2012年5月38例正定型为O型的待检标本，分别对其血型亚型的血清学检测结果进行统计学分析。均排除由其它原因导致的正反定型不符的患者。男有20例，女有18例，年龄在25～71岁，平均年龄为40.5±4.9岁。
1.2方法。
1.2.1血型血清学检测方法。①严格质控下使用全自动血型/配血系统，规范进行血型检测。②ABO血型系统抗体和红细胞ABH抗原试管法检测：取4个洁净试管，先做好标记，分别向试管内加入抗-H、抗-AB、抗-B、抗-A血清，在疑似A2亚型时还需多加一个试管，加入抗-A1血清，并对每个待测试管中加入1滴3～5%的被检红细胞盐水悬液，轻轻混匀后，使用离心机以1000r/min的转速进行离心试验15s，再取出4个洁净的试管，同样做好标记后，往里面滴入2滴经离心试验后的被检血清，还需要在每个试管中再加1滴3～5%的A1或A2或Bc或Oc的试剂红细胞，再次使用离心机以1000r/min的转速进行离心试验15s，观察试验结果。
1.2.2放散与吸收试验。①吸收试验：使用生理盐水对压积红细胞1ml进行洗涤≥3次，最后1次洗涤后，将试管中的红细胞沉淀后的上清液尽量弃掉，然后在试管中加入抗-A血清或抗-B血清1ml，充分混匀后，放置在4℃下进行2h孵育，期间保持对试管进行轻摇，充分混合抗体血清和红细胞；再使用离心机以1760r/min的转速进行离心试验5min，将血清与红细胞分开放入2个不同的洁净试管中，对红细胞使用4℃的生理盐水进行洗涤，最后一次洗涤后再次使用离心机进行离心试验分离出上清液，最后采取3%的反定细胞对其中残留的游离抗体进行检测。②热放散试验：对经过等体积生理盐水洗涤并经过上述吸收试验后的红细胞，给予56℃下进行热放散试验，取出上清液并均分为3份，分别标记为A、B、O试管，并对应加入1滴试剂红细胞，观察试验结果。
1.2.3凝集机制试验：属于分泌型的患者给予唾液ABH物质测试，分别取4个洁净的硬质塑料试管，分别为生理盐水、非分泌型标本、分泌型标本、受血者标本，并分别滴入50μl经倍比稀释后为2+抗体强度的血清，放置在室温下进行10min孵育，然后对每个试管中加入50μl的经洗涤后3～5%的ABO标准红细胞悬液，放置在室温下进行30min孵育，接着使用离心机以1000r/min的转速进行离心试验15s，观察试验结果。
【中图分类号】R737．31
【文献标识码】A
【文章编号】 1673-7555[2007]01-0045-03
卵巢恶性肿瘤是女性生殖器三大恶性肿瘤之一，因卵巢位于盆腔内，癌早期无症状，一旦出现临床症状，常失去治疗时机，故急需寻找一种早期正确诊断的方法。近年研究发现卵巢癌患者血清中含有肿瘤相关因子，来源于原发肿瘤的DNA。由于血清标本来源方便和非侵入性等优点逐步替代组织学肿瘤标记的检测。肿瘤的发生是由遗传因素及环境因素两方面决定，可以检测卵巢癌患者血清中遗传学改变，为卵巢癌早期诊断及预后监测提供新依据。
1肿瘤患者血清中基因改变的研究
1．1血清游离DNA的来源 上世纪60年代，首次在红斑狼疮患者血浆中发现游离DNA及其抗体，近年研究发现恶性肿瘤患者血清及血浆中DNA含量明显高于良性疾患，并在恶性实体肿瘤患者血清DNA中检测到与相应的原发肿瘤相一致的细胞遗传学改变，从而使外周血DNA的研究受到了前所未有的重视。关于肿瘤外周血DNA的来源及其发生机制主要有以下四种假说。①循环肿瘤细胞或微转移灶的裂解：据推算，在胰腺癌患者血清中如果能测及DNA时，每毫升血液中至少含有1000～10000个肿瘤细胞，显然外周血中没有足够的肿瘤细胞产生如此高水平的DNA，故这种假说不能完全解释肿瘤患者外周血中DNA的来源。②肿瘤细胞的坏死；有证据表明在瘤体较大的患者或发生转移的晚期患者的血浆中可以检测到高水平的外周血DNA，因此推测外周血DNA有可能来源于肿瘤细胞的坏死。可是有些早期肿瘤患者能检测到外周血DNA，而且肿瘤患者在接受化疗时外周血DNA不因肿瘤细胞坏死而增加，有时反而明显降低，故肿瘤细胞的坏死亦不是外周血DNA的惟一来源。③肿瘤细胞的凋亡：由于血浆DNA电泳后表现出凋亡细胞所特有的梯度条带，一些学者提出了外周血DNA来源于肿瘤细胞凋亡的观点。④细胞自发性释放DNA：淋巴细胞或离体培养的器官能通过一种自我平衡机制自发释放白复合物，并优先释放细胞内新合成的DNA。据此有学者推测肿瘤循环DNA可能也会以同样方式释放人血。目前，关于肿瘤患者外周血DNA的来源还不能具体确定，具体来源及机制还有待于今后的实验研究进一步证实。
1．2卵巢癌患者血清游离DNA微卫星变化的研究近年研究表明，血清中游离DNA存在着微卫星变化，微卫星变化包括微卫星位点杂合性丢失(Lossof-Heterozy2gosity，LOH)和微卫星不稳定(mierosate insta－biliry，MS1)，微卫星不稳定性(MS1)是近来发现恶性肿瘤普遍存在的现象[2,3]，是继癌基因激活和抑癌基因失活后又一新的肿瘤发生机制。微卫星(mierosat－ellite，MS)是短串核苷酸的简单重复序列，重复单位为2～6个核苷酸，重复次数在20～100左右。MSI是在DIMA复制过程中，由于删A链的滑动，导致MS中重复单位的插入和缺失，引起任何MS长度的改变，出现新的微卫星等位基因。MSI是人类错配修复基因变异导致基因组不稳定的重要表现形式。近年来，大量文献提示了卵巢瘤组织的3p、6q、8 q、9q、13q、X染色体微卫星位点均有频繁的等位基因杂合性丢失(LOH)，且该类染色体特定或附近区域可能存在着某些与卵巢癌相关的候选抑癌基因。现将其部分研究结果总结叙述如下：
1．2．1卵巢癌患者血清DNA与肿瘤组织DNA3号染色体(3p14．25)变化 肿瘤分子生物学的深入研究表明，卵巢癌组织中出现高频率的3号染色体短臂(3p14，25)等位基因缺失，提示该区域可能存在与卵巢癌相关的抑癌基因[7,8 3]。张华等[9]研究以卵巢癌患者血清标本为DNA来源并结合相应的癌组织标本，分别对3p14，25的4个微卫星位点，(D3S1029、D3S1228、D3S1300、D3S1481)进行杂合性丢失检测，其研究结果表明：卵巢癌的发生与卵巢癌患者血清DNA与肿瘤组织DNA3p14，25出现杂合性丢失密切相关，血清3p14，25出现杂合性丢失率与卵巢癌恶性程度有关。在3014－21区域存在着SEMA3B、RASSF1A等抑癌基因。Xiang R及Tsc等[10]。研究发现在多种恶性肿瘤包括肾瘤、肺癌、等恶性肿瘤中均出现该区域多个微卫星位点的LOH。徐军等研究3号染色体(3p14)等位基因的LOH，他们选择3014上的3个微卫星位点(D3S1234、D3S1300、D3S1312)，结果在所检测的样本中发生至少1个位点缺失的百分率为67．7％，发生2个微卫星位点缺失的为35．5％。
