时间：2023-05-24 14:35:05
开篇：写作不仅是一种记录，更是一种创造，它让我们能够捕捉那些稍纵即逝的灵感，将它们永久地定格在纸上。下面是小编精心整理的12篇干细胞培养技术，希望这些内容能成为您创作过程中的良师益友，陪伴您不断探索和进步。
2010年诺贝尔生物医学奖授予英国生理学家罗伯特•爱德华兹，以表彰他在“体外受精”技术领域做出的开创性贡献。
1978年，罗伯特•爱德华教授和同事一起成功地使第一例试管婴儿诞生，从此开创了生殖医学领域的新纪元。试管婴儿在20多年前也曾被世界舆论界视为洪水猛兽而大加抨击，但时至今日，这项技术已经被全世界绝大多数国家承认，堪称医学史上的一大奇迹。迄今为止，全球已有上百万试管婴儿诞生。
被誉为“试管婴儿之父”的英国剑桥大学教授罗伯特•爱德华说：“克隆单纯从技术上讲非常简单，就是把卵细胞中DNA去掉，然后将体细胞中的DNA移入其中。这在世界上任何一个试管婴儿实验室中都可以完成，困难在于如何降低克隆的危险。”
本文以此热点问题作为命题材料，对2011年高考生物试题进行单项预测。预测材料及其涉及的知识、试题如下：
1．试管婴儿
【知识链接】要做好有关“试管婴儿”的试题，除了书本上的知识外，还要掌握“试管婴儿”技术的有关知识。“试管婴儿”技术是通过将不孕夫妇的和卵细胞取出在试管中完全受精，并在试管中培养使其发育到囊胚期，再将胚胎移入女性子宫内使其发育成胎儿。
体外受精步骤包括：的采集与培养、卵母细胞的获取与培养、体外受精等操作技术。具体过程如下图:
哺乳动物胚胎发育的过程大体概括如下图：
例1 下列关于关试管婴儿的说法，不正确的是（）
A. 从良种母牛体内采集的卵母细胞都需要进行体外培养
B. 从良种公牛采集的需进行获能处理
C. 早期胚胎移植的意义在于提高优良母畜的繁殖率
D. 早期胚胎指的是由受精卵发育至原肠胚时期的胚
解析：本题考查了试管婴儿的相关知识。根据体外受精和胚胎发育过程图解可知，早期胚胎指的是由受精卵发育至囊胚时的胚。
答案：D
例2 据2008年1月17日《干细胞》杂志报道，某科学家使用了进行试管受精的年轻女性捐献的卵子，以及2名志愿者的皮肤成纤维细胞，成功克隆出了5个人体胚胎，进而可以开发出有研究价值的干细胞。请回答：
（1）上述过程中主要应用到的两项动物细胞工程技术为；若将某经过修饰的基因导入其中的部分胚胎干细胞，常用的方法是。
（2）在使用合成培养基进行胚胎干细胞培养时，通常需要加入等天然成分；在细胞培养时，要保证被培养的细胞处于一定的气体环境，所需要的气体主要有 。
（3）科学家欲进行胚胎分割移植，则应该选择发育良好、形态正常的或囊胚，将其移入盛有操作液的培养皿中，然后用分割针进行分割。
答案：（1）动物细胞培养、细胞核移植显微注射技术（法）
（2）血清（血清、血浆） 氧气和二氧化碳 （3）桑葚胚
2．克隆人研究
【知识链接】克隆人的基本原理是动物细胞核的全能性，包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植。其基本过程为：
细胞核移植技术中注入去核卵母细胞中的不是供体细胞核，而是整个细胞，伴随着两细胞融合，体现细胞膜的结构特点：具有一定的流动性。该技术形成重组细胞继而发育成一个新个体，体现了细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。
例3 下图为克隆人的示意图，据图回答：
（1）图中所涉及的现代生物技术有、和
等。
（2）下列有关胚胎移植的叙述正确的有（）
A.冲卵指的是从子宫中冲出胚胎，而非冲出卵子
B.只有供、受体生理环境高度一致，移入受体的胚胎才能被接受，并继续发育
C.供体和受体要进行免疫检查，防止发生免疫排斥反应
D.不同动物其胚胎移植的时间不同，人的胚胎移植最好在四个细胞阶段进行
（3）图中两个婴儿长大后，外貌、性格和其他特征与原型男人相同，这说明 具有全能性。
（4）使用培养基进行胚胎干细胞培养时，通常要加入等天然成分，除了保证被培养细胞处于无菌、无毒及充足氧气的环境中，还需要保证细胞生活所需的；早期胚胎发育在阶段以前的细胞是全能细胞。
（5）图中从“内细胞团到胚胎干细胞”的培养过程中，必须用处理内细胞团，使之分散成单个细胞。干细胞形成组织、器官必须要进行 和 。
（6）在体外培养胚胎干细胞能否获得动物器官?
。为什么？
解析：（1）该图利用了细胞核移植、动物细胞培养、胚胎分割移植等技术。（2）冲卵一般是指是胚胎收集中的冲卵――胚胎、早期胚胎。供体和受体只有保证具有相同的生理状态，才能保证胚胎的正常发育。（3）克隆过程说明动物细胞核具有全能性。（4）动物细胞培养液的成分包括葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。动物细胞培养的条件：无菌、无毒的环境；营养物质（合成培养基）；温度和pH（36.5±0.5℃，7.2～7.4）；气体环境（氧气和二氧化碳）等。（5）动物细胞培养过程常用胰蛋白酶处理组织，以使之分散成单个细胞。（6）胚胎干细胞在体外培养条件下一般只能增殖进行细胞分裂，不能发生细胞分化。
答案：（1）核移植 胚胎移植 细胞培养（另外写细胞融合、胚胎分割也对，写了三个则给满分）（2）ABD（3）动物体细胞核 （4）血清 温度和pH 桑葚胚（5）胰蛋白酶 细胞的分裂 分化 （6）不能 胚胎干细胞在体外培养条件下可以增殖而不发生分化
3．生物技术中的伦理问题
【知识链接】生物技术引发的伦理问题包括克隆技术引发的伦理问题、试管婴儿引发的伦理问题、基因检测引发的伦理问题。中国政府对于克隆技术的态度是禁止生殖性克隆人，不反对治疗性克隆人；对于试管婴儿的态度，中国卫生部的规定是实施体外受精、胚胎移植及衍生技术必须获得卫生部的批准证书。
例4下图所示为人类“治疗性克隆”的大致过程。请回答下列问题：
（1）图中①为 细胞，过程A是目前实现体细胞克隆的关键技术，该技术称为 。
（2）图中③能诱导分化出神经细胞、血细胞、肌肉细胞，其根本原因是 的结果。这样培育得到的组织器官进行自体移植的最大好处是 。
（3）若应用转基因技术治疗遗传性糖尿病，可将健康人的控制胰岛素合成的基因导入结构④中的
，原因是这些细胞 。
（4）在用PCR技术扩增胰岛素基因时，缓冲溶液中必须加入的物质有：、分别与两条模板链结合的两种引物、 以及四种脱氧核苷酸。DNA的合成方向总是从子链的延伸。
（5）我国政府禁止生殖性克隆，但不反对治疗性克隆研究。为什么要反对生殖性克隆（即克隆人）呢？请你写出一条理由： 。
解析：从图可以看才出，治疗性克隆是将患者的体细胞的核与卵细胞的细胞质进行重组， 形成重组细胞，将重组细胞经过培养得到囊胚，取囊胚内细胞团培养得到不同组织器官，可用于进行自体移植，不会产生免疫排斥反应。
答案：（1）次级卵母（卵） 核移植
（2）基因选择性表达不会产生排异（免疫排斥）反应
（3）内细胞团分化程度极低（或具有全能性），可使外源基因在相应组织细胞表达
【摘要】 目的 探索大鼠骨髓源性肝干细胞同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居情况。方法 采用全骨髓培养法体外培养细胞，贴壁筛选纯化骨髓间充质干细胞并进行体外培养、扩增，应用肝细胞生长因子(HGF)诱导分化出肝干细胞，鉴定后，经肝脏中叶注射入同种异体正常组和暴发性肝衰竭组大鼠体内，于移植后的第1、2、4周取受体肝脏移植原位（注射部位)、邻位（距注射部位0.5 cm)组织，应用PCR技术检测性别决定因子基因片段，研究肝干细胞在大鼠肝脏内定居情况。结果 经肝脏注射移植的肝干细胞在正常组和肝损伤组的肝脏内均能定居，且定居的细胞数量上肝损伤组明显多于正常组。结论 经肝脏注射移植的骨髓源性肝干细胞可以定居于肝脏内，且定于肝脏的干细胞数量与肝脏是否损伤密切相关。
【关键词】 骨髓间充质干细胞；肝干细胞；细胞移植
骨髓间充质干细胞(MSCs) 具有多向分化潜能，可以在体外诱导分化出肝干细胞，此种骨髓源性肝干细胞可以为肝组织移植工程提供新的细胞来源。近年来的研究主要集中于体外诱导MSCs为肝干细胞，此种细胞具备了肝细胞的形态，在体外能够表现出一定的肝细胞功能〔1〕，但对骨髓源性肝干细胞在体内的定居和定位能力情况尚不明确。本实验通过对大鼠MSCs进行体外培养，诱导、分化出肝干细胞，同时建立暴发性大鼠肝衰竭模型，探讨骨髓源性肝干细胞同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居情况。
1 材料与方法
1.1 材料
低糖DMEM培养基(Invitrogen)、Percoll(Pharmacia，比重1.077 g/L)(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶2(Sigma)、肝细胞生长因子（HGF)(CYTOALAB公司)、细胞培养箱(Forma公司)；纯系SD大鼠、3周龄、体重100～120 g(供体大鼠)和成年纯系SD雌性大鼠、体重180～220 g(受体大鼠)，由吉林大学实验动物中心提供。
1.2 骨髓源性肝干细胞培养
1.2.1 MSCs分离、培养及定向肝干细胞的诱导分化
从供体SD大鼠股骨提取骨髓细胞。用比重1.073的Percoll分离液行MSCs分离，加含抗生素及10%小牛血清的IMDM培养和扩增，取第3代MSCs加入HGF(20 μg/L)诱导定向肝干细胞分化。
1.2.2 诱导后的骨髓源性肝干细胞鉴定
用ELASA法检测细胞培养液中的甲胎蛋白（AFP)、白蛋白（ALB)。用免疫组化法检测细胞中细胞角化蛋白（CK)18、CK19和波形蛋白（Vimentin)的表达。
1.3 肝损伤动物模型的制作和分组
受体雌性SD大鼠20只，随机分为正常大鼠组和肝损伤组。肝损伤组用质量浓度10%D氨基半乳糖溶液一次腹腔内注射，剂量1 200 mg/kg体重。
1.4 同种异体大鼠骨髓源性肝干细胞移植
正常组大鼠和肝损伤组大鼠，分别以戊巴比妥麻醉，仰卧位固定，常规消毒、备皮、铺无菌巾，上腹正中切口，长约1 cm，于肝中叶以BD胰岛素注射器注射肝干细胞悬液0.4 ml（107/ml )，观察无出血后缝合伤口。
