时间：2022-11-06 00:58:00
关键词：人事档案;收集;鉴别;工作
收集人事档案材料，充实人事档案内容，是贯穿于人事档案工作始终的一项经常性的工作。鉴别工作的好坏直接决定着人事档案质量的优劣。对能否正确贯彻人事政策也有一定的影响。它是一项非常重要的工作，在人事档案中占有特殊的地位。
1.人事档案的收集
收集人事档案材料，政策性强，涉及面广，难度较大，它不仅是人事档案部门的任务，也是形成人事档案材料部门的任务，必须各方面密切合作才能做好。
1.1人事档案的归档
人事档案材料的归档范围做好收集工作，首先应明确收集什么。人事档案材料的归档范围包括：调配、任免、考察考核材料，录用材料，办理出国、出境材料，各种代表会材料，工资待遇材料，学历和评定岗位技能材料，职称材料，加入党团组织材料，政审、考核材料，奖励与处分材料，履历、自传、鉴定材料，科研材料， 残疾材料，其他材料。
1.2人事档案材料的收集渠道
人事档案材料的形成不仅仅局限于组织、人事、劳动部门，凡是与人事管理活动有关的部门都有可能产生人事档案材料。应摸清人事档案材料的来源，做到"有的放矢"。当前，人事档案材料主要通过以下渠道收集。
通过组织、人事、劳动及其他人员管理部门，收集各种履历表、简历表、登记表、自传、鉴定、考核、考绩、任免、招聘、录用、招工、"以工代干"转干的材料；评聘、晋升、套改专业技术职务职称和评定工人岗位技能的材料；授予学位、学衔、军衔的材料；审计工作中形成的有关材料；出国、出境、办理工资、调整级别待遇、离休、退休的材料。通过员工所在党、团组织、政府机关、企业、事业单位的有关部门，收集员工人党、入团，民主评议党员、退党、退团、除名及参加派的有关材料；授予各种荣誉称号的先进事迹和奖励材料；有关政治历史问题的审查、甄别、结论、调查报告和本人的申诉、检查交待材料；更改姓名、年龄、参加革命工作时间、入党入团时间、申请书和组织审批材料。
1.3建立和健全收集制度
人事档案部门应建立和健全移交制度，明确规定各单位、各部门日常工作中形成的，凡是属于归档范围的材料，均应移交人事档案部门。人事档案部门不能完全坐等有关单位主动送材料上门，应经常与有关部门保持密切联系，定期或不定期索要应归档的人事档案材料，对于迟迟未交者，应及时貧函、打电话或登门索要。检查核对制度人事档案部门对所管人事档案数量的状况，应定期进行检查核对，将不符合归档要求的材料，退回形成单位重新制作或补办手续；不属人事档案范围的材料，予以剔除或退回原单位处理。
组织、人事、劳动等部门，根据工作需要和档案材料的缺少情况，统一布置填写履历表、登记表、鉴定表、自传等，使人事档案及时得到补充。
2.人事档案的鉴别
人事档案鉴别工作，就是按照一定的原则和规定，对收集起来的档案材料进行审査，甄别其真伪，判定有无保存价值，确定其是否归入人事档案。它是人事档案材料归档以前的最后一次检查。鉴别是系统整理的基础和前提，也是保证人事档案材料完整、精炼、真实的重要手段。鉴别工作的好坏直接决定着人事档案质量的优劣。对能否正确贯彻人事政策也有一定的影响。它是一项非常重要的工作，在人事档案中占有特殊的地位。
2.1鉴别工作的原则
鉴别工作的政策性很强，必须遵循"取之有据，舍之有理"的原则。取之有据，是指归人人事档案的材料要有依据，符合上级的有关规定。舍之有理，是指决定剔除的材料，要有足够的理由，尤其是准备销毁的材料，更须十分谨慎，不能武断或草率。人事档案是培养、选拔干部的依据，有时一份材料会影响一个人的使用。因此，应以高度负责的精神，慎之又慎地决定材料的取舍。为正确贯彻鉴别工作原则，必须做到以下几点。
2.2鉴别的内容和方法
判断材料是否属于人事档案通过各种渠道收集来的材料，由于种种原因，有些属于人事档案，有些属于文书档案、案件档案、业务考绩档案、诉讼档案等，有的材料应该归档，有的应由本人收存，有的需转递有关部门。鉴别工作的任务之一，就是把不属于人事档案归档范围的材料剔除出去。
从纪检、监察和行政管理部门收集来的处分决定、结论、批复、本人对处分决定的意见和检査交待材料，属于人事档案范围。本人申诉材料、旁证、检举揭发材料，属于案件档案范围，由纪检、监察部门保存。
从专业技术单位和学校收集来的评聘专业技术职称的申报表、审批表、考绩材料、发明、创造、革新成果登记和论著目录、受奖材料、学位学衔材料、毕业登记表、学历证明、考试成绩单等，属于人事档案范围。从组织、人事、劳动部门收集来的干部职务任免、员工录用、聘用、招用、职级待遇调整、更改姓名、参加工作时间等的登记表和审批材料等，属于人事档案范围。
判断是否本人的档案材料人事档案是以员工姓名为特征整理保存的，确定档案材料是否归档，首先应弄清楚是谁的档案，不能因同名同姓、同姓异名、异姓同名而张冠李戴，因一人多名而将材料分散。为防止张冠李戴，应仔细核对档案材料上的籍贯、年龄、性别、家庭出身、本人成分、工作单位、加人党团组织、参加工作时间、职务、工资级别等基本情况是否相同。
判断材料是否处理完毕和手续是否完备只有处理完毕和手续完备的材料，才能归入人事档案。凡是悬而未决需要继续办理的"敞口"材料，不得归入人事档案。查对材料是否重复人事档案要保持精炼，拣出重份和内容重复的材料。鉴别工作中，还应同时检査档案材料有无破损、霉烂变质、字迹模糊、伪造或涂改等现象，有问题时及时处理。
2.3剔除材料的处理
转出经过鉴别，认定不属员工本人的材料，或者是不应归入人事档案的材料，均应转给有关单位保存或处理。转出时，要写好转递材料通知单。退回近期形成的档案材料，手续不够完全，或内容尚需査对核实，应提出具体意见，退回有关单位，待修改补充后再交回来。凡应退还本人的材料，经领导批准后退还本人，退还时应进行登记，接收人清点无误，签名盖章。留存不属于人事档案范围，又有保存价值的参考材料，整理后由组织、人事部门作为业务资料保存。销毁无保存价值、重份的材料，应按有关规定销毁。销毁时要认真审查，逐份登记，并说明销毁的理由，经主管领导批准后，进行销毁。
参考文献
关键词：人事档案；信息公开；内容
在现有的人事档案中，干部档案管理无论是从制度上还是从收集分类整理上是比较规范的，其他类别人事档案的内容主要是以干部档案为参照标准。根据《干部档案工作条例》和《干部档案整理工作细则》等有关文件的规定，干部人事档案材料分为十类：
1 履历材料
《条例》、《细则》中规定：凡是反映本人全面经历等基本情况的表格材料归入此类。这包括：干部、工人、教师、医务人员、军人、学生等各类人员的履历表（书）、登记表、简历表；履历兼有鉴定等其它内容的履历表、简历表及登记表；个人参加革命活动的简历材料；更改姓名的报告及批件。
2 自传材料
凡由本人撰写的叙述自己简历、思想变化过程、社会关系等情况的材料，均归入本类。这包括：自传；有自传内容的入党入团申请书；有自传内容的“历史”反省材料。
3 鉴定考核考察材料
凡是各个年度、阶段或参加临时性工作、学习、劳动以及工作调动等，由干部本人或组织写的主要鉴定材料和组织上做出的反映干部德、能、勤、绩情况的正式考核、考察材料及民主评议综合材料都收入此类。这包括：鉴定材料（包括自我鉴定）；标题不是鉴定，内容属于鉴定性材料；无奖励审批表的比较完整的先进事迹材料；考核考察材料；由组织做出的反映干部“”中表现材料；动乱和暴乱期间的考察材料及写实表；年度考核登记表；民主评议干部综合材料；后备干部登记表；入党积极分子考察写实材料，预备党员预备期考察写实表；大中专院校考生治思想品德审查表；主审机关做出的审计结论（报告）。
4 学历和评聘专业技术职务材料
这包括：学历、学位、学绩、培训结业成绩表和评聘专业技术职务、考绩、审批材料，如报考高等院校学生登记表、审批表；选拔学生登记表；保送学生登记表、审批表；考生登记表、审批表；学生成绩单、记分册；毕业生登记表；学籍档案表；业务培训成绩单（包括有鉴定的成绩单）；符合国家规定的学历证明；教师资格过渡申请表；教师资格审查表；专业技术职务任资格评审表（呈报表）、申报表；聘任、套改、晋升、解聘专业职务（职称）的审批表、登记表；干部的创造发明、科研成果、著作及有重大影响论文的评价材料及目录；干部本人写的业务报告；反映干部业务能力方面的其它材料。
5 政历审查材料
政治历史问题的审查材料包括甄别、复查材料和依据材料，党籍、参加工作时间等问题的审查材料。凡是对本人历史问题的审查材料及各种原因对干部经历、出身、成份、社会关系审查的材料都归入此类。
6 参加党派材料
凡己经批准为中共正式党员、共青团员的有关材料及加入派的有关材料都归入此类。包括：中国共产党入党志愿书，申请书和转正申请书；中国共产主义青年团入团志愿书、申请书；中国共产党党员登记表、不予登记的决定、组织审批意见及其依据的材料；延长预备党员预备期的决定；取销预备党员资格的组织意见；民主评议党员中形成的组织意见或民主评议党员登记表、认定为不合格党员被劝退或除名的主要事实依据材料和组织审批材料；退党、退团和超龄离团的材料；“”中突击发展的党员被取消党籍的处理报告、上级组织意见、决定；加入派的有关材料。
7 奖励材料
凡各级组织正式命名授予英雄、模范、先进工作者等称号和本单位年度性奖励决定（审批表）及荣誉称号材料、通报表扬材料，如创造发明奖励材料、各种业务奖励材料、从事专业工作三十年人员审批表、登记表、有突出贡献的中青年专家审批表、登记表、拔尖人才审批表、优秀党员、团员登记表（审批表），优秀党务工作者审批（呈报）表和其它荣誉称号的审批材料都列入此类。
8 处分材料
这包括纪律检查、监察和行政管理工作中形成的处分决定（免予处分的意见）、查证核实报告、上报批复、本人对处分决定的意见和检查交待材料，通报批评材料。法院审判工作形成的判决书，复查甄别报告、决定、上级批复材料，离婚材料等。
9 录用、任免、聘用、转业、待遇、出国、退（离）休、退职材料及各种表会代表登记表等材料
凡办理任免、选举、授衔、晋级、退（离）休、军队转业、出国审查等事项，由组织填写呈报、审批形成的手续完备的表格材料均归入此类。本类又分为四小类：第一小类：干部工资级别登记表；调整工资、工资改革、提职、兑现工资、转正定级人员工资审批表、奖励工资、各种津贴、补贴审批表，调整工资区类别审批表、调整级别报告表。第二小类：以工代干转正审批表；吸收、录用、干部审批表；选拔干部审批表；考试录用千部（公务员）审批表；聘用干部审批表、聘用干部合同书、续聘审批表、解聘、辞退材料；干部任免呈报（审批）表；退职、退（离）休审批表第三小类：因公出国人员审查表。第四小类：知青上山下乡审批表；临时工转为固定工人审批表；保留全民职工身份审批表；招工、入伍（兵役登记表）审批表；子女就业审批表；军队转业干部、复员、退伍军人审批表；县团级以上党代会、人代会、政协代表会议、工、青、妇等群众团体代表会、派代表会议代表登记表；国家公务员过渡表；军衔、警衔审批表；享受司局级和处级待遇审批表；干部江人）调动审批表；港澳华侨审批表。
【关键词】 肿瘤标志物；CA125；腹水；鉴别诊断
腹水常见病因有肝硬化、恶性肿瘤和结核性腹膜炎等，其中疑难性腹水中癌性腹水占的比例最大(63.6%)，其次为结核性腹膜炎腹水(21.1%)［1］。目前在临床上，肿瘤及结核所致腹水的鉴别有时仍很困难。CA125是一种肿瘤相关的糖蛋白类标记物，通常用于卵巢肿瘤的诊断、复发和预后的判断，近年来发现其值升高与腹水密切相关。本文对140例女性腹水疾病患者进行临床分析，探讨其对女性腹水诊断及鉴别诊断的价值。
1资料与方法
1.1病例来源
收集2007年9月-2009年5月宁夏医科大学附属医院女性腹水140例的临床资料。其中结核性腹水为35例，年龄（42.6±16.6）岁，皆由腹水液病检，腹膜活检或手术、B超、CT等综合检查得以证实，或采用排它性诊断，同时诊断性抗结核治疗有效确诊；肝硬化失代偿期为45例，年龄为（59.8±15.1）岁，均经肝、脾B超及肝功能实验室检查等证实；卵巢癌为31例，年龄为（52.7±12.8）岁，均由腹水脱落细胞学检查或手术治疗后病理检查得以确诊。胃癌腹膜转移者29例，平均年龄为（53.1±11.2）岁，均经过内镜及活检等检查方法确诊。
1.2方法
按照病因分为4组，分别为肝硬化腹水组、卵巢癌腹水组、结核性腹膜炎腹水组和胃癌腹膜转移组。分析各组血清CA125的定量值(正常值为小于35 IU·L-1)。
1.3统计学方法