1．2．2卵巢癌组织17号染色体(17p13．1，17 q211)的微卫星不稳定性(MSl)梁惠琪、关明等利用新鲜卵巢癌组织及癌旁正常组织的DNA中，用聚合酶链反应(PCR)扩增17号染色体上5个微卫星位点，它们都是(cA)n二核苷酸重复序列，D17S513、TP53、D17S855、D17S806和D17S579，分布于17号染色体不同位置。D17S513位于17号染色体端粒处，TP53定位于17013．1，在p53附近，D17S855、D17S806和17S579定位于17q21．1，在BRCA 1附近。用单链构象多态性(Single St rand Confo rmat ion Po lymo rphism，SSCP)分析法检测微卫星不稳定性(MSl)，并用银染方法显示结果。其结果表明17号染色体定位于抑癌基因BRCA 1附近的3个微卫星位点以及p53附近的微卫星位点均频繁地出现MSI。证实了频繁发生微卫星不稳定的染色体区域附近，可能存在抑癌基因，并且有可能引起抑癌基因功能的丧失。
1．2．3卵巢癌患者血清DNA抑癌基因BRCAI／TP53基因杂合性丢失LOH) 高海峰、傅士龙等选用了位于17号染色体上的两个抑癌基因BRCAI及TPP3中四个微卫星位点对卵巢癌患者血清DNA及其相应肿瘤组织DNA的BRCA1／TP53等位基因杂合性丢失(Loss of Heterozy 2 gosity，LOH)的研究，结果提示卵巢癌患者血清DNA与肿瘤组织DNA中BRCM及TP53基因LOH密切相关，从而证实了卵巢癌患者血清DNA主要来源于原发肿瘤组织。近年来的研究表明肿瘤患者血液NA浓度显著高于正常人群，并提示体液包括血清、血浆及腹水。DNA中高频率遗传学标志变异的检测对于监控疾病具有一定的临床意义，因此血清DNA微卫星变异分析被人们认为是一种具有潜在性临床应用价值的分子检测方法。
2卵巢癌患者血清蛋白质类改变的研究
卵巢癌患者血清中蛋白类异常改变主要为促进
细胞增殖因子、促进新血管形成的因子及各种酶类异常表达。实体肿瘤是依赖血管性肿瘤，血管为肿瘤提供营养和转移途径，在没有新生血管之前，肿瘤只能生长到1～2mm，不能发生转移，在新生血管后，肿瘤会呈指数倍增长，转移机会也随之增加。现就与实体肿瘤血管形成密切相关的两个因子进行叙述，即血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)：
2．1血管内皮生长因子(VEGF) VEGF是已知的作用最强、最专一的血管生成促进因子之一。Pdlar等[16]分析了68例临床Ⅰ、Ⅱ期的卵巢癌患者的VEGF表达水平，发现VEGF阳性者平均生存期为22个月，而阴性者的平均生存期大于108个月，两者的平均生存期限有着极显著性差异(P
2．2碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblasffactor，bFGF)是一种具有促进有丝分裂，能够促进包括内胚层、中胚层和神经内胚层来源的多种细胞和组织生长、分化，同时具有促进伤口愈合、组织修复和血细胞生成等生理功能。bFGP可能通过下面两种主要机制参与肿瘤的形成和发展：①通过过表达bFGP，而以自分泌和旁分泌方式促进细胞过渡增殖和肿瘤生长。②通过促进新生血管形，为肿瘤细胞生长提供丰富营养。李萍、李新鸣等研究发现卵巢癌CAOV3细胞经bFGF处理，细胞增殖比明显增加，且与bF6P水平呈剂量依赖关系。
3卵巢癌患者血清检测的意义及前景
【关键词】 脂肪肝；肝功能；血脂血清学指标；诊断；应用价值
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2017.15.020
随着人们生活水平的提高， 饮食结构的改变， 临床脂肪肝的发病率呈上升趋势。由于脂肪肝患者无明显的临床症状， 但其肝功能和血清学指标发生变化[1]。本次研究选取2016年1～8月本院收治的42例脂肪肝患者作为研究对象， 探讨肝功能和血脂血清学指标检测在临床诊断脂肪肝的应用价值， 现报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 选取2016年1～8月本院收治的42例脂肪肝患者作为研究对象， 将其设为观察组， 纳入标准：患者肝脏经影像学检查， 符合弥漫性脂肪肝的诊断标准；经活检符合中华医学会肝脏病学会中脂肪肝的诊断标准[2]；同时选取同期在本院接受健康体检的40例健康者作为对照组， 两组受试者对本次研究知情且均已签署知情同意书。观察组中男24例， 女18例， 年龄21～70岁， 平均年龄（42.1±10.5）岁；
对照组中男23例， 女17例， 年龄22～72岁， 平均年龄（42.9±
11.7）岁。两组受试者性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。
1. 2 方法 清晨在受试者空腹状态下抽取5 ml静脉血， 应用离心机进行离心， 离心速率为3000 r/min， 将血清储存于冰箱中-20℃储存， 应用全自动生化分析仪（厂家：罗氏， 型号AU5400）， 按照试剂盒上说明书进行操作。
1. 3 观察指标 对两组AST、ALT、TC、TG、LDL-C、HDL-C指标进行观察并比较。
1. 4 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检测；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检测。P
2 结果
2. 1 两组受试者的肝功能血清学检测结果比较 观察组AST、ALT水平分别为（82.25±4.54）、（57.35±6.46）U/L， 均明显高于对照组的（42.22±3.56）、（26.04±3.35）U/L， 差异具有统计学意义（P
2. 2 两组受试者的血脂血清学检测结果比较 观察组TG、TC水平均明显高于对照组， 差异具有统计学意义（P0.05）。见表2。
3 讨论
近年来脂肪肝疾病发病率呈上升趋势， 给人们的身体健康构成严重威胁。肝脏是人体代谢主要器官， 肝脏功能下降时， 机体的转运功能明显降低， 肝脏内脂类物质沉积， 导致脂肪肝的发生[3]。脂肪肝的临床表现呈现多样化， 常见的有恶心呕吐、食欲下降、上腹隐痛等， 若不及时治疗可能发展为肝硬化甚至危及生命， 早期诊断对临床治疗有非常重要的作用[4]。
临床应用肝活组织进行穿刺检查， 给患者带来极大的痛苦， 且风险较大。应用肝功能和血脂血清学检查， 该方法无创， 且ALT和AST能反应肝细胞的受损程度。本次研究结果表明， 观察组AST、ALT、TG、TC水平均明显高于对照组， 差具有统计学意义（P
综上所述， 通过检测肝功能和血脂血清学等指标， 能反映脂肪肝患者的病情， 给临床诊断提供理论依据。
参考文献
[1] 刘云霞.脂肪肝诊断中肝功与血清学指标检验的应用价值分析.临床医学研究与实践， 2016， 1（17）：88-89.
[2] 张晓红.肝功与血脂血清学指标水平检测在脂肪肝诊断中的应用分析.中外医学研究， 2015， 13（10）：56-58.
[3] 邢敏， 杨自力.血脂、血糖、肝功能等生化指标联合超声诊断脂肪肝及评估其预后的价值.肝脏， 2016， 21（4）：327-328.