1.5 受体体内移植骨髓源性肝干细胞鉴定
应用PCR技术检测性别决定因子基因片段(sex determining region of the Y，Sry)。干细胞移植后1，2，4 w后取受体肝脏移植原位(注射部位)、邻位(距注射部位0.5 cm)组织，应用PCR技术检测〔2〕性别决定因子基因片段(Sry)。引物按文献〔3〕设计，由上海Casarry生物有限公司合成序列，外引物对SRY1/ SRY2扩增片段大小为317 bp，内引物对SRY3/SRY4扩增片段大小为121 bp。
2 结 果
2.1 骨髓源性肝干细胞的培养结果 大鼠MSCs经原代培养，细胞传代，诱导分化，细胞异形性较诱导前增加，表现为圆形、椭圆形细胞数量较诱导前明显增加，而梭形细胞数量减少，诱导培养10 d左右，细胞形态表现为圆形、椭圆形细胞为主，梭形细胞已极少见。免疫组化染色，二氨基联苯胺（DAB)显色，在倒置显微镜下，可见细胞形状显圆形或卵圆形，胞浆内出现棕黄色颗粒。CK18、CK19、Vimentin呈阳性表达。细胞培养液中AFP、ALB含量诱导前分别为(0.021±0.008) ng/ml和(0.72±0.14) g/L；诱导后分别为(0.403±0.042) ng/ml，(6.1±0.32) g/L。诱导后的AFP、ALB含量明显高于诱导前（P＜0.05)。表明经诱导的MSCs分化为肝干细胞。见图1。
2.2 肝损伤模型病理结果
D氨基半乳糖注射后，大鼠肝脏肝索紊乱，肝细胞肿胀变性、灶性及大片坏死，伴出血及炎性细胞浸润。见图2。
2.3 性别决定因子基因片段检测结果
肝损伤组：检测1 w时阴性，2 w时原位肝组织Sry阳性表达，邻位未表达，而4 w时原位及邻位组织检测到Sry表达，原位表达较2 w时增强，邻位较弱。正常肝脏组：1及2 w均未检测到表达，4 w时检测到原位微弱表达。见图3。
3 讨 论
MSCs具有多向分化潜能，特别是具有向肝脏干细胞、肝细胞及血管内皮细胞分化的潜能〔4〕，因而有望成为肝组织移植工程新的种子细胞来源。由于MSCs是成体干细胞，取材方便，可以来自患者自身，无排斥反应，故具有重要的临床应用价值。本实验根据文献报道〔5〕，使用HGF，使MSCs分化为肝干细胞，对骨髓源性肝干细胞同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居情况进行初步研究。
目前研究表明移植肝干细胞可存活于受体许多部位包括肝、脾、腹腔、胰腺、肺、肠系膜、肾及肾脂肪囊、腹膜后等部位〔2，6～8〕。肝脏由于其独特的营养环境、生理及解剖结构环境无疑是最理想的场所，可经门静脉输入或肝实质植入，该组实验采用肝脏植入方法，取得较好效果，说明此方法是安全可行的。本实验采用同种异体移植，应该考虑免疫排斥反应，但文献报道，纯化的MSCs具有独特的免疫原性，进行同种异体移植不需要预先应用免疫抑制剂，无免疫排斥反应，是良好的基因治疗靶细胞。
目前鉴定受体体内被移植后的肝干细胞有许多方法，其中较为常用的是以雄性动物为肝干细胞供体〔1〕，雌性动物接受细胞移植后，分化增殖的细胞 Y 染色体阳性，证明雌性受体内存活的细胞来自雄性供体细胞，这就可以清楚地将植入的细胞与原有的细胞区分开来，进一步研究移植作用，本实验采用雄性供体细胞为雌性受体移植，检测移植部位细胞的Y染色体表达情况，进而检测移植细胞是否定植。
实验结果显示，移植后2 w肝衰竭大鼠移植原位检测到表达，4 w表达明显增强，而且临近部位出现表达；正常大鼠在移植后4 w移植原位出现微弱表达。实验证实，骨髓源性肝干细胞在正常大鼠肝脏及肝损伤大鼠肝脏内均能定居，但在肝损伤大鼠肝脏内定居能力明显增强。考虑可能为大鼠肝损伤后，刺激机体分泌出各种促进肝细胞再生的生长因子，为移植细胞提供定居所需的微环境。文献报道，在正常大鼠体内，HGF等因子的活性是被抑制的，只有在肝损伤时，启动肝再生程序，这些因子才能被激活，引起肝细胞有丝分裂。
本文通过实验证实了大鼠骨髓源性肝干细胞移植后可以定居于受体肝脏内，而且在肝损伤后有利于干细胞移植的定居，这为下一步研究定居于肝内的骨髓源性肝干细胞的功能奠定了基础。
参考文献
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3 Tashiro H，Fukuda Y，Kimura A，et al.Assessment of microchimerism in rat liver transplantation by polymerase chain reaction〔J〕.Hepatology，1996；23（4):82834.
4 Schwartz RE，Reyes M，Koodie L，et al.Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocytelike cells〔J〕.J Clin Invest，2002；109（10):1291302.
5 张刚庆，方驰华，池达智.肝细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究〔J〕.中华外科杂志，2005；43（11)：71620.
6 Fox IJ，Chowdhury JR.Hepatocyte transplantation〔J〕.Am J Transplant，2004；6:713.
[关键词]表皮干细胞；酶消化法；组织工程皮肤；分离；培养
[中图分类号]R318 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2011）01-0079-04
Improved culture method of Human epidermal stem cell and tissue engineering skin construction
ZHANG Yan-gang, HU Da-hai, ZHANG Zhan-feng,CAI Wei-xia, ZHU Hua-yu, SHE Tao
(Department of Burn and Skin Surgery, Burns Center of PLA, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi'an 701132,Shaanxi,China)
Abstract:ObjectiveTo improve the traditional methods of dissociation and culture of the human epidermal stem cells (hESCs) and provide more productive and more active seed cells for tissue engineering skin construction.MethodsCell morphology was observed by inverted microscope, MTT law growth curve. Immunocytochemistry was used to observe the expression of β1 integrin and keratin 19 (CK19) on epidermal stem cells. Compare the morphological features of tissue engineered skin constructed with the seed cells which were obtained by two methods.Results Trypan blue staining displays the number of hESCs dissociated by modified method is(92.25±15.61)significantly elevated compared with traditional method (68.50±26.91)(P＜0.01),and the proportion of living cells 94%±0.01% increased significantly compared with traditional method(75%±0.04%)(P＜0.05).The result of immunocytochemistry showed that the expression of β1 integrin and keratin 19(CK19) was positive, which were markers of hESCs. HE staining showed that, by using the improved method, the number of multiple epidermal layers was 5～6 on tissue engineering, and cells of epidermal in the basal partwere arranged. In contrast, the number of multiple epidermal layers was 3～4, and the cells of epidermal in basal part arranged in scattered by using the traditional method. ConclusionHuman epidermal stem cells in a larger amount and better vitality can be obtained by using a modified enzyme digestion method, which form basis of construction of skin tissue engineering.