应用SPSS 17.0软件进行统计分析，测定结果数据以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析，均数间两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
140例女性腹水患者血清CA125检测结果，见表1。4组间CA125均数不同（F总=9.173，P总＜0.01），卵巢癌组与结腹组、肝硬化组、胃癌转移组比较差异均有统计学意义（P＜0.01 ）。结腹组、肝硬化组及胃癌腹膜转移组两两比较未见统计学意义(P＞0.05)。
表1各组疾病血清CA125检测结果
组别n血清CA125/IU·L-1
结腹组35489.2±294.9＊
肝硬化组45356.8±204.5＊
卵巢癌组311478.8±453.9
胃癌腹膜转移组29304.2±237.4＊
F总=9.173，P＜0.01；与卵巢癌组比较＊P＜0.01
3讨论
CA125是从乳头状浆液囊性卵巢癌中提取的OVCA433抗原［2］。1981年Bast首先发现CA125存在于卵巢癌患者的血清中，后来又发现 CA125存在于各种胚胎体腔上皮来源的组织中，如间皮细胞组织:腹膜、胸膜及心包膜；苗勒管上皮: 子宫内膜、输卵管。正常人血清中CA125含量甚微，因其是一种相对分子质量较小的糖蛋白，一旦上述组织受到炎症刺激或者癌变时，便可释放到浆膜腔液中，并进入体循环，最终导致血清及浆膜腔液中的CA125具有较高水平［3-4］。CA125作为肿瘤标志物特别是卵巢癌标志物已被广泛认可，并作为鉴别良恶性疾病非侵入性的检测手段之一，然而这种肿瘤相关抗原并不具有肿瘤或组织的特异性。本文结果显示各种病因导致的腹水血清CA125均升高，肝硬化组、结核性腹膜炎组及胃癌转移组两两之间差异无统计学意义（P＞0.05），卵巢癌腹水组较其它组升高（P＜0.01），进一步验证，肿瘤相关抗原并不具有肿瘤或组织的特异性，血清CA125可被作为诊断卵巢癌性腹水的敏感指标之一。
近年来有不少文献提出，血清 CA125值的升高与肝病有关，其中，有报道称肝硬化患者的血清CA125可高于正常水平，特别是有腹水的肝硬化患者［5-6］。本文测定肝硬化腹水组 CA125均有一定程度的升高，且与卵巢癌腹水组差异有统计学意义 (P＜0.01)，与结核性腹膜炎组及胃癌转移组差异均无统计学意义（P＞0.05），说明在进行鉴别诊断时，除卵巢癌外，CA125值不能作为与其他疾病鉴别时的参考指标。肝硬化患者血清CA125升高机制目前尚不清楚，有报道认为，CA125 可在体腔上皮组织中包括腹膜间皮、卵巢上皮等细胞中表达［7］。故腹膜受到非特异性刺激时，如肝硬化门脉高压，血液回流受阻及肝脏对抗原的处理能力下降，作用于腹膜间皮组织产生大量 CA125 释放入腹水中 ，然后进入血液从而导致血清中 CA125 升高。
结核性腹膜炎血清中CA125 水平升高的机制可能为腹膜炎症时，间皮组织受到损害，大量的CA125释放所导致的。有报道提出，结核性腹膜炎患者血清CA125可作为诊断的参考指标，但本文研究认为，其对结核性腹膜炎的诊断尚缺乏特异性。
另外，从本研究可以看出，胃癌合并腹水时血清CA125 值也明显升高，但却明显低于卵巢肿瘤腹水者，与其他良性病变腹水患者血清水平并无差异。胃癌腹水患者血清CA125升高的机制可能为癌肿转移引起腹膜的炎症，从而导致该区域的CA 125 抗原含量明显增高［8］，Bunzo 等［9］的研究也说明血清CA125 水平与胃癌腹膜转移有明显的相关性。但是有诸多研究提出，血清CA125主要对卵巢癌较为敏感，对其他类型肿瘤的诊断价值却较低。其特殊性在于CA125主要分布在间皮细胞组织和米勒管上皮，当这些部位发生癌变或受到炎症刺激时，血清中CA125的水平将显著升高［10］。因此间质细胞和米勒氏管衍生物发生的卵巢癌患者血清CA125的水平升高更显著。同时，血清CA125也是目前最重要的卵巢癌相关性抗原，它在癌变的卵巢上皮细胞膜上表达，并可释放到细胞间质中，是卵巢癌特异性较高的肿瘤标志物。因此，在进行诊断及鉴别诊断时，血清CA125 检测仍是迄今应用最广泛的卵巢癌标志物，同时也可作为卵巢癌腹膜转移发生的标志物之一。
参考文献
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［8］Kabawat SE， Bast RC Jr， Bhan AK， et a1. Tissue distribution of a coelomic-epithelium-related antigen recognized by the monoclonal antibody OC125 ［J］. Int J Gynecol Pathol， 1983， 2(3):275-285.
一名高校老师如果我们不以身作则写自我鉴定怎么带动学生呢，小编今天就给大家整理转正自我鉴定，喜欢的要来参考阅读哦
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高校教师自我鉴定范文转眼三年的考核期已到，学校要求把个人三年的情况做一总结，我很是惭愧，觉得自己的工作热情远不如过去，看结果只能算是勉强符合考核的各项指标。其实从学校要求我们签考核任务书起，我就产生抵触情绪，并且是消极怠工。我总觉得高校教师的工作性质不能采取明确的量化标准进行考核，一年一定要发几篇文章，申请多少科研经费、几个国家或地方级别的课题等等，否则就要如何这般。我喜欢教师这个职业，一是它的神圣——传道授业解惑，二是它的自由与民-主，这样才可以使教师尽其所能发挥自己的聪明才智，创作性地工作。高校教师的工作一旦有了功利的目的和要求，则必然会使一些人只为应付考核做事，不求有更多的努力。而我这类人，没有考核要求时还干劲十足，自从考核开始我就觉得不舒服，好像被人牵着鼻子走，有一个无形的枷锁套在自己的脖子上，总是尽力逃避这种约束，以至于工作提不起劲，懒懒散散，一晃三年就过去了。
为了考核，我简单地对自己三年的工作做了一个小结，上交组织。
一、在政治思想上贯彻执行党和国家的路线、方针、政策，遵守国家的法律、法规和各项规章制度，廉洁自律。 自觉遵守学校各项管理规定和各项纪律。团结同志，忠诚党的教育事业，严守职业道德和学术道德，为人师表，教书育人。
二、工作上首先在教学中认真履行自己的教师职责，很好地履行教学计划，认真组织教学，较好地完成了学院规定的教学任务。教学效果良好，受到学生的好评。
其次科研方面，结合社会学实际的教学和科研情况，积极申报教学科研项目，参与教学研究，努力提高教学科研能力;同时克服困难，积极争取科研资金，三年的科研经费超额完成，总体上完成学校要求的科研任务。最后在工作中，充分协调好各方面关系，与同事们一起共同完成学校交给的各项工作任务
三、热爱自己的本职工作，兢兢业业、勤勤恳恳，始终保持认真的工作态度和一丝不苟的工作作风，求真务实、乐观向上，具有较强的敬业精神和奉献精神。关注自己专业的学科发展，不断更新和完善自己的知识结构，提高自己的理论研究水平和教学水平。
总结三年来的思想、教学和科研情况，有成绩也更有不足，我愿意在以后的工作中更加努力，在各方面取得更大的进步。
【关键词】 Snail；融合蛋白；多克隆抗体
0 引言
上皮型钙粘附素（Ecadherin，Ecad）介导的粘附系统的破坏，是肿瘤从非浸润性转化为浸润性的关键步骤［1］。而锌指转录因子Snail，具有下调Ecad的作用［2］，本研究通过制备Snail抗体，为进一步开展Ecad的功能研究和应用奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和菌株 主要试剂购自北京中山公司；大肠杆菌DH5a和BL21由北京大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究所细胞实验室保存。
1.2 pGEX4T1 /Snail原核表达载体的克隆
从人血管内皮细胞提取总RNA，在逆转录酶作用下，合成cDNA。以逆转录的cDNA为模板，用上游引物5′CTGCAGGACTCTAATCCAG3′（含有EcoR I内切酶位点）和下游引物5′ATCCTTGGCCTCAGAGAGC3′（含有Sal I内切酶位点），进行PCR扩增，得到Snail C末端377bp的DNA片断；酶切、琼脂糖凝胶电泳分离后，用玻璃奶法（自制）纯化回收，与pGEX4T1原核表达载体定向连接。转化DH5α感受态细菌，提取质粒并酶切鉴定重组体。
1.3 融合蛋白的诱导表达与纯化
1.3.1 表达鉴定 表达质粒Snail/ pGEX4T1转化大肠杆菌DH5α后，经过酶切鉴定，挑取阳性细菌克隆至3ml LB/Amp+试管中培养3～5h。SDSPAGE分析融合蛋白的诱导表达情况。
1.3.2 可溶性鉴定 离心诱导菌液，收集菌体，以PBS重悬（50μlPBS/1ml菌液），加细菌裂解液混匀，冰浴。加入Triton X100至终浓度为1%，冰浴。冰上以20Hz间歇超声裂解。再离心并分别收集上清和沉淀，进行SDSPAGE，证实融合蛋白以包涵体形式存在。
1.3.3 纯化 加5倍体积超声缓冲液悬浮沉淀，冰上间歇超声30s，离心弃上清。重复3～4次。沉淀加等体积SDSPAGE loading buffer，超声重悬，沸水煮5min后上样，100V电泳6～7h。用冷0.1MKCl浸泡胶，切下目的条带放入透析袋内。将透析袋置于水平电泳洗脱装置内，60V洗脱过夜，次日100V继续洗脱1h，然后反转电极向相反方向洗脱3～5min。吸出透析带内液体，蔗糖包埋浓缩，PBS透析。行SDSPAGE定量，即获得纯化的融合蛋白。
1.4 抗Snail多克隆抗体的制备 抗原为原核表达并经SDSPAGE胶纯化的GST/Snail融合蛋白，免疫新西兰白兔。取耳血，用ELISA法测定抗体效价，当效价达到10-5时，放血，收集血清。
1.5 抗体效价和特异性免疫学鉴定
1.5.1 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测抗体滴度：观察结果并用ELISA Reader测OD490nm。
1.5.2 Western Blot鉴定抗体 SDSPAGE分析融合蛋白的诱导表达情况。
2 结果
2.1 Snail/ pGEX4T1原核表达载体的构建和鉴定结果 以Snail全长为模板，PCR大量扩增出Snail片段，经鉴定在约400bp处有条带扩出，与推算值相符；将目的片段装入 pGEX4T1原核表达载体后，酶切鉴定正确，在近400bp处有条带释放。
2.2 融合蛋白GST/Snail的诱导表达和纯化 经纯化的GST/Snail融合蛋白只有一条蛋白带。
2. 3 Snail多克隆抗体活性鉴定
2.3.1 ELISA鉴定 经制备型SDSPAGE进一步纯化的融合蛋白GST/Snail免疫新西兰兔获得抗血清，ELISA实验结果表明，其效价为5×105。
2.3.2 Western Blot 鉴定抗体 Snail/ pGEX4T1感染的细胞在近40KD处出现条带。
3 讨论
本课题通过基因工程手段原核表达Snail羧基端的GST融合蛋白［3］，然后免疫新西兰兔获得效价高、特异性强的抗Snail抗体，与一些进口抗体相比造价低，且适用于免疫荧光、石蜡切片等［4］，为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾病的相关性提供了工具。我们利用该抗体研究了宫颈不同组织学阶段的蜡块标本，Snail1表达的免疫组织化学反应在宫颈癌中呈上升趋势，阳性表达率为81.9%，与正常及非典型增生组差别明显（P＜0.05），证明Snail与癌分化程度相关。表明了Snail是肿瘤进展过程中浸润的一个重要的调节因素［5］，为今后进一步揭示肿瘤的浸润和转移开创了新的途径和工具。
【参考文献】
［1］ Cano A， PerezMoreno MA，et al. The transcription factor snail controls epithelialmesenchymal transitions by repressing Ecadherin expression［J］. Nat Cell Biol，2000，2(2):7683.