关键词：血清学方法；包虫病；预防控制
包虫病多见于新疆、内蒙和青海等农牧区，导致棘球绦及其幼虫寄生人体的原因有农牧民习俗和等原因。随着包虫病感染病例的增多，也使得医疗机构提高了预防控制包虫病流行的力度。而影像检查技术不容易及时发现囊肿或肿块从而导致误诊，本文将探讨通过检测包虫病患者血清的免疫学方法对该病进行检测，以达到预防控制包虫病流行的效用；现报道如下。
1资料与方法
1.1抗原与血样 从新宰绵羊肝脏或肺脏提取棘球蚴囊液，用pH 9.6的碳酸盐稀释使其蛋白质含量达到50 μg/ml；采用预包被板和包虫病抗体检测试剂盒等。血样采自流行病学调查现场，经我B超和X线检查确诊的120例包虫病患者的血清各取5 ml，也抽取非包虫病体检者阴性血清作为参照，血清经分离后保存待用。
1.2检验方法 检测方法有：点酶联免疫吸附检验（Dot-ELIS）和微量间接血凝检验法（IHA），酶联免疫吸附检验（ELISA）和EM18免疫印渍检验（EM18-ELIB）。②Dot-ELIS检验将抗原吸附在PVC反应板表面，待充分反应后用洗涤法彻底清除游离残余。②IHA检验抗原载体经金属阳离子静电作用让蛋白质与红细胞表面结合达到致敏效果，并在微量滴定板上以1：64比例稀释再加入致敏红细胞悬液1滴，混匀1～2 h后观察红细胞凝集程度以确定阳性反应孔为滴度终点。③ELISA检验将棘球蚴囊液抗原稀释至每孔内含蛋白质10 μg/ml，其中IgG抗原酶结合物工作浓度为1：200。显色采用TMBS底物，阳性临界值以x+3s≥阴性为对照。④EM18-ELIB检验抗原采用泡型包虫原头蚴粗抗原，SDS-PAGE电泳结束后再转至NC膜制成抗原膜条，再用所制成的抗原膜条做Western Bolt检验，血清稀释比例为1：100，IgG抗原酶结合物按1：100比例稀释然后经BA底物显色反应后，若8 kDa处出现反应带可判断为阳性。
1.3数据处理 采用SPSS17.0软件处理实验数据，计量资料使用（x±s）表示，进行t检验；计数资料使用χ2检验；以P
2结果
2.1不同血清检验方法的检测结果 经B超和X线影像学检测确诊的120例包虫病患者，应用不同血清检验方法检查的结果中，囊型包虫病和泡型包虫病各有109例和11例，其中对泡型包虫病使用Dot-ELIS、IHA、ELISA该3种血清检验法与B超和X线影像学检测结果等同，Dot-ELIS、IHA、ELISA和EM18-ELIB这4中血清检验法也与上述检测方法所得出的结果等同，见表1。
2.2不同血清学方法对包虫病患不同位置的检测结果 肺脏包虫病患者应用囊型包虫抗原IHA检测血清阳性率低于其它部位血清阳性率，但Dot-ELISA检验和IHA检验及ELISA检验所检出的血清阳性率相近，见表2。
3讨论
包虫病容易寄生于人体组织和器官以至于临床难以依据病原学进行确诊，所以临床对于包虫病的检测通常将查体和影像学以及免疫学等检验结果做综合性判断。影像学检验虽然能够有较高检出率，但影像检查技术不容易及时发现囊肿或肿块从而导致误诊。而包虫病作为地方性疾病，由于感染病例的增多也相应提高临床对其的重视程度。
本次探讨中不同检验方法对囊型和泡型包虫病敏感程度也不尽相同，其中Dot-ELISA抗原和IHA抗原对于该两型包虫病的敏感度相似。对泡型包虫病使用Dot-ELIS、IHA、ELISA该3种血清检验法与B超和X线影像学检测结果等同，但ELISA抗原检出囊型包虫阳性率低于Dot-ELISA和IHA检验法，说明该两种囊型包虫生理和生化代谢各异。因此，需要在临床诊断中加强检测的敏感度。
泡球蚴缺乏完整角质层使得故血清中抗多含有囊型包虫病，B超和影像检验出的钙化的囊型或灶型包虫病多分布于肝、肺2脏，血清学检验方法不易检出的原因，通常为包虫囊肿生长受到抑制后出现退行性改变，减少了血清抗体滴度导致血清学方法难以发现特异性抗体[1]。此外，还需看到本次检测结果中还存在肝脏、肺脏的囊块符合影像征象，但3种血清学检查结果均不支持该结果，这也说明对包虫病的诊断需综合临床和各类检验结果做出判断。
本次探讨可见囊型和泡型该2型包虫病的致病性及诊疗方法各异，也导致了临床需审慎做出判断。在钙化的灶型或囊型中若EM18-ELIB检查为阳性则可考虑为泡型包虫病，而单发单囊包虫患者血清呈阳性则说明囊型包虫也会分泌出EM18抗原，同时也说明种棘球绦虫的生理生化代谢因种类不同其差异也不尽相同[2]。据卢爱桃，郭卫东，宋壮志，等报道[3]，目前通过将泡型包虫的原头节进行分离发现其具有EM2、EM2a和EM18特异性抗原，也说明泡型包虫有特异性较强，与本文所探讨的结果具有一致性。
综上，通过采用不同血清学对包虫病进行检测，并对比各种检查方法的检测结果的敏感度和准确率，便于临床分析各种检测方法的效用，有助于临床对包虫病作出准确的诊疗判断，进而可以起到积极预防控制包虫病的流行的作用。
参考文献：
[1]侯岩岩，赵江山.新疆6～12岁学生包虫病血清学调查分析[J].疾病预防控制通报，2014，29（6）：4-5.
关键词：EB病毒；鼻咽癌；筛查；预测
1 EBV DNA与诊断
1998年泰国Mutirangura等发现鼻咽癌患者血清中可检测出EBV DNA，且检测的阳性率明显高于正常人群[1]。马来西亚Chai SJ等进行的一个多中心回顾性研究，对390例经病理确诊而尚未治疗鼻咽癌患者和41例健康对照人群及31例非恶性疾病患者采用定量PCR方法进行血浆EBV DNA 检测发现，其阳性率分别为89.7% （350/390） ，12.2% （5/ 41）和6.5% （2/31）。中位浓度分别为6582 copies/ml （777-47，035 copies/ml），0 copies/ml和0 copies/ml，p
2 EBV DNA与分期、肿瘤体积
香港的Chan等发现血浆EBV DNA浓度与异基因移植裸鼠肿瘤质量成线性关系[3]，香港的Edward等对21例局部/区域复发或残留的鼻咽癌患者进行手术治疗，手术前中后检测患者的血浆EBV DNA浓度的检测发现，术后患者EBV DNA浓度明显下降[4]。Lo等对10例鼻咽癌患者血浆EBV DNA水平作每天检测发现，所有患者血浆EBV DNA在最初治疗的1w内均出现一过性升高，这种现象与治疗诱导癌细胞死亡释放EBV DNA入血一致。以上均提示了血浆中的EBV DNA来源于原发肿瘤组织中，血浆中的EBV DNA是由鼻咽癌组织中释放入血，因此血浆中EBV DNA的浓度可能反映原发肿瘤的大小。
Chai等观察到早期患者（Ⅰ、Ⅱ期）和中晚期（Ⅲ、Ⅳ期）中位EBV DNA拷贝数分别为2780 copies/ml 和10150 copies/ml。在161例IV期患者中，有远处转移的患者（M1）中位EBV DNA拷贝数为无远处转移的患者9.3倍，（199072 copies/ml 对 21411 copies/ml）[5]，提示血浆EBV-DNA 拷贝数及阳性率与鼻咽癌患者的临床T分期均呈正相关关系。
3 EBV DNA与疗效、预后预测
多个研究发现治疗前EBV DNA水平的高低有重要的疗效评价、及预后预测的作用， Lueng等长期随访376例鼻咽癌患者，多因素分析证实EBV DNA浓度总生存的独立预后因素，研究观察Ⅱ期与Ⅲ期，Ⅲ期与Ⅳ期生存率差异有统计学意义。亚组分析根据EBV DNA水平高低Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期患者分成高危组（>4000copies/ml）和低危组（4000copies/ml），结果显示Ⅰ、Ⅱ期低危组5年生存率（91%）与Ⅰ期患者（92%）相似，而Ⅰ、Ⅱ期高危组5年生存率（64%）类似于Ⅲ期患者（73%），在Ⅲ和Ⅳ期患者中，高水平EBV DNA仍然为不良的预后因素，但总生存率未能与总分期有明显区别。
然而，也有文献报导，血浆EBV DNA清除率，或治疗后EBV DNA水平更能有效判断预后。香港Ngan等对19例复发转移患者进行化学治疗，观察到62%患者在临床复发前17.4w（8～74.5w）已检测到血浆EBV DNA，有远处转移的患者血浆EBV DNA浓度高于局部/区域复发者，挽救性化疗后血浆EBV DNA早期下降至基线水平者疗效好，提示血浆EBV DNA清除率在预测化疗效果中有重要作用。