Key words:human epidermal stem cells; enzyme digestion; tissue engineering skin; dissociating; culturing
近年来仿照皮肤的生理结构，人们构建各种组织工程皮肤，有望解决皮源短缺及预后瘢痕的问题，其种子细胞主要是表皮干细胞、成纤维细胞等。因此，表皮干细胞的分离、培养就成了必须面对的问题，在以往的报道中[1-4]，有关hESCs的培养常采用中性蛋白酶（Dispase）消化过夜分离表皮层、再以0.25%胰蛋白酶37℃消化10～15 min分离表皮干细胞，但实际应用中发现该方法存在细胞活力差，产率低等缺点。本研究中我们采用改良后的方法分离培养hESCs并和常规的培养方法加以比较，旨在建立一种更为高效的分离培养表皮干细胞的方法。
1材料和方法
1.1 实验材料和主要仪器：取小儿包皮组织（2～6岁），(来自西京医院泌尿外科包皮环切术，均取得患者家属知情同意)。DispaseⅡ酶（Gibco）；Trypsin（Gibco）；DMEM (Hyclone)；胎牛血清（FBS，杭州四季青）；角质形成细胞无血清培养基(K-SFM，Gibco)；表皮生长因子（epidemal growth factor, EGF）和牛垂体提取物（bovine pituitary extract, BPE）(Gibco)；人胎盘Ⅳ型胶原(Sigma)，MTT (Gibco)；DMSO (西安化学试剂厂)；多聚甲醛(西安化学试剂厂)；小鼠抗人β1整合素（鼠单抗IgG）、CK19（鼠单抗IgG） (北京中杉金桥生物技术公司）；鼠尾胶原（自制）；台盼蓝；倒置荧光显微镜（Olympus）；M680型酶标仪（伯乐公司）。
1.2人表皮干细胞分离、培养：修剪皮下结缔组织，0.9% NaCl浸泡、清洗3遍，每次5～10min，0.05%醋酸氯已定+0.9% NaCl（1:2，体积比）浸泡5～8min，再次0.9% NaCl浸泡清洗3遍，每次10min，然后将上述组织块置于4℃ Dispase酶(0.25%)浸泡14～16h。以下为两种方法分离人表皮干细胞。
传统方法：取出皮片，0.9% NaCl反复清洗，分离表皮和真皮层，剪碎表皮为1.0mm×1.0mm，加0.25% Trypsin + 0.02% EDTA，37 ℃水浴10min加入含有10% FBS的DEME终止消化。反复吹吸至细胞悬浮，200目筛网过滤，1 000rpm离心5～10min，弃上清，收集细胞，用人表皮干细胞培养基重新悬浮细胞（10ml），吹打成单细胞悬液，台盼蓝染色。并接种于预先铺有Ⅳ型胶原的25cm2培养瓶内，置于37℃，5% CO2孵育箱中孵育10～15 min后，吸出培养液及未贴壁细胞，PBS洗2次，加入适量新鲜培养基（K-SFM，5ng/ml hEGF，30 μg/ml BPE）继续培养。
改良方法：取出皮片，0.9%氯化钠反复清洗，分离表皮和真皮层，将表皮置于小抗生素瓶后加0.125% Trypsin+ 0.01% EDTA3ml，弯头吸管快速搅拌2min，吸出并加入离心管（已经加有10% FBS的DMEM 1.5ml）中和，再次重复消化一次，吸出后加入另一离心管（已经加有10% FBS的DMEM 1.5ml）中和，将前后两次消化液体合并，离心（1 000rpm，5min），PBS10ml悬浮细胞，台盼蓝染色鉴定后，再次离心（1000rpm，5min），表皮干细胞培养基（K-SFM）悬浮细胞，接种于预先铺有Ⅳ型胶原的培养瓶内，置于37℃，5% CO2孵育箱中孵育4～5min后，吸出培养液及未贴壁细胞，PBS洗2次,加入适量新鲜表皮细胞培养基培养（K-SFM，5ng/ml hEGF, 30μg/ml BPE）。
1.3表皮干细胞增殖：将两种方法分离出的hESCs分别作MTT比色试验。两组细胞均以1×105个/孔的密度接种预先铺有Ⅳ型胶原的24孔板内，每24h取3孔做MTT比色实验。根据每天记录的细胞数绘制细胞生长曲线图。
1.4 表皮干细胞鉴定：取二代表皮干细胞培养36 h，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗；0.1%Triton X-100孵育10min；PBS清洗3次，每次5min；3%H2O2去离子水孵育5～10min，以消除内源性过氧化物酶活性；2%山羊血清封闭20 min,加入CK19（1:50稀释）、整合素-β1（1:50稀释）一抗4 ℃过夜；PBS洗5次，滴加生物素化二抗工作液200μl，37℃孵育10min，PBS洗5次；滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液200μl, 37℃孵育10min，PBS洗5次；显色剂显色。
1.5构建组织工程皮肤：以两种不同方法分离、培养的hESCs为种子细胞，鼠尾胶原复合成纤维细胞作为支架材料构建组织工程皮肤。4ml 5×DMEM和14ml胶原于冰上混匀，用1mol/L NaOH调至中性后，加入2mlFBS（含2×106成纤维细胞）混匀，以3ml/孔加入Transwell小室内，放入37℃，5% CO2孵箱培育，待其凝固后加入10% FBS的DMEM，继续培养，24h后将2代hESCs以3×106/孔种植于鼠尾胶原表面，气-液面培养1周。
1.6 统计学分析：采用SPSS11.0软件进行统计处理，实验数据以x±s表示，两组间均数比较行两样本t的方差分析， P＜0.05为差异有显著性意义。
2结果
2.1 改良消化法和传统消化法细胞消化效率的比较：将同一块包皮组织等份分开，用两种方法同时分离表皮细胞，台盼蓝染色、细胞计数（总体积均为10ml），实验独立重复5次。
2.2改良法和传统法分离细胞形态学比较：采用Ⅳ型胶原粘附法分选表皮干细胞，改良法较传统法粘附细胞密度大，4h后大部分细胞贴壁良好，镜下可见细胞胞体小，核质比大，呈三角形或多边形。接种后第二天培养基中存在一定数量的漂浮细胞，但改良法漂浮细胞数明显少（图2）。3天后，有部分细胞形成较小克隆，胞体紧密相靠，胞膜互相衔接，呈典型“铺路石样”生长。
2.3改良法和传统法细胞增殖比较：两组细胞在第2天细胞数量有所下降，均在第4天时进入对数生长期，改良法细胞在对数期呈明显上升趋势，于第7天到达平台期，镜下观察细胞融合；传统法细胞对数期上升缓慢，第8天时细胞仍未融合。由此表明出改良法细胞活性较好生长较快（图3）。
2.4改良法和传统法分离细胞的鉴定天对采用两种方法培养的hESCs行K19、β1整合素免疫染色，结果显示，95%以上细胞K19、β1整合素均呈阳性表达(图4)，且两种方获得的表皮干细胞生物学特性无显著差异。
2.5 改良法和传统法分离的细胞构建组织工程皮肤组织学比较：两种方法分离培养的hESCs分别构建出的组织工程皮肤均呈3层：由下到上为真皮层、表皮层、角质层。改良法细胞构建的组织工程皮肤表皮层厚，约5～6层，表皮和真皮交接处可见细胞排列整齐，形似基底细胞。传统法细胞构建的组织工程皮肤表皮层较薄，约3～4层，表皮真皮交接处未见类似基底细胞（图5）。
3 讨论
hESCs是皮肤组织的特异性干细胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能。是皮肤发生、修复、重塑的关键性源泉[5]，以其作为种子细胞构建组织工程皮肤，可获得与生理皮肤相类似的组织结构。临床上大面积较深度烧伤往往导致表皮、真皮的损伤缺失，近年来，利用含有hESCs的组织工程皮肤覆盖创面取得一定的效果，而在其构建的过程中表皮干细胞的分离培养是必须面对的问题。
传统的方法中表皮层与真皮层分离后，用剪刀剪碎成1.0mm×1.0mm大小后进行胰蛋白酶消化，减碎的过程中暴露在组织边缘的细胞增多，而剪刀的挤压可对组织造成挤压损伤[6]，导致部分细胞壁损害进而细胞活力下降或死亡，在改良的方法中，直接进行胰酶消化避免了这一损伤情况的发生。在胰酶消化这一步，传统方法采用0.25%胰蛋白酶＋0.02% EDTA，37℃水浴，10min，而改良方法以0.125%＋0.01% EDTA胰蛋白酶也可以消化下来表皮干细胞，并且胰蛋白酶的含量低，减少了胰蛋白酶对细胞的损伤。当胰酶将细胞分泌的粘蛋白膜水解后，如还没有终止它的活性，此时胰酶就有可能进攻细胞内的某些蛋白质，造成它们的解离，进而诱发细胞凋亡[7]。胰酶浓度的降低也少了中和血清的用量，从而降低了血清对hESCs分化的影响[8]。对比传统方法，将37℃消化改为常温下消化，进一步降低胰酶的活性。为了进一步减少胰酶对细胞的损伤，再将传统方法的消化10min改良为2次消化，每次2min总计4min，每次消化后立即终止。以往的方法中，用来消化时，将剪碎的细胞置于胰酶中反复吹打，而吹打本身也会造成细胞损伤，且吹打容易产生泡沫加剧细胞损害，本改良方法中，只以吸管做搅动，充分均匀胰酶的消化作用又不会产生吹吸的作用，减少了细胞在反复吹打过程中的损伤。
将同一块包皮组织等份分开，用两种方法同时分离hESCs，台盼蓝染色结果表明：改良法的活细胞率明显大于传统法细胞，从形态上观察，细胞展开生长无差异。我们用两种方法培养的原代细胞绘制细胞生长曲线（图3），可以看出改良法细胞存活数量多，增殖速度快，细胞活性好，证明了改良法培养可以快速获得大量hESCs。研究表明，K19表达阳性的细胞多分布在毛囊隆突部和基底膜，且具有干细胞的慢周期性和强大的增殖特性，而终末分化的表皮细胞则表达K10。所以K19也被认为是表皮干细胞的特异性标志[9]。β1整合素不仅介导表皮干细胞与细胞外基质的黏附，也调控终末分化启动，β1整合素表达的降低会刺激表皮干细胞离开干细胞池，向上迁移成为终末分化细胞，因而认为β1整合素高表达可以是表皮干细胞的标志物之一[10-11]。我们将应用Ⅳ胶原快速贴壁的改良法细胞通过细胞免疫化学方法研究，显示改良法细胞K19、β1整合素呈阳性表达，证实了采用改良方法培养的细胞为hESCs。进一步分别采用两组细胞为种子细胞，鼠尾胶原为支架构建组织工程皮肤，组织切片HE染色显示改良组hESCs细胞构建的组织工程皮肤表皮层较厚，细胞复层多，表皮细胞复层层数为5～6层、基底细胞排列整齐，而传统组hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为3-4层、基底细胞排列散乱，表明应用改良组细胞更适宜构建组织工程皮肤（图5）。