［2］Comijn J， Berx G， Vermassen P. Mechanisms of inactivation of Ecadherin in breast carcinoma: modification of the twohit hypothesis of tumor suppressor gene［J］. Mol Cell，2001，7(6):12671278.
［3］Bolos V， Peinado H， PerezMoreno MA， et al. The transcription factor Slug represses Ecadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors［J］. J Cell Sci，2003，116(Pt 3): 499511.
关键词：技能 鉴定 质量管理 刍议
职业技能鉴定考试是我国技能人才制度改革的重要内容，是国家实施人才战略，打造2025中国制造，提高综合国力的重要举措。由于职业技能鉴定考试关系到技能人才的培养水平，关系到我国经济社会的发展，因此受到社会瞩目。实现安全考试、公平考试和科学考试，确保职业技能鉴定质量，是职业技能鉴定机构的重要任务。
一、夯实职业技能鉴定工作基础
职业技能鉴定工作开展的如何，基础工作是关键，笔者认为要从以下几点着手。
1.着重完善工作流程
去年烟台市编印了《烟台市职业技能鉴定工作流程与规章制度》一书，重点梳理规范了九项工作流程。制定了《烟台市职业技能鉴定考评员管理办法》《技能鉴定国家题库烟台分库运行管理办法》。工作流程方面：编制了报名、收费、试卷制发、考务安排、考评、阅卷登分、成绩汇总公布、空白证书管理及证书打印发放、证书补发等九项工作流程，推动鉴定工作向标准化、精细化、规范化方向发展。考评员管理办法方面：从考评员管理、选派、奖惩等三个层面，细化了考评员的任职条件、资格认定、组织使用、选派、评价等环节，重视和加强对考评员的表彰和惩处。国家题库烟台分库运行办法方面：从试题的抽取、审定、印刷、传递、评阅、保管等各个环节做了具体的保密要求。同时，对鉴定过程实行了质量督导员、考评员、考点三方互评机制，设计了《质量督导员意见反馈表》《考评员意见反馈表》和《考点意见反馈表》三张表格，每次鉴定考评结束后报鉴定中心。
2.着重抓好三支队伍
当前，职业技能鉴定事业正处于一个规范和发展时期，繁重的鉴定任务，要求必须配备一支结构合理、作风优良、技术过硬的高素质鉴定工作队伍作为有力保障。重点要抓好管理人员、考评员、质量督导员三支队伍建设。
（1）提高管理人员业务素质。每名工作人员不但要对鉴定流程了如指掌，对各工种的应会考试项目内容也要基本了解，要定期请考评员讲解工种专业知识，对管理人员开展有针对性的岗位培训。
（2）加强对考评员的使用与管理。一是要统筹做好考评员选派工作，分职业（工种）建立考评专家库，对组织和使用情况实时登记，做到人员使用派遣的科学、快捷。二是要不断完善评价手段。实行日常考核与年度考核相结合。根据派遣记录、质量督导员和考点对考评员参与鉴定的评价进行日常考核，形成记录。年终鉴定中心组织部分质量督导员、工作人员和鉴定所负责人组成考核小组，结合考评员日常考评工作表现和被投诉问题的查处情况，对考评员技术水平、工作绩效、职业道德、执行制度规定情况等方面进行综合考核。三是对考评人员实行优奖劣罚。设立“优秀考评员奖”和“合理化建议奖”，对考核优秀的给予奖励，对失职、渎职的或违反鉴定规章制度、、一年内三次以上无故不接受考评任务的考评人员，根据情况，分别给予警告、暂停考评委派、取消考评员资格等处罚。
（3）抓好质量督导员管理和监督。要适应政府职能转变和鉴定管理方式改革的需要，主动转变工作方式，加强鉴定督导员队伍建设，全面提升督导员队伍素质，强化质量意识，切实履行鉴定监管的职责。一是建立督导人员日常管理档案，记录督导人员的每次督导工作情况。不定期组织职业技能鉴定机构负责人对质量督导员工作进行评价，年终进行全面分析，并提出评价意见，作为其是否续聘的主要依据。对做出突出成绩的质量督导员给予表彰，不合格的进行业务培训和思想教育，仍不合格的，取消其督导员资格。二是切实发挥质量督导员的作用。在实施鉴定时，不定期以轮换方式派遣质量督导员，并树立督导员的权威，凡督导员认定考前准备不充分的不考，考试中出现严重问题的停考，考试舞弊的，按规定取消考试资格。三是不断提高质量督导人员的工作责任心和风险担当意识。督导人员要对每次督导写出督导情况分析，鉴定中心要经常组织相关人员通报考试中出现的各种情况，通过对具体考试的解读，提高督导人员的业务水平和督导能力。
二、规范职业技能鉴定考试过程
每次考试都必须高度重视。不论是全国统考，还是院校毕业生、社会统一鉴定，或是失业职工、农民工鉴定，考前都要制定考务手册，严密布置，并按规定实施。
1.明确责任分工
对鉴定中心、考点、督考员、监考员、保密员等人员要明确职责，责任到人。对试题的抽取、审核、印制、分装、保管，试卷的运送、交接、存放，必须落实到人并实行签字制度。工作过程中，不管哪个环节出了问题，谁出了问题追究谁的责任。考试前要开好三个会，即考点考务会、督考人员会及监考人和考评员培训会。
2.严肃考风考纪
鉴定过程实行考场封闭，无关人员不得进入考试区域，监考人员、考评人员、质量督导人员、考务工作人员都必须挂牌上岗。认真检查考生的身份证、准考证，对大型考试各考场安装无线电屏蔽仪并使用身份证识别仪进行鉴别。
3.严格考评员轮换
在操作考试中为避免考评员因考评时间长产生疲劳而影响考评质量，每名考评员在同一场次担任考评工作不得超过两天，在同一鉴定所内连续从事考评工作不得超过三次。
4.严把考件测评关
三级以上的工种考试，对不需要现场评阅的考件，全部实行二次编号、封存，运回鉴定中心，重新选派测评人员进行检测评分，最大限度排除外界因素的干扰。
三、加强职业技能鉴定质量督导
1.逢考必督
在鉴定工作中，要始终坚持把现场监督作为控制质量的重要一环。对于职业资格等级高或考生多的考试，每个工种甚至每个考试项目都要派一名质量督导员。对规模大的全国、全省的统考更要加大质量督导力度，抽调精干人员到各考点担任督考工作，并要请纪检、公安、无线委共同做好监督监控工作。
2.认真落实现场督导检查
质量督导员主要围绕以下七个方面实施督导：一是检查考场布局及相关规定张贴情况，检查理论考试考桌间距等考场布置是否合理及考场卫生情况等；二是检查考场考生与考评员、监考员比例情况；三是检查考评员、监考员证件佩戴情况；四是抽查考生双证的携带情况及有无替考情况；五是检查考试过程中监考人、考评员是否认真履行工作职责；六是监督检查考试过程中考生是否有舞弊情况；七是做好考点、考评人员的沟通与协调工作。
3.做好记录和反馈
一是对考点设施设备准备情况、是否设警戒线、操作用料是否充足、工作人员是否准时到位、有无安全隐患等方面做出评价；二是如实填写考评员、监考员的履职情况；三是对考试过程中出现的问题提出要求和建议。
四、强化职业技能鉴定考试安全工作
1.加强鉴定考试安全制度建设
制度建设带有根本性、长远性和稳定性。我们要针对鉴定考试工作的性质、特点，研究制定适应新形势的考试考务工作规程，建全完善责任追究制度，制定以确保考试安全为核心的工作人员行为规范，建立重大考试突发事件预案制度，为鉴定考试安全工作奠定坚实的制度保障基础。要健全管理措施，细化考务信息管理、试卷管理、考试实施和阅卷管理等重点环节的工作流程，努力做到任务要求明确、安全责任明确。
2.加强鉴定考试工作队伍建设
队伍建设是做好考试安全最核心、最基础的工作。必须下大决心、下大工夫抓好鉴定考试机构队伍建设，按照2015年人社部开展的人事考试工作人员警示教育活动部署，充分利用考试安全的典型案例，定期开展考试安全警示教育。要通过各类培训，增强考试工作人员预警风险、识别风险和化解风险的能力。
3.加强操作考试安全措施
职业技能鉴定考试较其他类型的考试，最突出的特点是要进行技能操作考试，即考生需要利用设施设备进行动手操作，这一考试特点，决定了技能鉴定考试存在着更多的安全风险。为此，在每次操作考试前，考点要安排专人对考试用设备设施进行试运转，确保设备的正常使用。考试用的材料，必须按考试准备通知单要求的型号规格准备。考试前一天，督考员要对考场进一步检查，并由考点负责人签署考点考试安全承诺书，交到督考员手中。
4.预防为主，打击考试作弊
王胜军 苏兆亮 陈建国 夏圣 邵启祥 黄新祥 许化溪
【摘要】 目的： 克隆并原核表达小鼠高迁移率族蛋白1（high mobility group box1，HMGB1）。方法： 从小鼠脾脏细胞中提取总RNA，应用RTPCR获得小鼠HMGB1cDNA，经PCR扩增小鼠HMGB1基因；通过TA克隆将该基因构建到PMD18T载体中，测序鉴定；将该基因插入pET28a(+)表达载体，IPTG诱导后，可表达相对分子质量约30 kDa的蛋白。蛋白质印迹鉴定表达的目的蛋白。结果： 经RTPCR扩增得到648 bp的DNA片段，序列分析显示与基因库中报道的已知序列完全一致；构建了含有HMGB1编码序列的原核表达载体，经诱导表达、蛋白质印迹鉴定，获得相对分子质量约30 kDa的融合蛋白。结论： 成功克隆和表达了小鼠HMGB1基因，为HMGB1蛋白的功能试验奠定了基础。
【关键词】 高迁移率族蛋白； 克隆； 原核表达
［Abstract］ Objective: To clone and express mouse high mobility group box chromosomal protein1(HMGB1)gene.Methods： Total RNA was extracted from mouse spleen cells， and the whole length of HMGB1 gene was obtained by RTPCR.The HMGB1 gene was cloned into PMD18T vector by TA clone and sequenced. Then the gene was inserted into pET28a(+) expression vector. identified by Western Blot. Results： The target DNA sequence of HMGB1 was obtained by RTPCR which was about 648 bp length，sequencing results showed that HMGB1 gene was exactly consistent with the sequence reported in GenBank;Western Blot identified there was a protein strap about Mr.30 000.The HMGB1 protein was successfully expressed. Conclusion： Clone and express mouse HMGB1 gene. It might provide a foundation for further study on the protein of HMGB1 function.