4讨论与思考
对于复发转移鼻咽癌，血浆EBV DNA清除率、治疗后EBV DNA浓度反映化疗疗效，能早期判断化疗疗效，及时发现无效的化疗方案，尽早更换，为晚期鼻咽癌患者争取宝贵的治疗机会。血浆EBV DNA检测作为鼻咽癌一种无创、成本效益高且准确预测预后的方法，将在我们的临床实践中起着重要的影响。
参考文献：
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[关键词] 乙型肝炎病毒;DNA;ELISA
[中图分类号] R512.6+2[文献标识码] B[文章编号] 1673-7210(2010)06(b)-064-02
The relationship between quantitative detection of HBV-DNA and its serological markers
PENG Jiliang1, WEN Xiuming1, XU Ruihuan2, SHEN Cishi1, HE Chunhui1
(1.Shenzhen Longgang Blood Station, Shenzhen 518172, China; 2. Longgang Central Hospital of Shenzhen City, Shenzhen 518116, China)
[Abstract] Objective: To study the HBV-DNA positive rates under its different serological groups. Methods: 324 HBV serum were detected by ELISA and quatitative PCR technique. Results: The HBV-DNA positive rate was 78.4% (254/324) in HBsAg positive group,and 4.8% (5/103) for HBsAg negative group, the differences between the two groups were statistically significant (P
[Key words] Hepatitis B virus; Deoxyribonucleic acid; Ensyme linked immunosorbent assay
近年来随着分子生物学技术的发展及其在临床应用方面的推广,应用实时荧光定量聚合酶链反应检测 HBV 病毒载量已成为目前临床诊断 HBV 感染的常用指标,进一步提高了检测的质量。同时采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测乙型肝炎病毒HBV标志(HBV-M)简便易行,一直为许多临床科室使用。临床上有必要把此两种方法的检测结果联合起来进行分析,指导临床应用。
1 材料与方法
1.1 研究对象
2009年6～9月来我院住院及门诊的423例患者,年龄13～66岁。所有标本用无菌管留取血样3 ml,于3 h内分离血清,并冻存于20℃冰箱。
1.2 主要试剂
HBV-DNA定量诊断试剂由深圳市匹基生物技术公司提供。HBV-M测定用酶联免疫吸附试验(ELISA),试剂由上海科华生物工程公司提供。
1.3 检测方法
1.3.1 ELISA法按试剂说明书进行。
1.3.2 荧光定量PCR法检测HBV-DNA①样本处理,取待测血清或血浆样本以及试剂及试剂盒中的对照各100 μl,分别加到0.5 ml离心管中,100 μl DNA提取液1,振荡混匀,13 000 r/min离心10 s,25 μl DNA提取液2,振荡10 s,200 r/min离心10 s,100℃干浴或沸水浴10 s,13 000 r/min离心10 s,保留上清备用。②反应体系为40 μl:37.6 μl PCR反应液、0.4 μl Taq酶、0.06 μl VNG及2 μl提取物。③循环条件为:37℃ 5 min、94℃ 1 min、95℃ 5 s,60℃ 30 s 42个循环。荧光信号收集在60℃。
1.3.3 污染的控制标本的处理、试剂的配制、上样及PCR扩增检测严格分室进行,每次检测均设强阳性、临界阳性、阴性、质控试剂参照品。
1.4 检测仪器
美国ABI公司生产的ABI7500荧光定量PCR仪,芬兰Labsystems生产的Multiskan MK 3酶标仪。
1.5 统计学方法
对所得数据进行χ2检验。P
2 结果
2.1 HBsAg(+)组与HBsAg(-)组HBV-DNA阳性率的比较
324例血清标本HBV-DNA表达情况见表1。
表1 HBsAg(+)组与HBsAg(-)组HBV-DNA阳性率的比较(%)
Tab.1 The comparasion of HBV-DNA between HBsAg(+)group and HBsAg(-)group (%)
由表1可见,HBsAg(+)组HBV-DNA阳性率为78.4%,有21.6%的阴性率。HBsAg(-)组HBV-DNA阴性率为95.1%,有4.8%的阳性率,组间差异有统计学意义(P
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2.2 HBV-M不同模式的HBV-DNA检测结果
324例血清标本HBV-M不同模式的HBV-DNA检测结果见表2。
表2 HBV-M不同模式的HBV-DNA检测结果
Tab.2 The results of HBV-DNA under HBV different serological makers
由表2可见血清HBsAg HBeAg HBcAb阳性组合HBV-DNA阳性率为100.0%,拷贝数达到1.61×107拷贝/ml。HBsAg、HBcAb、HBsAg HBeAb HBcAb、HBsAb、HBeAb、HBcAb阳性率依次降低。
3 讨论
酶联免疫吸附试验检测乙型肝炎病毒已成为临床常规。乙肝五项的检测为临床提供一定的信息[1-3],但对HBsAg阴性者,本实验发现有5%的 HBV-DNA阳性,且拷贝数在104拷贝/ml 左右,与某些文献报道相似[4-5]。其原因可能由于:①HBV发生变异,其前S区变异率比S区高2倍;前C/C区变异研究较多。②HbsAg的表达可能较低或其抗原性改变较大,用现有的试剂检测不出。③形成免疫复合物,有人发现血中免疫复合物的存在可能影响HbsAg的检出[6]。
乙型肝炎病毒DNA拷贝数可真实反映HBV感染的状况[7-9],本试验结果为HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)的患者血清,HBV-DNA全部阳性,平均含量为1.61×107拷贝/ml; HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)的患者血清,HBV-DNA阳性率为47.0%,平均含量为3.42×104拷贝/ml;HBsAg(+)HBcAb(+)的患者血清,HBV-DNA阳性率为69.0%,平均含量为6.32×104拷贝/ml,而HBsAb(+)HBeAb(+)HBcAb(+)的患者血清,HBV-DNA阳性率为5.2%,平均拷贝数为4.12×104拷贝/ml,由此可以看出血清中乙型肝炎病毒DNA拷贝数与其血清学指标组合是相匹配的,对乙型肝炎的临床诊断,特别是对其疗效有较大的指导意义[10-11]。本实验发现HBsAg(+)HBcAb(+)的阳性率为69.0%,比HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)的阳性率(47.0%)高,且差异有统计学意义(P