表皮干细胞是一种在成年期还能维持较高的自我更新能力的细胞群，在正常状态下维持表皮的自我更新，当受到损伤刺激时，表皮干细胞可以参与皮肤损伤的修复[12]，本研究采用改良法分离培hESCs并与传统方法对比，显示出改良方法培养出的hESCs活力和增值能力更好，构建的组织工程皮肤具有更好的形态结构，为以表皮干细胞为种子细胞构建组织工程皮肤进一步奠定了基础。
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【摘要】 ［目的］探索在旋转生物反应器内，应用微载体技术快速扩增并向软骨分化人脂肪干细胞。［方法］将人脂肪干细胞结合Cytodex3微载体在旋转的生物反应器（RCSS）内进行动态培养，应用倒置显微镜和扫描电镜对微载体表面的脂肪干细胞进行动态观察，并对收获的脂肪干细胞进行SafraninO、toluidine blue染色等组织化学染色及Ⅱ型胶原的免疫化学染色分析。［结果］脂肪干细胞于24 h内贴附于Cytodex3微载体表面，细胞形态为短梭形，随时间的延长，贴附于微载体的细胞逐渐增多，到培养后期，细胞密度可达最初接种的19倍左右，在微载体上收获的细胞进行番红花O、阿利新蓝染色呈阳性，Ⅱ型胶原染色阳性，均强于对照组。［结论］利用微载体细胞培养技术可简便快速地在体外扩增脂肪干细胞，并成功实现向软骨细胞分化。
【关键词】 脂肪干细胞； 生物反应器； 微载体； 软骨细胞
自从2001年Zuk等人［1］从脂肪中提取出了具有多向分化潜能的干细胞后，脂肪干细胞(adipose derived stem cells，ADSCs)以其来源广泛，取材方便，扩增迅速等优点迅速成为了组织工程的研究热点。多项研究证实，ADSCs在体外可以向多种细胞系分化，包括骨、软骨、脂肪、肌肉、神经及内皮［2、3］。其生物学特性与骨髓基质干细胞非常相似，在组织工程领域颇具应用前景。而软骨是公认的最适于应用组织工程技术构建的组织，因此以ADSCs作为软骨组织工程的种子细胞，具有很高的实用价值。构建组织工程软骨通常要求短期内获得大量的种子细胞，并且在体外培养过程中能够保持良好的表型。传统的静态培养方式很难满足这些要求，而立体三维动态培养不但可以加速细胞的增殖，而且利于软骨方向分化及表型的维持［4］。因此，本研究利用生物反应器技术结合微载体对ADSCs进行快速扩增同时向软骨细胞方向诱导，旨在观察ADSCs在微载体上增殖分化情况，探讨其未来临床应用的可行性。
1 材料和方法
1.1 材料
Ⅰ型胶原酶，地塞米松，2磷酸1抗坏血酸，ITS，Cytodex 3(Sigma)，胰酶，高糖DMEM(Gibco)，胎牛血清(元亨圣马)，FGF2、TGFβ1(Peprotech，UK)，Ⅱ型胶原鼠抗人单克隆抗体(北京中山公司)，旋转生物反应器(Synthecon)，Olympus倒置显微镜(Olympus)。
1.2 方法
1.2.1 ADSCs的分离培养 取膝关节置换术中切除的髌下脂肪垫，严格保持无菌，取材后30 min内进行干细胞分离。在超净工作台中，用显微剪刀仔细剔除脂肪组织表面的筋膜和小血管，DHank's冲洗3遍以洗去红细胞的污染。剪碎，加入5倍体积的0.075%的Ⅰ型胶原酶，37℃、搅拌30 min，离心2 000 r/min，5 min，倾去上层脂肪及上清，DHank's洗涤，100目筛网过滤。离心1 000 r/min 5min，沉淀用DHank's洗2遍，将细胞重悬于含10%FBS的高糖DMEM培养基，48 h后换液。细胞长满80%后，用0.25%胰酶消化传代培养。至第2代时，换培养液为软骨诱导液(5 ng/ml FGF2，10 ng/ml TGFβ1，50 μg/ml Vc、10-7M Dexamethasone，1xITS)进行软骨方向诱导分化。
1.2.2 Cytodex 3预处理 取干重微载体珠50 mg，放入10 ml的洁净玻璃瓶中。向瓶中加入不含钙和镁离子的PBS 10 ml，室温下至少孵育3 h以膨胀微载体珠，用巴氏吸管弃去上清液，PBS清洗微载体2次，弃去PBS，再加入新鲜不含钙和镁离子的PBS 10 ml，高压灭菌20 min，吸除上清液，微载体用培养液清洗，置于4℃冰箱中备用。
1.2.3 细胞培养方式 将Cytodex 3微载体50 mg及ADSCs(最终浓度1×105/ml)加入到10 ml体积的RCSS培养容器中，并补加软骨诱导培养基至充满容器。把接种细胞的容器连接于旋转底座。整个装置放于5%CO2孵箱，于37℃常规条件下培养。开始以5 r/min的速度旋转5 min，以充分混合细胞，然后停止旋转5 min。再旋转容器5 min，再停止容器旋转5 min。多次重复循环，最后持续旋转容器并逐步调整转速至10～12 r/min。视培养基颜色及pH值决定是否换液及换液量。ADSCs静止培养是以1×105/ml接种于6孔板中，每孔2 ml，接种5孔，培养过程中每2～3 d更换培养液，保持细胞供养充足。
1.2.4 细胞形态学观察和计数 人ADSCs分别培养1、3、5、7 d，取样本于倒置显微镜下观察微载体表面ADSCs生长形态及增值变化情况，消化、分离微载体表面的软骨细胞并用血细胞计数板计数，描记细胞培养生长曲线。并取第3 d细胞微载体样本，进行扫描电镜观察，观察细胞生长形态及基质分泌情况。对照组静态单层培养的ADSCs细胞，分别于1、3、5、7 d观察细胞生长形态及增值变化情况，并收集一孔细胞计数，描记细胞生长曲线。
1.2.5细胞化学及免疫细胞化学分析分别将微载体上生长的ADSCs和单层培养的ADSCs进行消化收集，爬片，应用SafraninO染色，toluidine blue染色观察细胞外基质中GAG合成和分泌情况。应用Ⅱ型胶原单克隆抗体与细胞爬片共同孵育，以DAB为底物应用免疫过氧化物酶法显色，阳性染色为棕色反应，观察Ⅱ型胶原分泌合成情况。
2 结果
2.1 ADSCs在Cytodex 3微载体表面贴附生长情况
细胞接种3 h后，细胞开始贴附于微载体表面，24 h后，绝大部分细胞已经贴附在微载体表面，培养基中仅可见少量死亡细胞。细胞由球形、半球形逐渐伸展为短梭形，偶见伪足伸出，形态不规则(图1a)。第3 d，微载体表面细胞明显增多，在不同焦距平面上均可见细胞贴附生长，细胞周围可见基质分泌沉淀，微载体间偶见细胞连接。细胞形态呈短梭形扁平状。培养基中少见死亡细胞，电镜扫描，细胞在微载体表面贴附良好(图1b)。第5 d，微载体大部分空间已被细胞所覆盖，细胞层叠生长，大量基质分泌，单个细胞形态不易区分，微载体之间可见宽大的细胞连接体，微载体呈团状生长(图1c)。第7 d，微载体已被完全覆盖，表面细胞互相重叠呈团块状，这使得微载体表面变得粗糙、凹凸不平。微载体间广泛存在细胞连接，培养基中几乎无脱落细胞(图1d)。
2.2 ADSCs在静态培养中生长情况
细胞接种于诱导培养基2 h后，开始贴壁，24 h后全部贴壁。细胞形态为短梭形或多角形，与未诱导ADSCs相比较细胞个体略大。完全贴壁后即开始快速增殖，3 d达到50%融合，5 d达到80%融合。随细胞密度增加，增值速度减慢，7 d基本完全融合。
2.3 2种不同培养方式下ADCSs的生长曲线
在第1、3、5、7d，分别从RCCS容器及普通培养瓶中收集ADSCs并计数，做生长曲线如图2。台盼蓝染色排除试验显示，从微载体上回收ADSCs存活率90%以上。血细胞计数板计数，可见ADSCs于RCSS接种后的第3 d起生长加速，至第7 d细胞密度达到最高值，约为最初接种的19倍。静态单层培养第7 d收获细胞总数约为最初的6倍余。
2.4 细胞化学及免疫细胞化学检查分析
2组不同培养方式的ADSCs爬片染色显示，微载体培养的细胞SafraninO染色，toluidine blue染色呈强阳性，强于静态培养组，表明细胞外基质中含有大量GAG；Ⅱ型胶原染色亦呈强阳性。结果表明微载体上培养的ADSCs经过动态诱导培养，有软骨特征性基质成分表达(图3～5)。
3 讨论
脂肪来源干细胞容易获得，并且来源广泛，与骨髓基质干细胞一样均属于来自中胚层的成体干细胞。De Ugarte等［5］发现来源于骨髓和脂肪组织的干细胞在细胞获得率、细胞老化、基因转染和细胞的黏附特性等方面没有明显的差别。因此，ADSCs作为软骨组织工程的种子细胞，具有不可多得的优势和前景。
作为临床应用，构建组织工程软骨往往需要大量的种子细胞，有研究表明当细胞数量少于1×107/ml时就不能形成软骨或生成很少［6］。传统的培养方式不仅扩增速度慢，而且不容易维持干细胞诱导后的表现；在三维培养条件下则有利于ADSCs向软骨方向分化，并促进细胞外基质的合成［7］；而动态三维立体培养则进一步提高了组织工程软骨的生物化学功能和生物力学功能。
微载体细胞培养技术是一种微载体与生物反应器结合的技术，现已广泛应用于组织工程领域。在动态培养过程中，外部流体力学刺激能够明显增加细胞增殖，促进细胞DNA的合成，利用生物反应器和微载体进行细胞扩增，细胞浓度最高可达到1×108/ml［8，9］。这在常规培养条件下是很难达到的。这首先是由于微载体有较大的表面积(Cytodex 3 110 g提供约4600 cm2的表面积)［2，5］，相同容积的生物反应器和普通培养瓶相比，前者可比后者多培养数10倍甚至100倍的细胞，可以满足较大体积组织构建对种子细胞数量的需求；其次因为整个培养容器由电机驱动沿水平轴旋转，培养基以及细胞颗粒随容器一起旋转，细胞微载体颗粒在水平轴内建立均质的液体悬浮轨道，使细胞所受到的重力、浮力及剪切力达到平衡，这就构成了一种微重力培养环境，利于细胞聚集，并在微载体表面各个方向上均衡扩增生长；最后一点在这种动态环境中，细胞与营养物质易于均质分布，显著改善微环境中的营养物质及代谢产物的交换，保持培养环境的均一性和稳定性，有效促进了细胞的增殖。
组织构建的另一个难题是怎样保持其诱导表型，不发生去分化。生物反应器和微载体介导的动态三维培养，不但为细胞增殖提供了良好的环境，而且周期性的力学刺激作为一种必要的物理信号在细胞的分化过程中起到了重要的作用。在动态环境中细胞活性增强，加之诱导因子的作用，使得大量蛋白合成分泌，形成特异的细胞外基质，促进了细胞的分化和成熟。总之，这种动态培养微环境提供了细胞聚集、快速三维生长和分化的条件，为工程化组织构建提供了更为有效的手段［10］。本实验的结果也证实了这一点，实验中ADSCs在微载体上能够迅速贴附、伸展并快速增殖。第7 d细胞已将微载体表面完全覆盖，并凸出微载体表面生长，微载体间相互连接，呈团状生长。微载体培养在1周的时间内细胞数量增长了近20倍，而静态培养则仅为6倍，组织化学及免疫组织化学均显示微载体培养的细胞有较好的表型及细胞外基质。本研究为以ADCSs作为种子细胞构建组织工程软骨提供了实验依据，为进行更加深入的研究奠定了基础。