［Key words］ high mobility group box1; clone; prokaryotic express
高迁移率族蛋白1(high mobility group box1，HMGB1)是高迁移率族蛋白超家族的成员之一，是一种含量丰富的非组蛋白核蛋白［1］。编码区由648 bp组成，编码215个氨基酸，在核内具有调节基因转录和表达等作用；在细胞外HMGB1可以诱导某些炎症因子的释放，作为一种晚期炎症因子参与脓毒血症的发病过程［2，3］。最近研究表明，HMGB1也参与自身免疫性疾病的发病过程，如类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮等［4，5］。但其确切的作用机制尚未完全清楚。本研究克隆并表达了小鼠HMGB1，经鉴定表明获得了小鼠HMGB1的融合蛋白，为进一步探讨HMGB1对免疫细胞的调节及其在类风湿性关节炎中的作用机制，寻找类风湿性关节炎治疗的新途径奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
大肠埃希菌Rossta，DH5α，质粒pET28a(+)为本室保存；Trizol购自Invitrogen 公司；DNA Gel Extraction Kit、各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、rTaq酶、pMD18T 载体购自TaKaRa宝生物工程(大连) 有限公司；AMV Reverse Transcriptase， RNase Inhibitor均购自Sigma公司;鼠抗HisTag单克隆抗体购自Omiga公司;HisTrapHP购自GE Health care公司。
1.2 方 法
1.2.1 PCR引物和设计 根据基因库中小鼠HMGB1 mRNA序列，设计编码区的特异性引物：上游引物序列为P1: 5′CGAGCTCATGGGCAAAGGAGATCCT3′，下游引物序列为P2： 5′CCAA GCTTTTATTCATCATCATCATC3′，在上下游引物5′端分别插入Sac Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点和保护碱基，以便于酶切、克隆。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2.2 总RNA的提取及RTPCR 颈椎脱臼处死成年小鼠，无菌取脾脏，经充分研磨过滤后，用Trizol一步法提取总RNA，逆转录获得cDNA模板，然后用HMGB1编码区特异性引物进行PCR扩增。循环条件为：94℃ 30 s， 57℃ 30 s， 72℃ 45 s， 共30 个循环。取5 μl PCR产物， 用1%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后， 紫外透射分析仪观察结果。
1.2.3 TA克隆PCR扩增产物到PMD18T载体 回收PCR产物，TA克隆PMD18T。转化大肠埃希菌DH5α感受态，培养后挑取单个菌落、提取质粒、Sac Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，将阳性重组子命名为PMD18THMGB1并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序证实。
1.2.4 HMGB1表达载体的构建和诱导表达 用Sac Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切PMD18THMGB1和表达质粒pET28a(+)，胶回收后连接转化大肠埃希菌Rossta感受态细胞。挑取生长良好的菌落并接种于3 ml LB培养基中，37℃，250 r/min增菌过夜，次日以1∶100接种于300 ml LB培养基中，37℃培养至D(600) nm=0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，30℃诱导4 h后离心收集细菌，超声后分别取上清和沉淀，以12 g/dl的SDSPAGE及蛋白质印迹分析鉴定表达的蛋白。经限制性内切酶分析，含正确序列的克隆重组质粒命名为pET28HMGB1。
2 结 果
2.1 HMGB1编码区cDNA的获得与鉴定
通过1%的琼脂糖凝胶电泳证实，经逆转录获得的一条约648 bp大小的特异性条带，与预期目的片段大小相符（图1）。
2.2 PMD18THMGB1的双酶切鉴定结果
将重组质粒DNA经Sac Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后，通过1%琼脂糖凝胶电泳，获得一条约为648 bp大小的目的条带，与预期结果相符(图2)。
2.3 HMGB1质粒测序结果
将重组质粒PMD18THMGB1送上海生工工程技术有限公司进行测序，测序结果与基因库中的序列比对完全正确。
2.4 pET28HMGB1原核表达载体的构建及鉴定
测序正确的PMD18THMGB1及pET28a(+)，分别用Sac Ⅰ和Hin d Ⅲ双酶切后，回收目的片段HMGB1和载体pET28a(+)，然后用T4连接酶连接构建成重组质粒pET28HMGB1。重组质粒转化Rossta感受态，挑取单个菌落提取质粒，Sac Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后，1%的琼脂糖凝胶电泳，在大约648 bp的位置可见目的条带。
2.5 pET28HMGB1的原核表达及鉴定
pET28HMGB1的Rossta转化菌，在30℃条件下IPTG诱导超声，目的蛋白以可溶性和包涵体形式存在。SDSPAGE电泳可以见到在大约30 kD处有一条带，与预期结果相同（图3）。蛋白质印迹鉴定结果见图4。
3 讨 论
HMGB1是近年来发现的晚期炎症介质，相对分子质量约为30 kD，在哺乳动物中高度保守，表达谱较为广泛。HMGB1作为核内蛋白，是核小体的非组蛋白，主要参与核小体的稳定，异化基因转录等。在细胞坏死的情况下HMGB1可释出细胞，但在细胞凋亡时HMGB1则与染色体结合并连同死细胞被机体的吞噬细胞清除，部分HMGB1可由活化的巨噬细胞分泌，但其具体的出胞机制尚未清楚。有研究表明巨噬细胞活化后，可以增加HMGB1的表达和释放［6］。在胞外，HMGB1可以刺激滑膜细胞释放TNFa，IL1，IL6等致炎因子。类风湿性关节炎的发生发展与T，B淋巴细胞的活化有关［7］。近年来研究发现，TNF和HMGB1在类风湿性关节炎的发生发展过程中均作为重要的炎症介质参与炎症反应。封闭TNF的治疗方法已在类风湿性关节炎的治疗中取得了良好的效果。但另有研究发现，敲除TNF的小鼠不仅仍可发生类风湿性关节炎，而且TNF抑制剂治疗效果受到影响，这提示HMGB1等其他分子参与炎症反应的可能性。近年来，HMGB1在类风湿性疾病中的作用正日益受到人们的关注［8］。 本研究成功克隆了小鼠HMGB1编码区全长序列，并在大肠杆菌中获得了融合蛋白的表达，为进一步研究HMGB1对免疫细胞的调节及其在类风湿性关节炎中的作用奠定了基础。
参考文献
［1］ Bustin M.Regulation of DNAdependent activities by the functional motifs of thehighmobilitygroup chromosomal proteins［J］.Mol Cell Biol，1999，19(8)：5237-5246.
［2］ Wang H， Yang H， Tracey KJ. Extracellular role of HMGB1 in inflamation and sepsis ［J］.Intern Med，2004，255(3):320-331.
［3］ Wang H， Yang H， Czura CJ，et al. HM GB1 as late mediator of lethal systemic inflammation［J］. Am J Respir Crit Care Med，2001，164(10):1768-1773.
［4］ RovereQuerini P，Capobianco A，Scaffidi P，et al. HMGB1 is an endogenous immune adjuvant released by necrotic cells［J］.EMBO Rep， 2004， 5(8):825-830.
［5］ Aneja RK，Tsung A，Sjodin H，et al. Preconditioning with high mobility group box 1(HMGB1) induces lipopolysaccharide(LPS) tolerance［J］. Leukoc Biol，2008，84(5):1326-1334.
［6］ 朱明光，常雅萍.高迁移率族蛋白B1的致炎细胞因子作用研究进展［J］.国际免疫学杂志，2006，29（4）：257-260.
【关键词】 ，基因表达
Construction and identification of recombinant eukaryotic expression vector of human antisense cortical actinassociated protein gene
【Abstract】 AIM: To construct a recombinant eukaryotic expression vectorpcDNA3.0/cortactin containing functional region of human antisense cortical actinassociated protein gene (cortactin)， so as to provide a tool for the further study on the impact of cortactin in hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis. METHODS: Total RNA was extracted by using Trizol onestep method from cell line MHCC97. CDNA was amplified using reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR). Product of PCR， amplified by being transformed into E.coli Dh5α， was inserted reversely into the eukaryotic expression vector after digestion and ligation using restriction endonucleases and ligase. RESULTS: The correct cortactin cDNA clone was obtained and it was confirmed that cortactin cDNA was inserted reversely into the eukaryotic expression vector correctly using PCR， digestion identification and sequencing. CONCLUSION: The recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3.0/cortactin is successfully constructed.
【Keywords】 gene expression; highly metastatic HCC cell line MHCC97; reverse transcriptase polymerase chain reaction; human cortical actinassociated protein (cortactin)
【摘要】 目的： 构建一个包含人皮层肌动蛋白（cortactin）反义基因的全部功能区的重组真核表达载体pcDNA3.0/cortactin，为进一步研究人皮层肌动蛋白对人肝癌细胞的转移影响的研究奠定基础. 方法： Trizol试剂法提取体外培养的人肝癌高转移细胞株MHCC97总RNA，经逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）扩增目的片段，PCR产物及真核表达载体分别双酶切后进行连接，并转化入大肠杆菌Ecoli.Dh5α扩增以获得重组载体. 结果： RTPCR获得预期大小的特异性DNA片段，经PCR、双酶切鉴定及测序证实已将人皮层肌动蛋白基因cDNA片段正确的反向插入真核表达载体中. 结论： 成功获得反义pcDNA3.0/cortactin重组质粒.
【关键词】 基因表达；高转移肝癌细胞MHCC97；逆转录聚合酶链反应；人皮层肌动蛋白cortactin
0引言
原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一， 其侵袭转移和术后复发是患者死亡的主要原因. 目前国内外对肝癌转移机制研究逐步深入. 最近人们发现人皮层肌动蛋白cortactin基因对于肿癌的转移有重要的促进作用.为此，我们利用反义核酸技术构建真核表达载体pcDNA3.0/cortactin，为后续的研究将该基因片段转染入肝癌细胞株，观察该基因在肝癌细胞株中的表达情况，并对转染后的细胞功能进行研究作好准备.
1材料和方法
1.1材料高转移肝癌细胞MHCC97购自上海复旦大学中山医院肝癌研究所；大肠杆菌Ecoli. Dh5α，真核表达载体pcDNA3.0由第四军医大学分子生物学教研室吴元明博士惠赠. 高糖型DMEM培养液为 Invitrogen公司产品；新生牛血清系北京元亨圣马生物技术研究所产品；胎牛血清为杭州四季青生物工程材料技术有限公司产品；胰蛋白酶(Trypsin)为北京原平皓生物技术有限公司产品；胰蛋白胨(Tryptone)及酵母提取液（Yeast Extract）为OXLID公司产品；琼脂（Agar）为Sanland公司产品；琼脂糖（Agarose）为上海Yito公司产品；Trizol试剂、Taq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶（XhoI， BamHI）、pMD 18T载体、Trizol试剂为Takana公司产品；胶回收试剂盒为BioDev公司产品；质粒小量抽提试剂盒为Vgene公司. PCR引物： 根据Gene Bank中查到的cortactin的mRNA序列，用软件Primer Premier5.0设计上下游引物，引物序列如下（划线部分分别是BamHI和XhoI的碱基识别序列，斜体部分为保护序列）：上游引物5′ATACTCGAGGTGGAACAAGACCGAATGGA3′；下游引物 5′TAGGATCCATCCCAGCCAAGGGCACATT3′.
1.2方法
1.2.1高转移肝癌细胞MHCC97培养将购回的细胞经2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，培养于含100 mL/L胎牛血清的高糖型DMEM完全培养液中，置于37℃含50 mL/L CO2的孵箱中培养，每3 d换液1次，直至铺满.
1.2.2总RNA的提取用2.5 g/L胰蛋白酶消化培养铺满的肝癌细胞MHCC97，PBS洗涤后转移至1.5 mL微量离心管中，离心1000 g离心10 min，弃上清，加入1 mL Trizol试剂，立即反复抽吸至细胞充分裂解，静置5 min，加入200 μL氯仿剧烈振荡15 s，低温离心机4℃ 12000 g离心20 min，取水相至一新的微量离心管中，加入等体积的异丙醇，4℃静置60 min，低温离心机4℃ 12000 g离心20 min，弃上清，750 mL/L乙醇洗涤沉淀2次、4℃ 5000 g离心10 min，弃上清，沉淀自然干燥3 min，加入15 μL无Rnase水溶解沉淀. 取5 μL行凝胶电泳； 2 μL用于反转录.