本实验所用的BIO-RADicycler荧光定量PCR技术灵敏度高,操作简单,克服假阳性结果,无需PCR后处理,防污染效果好,可直接反映病毒在体内的存在情况,已为临床普遍应用。血清学ELISA方法是检测病毒侵染机体产生的免疫反应,间接反应病毒的感染状况。对于 HBeAg 与 HBV 病毒载量之间的关系,一般认为两者的水平存在一定程度的一致性。本试验显示两者既有相关,又不尽一致,临床上需要将两者结合起来对患者进行诊断和治疗。
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关键词：乙肝两对半（HBVM）；HBVDNA
【中图分类号】R156.3【文献标识码】A【文章编号】1674-7526（2012）06-0349-02
乙型病毒性肝炎，简称乙肝，是一种由乙型肝炎病毒（HBV）感染机体后所引起的疾病。乙型肝炎病毒是一种嗜肝病毒，主要存在于肝细胞内并损害肝细胞，引起肝细胞炎症、坏死、纤维化。乙型病毒性肝炎分急性和慢性两种[1]。我国目前乙肝病毒携带率为7.18%，其中约三分之一有反复肝损害，表现为活动性的乙型肝炎或者肝硬化。随着乙肝疫苗的推广应用，我国乙肝病毒感染率逐年下降，5岁以下儿童的HBsAg携带率仅为0.96%。HBV-DNA意思是乙肝病毒脱氧核糖核酸。乙肝病毒是一种部分双链DNA病毒，也就是说它的遗传物质是DNA，它载有病毒所有遗传信息，乙肝病毒靠它才可以复制、增殖、繁衍后代。经研究证实，乙肝病毒的裸DNA（没有蛋白质包裹DNA）就有感染性，完成对宿主的侵袭，造成宿主体内出现完整的乙肝病毒颗粒。也就是说HBV-DNA检测相当于完整的乙肝病毒颗粒。因此，HBV-DNA检测是判定乙肝病毒有无复制的金指标。本次研究为了更好的了解乙肝两对半和HBVDNA两者之间的联系，选择从2008年1月到2009年1月期间就诊的患者的320份血清。并将这320份血清随机分为两组，观察组和对照组，观察组使用ELISA方法检测乙型肝炎两对半（HBVM），用PCR方法检测HBVDNA。对照组的HBVDNA和乙型肝炎两对半（HBVM）都采用ELISA法检测并分析[1]。将两种效果进行分析和比较，并将这些资料进行分析研究。现将研究成果报告如下。
1资料与方法
1.1一般资料：选择从2008年1月到2009年1月期间就诊的患者的320份血清。并将这320份血清随机分为两组，观察组和对照组，观察组使用ELISA方法检测乙型肝炎两对半（HBVM），用PCR方法检测HBVDNA。对照组的HBVDNA和乙型肝炎两对半（HBVM）都采用ELISA法检测并分析。
1.2.1检测方法：用ELISA方法检测HBsAg，抗HBc，抗HBs，HBeAg，抗Hbe，用PCR方法检测HBVDNA，各个操作方法和结果的判定按照说明书进行。
1.2.2统计学方法：统计学处理的所有数据均按照SPSS110的软件进行过处理。差异有统计学意义。P
2结果
观察组中就诊的患者的320份血清样品HBVM和HBVDNA检测结果比较，见表1。
2.2用PCR是检测HBVDNA含量较为精准的方法，能够正确反映乙肝病毒的复制水平和活跃程度。
[关键词]核酸检测；血液筛查；输血风险；血液安全；转录介导扩增技术
输血相关传染病的预防和控制是全社会关注的焦点之一。2010年，国家卫生与计划生育委员会（原卫生部）确定在全国15家采供血机构开展核酸检测（NAT）试点工作，以进一步保证血液检测质量，提升我国无偿献血者血液检测水平。到目前NAT技术已经广泛运用于全国各地血站的血液筛检。该技术的检测灵敏度较ELISA检测方法高，能显著缩短病原体检测的窗口期，从而降低输血传播病毒的残余风险50%以上。但NAT技术从理论上并不能完全消除“窗口期”，国外已有经核酸检测后仍发生输血后感染的病例报道，包括HIV和HBV。本中心2010年11月正式将NAT技术应用于血液筛查项目中，对全部无偿献血者血液标本进行HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA核酸检测。本研究通过对无偿献血者血液标本的常规血清学及核酸检测结果的分析，以评估核酸检测的检测功效，以及本地献血者人群的感染状况。现将检测结果报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
2011年1月～2014年12月，广州血液中心采集的无偿献血者血液标本1146740例。所有无偿献血者均符合现行的卫生部《献血者健康检查要求》（GB18467-2011）。血液采集后同时留取核酸检测标本和酶免检测标本管各一支。核酸检测标本采集、保存和处理等均严格按照卫生部核酸检测试点技术要求操作。
1.2主要仪器与试剂
核酸检测仪器：Grifols公司（原诺华诊断公司）PROCLEIX TIGRIS全自动核酸检测分析系统，试剂配置恒温箱（RPI）。试剂为PROCLEIXULTRIO Assay核酸联检试剂盒和核酸鉴别试剂盒（Discriminatory Assay）。核酸检测试剂批号：（593226，614952，624775，116153等）。血清学检测仪器：STAR全自动加样仪和全自动酶联免疫分析仪（FAME24/30）。ELISA检测主要试剂包括乙肝表面抗原试剂盒（法国梅里埃，批号B11FA，20110704；上海科华：批号201101031，201201011，201302011）、丙型肝炎抗体试剂盒（美国强生ORTHO：批号EXE187，EXE208；上海科华：批号201103011，201202031，201303011）及人类免疫缺陷病毒（HIVl/2）抗原抗体检测试剂盒（法国伯乐，批号1F0189，280213，3F0259；北京万泰，批号1201 10204，120121 120，12013 1022）。
1.3检测策略
血液标本采用血清学和NAT并行检测操作策略；对核酸检测单独反应性标本进行分项鉴别试验。
1.4检测方法
采用PROCLEIX TIGRIS 全自动核酸检测分析系统（TMA方法）对血液核酸标本进行单人份联合检测（HIV-1/HCV/HBV）；对核酸检测单独反应性标本进行分项鉴别试验；核酸检测结果反应性结果由检测系统软件自动判定，其判定标准为样本的S/CO值≥1。采用两种不同厂家的ELISA试剂对献血者标本进行血清学HBsAg、HCVAb、HIVAgAb检测，严格执行说明书进行相关操作，通过阴阳性对照及室内质控品来控制试剂盒的质量和检测的有效性；血清学检测结果阳性的判定：样本OD≥cut off值。
1.5检测原理
Grifols核酸检测试剂是以转录介导的扩增（transcription-mediated amplification，TMA）技术原理来检测病毒核酸的方法。其检测基本原理是：利用特异性的目标捕获试剂和磁微珠分离纯化被检测病毒核酸分子，再通过TMA技术来扩增HBVDNA、HCV RNA和HIV-1 RNA（1型）的核酸片断，最后通过杂交保护（HPA）方法检测扩增产物。试剂中含有内标分子，用以监测整个反应过程，避免出现假阴性结果。
1.6统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行处理和分析，对计数资料进行x2检验，P
2结果
2.1血清学与核酸检测结果的比较
对1 146 740例献血者血液标本，核酸检测的阳性检出率为0.97%，低于血清学（HBsAg，HCVAb，H1VAbAg三项之和）的检测阳性率1.66%，二者之间的差异具有统计学意义（x2=2128.4，P
2.2核酸检测
4年中Grifols单人份核酸检测系统的总阳性率为0.97%，并且阳性率呈现逐年缓慢增加的趋势。在对每年的检测阳性率进行比较时，各年度间检测阳性率未见统计学意义（x2=2.442，P
2.3血清学合格标本中核酸检测情况
在1114428例血清学检测合格标本中，单人份核酸检测共检出2457例核酸反应性样本，核酸单独反应性比率为0.22%；在对每年检测阳性率进行比较时，各年度间血清学检测合格标本其NAT检测阳性率之间的差异具有统计学意义（x2=16.506，P
2.4核酸鉴别结果