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【关键词】 人端粒酶逆转录酶 端粒酶 人骨髓间充质干细胞 基因
Abstract：［Objective］To explicate whether the telomerase activity is regulated by human telomerase reverse transcriptase (hTERT) in human bone marrow mesenchyme stem cells(hBMSC).［Method］hBMSC were cultured and transfected with eukaryotic expressing plasmid pCIneohTERT encoding hTERT. After selection with G418 to stabilize the transfection，expression of hTERT mRNA was detected with TRPCR， detecting the expression of hTERT protein was detected with Western Bolt， and the telomerase activity in untransfected and transfected cells were detected by RTPCR.［Result］The hMSCs grew well after transfecting plasmid pCIneohTERT.The cells began to suspend and die after the day of the G418 selection. At the tenth day，all the untransfected cells were dead， but the transfected cells began to clone proliferation. So the density of G418 subdued to 100 μg/ml for maintaining selecting， at the twentieth day，there were obvious antiG418 cell clones. After stable transfection， hTERT was expressed at mRNA and protein level in these anti418 cell clones， and meanwhile telomerase activity was positive and obviously raise up in these transfected cells.［Conclusion］In human' bone marrow mesenchyme cells，telomerase could be activated by exogenous hTERT. This is a foundation to establish immortalized human bone marrow mesenchyme stem cell line.
Key words：hTERT; telomerase; human bone marrow mesenchyme stem cell; gene
髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchyme stem cell，hBMSC)目前作为组织工程的种子细胞，在基础研究与临床中得到广泛应用。但是也存在许多问题［1～3］，在基础研究中存在如何得到纯化，甚至标准的细胞系，使各实验室之间以及实验室前后研究之间具有可比性和延续性的问题；在临床生物工程应用中存在细胞老化、去分化，以及生物工程化器官过程中，如何获得足够数量的种子细胞的问题［3］。
细胞培养广泛应用于基础研究、临床实践和生物工程［4］。然而，正常组织来源的细胞在通常的体外培养条件下经过有限次的传代后，就会停止分裂增殖，发生衰老和死亡［5］，这就限制了细胞培养技术的进一步应用。因此，学者们提出建立永生化细胞系，使体外培养的细胞具有无限增殖能力。
研究表明，端粒酶的激活可以延缓细胞的衰老，甚至使细胞永生化［6，7］。TERT作为端粒酶的逆转录酶，与细胞端粒酶的活性高低密切相关［8］。本实验将外源性人TERT(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因转染至克隆培养的hBMSC中，以明确hTERT能否调控其端粒酶活性，为建立永生化人骨髓间充质干细胞系奠定基础。
1 材料和方法
1.1 主要试剂与材料
LDMEM低糖培养基，胰酶，限制性内切酶EcoRI、SalI，Midi质粒纯化试剂盒，G418：均为美国Gibco BRL公司产品；胎牛血清为美国Hyclone公司产品；LipofectAMINE 2000转染试剂盒：美国Invitrogen公司；端粒酶活性检测试剂盒：华美生物工程公司；质粒pCIneohTERT(hTERT基因克隆至真核表达载体pCIneo，酶切位点EcoRI和SalI)美国学者Weinberg RA惠赠。
1.2 方法
1.2.1 质粒DNA的转化、扩增、纯化和鉴定 挑取生长良好的大肠杆菌DH5α单菌落制备为感受态细胞，取50 μl感受态细胞，加2 μl质粒pCIneohTERT溶液进行细菌转化，过夜后挑取单菌落，接种于含氨苄青霉素的LB培养液进行质粒的扩增，按试剂盒说明书提取并纯化质粒。核酸蛋白分析仪进行浓度和纯度的测定后，取10 μl质粒以EcoRI和SalI双酶切(各0.5 μl)，1％琼脂糖电泳进行鉴定，其余置-20°保存待用。
1.2.2 细菌培养和基因转染 原代单克隆培养的人骨髓间充质干细胞［9］接种于24孔板，每孔约2×105个细胞，待细胞长到90％时，按LipofectAMINE 2000转染试剂盒说明书进行pCIneohTERT的转染。24 h后1∶10传代，次日加G418，浓度为200 μg／ml。经过9～10 d，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，此时将G418浓度降为100 μg／ml，继续培养，20 d左右出现明显细胞抗性克隆。在显微镜下用含胰酶的10 μl移液枪转移至24孔板扩大培养。取转染前及转染后第10、25代细胞进行以下实验。
1.2.3 hTERT mRNA的表达 用Trizol裂解沉淀细胞后，提取总mRNA。根据hTERT的mRNA序列(Gene Bank)和参考文献［10，11］， 设计PCR扩增的两条引物：上游5'-GACACACATTCCACAGGTCG-3’和下游5'-GACTCGACACCGTGTCACCTAC-3'，预期产物片段为175 bp。采用Titan TM One Tube RT-PCR Kit进行RT-PCR检测hTERT mRNA的表达。RT-PCR参数为：50° 30 min；94° 10 s，60° 30 s，68° 45 s，10个循环；94° 10 s，60° 30 s，68° 2 min，25个循环；68°，7 min。
1.2.4 hTERT蛋白的表达 参照文献［12，13］，以三去污剂裂解液裂解细胞，提取细胞内总蛋白，经核酸蛋白分析仪定量后，每孔上样量为50 μg，进行hTERT的Western Blot分析。采用Western Blotting Luminol Reagent测试剂盒显色。同时，取细胞爬片，多聚甲醛固定后，按说明书进行细胞免疫组织化学染色，免疫荧光显色。
1.2.5 端粒酶活性的检测 按端粒酶活性检测试剂盒说明书操作。收集2×106个细胞，洗涤离心后裂解，冰浴30 min，离心后上清即含细胞端粒酶。取2 μl进行RTPCR扩增端粒酶重复序列。扩增产物经杂交反应后显色，测定波长450 nm处的吸光度A值，反映细胞端粒酶活性。其中阳性对照：人胚肾转化细胞系293细胞；阴性对照：65°处理293细胞30 min。阴性对照A值低于0.05时按0.05计算，高于0.05时按实际值计算，样本大于阴性对照A值的3倍时，判为端粒酶活性阳性。
2 结 果
2.1 质粒扩增和酶切鉴定
质粒pCIneohTERT经试剂盒提取纯化后，核酸蛋白分析仪分析表明：A260／A280和A260／A230的比值分别为1.80和2.12，说明提纯质粒好，基本无蛋白、RNA及酚的污染，可用于基因转染；浓度为0.55 μg／ μl。采用EcoRI和SalI双酶切后电泳如图1所示，酶切片段与预期大小一致，表明质粒无误。
图1 pCIneohTERT酶切鉴定(M:2kb Marker，D：酶切，P:质粒)
2.2 细胞培养和基因转染
细胞转染质粒pCIneohTERT后，生长状态良好。加G418后第2 d，细胞开始悬浮，逐渐死亡。第10 d，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，转染组细胞开始克隆增殖。G418浓度降至100 μg／ml维持筛选，20 d左右开始出现明显抗G418细胞克隆(图2)，用移液枪转移，扩大培养。
图2 转染后BMSCs的G418抗性克隆形成17 d观察
2.3 hTERT mRNA的表达
转染后第10、25代细胞的总RNA经RTPCR后可获得约175 bp的特异性片段，表明细胞在mRNA水平上表达hTERT(图3)。
2.4 hTERT蛋白的表达
Western Blot检测结果显示转染细胞在124 ku左右见特异性条带，为hTERT蛋白，转染前细胞未能检测到该蛋白(图4)。
细胞免疫组织化学染色显示hTERT蛋白定位于细胞核(图5)。
图3 RTPCR分析hTERT mRNA表达，获175bp特异片段(P10，P25转染传代细胞；C：对照原代细胞) 图4 Western Blot分析hTERT蛋白的表达(P10，P25转染传代细胞，C：对照原代细胞) 图5 hTERT蛋白的表达，免疫细胞化学染色，免疫荧光×200
2.5 端粒酶活性
端粒酶检测结果，图6表明原代BMSC仍然存在一定端粒酶活性，但是活性较低。转染后BMSCs端粒酶活性转为阳性，并且持续保持阳性表达，其活性可达到人胚肾细胞系的水平。