1.2.3反转录合成cDNA根据反转录试剂盒的说明用随机六聚体法反转录合成cDNA. 将反应体系置于冰上，取总RNA 2 μL+引物(随机六聚体)1 μL+去离子水9 μL于PCR反应管中，轻轻混匀，在PCR反应仪中70℃静置5 min；放置冰上，依次加5×Buffer 4 μL， Rnase抑制剂1 μL和dNTP 2 μL，轻混匀，25℃ 5 min；立即冰浴后加入反转录酶1 μL（终体积20 μL），轻混匀后依次进行25℃ 10 min， 42℃ 60 min， 70℃ 10 min和立即冰浴. 取cDNA进行PCR.
1.2.4PCR扩增目的片段cortactin基因在PCR反应管中建立50 μL反应体系： Buffer 5 μL， MgCl2 3 μL， Sense 2.5 μL， Antisense 2.5 μL， cDNA 4 μL， dNTP 2 μL， ddH2O 31 μL；并用50 μL矿物油封. 热启动94℃， 4 min后加Taq酶 0.5 μL. 反应条件为： 94℃预变性4 min后，95℃变性30 s，56℃退火2 min，72℃延伸2 min，共35个循环，72℃再延伸7 min. 最后4℃保存. 产物行凝胶电泳. 目的片段切胶按胶回收试剂盒说明行胶回收纯化. -70℃保存.
1.2.5目的片段与T载体连接在0.5 mL PCR反应管中建立如下10 μL连接反应体系： pMD 18T Vector DNA 1 μL，目的片段胶回收产物3 μL，去离子水1 μL， Solution I 5 μL， 16℃反应2 h. 将全量连接产物转化至感受态细菌100 μL中；在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上37℃培养12 h，形成单菌落. 挑取少许摇菌，37℃， 200 r/min振摇扩增过夜.
1.2.6重组T载体的鉴定
1.2.6.1PCR法鉴定重组T载体中连接有目的片段取1 mL振摇扩增过夜的菌液，4000 g离心10 min，弃上清；菌液沉淀加100 μL水重悬并煮沸10 min裂解细菌；12000 g离心10 min，取上清于新的微量离心管中；取4 μL作为模板进行目的片段的PCR反应. 反应产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳.
1.2.6.2重组T载体双酶切鉴定将经PCR鉴定阳性的克隆进行扩增摇菌，按质粒抽提试剂盒说明进行提质粒.质粒进行双酶切鉴定，限制性内切酶为XhoI， BamHI. 37℃双酶切6 h，并70℃ 15 min灭活双切酶；产物行10 g/L琼脂糖电泳鉴定.
1.2.6.3目的片段的测序鉴定如经PCR及双酶切鉴定均证实目的片段已连入T载体. 可取阳性克隆菌液100 μL，交上海华大基因公司测序鉴定.
1.2.7目的片段与线性质粒pcDNA3.0的连接将测序正确的连接有目的片段的重组T载体及pcDNA3.0分别进行双酶切，双酶切反应体系同前，产物行凝胶电泳，切取目的片段及线性质粒胶回收纯化. 目的片段及线性质粒按3∶1比例建立连接反应体系， 16℃反应2 h，将全量(10 μL)连接产物转化至感受态细胞100 μL中；在含有Amp的LB琼脂平板培养基上37℃培养12 h，形成单菌落. 摇菌扩增，抽提质粒.
1.2.8重组质粒pcDNA3.0/cortactin（+）的双酶切鉴定微量离心管中依次加入去离子水11 μL， 10×K Buffer 2 μL， BamHI及XhoI各1 μL，最后加入重组质粒pcDNA3.0/cortactin（+） 5 μL， 37℃双酶切6 h. 产物行10 g/L琼脂糖电泳鉴定.
2结果
2.1提取的总RNA凝胶电泳分析见28， 18和5S 3条不同的明亮条带，说明提取的总RNA的完整性良好. 对RNA样品进行紫外分光光度分析得出A260/A280>1.8，表明RNA有较高的纯度，符合反转录的要求.
2.2目的片段PCR产物进行凝胶电泳在500 bp处有明亮特异条带，与预期结果一致（图1）.
2.3重组pMD 18T/cortactin（+）的鉴定
2.3.1PCR鉴定在500 bp处有明亮特异条带，与预期结果一致（图2），初步表明目的片段连接上重组T载体.
2.3.2双酶切鉴定双酶切结果行凝胶电泳，在500 bp处及大于2000 bp处分别有明亮条带（图2），表明cortactin基因已连接入T载体.
图1目的片段cortactin基因的PCR产物凝胶电泳结果（略）
图2重组pMD 18T/cortactin（+）的PCR及双酶切鉴定凝胶电泳结果（略）
2.3.3重组pMD 18T/cortactin（+）的测序鉴定结果与Gene Bank中的cortactin序列进行比对，结果完全一致.
2.4重组质粒pcDNA3.0/cortactin（+）的双酶切鉴定凝胶电泳分别于大于5000 bp及500 bp处有明亮条带（图3），表明测序结果正确的cortactin片段连接入pcDNA3.0 中的BamHI和XhoI酶切位点之间，已成功获得重组真核表达载体pcDNA3.0/cortactin（+）.
图3重组质粒pcDNA3.0/cortactin（+）的双酶切鉴定凝胶电泳结果（略）
3讨论
肝细胞肝癌(HCC)是目前最常见的恶性肿瘤之一，尽管诊断和治疗技术取得了很大的进步，但是肝癌的高复发性仍是当前肝癌治疗工作中的一个难点和重点，而目前对肝癌术后复发的主要防范措施是术后的介入性化疗和大剂量长时间的干扰素治疗，疗效仍不满意［1］. 肝细胞肝癌的侵袭和转移包括了基质的降解、细胞迁移、血管生成等一系列步聚［2］，Yuan等［3］在头颈部肿瘤、膀胱癌、乳腺癌中的研究表明肿瘤的迁移运动能力加强能促进肿瘤的扩散与转移.
Cortactin是一个p80/85的蛋白，为Src蛋白激酶的作用底物［4］. Somogyi等［5］通过研究果蝇的皮层肌动蛋白发现该蛋白位于细胞的表面或两极；蛋白间相互作用机制类同于哺乳动物的皮层肌动蛋白，参与细胞骨架（cytoskeleton）的重组与黏附［3］，因而得名. cortactin基因EMS1，位于染色体11q13，该区域在头颈部肿瘤、膀胱癌及乳腺癌等中均有扩增，Chuma等［4］研究发现在转移性肝癌细胞株中均有cortactin的过表达，且该蛋白位于细胞的表面，故有望将此蛋白作为单克隆抗体治疗肝癌的靶向蛋白.
本实验利用反义核酸技术，根据碱基互补原理，合成一段与靶DNA互补的短链寡核苷酸，反向插入真核表达载体pcDNA3.0的BamHI和XhoI酶切位点之间，构建真核表达载体pcDNA3.0/cortactin（+）. 本实验通过对培养细胞进行Trizol一步法提取总RNA，反转录合成cDNA，目的片段连入T载体后经PCR、双酶切及测序鉴定等方法保证了插入真核表达载体pcDNA3.0序列的正确性. 并对重组真核表达载体pcDNA3.0/cortactin（+）进行双酶切鉴定，证实构建成功.
参考文献
［1］ 易述红，陈规划，许戈良，等. 奥曲肽诱导大鼠肝部分切除术后种植性肝癌细胞凋亡的研究［J］. 中华肝胆外科杂志，2004，10(6):411-413.
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关键词：生产设备；维修保养；设备管理
中图分类号：TU522文献标识码： A
1.目的
规范公司生产设备大修、转场维修、故障维修及保养的管理，提高设备的完好率和利用率，提升公司效益。
2.术语和定义
2.1 生产设备大修
是指为使设备恢复其出厂设计性能和精度而进行的全面性修理。
2.1.1生产设备大修判定标准：是指生产设备大修前应具备的条件，同时满足下列二个条件时,则需大修：
（1）生产设备性能已达不到出厂设计要求。
（2）时间达到生产设备的大修间隔规定。
2.1.2从动力、机械、电气、液压四方面对生产设备进行评判，当每方面至少有一半以上要素同时发生时，判定为生产设备性能达不到出厂设计要求。
（一）动力部分（发动机）：
（1）发动机动力性能显著下降。
（2）发动机燃油、油或冷却液消耗量明显增加。
（3）运转时有严重的异响。
（二）机械部分：
（1）生产设备主体结构部分严重变形、严重开裂或严重锈蚀。
（2）制动器出现磨损严重、操作失灵、制动力下降或失效，无法调整。
（3）钢丝绳出现严重断丝、严重变形、严重磨损、断股等达到报废标准现象。
（4）行走机构严重磨损，无法正常工作。
（5）传动机构主要部件到极限磨损程度，运转中出现偏摆、异响或撞击抖动现象；
（6）操作机构磨损间隙过大，操纵失灵。
（7）变速箱、齿轮轴磨损严重，运转中有异响现象。
（三）电气部分：
（1）电动机的定子及转子的对地及相间绝缘电阻低于正常值，运行中有严重异响，轴承损坏或有扫膛现象。
（2）安全保护装置损坏或失灵。
（3）因控制电路或元件老化经常引起生产设备出现故障而不能正常使用。
（四）液压部分：
（1）马达、泵或千斤出力明显下降，无法正常工作。
（2）因密封件或油管老化引起大面积的漏油现象。
（3）液压油路控制系统出现故障，不能正常工作。
2.1.3间隔指标：是指连续两次大修之间的间隔时间。考虑目前工程转移比较频繁，结合公司生产设备目前性能状态，大修时间间隔定为4年，大修时间间隔中不包括生产设备封存时间,如该生产设备中间有封存时间,大修时间间隔顺延，生产设备每经过一次大修后，时间间隔减少1年，直至报废。
2.2 转场修理
是指生产设备进行在施工现场转场安装前，为保证生产设备能恢复其设计性能和技术状况而进行的修理。
2.3 故障修理
是指生产设备日常性、突发性的修理，主要是排除使用不当、保养失误造成的临时故障或局部损坏。
2.4 保养
是指以清洁、、调整、紧固、防腐为主要内容的保护性修理，是以维持生产设备的技术状况为主的维修形式。
3. 管理内容
3.1 生产设备大修
3.1.1大修鉴定：设备管理单位组织操作、机务、液压、电气等相关专业人员对设备进行一次大修前鉴定，填写“大修前技术性能鉴定表”，根据鉴定结果，确定生产设备的大修范围，并由鉴定负责人签署意见。
3.1.2大修预算：设备管理单位根据“设备大修前技术性能鉴定表”编制设备大修预算表，并启动设备大修预算审批流程，对于公司不提取大修费用的生产设备，预算由设备管理单位自行审批。
3.1.3大修计划：设备管理单位编制“设备大修计划”后上报工程技术部审核、工程技术部汇总形成公司年度设备大修计划，经分管领导签署意见后报设备管理委员会批准。
3.1.4大修实施
1）确定维修人员：设备管理单位确定大修项目的项目负责人、技术负责人和施工负责人等相关人员。
2）确定技术方案：技术人员确定后，编制生产设备大修作业指导书，经设备管理单位审批后实施。要求大修作业指导书要能正确指导作业活动，规范现场操作，格式符合公司作业指导书管理要求。
3）确定项目工作计划：大修项目负责人组织施工负责人、技术负责人等相关人员对技术方案进行讨论，结合现场实际情况形成具体的“项目工作计划”， 经设备管理单位审批后实施。
4）安全技术交底：项目负责人组织参与大修的所有相关人员进行交底，并履行双签字手续，形成“施工交底记录表”，交底内容要全面、清楚，被交底人可以复述。中途参与施工人员要补交底后方能作业，大修项目因故停工超过一个月重新开工时，要重复交底。
5）大修过程：过程中技术负责人要及时填写“设备维修记录表”，施工负责人审核，大修记录要准确、及时、真实。
3.1.5大修验收：施工完成后，大修项目负责人组织施工负责人、技术负责人、操作人员、液压人员、电气人员、机务人员等专业人员按设备大修鉴定表及相关大修验收标准进行验收，并进行签字确认，形成“设备维修验收表”，验收要全面、无漏项。
3.1.6大修结算：生产设备大修完成后，设备管理单位填写大修结算单并启动大修结算流程，报公司工程技术部审核，计划经营部审批。
3.1.7资料归档：大修完成后1个月内设备管理单位要负责将资料进行整理，移交工程技术部审核并移交档案管理部门归档。
3.2 生产设备转场维修
3.2.1维修鉴定：设备转场安装前，设备管理单位组织相关专业人员对设备进行维修前鉴定，并填写“维修前技术性能鉴定表”，根据鉴定结果，确定转场维修范围，并由鉴定负责人签署意见。
3.2.2维修计划：设备管理单位根据设备维修鉴定结果编制“设备转场维修计划”，并经设备管理单位审批完成。