在2457例核酸单独反应性标本中，鉴别试验反应性的样本为718例，其中，HBV-DNA 711例，HCV-RNA 4例，HIV-RNA 3例，献血者中核酸单独阳性的样本大多属于HBV感染，HBV DNA鉴别阳性率与另外两者间的差异具有统计学意义（x2=2091.464，P
3讨论
目前，国内外应用于血液筛查的核酸检测技术主要有TMA及PCR两种。我中心使用的是Grills公司基于TMA技术的核酸检测试剂，对全部献血者样本进行单人份核酸检测。这种检测方法的灵敏度高，反应条件简单，扩增效率高，可以防止低拷贝的病毒阳性血液的漏检。其分析灵敏度为：HBVDNA 10.4IU/mL，HCV RNA 3.0IU/mL和HIV RNA45.0IU/mL。并且该方法的整个反应过程在1个试管中进行，因此也减少了污染发生的可能。本研究显示，广州地区无偿献血者血液标本的核酸阳性检出率明显低于酶免检测项目阳性检出率（P
在献血者血液筛查中引入核酸检测技术，其主要目的是检测出原有血清学检测可能漏掉的具有感染性的献血者样本。在本研究中的1114428份血清学检测合格标本中，单人份核酸检测共检测出反应性样本2475例，阳性检出率为0.22%（2457/1114428），结果明显高于大连和沈阳地区0.07%，这可能与各地区病毒流行率差异、检测样本数量、使用试剂差异，以及检测模式（单人份与多人份混样检测）不同有关。在对这些核酸单独阳性样本的鉴别检测中，共检出718例阳性结果，鉴别阳性检出率为29.22%。这个鉴别率与汪德海等报道的一致，而低于大连，杭州等地的数据。而出现核酸检测联检反应性，而鉴别试验全部为非反应性的原因可能有：（1）联检结果假阳性。这可能是由于酶免及核酸检测平行进行，检测人员若操作不规范，导致阳性标本的小范围污染，增加联检结果假阳性的可能；或由于检测试剂本身的非特异性反应。（2）鉴别试验的假阴性。如病毒浓度处于极低的浓度水平，由于病毒颗粒在血浆中的泊松分布，导致取样时未能吸取到带有病毒的样本；或可能是因不合适的储存条件，不良的运送，干扰物质的存在，导致样本中病毒的降解，也会造成鉴别试验假阴性的结果。由于我国乙肝的流行率相对较高，因此献血者中核酸单独阳性的样本大多属于HBV感染。而HBV感染，特别是隐匿性乙肝感染（OBI）的病毒浓度通常很低，因此出现上述低浓度样本的可能性很大。已有文章报道，对于不可鉴别的样本，采用其他核酸检测方法，或乙肝感染标志物（如乙肝核心抗体）进行检测时，部分样本仍然呈现阳性结果。提示这些不可鉴别的样本中存在一定比例的真阳性。
【关键词】梅毒;检测方法;临床意义
【中图分类号】R994.1【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)10-181-2
梅毒(Syphilis)是一种慢性接触性传染病。梅毒的病原体是苍白螺旋体(Treponema pallidum),是一种对人有严重致病性的螺旋体,能侵犯任何器官,产生各种症状。梅毒螺旋体只感染人类,故梅毒是唯一的传染源[1]。其传染途径,后天性梅毒主要通过传染,少数可通过接吻传染,也偶有通过胎盘传给胎儿而致病。得不到治疗的梅毒患者,在感染后一年内,其传染性最大,病期越长,传染性越小。感染四年后,通过性接触一般已无传染性,但仍可胎传[2]。本研究选用常用的RPR和TPPA2种方法同时对87例早期梅毒血清进行检测,比较梅毒检测实验方法的灵敏度和特异性。
1材料和方法
1.1一般资料:本组资料根据经我院皮肤性病科自2006年7月-2009年2月收治的65例确诊患者,其中男性患者42例,占64.62%,女性患者23例。最小年龄21d,最大年龄53岁,平均年龄为32±4.2岁。I期梅毒29例,Ⅱ期梅毒22例,III期梅毒10,潜伏梅毒4例。病程:最短1d,最长3个月,其中梅毒硬下疳溃破1～4d者7例,5～10d者20例,>10d者27例。
1.2试剂:TPPA试剂盒(富士瑞必株式会社日本东京);RPR试剂盒(上海荣盛生物有限工司)。
1.3方法:取患者血清,采用TPPA利用纯化的致病性梅毒螺旋体(Nmhol株)SEBODIA抗原包被明胶颗粒和RPR两种试验方法进行对比检测分析。试验操作参照试剂盒内说明书进行。
2结果
本组65例被测患者结果显示,3l例两种方法都为阳性,22例TPPA为阳性;2例RPR为阳性。见表l、2。
表1 两种方法检测梅毒患者血清的阳性结果;
试验方法 检测例数阳性 阴性
RPR 6537(56.92%) 28(43.08%)
TPPA 6559(90.77%)6(9.23%)
表2 梅毒患者的RPR、TPPA试验的阳性检出率和病程之间关系;
破溃时间例数RPR阳性TPPA阳性
1-4d 72(28.57%)5(71.43%)
5-7d 20 8(40%)12(60%)
10d2727(100%) 27(100%)
3讨论
梅毒是由苍白螺旋体引起的一种性传播疾病,潜伏早期的梅毒患者也有传染性[3]。这种病原体通过粘膜或有破损的皮肤进入人体后,经淋巴系统及血液循环播散到全身,几乎可以侵犯全身各脏器和组织,呈现出多种多样的临床表现,病程中有时呈无症状的潜伏状态。梅毒的主要是传播途径是性接触,有些人可以通过胎盘垂直传播,但接吻、带菌的毛巾、剃刀、餐具、输血等等也可以传播梅毒[4]。本病分3期:①一期梅毒。即硬下疳,潜伏期2～4周,外生殖器部位发生暗红色硬肿块、浅溃疡,有软骨样硬度,周围淋巴结肿大。②二期梅毒。在一期梅毒1～2个月之后,全身皮肤、粘膜发生对称泛发皮疹、斑疹、丘疹、脓疱疹等。粘膜可发生粘膜斑、扁平湿疣,传染性强。③三期梅毒。发生在感染后2～3年乃至10年,皮肤为树胶样肿,还可涉及骨、关节、心、血管,表现为主动脉炎、主动脉瓣闭锁不全和主动脉瘤等,侵及神经为脊髓痨,全身麻痹(麻痹性痴呆)。先天梅毒有早期先天梅毒,相当于后天二期,但较重。晚期先天梅毒与后天相似,但很少发生心、血管及神经病变。主要为实质性角膜炎、神经性耳聋、哈钦森氏齿(上门齿中央切痕,下小上大,宽厚相等)、佩刀形胫骨等。各期之间可有潜伏梅毒,无症状,仅血清反应阳性。治疗使用青霉素或红霉素、四环素等[5]。
梅毒是一种全身性慢性传染病,梅毒、结核、麻风并列为世界三大慢性传染病[6]。梅毒的病原体是一种螺旋体,梅毒螺旋体是一种小而纤细的呈螺旋状的微生物,长度为5―20nm,直径
梅毒螺旋体进入人体4～6周,血清中可产生抗类脂抗原的非特异性抗体和抗梅毒螺旋体抗原的特异性抗体。根据梅毒螺旋体进入人体后产生两种抗体的特征将血清血试验分为两大类[8]。
非梅毒螺旋体抗原血清学试验,目前最常用的具有代表性的方法为RPR,适用于梅毒筛查、疗效观察、复发或再感染的检查。梅毒螺旋体抗原血清学试验:①梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验(TPPA)。目前最具有代表性。可作为非梅毒螺旋体抗原血清试验(如RPR等)初筛阳性标本的确证试验。梅毒患者经过抗梅治疗后,不能作为疗效观察的指标。不能区分既往感染和现症感染,应结合非梅毒螺旋体抗原血清试验结果进行诊断[9]。
通过临床我们认为非梅毒螺旋体试验阳性可能表示:①现症感染;②复发或再感染;③生物学假阳性。梅毒螺旋
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体抗原血清学试验阳性可能表示:①现症感染;②既往感染;③感染了梅毒,梅毒螺旋体抗体终生阳性,不能作为治疗效果的指标[10]。
所以,为了排除非梅毒螺旋体试验的生物学假阳性结果,为了确认非梅毒螺旋体试验的阳性结果,所有的非梅毒螺旋体试验阳性标本必须用特异性梅毒螺旋体试验进行确证。非梅毒螺旋体血清试验一般来说灵敏度较高,但特异性较差,假阳性的机会较多,因此主要用于大量人群中进行筛选[11].梅毒螺旋体血清学试验的特异性及灵敏的均比非梅毒螺旋体血清学试验为高,但由于方法较为复杂、费时,一般只用于证实诊断。另外,梅毒临床诊断除了实验室检查还应结合相关依据:如(1)病史:包括不洁性接触史、配偶健康情况、本人过去有无性病的临床表现及患性病回购的治疗情况.怀疑胎传梅毒时,应询问其母亲婚姻、妊娠、分娩情况,兄弟姐妹的健康情况,以及患者有无早发和晚发胎传梅毒的临床表现[12].