图6 端粒酶活性比较
3 讨 论
端粒是真核细胞染色体末端富含G的DNA重复序列，由DNA及其相关蛋白组成，虽不含基因，但是在稳定染色体方面具有重要作用［14，15］。端粒酶是一种能延长端粒末端的核酸蛋白酶，由蛋白质和RNA组成，可以以其自身的内源性RNA为模板，发挥RNA指导的DNA合成作用，向端粒末端添加(TTAGGG)n序列，使端粒延长，从而延长细胞的寿命。正常情况下，除了一些生殖细胞和胚胎干细胞表达端粒酶活性以外，其他体细胞都不表达端粒酶活性［6］。现在已经明确人端粒酶由3个部分组成［17］:(1)端粒酶自身的RNA模板：端粒酶以自身RNA为模板，以端粒的3'-overhang为引物，在端粒的末端加上新的重复序列，使端粒延长。在多种人体正常组织中均有人端粒酶RNA的表达；（2)人端粒酶逆转录酶(hTERT)：是端粒酶的活性部位。Meyerson等［18］克隆出人的编码端粒酶催化亚基的cDNA，hTERT mRNA在大多数缺乏端粒酶活性的正常体细胞中不能检测到；（3)端粒酶的相关蛋白：TP1／TLP1基因编码端粒酶的相关蛋白，和端粒酶的活性没有必然的联系，具体功能尚不清楚。上述3个组成部分中hTERT是恢复端粒酶活性的关键。然而，有学者发现hTERTmRNA在组织分布上与端粒酶活性并不完全一致［19］，而且端粒酶的组成和结构至今尚未完全明确。另外，端粒酶活性受到复杂机制的调节，在不同层次上存在各种调节因素，如端粒长度变化、端粒酶RNA和蛋白组分、癌基因和抑癌基因、细胞分化和细胞周期等。所以，目前还不能断定hTERT与端粒酶激活的必然联系，即并不是每一种细胞转染hTERT基因均可激活该细胞的端粒酶活性。
为了明确在人骨髓间充质干细胞中导入外源性hTERT能否调控端粒酶活性，作者克隆培养hBMSC［9］，导入克隆至真核表达载体pCIneo的hTERT基因。G418筛选20d后形成抗性细胞克隆，移液枪转移，扩大培养，细胞端粒酶活性转为阳性。因此，作者认为在hBMSC中，导入外源性hTERT可以激活端粒酶，其活性可达到人胚肾细胞系的水平。
目前，有关端粒和端粒酶的研究主要集中在肿瘤的基因治疗上［20］，抑制端粒酶活性，促进肿瘤细胞凋亡。借用这一思路，反之，构建hTERT真核表达质粒转染体外培养的细胞，使细胞在体外培养的生命期延长，用于构建组织工程化标准种子细胞系，可能是解决体外培养细胞增殖困难、传代时间短、细胞衰老的方法之一，且hTERT真核表达质粒较病毒载体的安全性更高。以往研究结果表明［10，11］，将编码hTERT的基因转染到正常人成纤维细胞和血管内皮细胞，可以使正常人体细胞突破“Hayfliek极限”，细胞寿命得以延长，细胞可在体外长期传代，无致瘤性，细胞仍保持正常的形态和功能。
实验表明，用脂质体法将构建的hTERT真核表达质粒pCIneohTERT体外转染人骨髓间充质干细胞，转染后的细胞端粒酶活性明显提高，为进一步建立人骨髓间充质干细胞标准细胞系奠定了基础。
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【关键词】 骨髓间充质干细胞；生物学特性；细胞培养
The Biological Characteristics and Culture in Vitro of Rabbit Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells
〔Abstract〕 ObjectiveTo further study the isolation and cultivation procedures of mesenchymal stem cells from rabbit in vitro， and explore their biological properties. To build an experimental basis on applying MSCs as seed cells to treat many diseases. Methods
MSCs were obtained from tibias by density gradient centrifugation and were tested the rate of adhesion. The configuration was observed under phase-contrast microscope consecutively and the cell growth was measured by MTT method. Cell cycle and surface antigens were detected through flow cytometer. Results The subcultured cells showed active proliferative ability. More than 95% of subceltured MSCs were adhesive in 12 h. MSCs were positive for CD29， CD44， CD105 and negative for CD34.
Conclusion
In present culture condion， MSCs showed stable and rapid
growth in vitro . The characteristics make it possible to MSCs to be the seed cells for tissue engineering.
〔Key Words〕
Mesenchymal stem cells; Biological characteristics; Cell culture
干细胞是具有自我更新能力，且在适宜微环境下具有多系分化潜能的原始细胞[1]。近年研究发现，机体内除胚胎干细胞外还存在具有自我更新和分化能力的成体干细胞。其中骨髓中的干/粒细胞包括间充质干细胞（Mesenchymal stem cells， MSCs），造血干细胞及网状内皮系统。 MSCs 可在体外扩增并有多向分化潜能[2-4]， 且取材方便，免疫耐受性、遗传背景稳定及易于转染外源基因等，因而作为组织工程“种子细胞”有“广泛的应用前景”[5-8]。本实验通过对兔 MSCs 体外培养法及其生物学特性进行研究，以建立一套稳定、成熟的兔 MSCs 培养方法，从而为细胞移植等组织工程提供种子细胞来源提供实验基础。
1
材料及方法
1.1
主要试剂与仪器
低糖 DMEM 培养基（GIBICO 公司）、10% 胎牛血清（Hyclone 公司）、0.125% 胰蛋白酶（Sigma 公司）、Ficoll 淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技有限公司，比重 1.077 g/mL）、CD29、CD34、CD44、CD105 单克隆抗体和 FITC 标记的二抗（Lab vision）、MTT（沃宏公司）、倒置相差显微镜（OLYMPUS）、细胞培养箱（Forma）、流式细胞仪（FACSCalibur， BECTON DICKINSON 公司，美国）及超净工作台（ESCO）等。
1.2
实验动物
普通级健康新西兰大耳白兔，雌性，兔龄约 3 个月（南京市第一医院动物实验中心提供，许可证号：SCXK [苏] 2002-2007）。
1.3
方法
1.3.1
骨髓 MSCs 的分离纯化与培养
兔仰卧固定于兔台上，予 2% 利多卡因局麻后，持 16 号骨穿针，沿胫骨平台垂直刺入骨髓腔，外接肝素（3 000 U，0.2 mL）润洗过的 10 mL 无菌注射器，抽取骨髓 4 mL，缓慢叠于等量 Ficoll 淋巴细胞分离液（密度 1.077 g/mL）上，以 2 000 r/min 的速度离心 20 min，分离骨髓单个核细胞，收集界面上的细胞，移入另一离心管，PBS 洗涤，2 000 r/min 离心 5 min，反复 2 次，弃上清，悬浮于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基（青霉素 100 U/mL，链霉素 100 U/mL），轻轻吹打均匀，接种到 25 cm2 培养瓶，置 37℃，5% CO2 及饱和湿度培养箱中培养。4~6 d 首次换液，以后每 3 d 或 4 d 换液 1 次，14~21 d 细胞生长融合达 80% 以上，以 0.125% 胰蛋白酶消化，按 1:2 比例传代培养，倒置显微镜下逐日观察细胞形态。
1.3.2
骨髓 MSC 贴壁率检测
取对数生长期细胞，0.125% 胰蛋白酶消化制备单细胞悬液，调整细胞浓度为 1×105/mL，接种于 24 孔培养板，每次孔 1 mL，每 2 h 取出培养板，吸去 4 孔培养液，0.1 mol/L PBS 漂洗除去未贴壁细胞，0.125% 胰蛋白酶消化后离心收集细胞，进行细胞计数，共观察 12 h，按以下公式逐个计算每个时相点的贴壁率：贴壁率=（贴壁细胞总数/接种细胞总数）×100%。
1.3.3
骨髓 MSCs 生长曲线的测定
取第 3 代生长良好的细胞，用 0.125% 胰蛋白酶消化后用含 10% FBS 的 DMEM 制备细胞悬液，以每孔 103~104 个细胞于不同时相分别接种于 8 块 96 孔板中的 8 孔，每孔体积 200 L，置于 37℃、5% CO2 及饱和湿度培养箱中孵育。于第 2 天起行 MTT 比色法，每孔加入 MTT 溶液（5 mg/mL）20 L，37℃ 继续孵育 4 h 后，每孔加入 150 L 二甲基亚砜，振荡 10 min 后选择 490 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，以时间为横轴，光吸收值 A（OD）为纵轴绘制细胞生长曲线。
1.3.4
骨髓 MSCs 表面标记测定
取第 3 代MSCs，用 0.125% 胰蛋白酶消化，2 000 r/min 离心 5 min，PBS 洗涤 2 次，调节细胞浓度为 1×106/mL，分为 4 份，分别滴加人抗兔 CD29、CD34、CD44、CD105 一抗（以 PBS 代替一抗作为阴性对照），室温反应 30 min 后，PBS 洗涤 2 次，滴加 FITC 标记的抗兔 IgG，避光反应 15 min 后，经流式细胞仪检测细胞表面 CD29、CD34、CD44、CD105 阳性细胞的表达。
2
结
果
2.1