3.2.3维修实施
1）确定维修人员：设备管理单位确定维修项目的项目负责人、技术负责人、施工负责人等相关人员。
2）确定技术方案：技术人员确定后，要编制生产设备转场维修作业指导书，经设备管理单位审批后实施，维修作业指导书要能正确指导作业活动，规范现场操作，格式符合公司制度要求。
3）项目工作计划：维修项目负责人组织施工负责人、技术负责人等相关人员对维修方案进行讨论，结合现场实际形成“项目工作计划”，经设备管理单位审批后实施。
4）安全技术交底：项目负责人组织参与维修的所有相关人员进行交底，并履行双签字手续，形成“施工交底记录表”，交底内容要全面、清楚，被交底人可以复述。中途参与施工人员要补交底后方能作业，维修项目因故停工超过一个月重新开工时，要重复交底。
5）维修过程：过程中技术负责人要及时填写“设备维修记录表”，施工负责人审核，维修记录要准确、及时、真实。
6）维修验收：施工完成后，项目负责人组织施工负责人、技术负责人及操作人员、液压人员、电气人员、机务人员等专业人员按设备维修鉴定表及相关维修验收标准进行验收，形成“维修验收表”，验收要全面、无漏项。
7）资料归档：维修工作完成后1月内，维修单位要负责将资料进行整理归档，存放于设备管理单位。
3.3 生产设备故障维修
3.3.1 故障上报：生产设备发生故障，操作人员不能自行修理完成时，要及时向上级部门上报。
3.3.2 生产设备故障维修:
1）确定维修人员：设备管理单位根据故障发生性质，指派相关专业人员组织进行维修。
2）确定维修方案：技术人员确定后，编制生产设备维修方案，经设备管理单位审批后实施。维修方案要能正确指导作业活动，规范现场操作，格式符合公司管理要求。
3）安全技术交底：组织参与维修的所有相关人员进行交底，并履行双签字手续，形成“施工交底记录表”，交底内容要全面、清楚，被交底人可以复述。
4）维修过程：过程中技术负责人要及时填写“设备维修记录”，施工负责人审核，维修记录要准确、及时、真实。
5）维修验收：修理结束后，设备管理单位组织相关人员进行验收，并填写设备维修验收表。
3.4 生产设备外委修理
3.4.1 当内部维修能力不足时，可以外委修理，涉及到外委修理相关方时，要对其进行评审，评审时由设备管理单位发起，工程技术部进行资质审核，计划经营部进行经济指标审核，通过后进入公司合格供方名录。
3.4.2 设备管理单位要从合格供方名录中确定修理单位，维修费用在10万及以上的，按招投标管理规定执行来确定修理单位。签订设备维修合同后，设备管理单位监督修理过程，跟踪填写设备维修记录和最终验收记录。
3.5 生产设备保养
3.5.1 保养计划：设备管理单位编制本单位年度生产设备保养计划上报工程技术部审批。
3.5.2 保养实施：设备管理单位按照设备保养计划，进行检查和保养，并分别填写生产设备日常检查保养记录和定期检查保养记录。
3.5.3 保养验收：设备管理单位对生产设备保养情况进行检验，并在日常检查保养记录和定期检查记录上签字验收。
参考文献
[1]《中国能源建设集团有限公司设备管理暂行办法》
【摘要】 目的: 构建人IL8正义和反义真核表达载体。方法: RTPCR扩增正义和反义IL8基因片段后， 将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)， 通过菌落PCR、 双酶切及测序进行鉴定后， 采用脂质体法分别瞬时转染至人卵巢癌细胞系A2780和SKOV3细胞中， 并用RTPCR和ELISA法检测细胞转染后IL8的表达水平。结果: 经验证， 重组人IL8正义/反义真核表达载体构建正确。pcDNA3.1(+)ssIL8转染A2780细胞后， 其IL8 mRNA及蛋白表达水平均显著增加; 而pcDNA3.1(+)asIL8转染SKOV3细胞后， 其IL8分泌水平降低。结论: 成功构建了人IL8正义/反义真核表达质粒pcDNA3.1(+)ssIL8/pcDNA3.1(+)asIL8， 为后续研究IL8在卵巢癌及其他肿瘤中的作用打下基础。
【关键词】 IL8; 正义/反义; 真核表达载体; 卵巢癌细胞
[Abstract] AIM: To construct the sense or antisense IL8 eukaryotic expression vectors. METHODS: Sense or antisense IL8 full length gene were amplified by RTPCR and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+). After the identification by PCR， restriction endonuclease digestion and the nucleotide sequencing， the recombinant vectors were transfected into human ovarian carcinoma A2780 and SKOV3 cell lines transiently by lipofectamine mediation. The expression of IL8 gene and protein were detected by RTPCR and ELISA. RESULTS: The sense or antisense IL8 eukaryotic expression vectors were constructed and verified. The expression of IL8 gene and protein in A2780 cells transfected with pcDNA3.1(+)ssIL8 were increased， whereas the expression of IL8 protein in SKOV3 cells transfected with pcDNA3.1(+)asIL8 was decreased. CONCLUSION: The eukaryotic expression vectors pcDNA3.1(+)ssIL8 or pcDNA3.1(+)asIL8 have been constructed successfully， which lays a base for further study on roles of IL8 in ovarian cancer and other tumors.
[Keywords]IL8; sense or antisense; eukaryotic expression vector; ovarian carcinoma cells
IL8是一种多功能的趋化因子， 可参与多种恶性肿瘤的生长、 转移及血管生成。近年来研究表明[1， 2]， IL8在卵巢癌中高表达， 其高表达可能与卵巢癌发生、 发展及化疗关系密切。我们前期研究发现[3， 4]， IL8及雌、 雄激素均可促进卵巢癌细胞增殖; IL8还可在无雌、 雄激素的条件下调节卵巢癌细胞表达雌、 雄激素的受体， 从而增加该细胞对两种激素的敏感性。为了深入探讨IL8在卵巢癌发生、 发展及化疗和内分泌治疗中的作用及作用机制， 我们应用基因重组技术， 成功构建人IL8正义(sense， ss)和反义(antisense， as)真核表达载体， 从而为后续研究IL8在卵巢癌及其他肿瘤中的作用及作用机制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 TOP10感受态细菌购自北京天根生物公司; 真核表达载体pcDNA3.1(+)为美国Invitrogen公司产品， 由本室保存。人卵巢癌细胞系A2780和SKOV3细胞均为美国ATCC公司产品， 由本室保存。RPMI1640培养基为美国Gibco公司产品; 2×Premix Taq、 MMLV逆转录酶、 BamHⅠ、 XhoⅠ为TaKaRa公司产品; T4 DNA 连接酶为美国NEB公司产品、 DNA胶回收试剂盒为加拿大Bio Basic公司产品; 人IL8 ELISA试剂盒为美国R&D公司产品; OptiMEMⅠ、 LipofectamineTM 2000、 TRIzol试剂为美国Invitrogen公司产品; 100 bp和1 kb DNA Marker、 高纯度质粒小提试剂盒购自北京天根生物公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 人IL8全长编码基因扩增用引物， 参照GenBank数据库(NM000584.2)， 采用DNAMAN软件设计， sense IL8引物， F: 5′CTCGGATCCATGACTTCCAAGCTGGCCGTG3′(划线部分为BamHⅠ酶切位点)， R: 5′AGACTCGAGTTATGAATTCTCAGCCCTCTT3′(划线部分为XhoⅠ酶切位点); 目的片段318 bp。antisense IL8引物， F: 5′CTCGGATCCATGTGAATTCTCAGCCCTCTT3′(划线部分为BamHⅠ酶切位点)， R: 5′AGACTCGAGTTAACTTCCAAGCTGGCCGTG3′(划线部分为XhoⅠ酶切位点)， 目的片段318 bp。
1.2.2 目的基因的扩增 自SKOV3细胞中提取总RNA作为逆转录模板， 采用RTPCR方法扩增IL8正义全长目的基因片段。逆转录反应条件参照TaKaRa MMLV逆转录酶说明书进行， 逆转录产生的cDNA经PCR扩增获得约300 bp大小的目的片段(引物序列见1.2.1)。50 μL IL8正义PCR产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳后， 按照DNA胶回收试剂盒说明回收纯化DNA片段。以此纯化的IL8正义PCR产物为模板， 扩增IL8反义全长目的基因片段(引物序列见1.2.1)。PCR反应体系: cDNA 0.5 μL， 2×Premix Taq 25 μL， 上、 下游引物各25 pmol， 加双蒸水至总体积50 μL。PCR反应条件: 94℃ 5 min预变性; 94℃ 30 s变性， 59℃ 45 s退火， 72℃ 1 min延伸， 34个循环; 72℃ 延伸10 min。
1.2.3 重组质粒的构建 空载体pcDNA3.1(+)、 IL8正义或反义PCR纯化回收产物分别用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切， 经电泳回收目的条带后定量。按照目的片段和载体片段摩尔比为3∶1的原则， 用T4 DNA连接酶将双酶切后的目的片段和空载体进行连接， 而后转化入TOP10感受态细菌。将转化细菌均匀涂布于含氨苄青霉素50 mg/L的LB琼脂平板上， 倒置于37℃温箱培养12 h(过夜)。
1.2.4 重组质粒的鉴定 挑取孤立菌落， 用100 μL去离子水重悬， 作为模板， 进行菌落PCR扩增鉴定。PCR反应体系为: 菌落1 μL， 2×Premix Taq 10 μL， 上、 下游引物各10 pmol(引物序列见1.2.1)， 加双蒸水至总体积20 μL。PCR反应条件同1.2.2。经菌落PCR鉴定阳性的单菌落， 接种于含氨苄青霉素100 mg/L的LB液体培养基中， 37℃恒温摇床震荡培养过夜， 按照质粒小量提取试剂盒说明提取质粒， 并用BamH Ⅰ和XhoⅠ进行双酶切鉴定。经菌落PCR和酶切鉴定证实有插入片段后， 将阳性菌液2 mL送北京天根生物公司测序， 将测序结果正确的重组载体分别命名为pcDNA3.1(+)ssIL8和pcDNA3.1(+)asIL8。