梅毒血清学检查对于诊断二期、三期梅毒,以及判定梅毒的发展和痊愈,判断药物的疗效都有十分重要的意义。梅毒血清学检查包括非梅毒螺旋体血清学试验和梅毒螺旋体血清学试验。前者常用于临床筛选及判定治疗的效果,抽血后1小时即可出结果,费用也低廉。后者主要是用于判定试验,但是它不能判定治疗效果,一旦患有梅毒,这一试验将终身阳性。快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)。可用作临床筛选,并可作定量,用于疗效观察。
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【关键词】 梅毒螺旋体抗体；梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验；梅毒螺旋体抗体凝集法
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2017.13.023
梅毒在《中华人民共和国传染病防治法》中列为乙类防治管理病种， 其是一种慢性、系统性性传播疾病[1]， 由苍白螺旋体苍白亚种（TP）感染所引起。其主要通过性传播途径、血液、母婴垂直传播途径等传播。随着医学和科技的不断发展， 各种有效的抗菌药物可积极控制梅毒的发展， 但梅毒发病率仍居高不下， 且梅毒感染还可增加患艾滋病的风险[2]。梅毒根据临床表现可分为一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒、潜伏梅毒和胎传梅毒等。各期梅毒的临床特征分别为一期梅毒的硬下疳， 通常感染TP后7～60 d 出现；二期梅毒以二期梅毒疹可伴有全身症状；三期梅毒（晚期梅毒）中， 1/6为良性， 1/6～1/5为严重的晚期梅毒可有皮肤黏膜溃疡性损害或内脏器官的肉芽肿样病变， 近关节结节、心血管毒素、神经梅毒等表现[3]， 对自身组织器官的破坏性很强；潜伏梅毒（隐形梅毒）无明显临床症状， 脑脊液检查正常但梅毒血清试验阳性， 显性梅毒活动期后症状暂时消退后也可引起；孕期发生的显性或隐性梅毒叫妊娠梅毒， 此时， TP可通过胎盘或脐静脉传给胎儿让所生婴儿患先天梅毒， 梅毒孕妇极易造成流产、早产、死胎， 只有少数可生健康儿。据WHO估计梅毒在全世界流行， 每年约有1200万新发病例， 主要集中在南亚、东南亚和次撒哈拉非洲。我国近年来梅毒已成为报告病例数最多的性病， 因此采用高敏感性和高特异性的检验方法对于该病的确诊和治疗具有重要意义。本文采用TP-ELISA法和TPPA法两种方法对490份血清标本进行检测比较， 现报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 选择2015年1月～2016年7月在本院做TPPA的标本490例， 其中临床确认梅毒标本40例， 批量做TP-ELISA检测。
1. 2 试剂和方法 TP-ELISA和TPPA检测试剂盒分别购自珠海丽珠试剂公司和日本富士瑞必欧。两种检测都严格按照检测试剂盒说明书进行操作。采用瑞士的HAMEITONG为TP-ELISA的洗板和判读。TP-ELISA每次测试均设置空白、阴性和阳性对照， 与待测标本同时检测。TPPA每次测试均设置阴性、阳性对照， 与待测标本同时检测， 肉眼判读。
1. 3 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件处理数据。计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P
2 结果
2. 1 检测梅毒螺旋体抗体的阳性率 采用TP-ELISA和TPPA从上述血清中检出TP阳性有41例和40例， 阳性检出率分别为8.4%和8.2%， TP-ELISA的假阳性率为0.2%， 两种方法阳性检出率比较， 差异无统计学意义（P>0.05）。
2. 2 TP-ELISA和TPPA检测的一致性 两种方法阳性符合率为97.6%（40/41）， 阴性符合率为99.8%（449/450）， 总符合率为99.8%（489/490）， TP-ELISA阳性TPPA阴性有1例。见表1。
3 讨论
血清学试验在梅毒的诊断中具有重要意义。当人体感染梅毒螺旋体后1个月后， 抗类脂质抗原的非特异性反应素抗体[主要免疫球蛋白（Ig）M和IgG]和抗梅毒螺旋体抗原的特异性抗体（主要是IgG、IgM）可在血清中产生， 可通过各种免疫学方法检测此两种抗体作为协助诊断梅毒。实验室梅毒血清学诊断的方法很多， 选取符合患者利益的灵敏度高、特异度强检查方法显得尤为重要。针对非螺旋体抗原（心磷脂抗原）的快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）、 梅毒甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）等检测方法， 可做定量试验， 用于判断疗效和病情活动程度；而针对梅毒螺旋体特异性抗原的TPPA、TP-ELISA等检测方法， 特异度高， 用于TP 感染的确证[4]。另外梅毒螺旋体IgM 抗体检测诊断婴儿的胎传梅毒意义很大。TP-ELISA是以梅毒螺旋体抗原包被， 以双抗原夹心同时检测IgG、IgM抗体， 由于TP-ELISA法利用了酶的放大系统， 提高了检测灵敏度[5]， TP-ELISA操作简便快捷， 易实现大批量自动化处理， 非常适合用于大批量的血清梅毒筛查工作。高龄老人[6]血清中的特殊成分和临床上许多疾病如自身免疫性疾病、恶性肿瘤、糖尿病等可使患者体内含有某些治疗性抗体、易嗜性抗体、类风湿因子、甲胎蛋白等， 这些特殊成分有一定的吸附作用， 让 TP-ELISA血清学试验有一定的假阳性率， 本文中前面分析的TP-ELISA法阳性而TPPA法阴性的1例结果， 可能是上述原因造成的。TPPA 试验是目前国际上公认的检测梅毒确诊的首选方法， 其检测血清中的梅毒特异性抗体是利用人工载体明胶粒子包被纯化后的梅毒螺旋体菌株成分制成抗原， 其特异度和灵敏度均较高， 但其试剂价格昂贵， 检测时需手工将标本做系列稀释， 自动化程度低， 以肉眼判断结果， 主观性较强， 不利于大批量标本检测[7-9]。本文结果中TPPA法灵敏度高特异性好， 不易出现假阳性反应[10]， 本文中TPPA法未出现假阳性结果。由于梅毒特异性抗体IgG出现较晚， 甚至可终身存在， 而心磷脂抗体可在梅毒治愈后消失， 所以TP-ELISA或TPPA阳性也无法判断是初次感染还是既往感染， 即在确认梅毒后， 用TRUST法来判断传染性和治疗疗效比较适宜。总之不同的梅毒检测方法联合检测， 可进一步提高梅毒检测的敏感性和特异性[11-14]。
综上所述， 为实现大批量自动化处理和提高检测的准确性， 对于梅毒检验工作使用TP-ELISA筛查联合TPPA确认更为快速， 准确。
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【关键词】 Rh血型 DEL表型; RHD 1227A等位基因; 基因分型
[Abstract] Objective: To establish a genotyping method for DEL phenotype of human blood group system.Methods： The genotype was determined by using genotyping method of RH Box， and DEL phenotype was determined by serological method. An allelespecific polymerase chain reaction(ASPCR) was designed for genotyping of DEL phenotype according to the sequence of the allele of RHD 1227A. The results achieved by the ASPCR method were compared with those by serological method， the feasibility of the genotyping method in clinical practices was evaluated. Results： Twentyeight RHD-/RHD- samples were negative by serological method and genotyping method for DEL phenotype. In 25 RHD+/RHD- and RHD+/RHD+ samples， 11 DEL phenotype positive samples were positive by ASPCR method. However， one DEL phenotype negative sample was positive by ASPCR method for DEL genotype. This sample was determined positive by sequencing analysis. Genotyping method for DEL phenotype had higher sensitivity than serological method. Conclusion： The ASPCR method can be used for screening DEL phenotype among the population negative of RHD antigen.