MSCs 的形态学变化
原代培养中，可见细胞以分散、克隆集落方式增殖；第 1~3 天细胞大部分呈圆形、椭圆形生长；第 3~7 天贴壁细胞增多，并逐渐延展生长为多角形、星形或梭形； 7~21 d 贴壁细胞明显增多，并有集落形成，相邻集落融合成片达 80% 以上，细胞排列呈漩涡状，细胞间界限不清，细胞呈长梭形；14~21 d 后，细胞传代，传代后的细胞不以集落方式生长，而是均匀分布长梭形细胞。
2.2
MSCs 各时相点细胞帖壁率
见表 1。
2.3
MSCs 生长曲线分析
实验发现，细胞传代培养 1~2 d，吸光度变化不大，甚至有轻微下降，细胞处于潜伏期，第 3 天起呈对数生长，至第 7 天到达高峰，之后进入平台期，见图 2。
根据计算细胞的倍增时间公式可得：
DT = t ×〔lg2/（lgNt-lgNo）〕= 96 ×〔0.301/ （-0.060+1）〕= 30.8 h
2.4
MSCs 表面标记
流式细胞仪结果显示：CD34、CD45 阳性细胞均为 0.8%；CD29 和 Cd105 阳性细胞数为 99.8%。说明分享获得的细胞符合骨髓间充质干细胞的特点（见图 3）。
3
讨
论
MSCs 体外培养的生长特点和生物学特性已有较多相关文献报道。MSCs 在骨髓中的含量极少，约占有核细胞的 0.001%~0.01%[9]，如何获得高纯度、足量的 MSCs，成为 MSCs 应用研究的关键。
目前常用于 MSCs 分离方法有密度梯度离心法[10-11]、贴壁筛选法[12]、免疫磁珠法[13]、流式细胞仪分离法[14]及 Hung 等[15]研究的特制微孔培养板筛选法。采用全骨髓贴壁筛选法，将抽取的骨髓直接置于培养瓶中培养，利用骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性分离细胞，几天后换液观察细胞贴壁情况，这种保留造血干细胞和各种细胞混合培养的方法，由于维持了 MSCs 原始的生活环境，有利于 MSCs 分化，但所得细胞成分复杂， MSCs 纯度不足。单克隆抗体磁珠分离系统或流式细胞仪技术对细胞活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性，而且实验操作复杂，需要骨髓量大，不易重复，造价较高，一般仅限于在大实验室应用[16]。特制微孔培养板筛选法，可以快速有效分离得到相对同质的 MSCs，利用这种方法可以不用 Percoll 液去除红细胞[17]，但是结果不稳定，特定原料不易大量获取。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，利用Percoll 或淋巴细胞分离液提取单核细胞进行贴壁培养。操作上较贴壁细胞分离法烦琐，得到的细胞数不如后者多，但细胞纯度较后者高。本实验结合密度梯度离心法和贴壁筛选法，利用密度为 1.077 g/L 的 Ficoll 分离液，能有效去除绝大部分红细胞、粒细胞、脂肪细胞和血小板，获得纯度较高的单个核细胞。然后利用 MSCs 的贴壁性，逐渐弃掉未贴壁细胞，从而获得足量的 MSCs。
在培养过程中，我们还注意到以下几个环节：①与蒋雯等[18]不同，本实验研究发现，兔 MSCs 原代培养首次换液的时间宜在 4~6 d，过早换液将丢失过多尚未贴壁细胞，因在实验过程中，第 3 天首次换液后，收集旧培养液离心洗涤，再接种仍有细胞大量生长；且原代细胞在培养 14 d~21 d 左右才能达到80% 以上的融合，才能进行传代培养，这可能与我们用的培养基加的胎牛血清浓度不同，蒋雯等用的是 20% 的血清，而我们用的是 10% 的胎牛血清；②培养基中胎牛血清浓度保持在 10% 左右为宜，过低由于缺乏生长因子的刺激，细胞增殖减慢，而过高又因含大量促进细胞生长增殖分化的因子，易引起细胞过早出现老化；③兔 MSCs 原代接种贴壁不良时，可予胶原[19]包被培养瓶，增加细胞的贴壁率；④胰蛋白酶消化细胞时，可先将 PBS 润洗培养瓶 2 次，去除残留血清，更易将贴壁细胞消化下来，且消化时间缩短，不会造成消化时间过长对细胞的损伤；⑤细胞传代时，应注意接种密度，宜按 1:2 比例传代接种，如此细胞才能保持良好的增长趋势，不会因接种密度过稀致增长缓慢且易老化。
目前 MSCs 在生物医学领域有着广泛的应用，然而 MSCs 表面标志由于细胞分离、培养方法和培养时间等的不同而有差异。Pittenger 等[20]认为人MSCs 阳性表面标志是 SH2（CD105）、SH3、SH4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD124，阴性表面标志是 CD45、CD34 和 CD14 等造血细胞标志。Hung 等[21]采用带 3 m 孔培养板的装置培养分离得到人 MSC，培养至第 2 代末时阳性表面标志是 CD90、CD44、CD29、CD51，阴性表面标志是 CD45、CD34、CD7、AC133 等。研究者们应用不同的分离扩增方法及不同的方式表达细胞特性，使得对一些研究结果的比较变得困难，阻碍了其在这些领域的应用[22]。因此在 2005 年，ISCT（the International Society for Cellular Therapy）定义了 MSCs 的最低标准： 首先，MSCs 在标准培养条件下必须具备贴壁生长的特点；其次，MSCs 表达 CD105、CD73 和 CD90，而 CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79a、或 CD19 及 HLA-DR 表面分子表达阴性；第三，MSC 在体外能分化为格根包尔氏细胞、脂肪细胞和成软骨细胞[23]。本实验选择第 3 代细胞行流式细胞仪检测表面抗原显示，阳性表达黏附分子、整合素家族成员等如细胞表面抗原 CD29、CD44、CD105 阳性细胞数占 99.8%，而造血细胞表面标志阴性或极少表达即 CD34 阳性率只有 0.8%，上述结果表明：获得的细胞为非造血类的、符合骨髓间充质干细胞的特点，与文献资料吻合[12，24]。
通过对兔MSCs 培养方法和表面标识物的进一步研究，本研究建立了一套稳定分离、培养扩增骨髓间充质干细胞的方法，获得足量纯化的 MSCs 并进而研究其作为种子细胞治疗多种疾病提供了实验基础。随着基因工程和组织工程的发展，骨髓 MSCs 也将在细胞治疗、基因治疗等方面得到广泛应用。本研究设计的缺陷在于，这只是细胞培养的一个初步研究，下一步若对细胞周期及细胞活力进行检测，将对选择最合适代数细胞作为种子细胞的应用提供更有价值的信息。
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[摘要]目的：探讨人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染大鼠脂肪干细胞(rADSCs)的稳定表达系统对皮瓣成活的影响。方法：①培养和鉴定大鼠ADSCs，脂质体介导pcDNA3．1－VEGF165质粒转染大鼠(rADSCs)，经G418筛选抗性rADSCs并继续培养4周，用ELISA法检测转染后细胞培养上清中VEGF浓度。②Brdu标记被转染rADSCs后，在大鼠背部制备8．0cm×2．5cm的随意型皮模型，实验组(10只大鼠)为注射pcDNA3．1-VEGF165质粒转染的rADSCs悬液到大鼠腹腔，对照组(8只大鼠)为注射2ml被空载体pcDNA3．1(一)转染的rADSCs悬液，术后7天用透明纸描记法记录皮瓣成活范围，记数坐标纸格子并换算为成活面积百分率。分别于术后3天、5天、7天在成活皮瓣的远端切取皮瓣组织标本行免疫组化染色。结果：①ELISA检测4株转染和经G418筛选抗性并继续培养2周的第二代rADSCs上清中VEGF浓度多达(4．21±0．35)pmol VEGF／1×106细胞／48h(x±s，n=4)，有2株细胞培养液上清分泌VEGF较强，其余2株细胞相对较弱，均大于对照的空载体转染组和未转染组rADSCs培养液上清中的(0．49±0．15)pmol VEGF／1×106细胞／48h(x±s，n=3)和(0．61±0．86)pmol VEGF／1×106细胞／48h(x±s，n=3)，均P
[关键词]成体干细胞；基因治疗；随意型皮瓣
[中图分类号]Q789 [文献标识码]A [文章编号]1008―6455(2007)01-0007-04
皮瓣是用于修复较大的组织缺损和外露脏器的带血供的皮肤软组织，但是在转移手术后皮瓣经常发生血运障碍。研究表明，血管内皮细胞生长因子(VEGF)可以促进血管的新生，从而提高缺血皮瓣的成活面积。成体干细胞载体可以治疗多种疾病。研究表明，MSC等成体干细胞可以作为中枢神经性疾病等多种疾病的基因治疗载体，例如MSC可以作为VEGF、FGF等多种细胞因子基因治疗的载体，并通过旁分泌作用释放VEGF促进侧支循环的建立和血管的再生，而MSC自身则不参与缺血组织的治疗。目前ADSCs作为基因治疗载体的报道较少见，本研究旨在阐明脂肪干细胞可以作为运送VEGF基因到达皮瓣的细胞载体并通过旁分泌VEGF提高皮瓣的成活面积。
1 材料和方法
1．1材料：3周龄SD大鼠18只(雌雄不限)、Lipo-fectamineTM2000(美国Sigma公司)、pcDNA3．1-VEGF165质粒(本室构建并保存)、DMEME(Dul―beccos modified eagle balancedsalt solution)培养基、0．1％Ⅰ型胶原酶(美国Worthington公司)、CD49天抗体(北京中山生物技术公司)、恒温CO2培养箱、台式离心机(LingLi公司)、Calibur型四色流式细胞仪(美国Becton Dickinson)、DMIRB型倒置相差显微镜(德国Leica公司)。
1．2方法
1．2．1 rADSCs的分离和原代培养：SD大鼠麻醉后，在无菌下切取腹股沟脂肪垫，剪碎后加入0．1％Ⅰ型胶原酶消化40～60min，加入2倍体积的D-Hank’s液，离心收集沉淀并用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基稀释，转种到培养瓶中。
1．2．2 rADSCs的鉴定：收集处于对数生长期的第2代rADSCs，95％乙醇固定和漂洗后分别加入鼠抗鼠的CD49天单克隆抗体，4℃过夜，PBS洗掉未结合的抗体，加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠二抗，室温下放置30min，PBS洗掉未结合的抗体。用流式细胞仪检测。同时用PBS／FBS／NANO3代替一抗作为空白对照。