1.2.5 细胞瞬时转染 采用脂质体法将重组载体pcDNA3.1(+)ssIL8或pcDNA3.1(+)asIL8及空载体pcDNA3.1(+)分别导入A2780细胞和SKOV3细胞中。按照脂质体LipofectamineTM 2000说明书进行， 具体步骤如下: 用无抗生素、 含100 mL/L FBS的RPMI1640培养液调整细胞密度为2×108/L， 每孔2 mL加入6孔板， 37℃、 50 mL/L CO2培养过夜。待细胞生长至80%融合时， 更换新鲜的无抗生素、 含100 mL/L FBS的RPMI1640培养液。准备A、 B两液， A液: 250 μL OptiMEMⅠ， 加入4 μg重组载体或空载体， 轻混; B液: 250 μL OptiMEMⅠ， 加入10 μL脂质体， 轻混后室温放置5 min。上述两液混合后， 室温放置20 min， 加入到每孔细胞中， 37℃、 50 mL/L CO2培养6 h后， 更换无抗生素、 含100 mL/L FBS的RPMI1640培养液， 每孔2 mL。转染细胞分别命名为pcDNA3.1(+)/A2780、 pcDNA3.1(+)ssIL8/A2780和pcDNA3.1(+)/SKOV3、 pcDNA3.1(+)asIL8/SKOV3。
1.2.6 细胞转染后IL8表达水平的检测 转染后24 h， 采用ELISA法检测上清中IL8的含量; 同时收集细胞， 抽提RNA后分别以IL8的特异性引物进行RTPCR反应。引物序列如下: IL8， F: 5′AACATGACTTCCAAGCTGGCCG3′， R: 5′CAGTTTTCCTTGGGGTCCAGAC3′， 目的片段251 bp; 内参照GAPDH， F: 5′CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA3′， R: 5′ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA3′， 目的片段450 bp。PCR反应体系: cDNA 1.0 μL， 2×Premix Taq 10 μL， 上、 下游引物各10 pmol， 加双蒸水至总体积20 μL。PCR反应条件: 94℃ 5 min预变性; 94℃ 30 s变性， 59℃ 45 s退火， 72℃ 1 min延伸， 34个循环; 72℃ 延伸10 min。反应结束后， 取PCR反应液5 μL于12 g/L琼脂糖凝胶电泳。
2 结果
2.1 正义和反义IL8全长基因片段扩增 以SKOV3细胞的总RNA为模板， 应用前述引物进行RTPCR， 将扩增产物进行12 g/L琼脂糖凝胶电泳(图1)， 可见300 bp左右单一条带， 与预计片段长度(318 bp)相符。
2.2 重组载体的构建与鉴定 目的片段和空载体分别经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切， 按照目的片段与空载体的摩尔比为3∶1进行连接反应， 连接产物进行转化并过夜培养， 次日可见阳性菌落形成。挑选独立阳性菌落进行PCR扩增后， 可见约300 bp的条带(图2)。挑取PCR鉴定阳性的菌落摇菌， 提取质粒DNA后进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定(图3)， 可见约5.3 kb和300 bp左右的片段出现， 说明真核表达载体pcDNA3.1(+)上已成功插入了ssIL8或asIL8全长编码基因。对阳性克隆中的插入片段进行序列测定， 结果显示， 所克隆的基因与GenBank数据库中人IL8的正义及反义全长序列完全一致。
2.3 RTPCR技术检测IL8 mRNA在A2780细胞中的表达 与对照A2780细胞和pcDNA3.1(+)/A2780细胞相比(图4)， pcDNA3.1(+)ssIL8/A2780细胞的IL8 mRNA的表达水平明显增高， 而未转染细胞和转染空载体细胞之间差别不大。
2.4 ELISA法检测IL8蛋白在A2780和SKOV3细胞中的表达 转染正义IL8的pcDNA3.1(+)ssIL8/A2780细胞的IL8 蛋白表达水平为(1.043±0.004)μg/L， 明显高于转染空载体的pcDNA3.1(+)/A2780细胞(0.010±0.001)μg/L(P
3 讨论
IL8是一种多功能的趋化性细胞因子， 有学者认为IL8具有激活嗜中性粒细胞聚集到肿瘤局部， 对肿瘤细胞起杀伤和抑制作用; 而多数学者认为， IL8能促进肿瘤的生长和转移， 其机制主要是通过作为自分泌生长因子、 血管发生因子和促进Ⅳ型胶原酶的活性以及影响细胞的黏附移动， 从而促进肿瘤的发生、 发展和转移。IL8在多数肿瘤组织中高表达， 而在其相应的正常组织却不表达或低表达[5]。研究表明， 卵巢癌患者高表达IL8， 其腹水中表达水平明显高于血清[1]。应用免疫组化技术发现， 卵巢癌患者局部肿瘤组织中的IL8高表达与肿瘤的进展程度及不良预后有关[2]。从卵巢癌细胞系HeyA8分离出的IL8高分泌克隆 HeyA8(H)的增殖率明显高于低分泌克隆 HeyA8(L)， IL8可促进 HeyA8(L)克隆的增殖， 而IL8的中和抗体可降低 HeyA8(H)克隆的增殖; 应用IL8表达载体转染的HeyA8(L)克隆以增强IL8的表达后， 可明显促进肿瘤细胞的增殖、 微血管密度以及后来的肿瘤形成[6]。IL8还可封闭TNF相关凋亡诱导配体(TNFrelated apoptosisinducing ligand， TRAIL)诱导的细胞死亡， 并且能使TRAIL敏感的细胞系转变为TRAIL抗性细胞系， 表明IL8在保护卵巢癌细胞逃避TRAIL介导的凋亡中起重要作用[7]。此外， IL8表达可影响卵巢癌对化疗的敏感性。应用基因芯片技术分析发现， 紫杉醇耐药卵巢癌细胞的IL8 mRNA及蛋白表达均增加。Penson等报道[1]， 卵巢癌患者在紫杉醇治疗前给予甾体类抗雌激素治疗则血清中IL8水平下降， 紫杉醇治疗后24 h 则其水平上升。这一结果与早期Lee等人体外研究发现的紫杉醇可诱导人卵巢癌细胞的IL8转录和分泌的结果相一致。目前有关IL8诱导卵巢癌细胞对化疗药物产生耐药的机制尚不十分清楚。
我们以往的研究证明人卵巢癌细胞系SKOV3可组成性高表达IL8[5， 8]， 而本研究证实， 另一种人卵巢癌细胞系A2780中的IL8表达水平极低。提示这两种卵巢癌细胞可作为研究IL8在卵巢癌中作用及作用机制的一个良好模型。本研究首先从高表达IL8的SKOV3细胞中提取总RNA并以此为模板， 根据人IL8的全长编码区基因序列设计并合成ssIL8和asIL8两对引物， 通过RTPCR获得318 bp大小的目的片段即正义和反义IL8全长编码基因， 并将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中， 由此构建了重组载体pcDNA3.1(+)ssIL8和pcDNA3.1(+)asIL8， 后经菌落PCR、 双酶切及核苷酸测序， 证实所获片段和目的片段序列完全一致。最后应用脂质体法将IL8正义和反义表达载体分别导入低表达IL8的A2780细胞和高表达IL8的SKOV3细胞中， 并用RTPCR和ELISA法检测细胞转染后IL8的表达水平， 发现IL8的表达量具有明显差异， 从而达到了预期的试验目的。总之， 人IL8正义和反义真核表达载体的成功构建， 将为我们后续研究IL8在卵巢癌发展及化疗、 内分泌治疗中的作用与作用机制奠定基础， 同时也为研究其他高表达IL8的恶性肿瘤提供参考。
参考文献
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【关键词】 盆腹腔结核
本例腹腔结核(即结核性腹膜炎)以腹水为主要表现。因不符合结核性腹膜炎的典型表现未作出临床诊断。在借助腹水脱苷脱氨酶(ada)、肿瘤标志物ca125、b超及ct与腹腔恶性肿瘤鉴别时，因未能完全正确分析上述检查只能为鉴别诊断提供信息而不能作为鉴别诊断的确切依据，而作出了妇科肿瘤的临床误诊。提示了在临床工作中对腹水细胞学未找到癌细胞而结核性腹膜炎与腹腔肿瘤不能确切鉴别时应尽早腹腔镜检查或剖腹探查，并取活检以病理明确诊断，避免临床误诊。
1 病历摘要
患者，女，41岁。主因进行性腹胀伴腹围增大8个月余于2005年3月7日入院。5个月前于院外消化内科出院诊断为(1)腹水：癌性?(2)右侧卵巢囊肿。(3)左肺新生物。近5个月来仅于院外间断行抽腹水8次缓解腹胀治疗，未行其他治疗。月经史正常，家族史无特殊，否认结核接触史。入我科后经完善相关检查，尤其是血清ca125为117u/ml及腹水ca125为335u/ml均明显升高(正常参考范围0～35u/ml)。盆腔ct示：(1)卵巢异常影考虑为新生物，请除外卵巢转移性肿瘤。(2)大量腹水，疑有腹膜转移，请结合临床。肺部螺旋增强ct与院外2004年10月1
3日的肺部螺旋平扫ct比较，肺部病灶未见明显改变，性质待定[炎症?(结核)]，遂于3月11日以卵巢新生物待诊转入妇科，并于3月18日行剖腹探查术，术中见草黄色腹水约1000ml，腹膜、肠系膜、肠管浆膜、膈顶、肝、脾、胃、子宫、输卵管、卵巢表面均见大量米粒大小灰白色结节，直径最大约2cm，因取腹膜、肠系膜结节冰冻切片符合结核，增殖型为主。遂逐层关腹，术后予以抗结核治疗。3月21日病理诊断为结核。
2 讨论
2.1 对结核警惕性不够 对结核不典型病例尤其本例游离腹水型在ppd阴性，腹水葡萄糖正常，腹水ada(20.6u/l)<45u/l及无低热及食欲下降等结核中毒症状时而轻易排除结核存在的可能，从而导致对结核的漏诊。未考虑到ppd试验受许多因素影响，特别是在重症结核病等情况下，可能为阴性结果及腹水有关生化检查阴性示结核静止状态可能，而阳性检查更有助于结核活动时的诊断。
2.2 未能完全正确分析肿瘤标志物尤其ca125的意义 实际上，在目前通常使用的肿瘤标志物均不能称为理想的肿瘤标志物，它们中绝大多数既无器官特异性，也无肿瘤特异性。且除了afp和cea外，其他的肿瘤标志物还没有国际标准品，所以无法知道其真值。目前对于某一种测定方法来说，只能测知其对于被当作标准品的相对准确性，这就给肿瘤标志物测定中的质量控制和标准化带来了困难。同时，在肿瘤标志物测定中，目前还没有像酶蛋白等那样建立起一套被公认和被各实验室所共同接受的质量控制方法，虽然许多实验室也用各种不同的方法各自开展了质量控制，但无论室内质量控制还是室间质量评价，都带有很大的随意性。据统计，ca125升高在卵巢癌诊断中，对非绝经期女性其敏感性为50%，特异性为69%，对绝经期女性尤其是下腹部肿瘤的妇女，其敏感性为84%，特异性为92%。因此，在本病例中，患者月经史正常，故其敏感性及特异性均不很高，并在妇科彩色b超未见异常，阴道b超示右附件囊性占位(卵巢囊肿?)及盆腔ct示双侧卵巢新生物及大量腹水，局部腹
膜结节样增厚，疑有腹膜转移。在三者检查报告无明显一致性的情况下，以昂贵检查(盆腔平扫+增强ct)为依据，且由于未能完全正确分析ca125升高的意义的情况下做出了腹水性质为恶性及卵巢肿瘤的临床误诊。
2.3 经验教训 有慢性起病，病程长，且一般情况尚可的患者，在肺部有病变(甚至在本例患者中第1次院外肺部ct示左肺上叶前段可见类圆形高密度影，大小0.7cm×1.0cm左右，边界清，边缘可见浅分叶及小毛刺，可见胸膜凹陷征，类似于新生物的改变。但5个月后于我科复查肺部ct无明显改变，且纤维支气管镜检正常及纤刷物及肺泡灌洗液均未查见抗酸杆菌。)且合并腹水者，应短期随访x线胸片了解肺部病灶，若无明显改变，且多次腹水均未查见癌细胞者，应警惕肺结核继发盆、腹腔结核可能。若患者因经济原因不能尽早行肺穿刺手术及胸腹探查术确诊者应考虑诊断性抗结核治疗，以减少结核的漏诊及延误诊断，病情恶化。
【摘要】
目的： 构建人epo基因真核表达载体并转染人脐血间充质干细胞，获得稳定表达人epo的人脐血间充质干细胞. 方法 ： 从人胎肝细胞中提取总rna，经过rtpcr方法扩增人epo全长cdna， 应用 基因重组技术将epo cdna基因亚克隆至pcdna3真核表达载体内，以酶切和测序方法鉴定重组质粒pcdna3-epo构建的正确性，再将pcdna3-epo经脂质体介导转染人脐血间充质干细胞，经g418筛选后获得稳定转染epo基因的人脐血间充质干细胞，用rt-pcr，western blot和细胞免疫化学方法鉴定外源人epo基因在人脐血间充质干细胞中的表达. 结果： 酶切和测序结果均证实pcdna3-epo构建正确，rt-pcr，western blot和细胞免疫化学结果显示转染人epo基因的人脐血间充质干细胞体外能表达epo. 结论： 构建成功人epo基因真核表达载体，转染人脐血间充质干细胞后在体外可获得稳定表达.