[Key words] Rh blood group DEL phenotype; RHD 1227A allele; genotyping
Rh血型系统中D抗原在输血医学中意义重大，重要性仅次于ABO血型系统。有研究表明黄种人和白种人个体RHD基因结构不完全相同。在黄种人中一些RhD(-)个体用吸收放散的方法仍能检测到D抗原，称之为D洗脱阳性(DEL)[1]。这种血液输给RhD阴性患者仍会产生D免疫反应[2]，因此对DEL抗原的免疫原性应予以重视。目前临床上DEL血型的检测常用吸收放散方法，由于试验步骤繁琐而不适用于临床大规模应用。因此如何快速有效地鉴定DEL表型已成为一个具有重要临床意义的课题。近年来研究发现，中国汉族人群DEL表型和RHD 1227A等位基因相关[3]。本研究根据RHD 1227A等位基因相序列，通过等位基因特异性PCR技术(allelespecific PCR，ASPCR)，建立了DEL表型基因分型的检测方法，能有效地检测DEL表型，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象
至本中心血站献血的无亲缘关系的Rh阴性汉族献血者和至本站行产前检测的Rh阴性孕妇标本。
1.2 血型血清学试验
按卫生部《中国输血技术操作规程》进行红细胞RhD，C，c，E，e抗原的检测。间接抗球蛋白试验排除血样中的弱D和不完全D表型。IAT确认采用上海血液中心提供单克隆IgG抗D(clone:BS226，Bs232)，DIAGAST的单克隆IgG/IgM抗D(clone:P3×61+P3×21223B10+P3×290+P3×35)以及DBL NOVACLONE的单克隆IgG/IgM抗D(clone:4151E4+1752)。剩余血样通过吸收放散试验筛选DEL表型[4]。
1.3 DNA提取
抽取外周血5 ml，EDTANa2抗凝，采用试剂盒提取全血DNA(EZBDC血液基因组DNA快提试剂盒，济南泰天和生物科技有限公司)，分装-80℃保存备用。
1.4 RHD基因分型
采用RH Box基因分型试剂盒(G&T，美国)PCR反应总体积9 μl，含7 μl PCR引物混合液，1 μl DNA样品，1 μl Taq酶(含0.33～0.5单位)。PCR扩增条件：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环后置72℃再延长5 min。使用0.5×TBE缓冲液，配制2%琼脂糖凝胶，以10 V/cm电泳30 min，结果通过凝胶成像仪(FR200A全自动紫外与可见分析装置，上海复日科技)拍照成像。
1.5 RHD 1227A基因分型
采用吴俊杰等[5]的方法根据RHD基因和RHD 1227A等位基因相关序列设计一组特异性扩增RHD 1227A等位基因的引物(上海生工生物技术公司合成)。RHDels:5′GACCAAGTTTTCTGGAAA3′(位置对应于AJ299028的6885)，RHDela:5′CGAGAGAATTTTGAGCAC3′( 位置对应于AB035185的849832)。一对特异扩增人GAPDH基因240 bp的引物作为内对照，GAPDHF:5′TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG3′，GAPDHR:5′TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT3′。总反应体积为10 μl，含模板DNA 0.2 μl，特异性引物终浓度250 nmol/L，内对照引物终浓度50 nmol/L，MgCl2终浓度1.5 mmol/L，dNTP终浓度200 μmol/L，Taq酶0.2 U。PCR扩增条件：95℃预变性5 min，然后95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 50 s，30个循环后72℃再延长5 min。使用0.5×TBE缓冲液，配制2%琼脂糖凝胶，以10 V/cm电泳30 min，结果通过凝胶成像仪拍照成像。
2 结 果
2.1 Rh表型确定
通过凝集试验和抗人球蛋白试验，筛选Rh阴性标本。血清学确定53例Rh阴性标本，其中ccdee 10例，带有RhC抗原的43例。
2.2 PCR检测RHD基因
用美国G&T公司的RH Box基因分型试剂盒检测标本融合盒子(Hybird Rhesus Box)和下游盒子(Dwon Rhesus Box)。只带有融合盒子的为RHD基因完全缺失(RHD-/RHD-)，只带有下游盒子的为有2条染色体带有RHD基因(RHD+/RHD+)，同时出现融合盒子和下游盒子的为一条染色体带有RHD基因(RHD+/RHD-)，结果见图1。在10例表型为ccdee的标本中，RH Box基因分型都为RHD-/RHD-，在43例RhC阳性的RhD阴性标本中，检出18例RHD-/RHD-型，10例RHD+/RHD-型，15例RHD+/RHD+型。
1：RHD-/RHD-纯合子只显示下游盒子和融合盒子1508 bp条带;2，3：RHD+/RHD-杂合子，同时出现下游盒子和融合盒子1508 bp条带;M：DL2000标准参照物。内对照为429 bp
2.3 DEL表型的检测
在10例表型为ccdee的标本中，用血清学方法和基因分型的方法都未检测到DEL表型。在43例RhC阳性的RhD阴性标本中，18例未检测RHD基因的标本用血清学方法和基因分型的方法均未检测到DEL表型。在25例携带一条或两条RHD基因的RhD阴性标本中，用血清学方法检出11例DEL表型，这11例标本用基因分型方法均扩增到了867 bp的1227A等位基因条带，基因检测结果见图2。在这25例标本中有1例标本为血清学阴性，基因分型方法阳性。由于标本为陈旧性标本，无法重新进行吸收放散试验。由于吸收放散试验操作繁杂，步骤较多，同时操作者的不同判定的结果也会出现差异，因此可能为血清学法的漏检。后经上海生工生物技术公司对外显子9序列分析，结果为RHD 1227A阳性。结果见表1表1 RH Box基因型与DEL表型检测结果
3 讨 论
中国是个多民族国家，RHD基因的遗传背景十分复杂，DEL的遗传背景在中国汉族人和欧洲白人之间存在明显差异。根据近年来的研究结果表明，我国汉族人群DEL血型的分子基础是RHD 1227A等位基因[6]。因此本研究根据RHD 1227A等位基因序列，用ASPCR方法进行了DEL表型基因分型的检测。同时由于RHD基因的存在与RhC之间存在关联[7]，而DEL型的RHD基因基本完整。因此我们重点选择了RhC阳性表型的RhD阴性标本进行研究。
根据表1的结果，在28例RH Box基因分型RHD-/RHD-的标本中均未扩增到1227A等位基因，在25例携带一条或两条RHD基因的RhD阴性标本中，用血清学方法检出11例DEL表型，这11例标本用基因分型方法均扩增到了867 bp的1227A等位基因条带。这说明基因分型方法检测DEL表型和血清学方法相吻合。
在这25例标本中有1例标本为血清学阴性，基因分型方法阳性。由于标本为陈旧性标本，无法重新进行吸收放散试验，后经上海生工生物技术公司对此标本的外显子9序列分析，结果为RHD 1227A阳性。由于吸收放散试验操作繁杂，步骤较多，同时操作者的不同判定结果也会出现差异，因此此例标本可能为血清学法的漏检。这说明基因分型方法检测DEL表型和血清学方法结果还是一致的，同时这也提示基因分型的方法在灵敏度上高于血清学的方法，还有更好的重复性。
基因分型的方法可以有效地检测RHD 1227A等位基因，并且该方法有很高的灵敏度。因此对ccdee这些DEL表型阳性率比较低的标本可以通过检测多份样品的混合样来提高工作效率。
在中国汉族人中RhD阴性人群占0.2%～0.5%，这些RhD阴性人群中有很高比例的DEL表型，有文献报道中国汉族人中DEL表型占到RhD阴性人群的24.4%[8]。DEL虽然不表达正常的RhD蛋白，但还是可以表现为极弱的RhD抗原。到目前为止，临床上DEL表型的血液一直作为Rh阴性血液使用。最近已经有DEL血型血液输注给Rh阴性患者，从而导致抗D免疫事件发生的报道。因此在我国Rh阴性献血者中开展检测DEL血型很有必要，这是临床安全输血的重要保障。通过检测53例RHD 1227A标本，提示基因分型方法可以有效地检测RHD 1227A等位基因，同时基因分型的方法还可以利用血站的核酸检测系统实现自动化检测，这为临床上大规模开展DEL表型筛选创造了可能。
综上所述，ASPCR方法可用于临床筛选Rh阴性人群中的DEL表型。
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