【关键词】 细胞生成素 胎血 间质干细胞 转染
【abstract】 aim: to construct the eukaryotic expression vector of human epo gene and explore its expression in mesenchymal stem cells (mscs) derived from human umbilical cord blood (ucb). methods: the total rna was extracted from human fetal liver cells. epo cdna was obtained by rt-pcr amplication and subcloned into pcdna3 vector to construct recombinant pcdna3-epo plasmid. after identified by restriction enzyme analysis and sequencing,the pcdna3-epo was introduced into the human ucb-derived mscs mediated by lipofectamine and the expression of exogenous epo was examined by rt-pcr,western blot and immunocytochemistry. results: the recombinant pcdna3-epo was shown to meet the design by restriction enzyme analysis and sequencing. the results of rt-pcr,western blot and immunocytochemical analyses indicated that the exogenous epo successfully expressed in human ucb-derived mscs. conclusion: the recombinant pcdna3-epo with full coding sequence of human epo cdna is successfully constructed and human ucb-derived mscs with stable expression of exogenous epo are established.
【keywords】 erythropoietin；fetal blood；mesenchymal stem cells; transfection
0 引言
近年 研究 发现促红细胞生成素（erythropoietin，epo）具有神经营养、神经保护和促进神经发育的作用，在脑组织损伤尤其是新生儿缺氧缺血性脑损伤中发挥着重要作用［1］. 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，mscs）是近年发现的一种具有多向分化潜能的成体干细胞［2］，而且是外源基因良好的细胞载体［3-4］. 我们构建人epo基因真核表达载体，将其转染人脐血mscs，观察epo在人脐血mscs中的表达情况，以探索epo基因修饰的人脐血mscs用于移植 治疗 新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，hie）的可行性.
1 材料和方法
1.1 材料 人胎肝细胞系l02，质粒pcdna3由福州总 医院 实验科王水良博士惠赠. 菌种e. coli dh5α为福州总医院实验科保存. rt-pcr反转录试剂盒（promega公司）；dna胶回收试剂盒（上海华尧核酸技术有限公司）；质粒抽提纯化试剂盒（qiagen公司）；ecorⅰ，xhoⅰ限制性内切酶，dntp，taq酶，t4 dna连接酶，dna分子质量marker dl2000，dl15000（takara公司）；lipofectaminetm 2000，trizol（invitrogen公司）；mscs培养基mesenculttm（stem cell公司）；兔抗人epo抗体、hrp-羊抗兔igg，western blot化学发光试剂（santa cruz公司）；pvdf膜（pierce公司）；elivisiontm plus试剂盒（北京中杉生物技术公司）.
1.2 方法
1.2.1 epo cdna的合成 参照trizol说明书抽提人胎肝l02细胞总rna，反转录为人胎肝细胞总cdna，以反转录产物为模板，pcr法扩增epo cdna. pcr引物根据genbank中登录的epo cdna 全长序列设计两对引物. 扩增epo cdna全长序列上游引物： 5′-atgaattcatgggggtgcacgaatgtcc-3′，下划线部分为ecorⅰ酶切位点，下游引物：5′-gcctcgagtcatctgtcccctgtcctgc-3′，下划线部分为xhoⅰ酶切位点；预期扩增片段长582 bp. rt-pcr法鉴定epo在人脐血mscs中表达的上游引物为：5′-tcatctgtgacagccgagtc-3′，下游引物为：5′-cactgacggctttatccaca-3′，预期扩增片段长288 bp. 均由上海生工生物工程公司合成. pcr反应体系如下：总体积为50 μl，10×pcr缓冲液5 μl，dntp混合液4 μl，待扩增的模板（人胎肝细胞总cdna）6 μl，上游引物（20 μmol/l）0.5 μl，下游引物（20 μmol/l）0.5 μl，dna聚合酶1 μl，dd h2o 33 μl. 94℃预变性5 min，94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃ 45 s，共35个循环. 72℃延伸5 min. 取反应产物3 μl，15 g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定.
1.2.2 pcdna3-epo表达载体的构建 将pcr法扩增的epo cdna和质粒pcdna3经ecorⅰ和xhoⅰ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段. t4 dna连接酶于16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌dh5α，在氨苄青霉素选择性培养基上筛选阳性克隆. 快速抽提质粒后进行酶切鉴定，将酶切鉴定正确的菌株送上海生工生物工程公司测序. pcdna3-epo重组质粒的纯化按质粒抽提纯化试剂盒说明进行.
1.2.3 人脐血mscs的分离培养 脐血标本来自于健康足月顺产新生儿，产妇产前检查均正常，脐血的收集均已征得产妇同意. 无菌条件下采集脐带血，每份30～80 ml，脐血采集后4 h内应用密度梯度离心法分离脐血单个核细胞. 所得单个核细胞以1×109/l接种于mesenculttm完全培养基，置于37℃，50 ml/l co2和饱和湿度的co2培养箱中培养.5～7 d后首次换液，7～14 d后贴壁的人脐血mscs细胞克隆出现，当细胞融合达80%左右时按1∶3的比例传代.
1.2.4 pcdna3-epo重组质粒稳定转染人脐血mscs 选择p3代人脐血mscs，采用脂质体介导转染方法转染epo基因，按照lipofectaminetm 2000试剂说明书进行. 转染24 h后按1∶10接种到6孔板中，加入新鲜的完全培养基. 次日换液，加入含400 mg/l的g418的筛选培养基培养6 d，再换用含200 mg/l g418培养基培养，2 wk后阳性克隆形成，挑取单个克隆扩大培养和传代.
1.2.5 rt-pcr鉴定 抽提稳定转染pcdna3-epo的人脐血mscs总rna，经无rna酶的dna酶处理并抽提纯化后反转录为总cdna，以总cdna为模板，采用epo鉴定引物，pcr扩增epo cdna基因片段. pcr反应体系同上方法.
1.2.6 western blot 鉴定 取生长良好的稳定转染pcdna3-epo的人脐血mscs 1×107，加入ripa缓冲液（含10 g/l pmsf），冰浴后4 ℃离心取上清，用同样方法从培养的胎肝细胞系l02中抽提蛋白质. 测定蛋白浓度后进行100 g/l sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳. 电泳完毕后将蛋白转移至pvdf膜上，封闭液封闭，加入兔抗人epo多克隆抗体（1∶200）结合，洗膜后加入hrp-羊抗兔igg（1∶5000）结合，再次洗膜后加入western blot化学发光试剂，放置1 min后于暗室内用x光片进行化学发光自显影，洗片后采用图像 分析 仪扫描.
1.2.7 细胞免疫化学鉴定 将稳定转染pcdna3-epo的人脐血mscs按5×105/l接种于放置有消毒盖玻片的六孔板内，制备细胞爬片. 24 h后弃掉培养基，细胞爬片用pbs洗2次，加入40 g/l多聚甲醛固定20 min，pbs洗2次. 采用兔抗人epo多克隆抗体（1∶100），参照elivisiontm plus试剂盒说明进行细胞免疫化学染色. 实验对照组用未转染pcdna3-epo重组质粒的人脐血mscs爬片直接进行细胞免疫化学染色.
2 结果
2.1 pcdna3-epo真核表达载体的构建 用pcr法扩增epo cdna，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳，出现一条特异性区带，位于分子质量标准500 bp附近，与预期大小相符（图1）. 将pcr产物克隆至真核表达载体pcdna3中，重组质粒pcdna3-epo经酶切鉴定后，结果证实所插入基因的位置、大小和方向均正确（图2）；测序结果也表明所构建的质粒符合预期设计.
2.2 外源epo基因在人脐血mscs中的表达 在288 bp处扩增得到特异性目的片段（图3），表明在转染的人脐血mscs中有特异性的epo基因的表达. western blot 鉴定结果显示，在转染了pcdna3-epo质粒的人脐血mscs中可检测到epo蛋白的表达（图4），其蛋白条带位置（34 ku）与阳性对照即人胎肝细胞l02一致，而未经转染的人脐血mscs无epo蛋白的表达.
1: epo cdna ; 2: dna marker (dl2000).
图1 epo cdna 的pcr扩增产物（略）
1：pcdna3-epo的ecorⅰ/xhoⅰ酶切； 2：pcdna3-epo的ecorⅰ酶切； 3：pcdna3的ecorⅰ/xhoⅰ酶切； 4：pcdna3的ecorⅰ酶切； 5：dna marker（dl2000）； 6：dna marker（dl15000）.
图2 重组质粒pcdna3-epo的ecorⅰ/xhoⅰ酶切鉴定（略）
1：epo cdna片段的pcr产物； 2：dna marker（dl2000）.
图3 外源epo基因在人脐血mscs表达的rt-pcr鉴定（略）
1：人胎肝细胞； 2：转染epo基因的人脐血mscs.
图4 外源epo基因在人脐血mscs表达的western blot鉴定（略）
2.3 细胞免疫化学鉴定 转染pcdna3-epo的人脐血mscs胞质呈棕褐色，为epo阳性表达；未转染pcdna3-epo的人脐血mscs不表达epo，胞质为蓝色（图5）.
a： 转染； b： 未转染.
图5 外源epo基因在人脐血mscs中表达的细胞免疫化学鉴定 dab ×200（略）
3 讨论
hie是新生儿时期的常见病， 目前 对重度新生儿hie尚缺乏特异有效的 治疗 方法 ［5］. 近年报道从新生儿脐血中亦分离到mscs，发现mscs不仅可分化成多种中胚层来源的细胞，在一定的条件下亦能分化为神经细胞［2］，移植至脑内后能明显改善受损神经系统的功能［6］. mscs不仅能向神经细胞分化，而且易于外源基因转染和表达，将外源的神经营养因子基因体外转染mscs，再移植入脑内，神经营养因子在脑内稳定表达，可以增强mscs移植治疗的效果［3-4］.
epo是一种新的、作用很强的神经营养因子，不仅可促进神经前体细胞的增殖和分化，减少神经细胞的凋亡；而且能促进血管内皮细胞的成熟和存活，使血管再生，减轻局部缺氧造成的损害［1］. 脑内的epo和epo受体的表达受低氧诱导因子的调控，在缺氧缺血条件下，epo尤其是epo受体表达明显增加［7］，因此外源的epo具有很好的治疗缺氧缺血性脑损伤的作用. 然而epo仅有极少量透过血脑屏障，并且半衰期短，只有大剂量、多次静脉注射才能取到一定的治疗效果［8］，但大剂量静脉注射易出现红细胞增多，多次注射有导致纯红再障的风险［9］，而脑内注射尤其是多次脑内注射在临床上是行不通的. 将epo基因通过移植细胞导入脑内，使其在脑内持续表达，就可以发挥epo的神经营养和神经保护作用，此即为epo的基因治疗. 而且脑内的epo不进入血循环，不会出现红细胞增多和纯红再障等不良反应.
我们选择人epo基因和人脐血mscs作为靶基因和靶细胞，将人epo基因转染人脐血mscs，获得稳定转染人epo基因的人脐血mscs，以期作为一种基因修饰干细胞用于移植治疗重度新生儿hie，起到epo基因治疗和mscs细胞治疗相结合的双重作用. 本实验成功构建出了epo基因真核表达载体，转染人脐血mscs后经稳定筛选获得了能稳定表达epo的人脐血mscs，为epo基因修饰的人脐血mscs用于移植治疗重度新生儿hie奠定了实验基础. 同时因为epo是一种具有促红细胞生成作用的造血因子，人脐血mscs尚具有支持造血的功能［10］，因此epo基因修饰的人脐血mscs还可用于临床上各种贫血的治疗，对于探索治疗贫血的新方法也具有重要的实用价值.
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