1．2．3脂质体介导VEGF转染rADSCs：生长到70％～80％融合的细胞，用新鲜无血清DMEM培养基洗涤2遍。按LipofectamineTM2000操作说明，pcDNA3．1(一)、pcDNA3．1－VEGF165质粒分别8．0μg和LipofectamineTM2000 20μl混合，室温静置20min后，加入1ml不含血清的DMEM培养基，37℃、转染rADSCs 8h后，换成含血清的DMEM培养基继续培养24h，换成最小致死剂量0．5g/L的G418选择培养基，抗性细胞筛选，2周后细胞克隆形成，其阳性克隆在0．5g/L的G418维持剂量压力下继续扩大培养2周备用。
1．2．4 ELISA检测被转染rADSCs上清中VEGF浓度：各组rADSCs在培养24h后收集培养上清，用ELISA试剂盒检测培养上清中VEGF浓度，以平均pmol／1×106细胞／48h(x±s，n＝4)表示。
1．2．5被转染rADSCs的标记：在传代后的细胞培养液中加入新鲜配制的Brdu，终浓度5μg/m1，至细胞生长到95％以上融合后备用。接种在12孔板中的rADSCs在用Brdu标记后经抗Brdu单抗进行免疫细胞化学染色，随机观察5个视野并计数。
1．2．6动物实验：消化收集标记Brdu的rADSCs并台盼蓝染色记数为1×1077／ml，用D-Hank’s液反复3次洗涤，制成2ml的rADSCs的单细胞悬液用于注射动物模型。在大鼠背部一侧制备直径8×2．5cm的背部随意型皮瓣模型，掀起皮后保留皮下的肉膜。实验组有10只大鼠，在每只大鼠腹腔内注射2ml被转染的rADSCs单细胞悬液，对照组有8只大鼠，在每只大鼠腹腔内注射2ml被空载体pcDNA3．1(一)转染的rADSCs单细胞悬液。分别于术后7天用透明纸描记法记录皮瓣成活范围，用数坐标纸格子数的方法计算成活面积并换算为成活百分率。术后3天在皮远端切取全层皮肤组织标本并用4％的多聚甲醛固定1h，然后用80％到100％的系列梯度的乙醇脱水，石蜡包埋后切片，行HE染色和抗Brdu免疫组化染色。
1．2．7统计分析：数据用x±s表示，t检验。
2 结果
2．1 rADSCs的分离和培养以及鉴定：原代培养的rADSCs在贴壁后细胞形态均一，呈梭形的单层成纤维细胞样。流式细胞学检查示第3代rADSCs均一性较好，CD49天阳性率为95．3％。
2．2细胞转染与筛选效果：经转染和G418筛选后，非转染组的和pcDNA3．1(一)空载体转染组的细胞100％死亡，而pcDNA3．1－VEGFl65重组质粒转染组的细胞在筛选约2周后有数量较多的细胞集落，提示克隆化基因的细胞转染及G418筛选效果良好。
2．3 ELISA检测转染后细胞上清中VEGF浓度
2．4动物实验中大白鼠在手术后生命体征平稳，精神好，进食和饮水均好。术后7天，各组皮瓣的成活面积如下(表3、图1)，术后3天皮瓣远端皮肤组织抗Brdu免疫组化染色(图2)。
3 讨论
脂肪组织的基质成分中含有具有自我更新和多能分化潜能的脂肪干细胞(adipose derived stemcells，ADSCs)，我们以往的研究结果表明脂肪组织可以促进皮肤创面的愈合。由于脂肪组织来源广泛，取材方便，可以获得的基质细胞数量大，所以可以作为替换MSC来源的成体干细胞。ADSCs和MSC之间CD标记的区别是ADSCs表达CD49天，本实验通过流式细胞学对培养的rADSCs表面抗原CD49天阳性的检测确证和鉴定了培养的细胞是ADSCs。
pcDNA3．1－VEGFl65重组质粒转染组的细胞经G418筛选后出现数量较多的细胞集落，而非转染组的细胞100％死亡，提示VEGF基因转染细胞的效果和G418筛选细胞的效果都良好。ELISA检测转染后细胞上清中VEGFl65浓度随时间而升高，而非转染组和pcDNA3．1(一)空载体转染组的细胞上清中VEGFl65浓度较低，提示VEGF165在rADSCs中有效表达，并被正确修饰，rADSCs可以作为基因治疗中的载体细胞。因此，理论上可以将获得的稳定表达VEGF165的rADSCs移植到体内实施基因治疗。
Brdu是常用的一种标记细胞核的荧光染料。注入到腹腔的被转染rADSCs的Brdu标记细胞阳性效率可达70％以上，台酚蓝染色记数注入到腹腔rADSCs为1×107，较高的Brdu标记率和充足的细胞数量是rADSCs在本移植实验研究中作为皮瓣基因治疗载体细胞的前提。
随意型皮瓣是常用于研究皮瓣成活能力的模型。本实验选用大鼠背部的8cm×2．5cm随意型皮瓣模型，皮瓣远端由于超出长：宽＝1：1．5的比值范围，因而是血流供应较少的部位，在手术后局部出现血流缓慢，内皮细胞缺氧脱落和血栓形成等一系列的病理生理学改变，最终导致远端超出血流供应范围皮的缺血坏死。本研究结果表明，实验组皮瓣的成活面积(59．6±0．52)％，大于对照组的皮成活面积(40．5±0．27)％，P
[关键词] 起搏样细胞；CD45；HCN4；NF-160；窦房结
[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）06（b）-0009-04
Inducing directional differentiation of mouse bone marrow CD45-cells into sinoatrial node pacemaker-like cells in vitro
WEN Yu1 LI Bin2
1.Department of Histology & Embryology， Basic Medical College of China Medical University， Liaoning Province， Shenyang 110122， China； 2.Department of Sports Medicine， Affiliated Shengjing Hospital of China Medical University， Liaoning Province， Shenyang 110022， China
[Abstract] Objective To study method on inducing directional differentiation of mouse bone marrow CD45-cells into sinoatrial node pacemaker-like cells in vitro. Methods Mouse bone marrow CD45-cells were derived by using immunomagnetic beads system. After amplification in vitro， induced medium supplemented with 5-azacytidine and culture supernatant liquid of mouse sinoatrial node cells was used to cultivate. The expression on pacemaker-like cells markers of neurofilament protein （NF-160） and hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated potassium channel （HCN） 4 were detected by immunofluorescence staining. The expression of pacing genes （NF-160， HCN4 and HCN2） were detected by qRT-PCR. Results Differentiated cells of bone marrow CD45-cells after induced by culture in vitro expressed NF-160 and HCN4. qRT-PCR analysis showed， compared with cultured sinoatrial node cells in vitro， the expression of NF-160 and HCN4 were higher， while expression of HCN2 was lower. Conclusion The sinoatrial node pacemaker-like cells can be induced and differentiated from mouse bone marrow CD45-cells， and the cells will be one choice of ideal seeding cells for biological pacemaker building.
[Key words] Pacemaker-like cells； CD45； HCN4； NF-160； Sinoatrial node
心律失常是常见病，严重将危及患者生命。目前，对于严重心律失常、病态窦房结综合征患者，安装心脏起搏器是理想的治疗方法[1-3]。随着生物学及干细胞研究的发展，利用其相关技术逐步构建生物起搏器，对受损心传导系统的组织进行修复或替代，尤其是窦房结功能重建，可以使心脏的起搏和传导功能得以修复[4-5]。构建生物起搏器的种子细胞目前以干细胞为主[6-7]。由于骨髓源干细胞具有多向分化潜能，可自体获得，并能够在体外扩增，是比较理想的种子细胞，所以本研究采用5-氮胞苷联合窦房结细胞培养上清液体外诱导培养骨髓CD45-细胞，探讨其分化为起搏样细胞的可能性。研究周期为2014年8月～2015年1月，旨在为临床因窦房结起搏细胞数量减少或功能衰退造成的心传导系统功能障碍、严重心律失常等疾病的替代治疗以及生物起搏技术的应用奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物、仪器和试剂
1.1.1 实验动物 选取昆明小鼠10只，雌雄不限，4～5周龄，体重20～30 g，常规饲养，健康。
1.1.2 主要仪器和试剂 低糖DMEM和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Hyclone；DMEM-F12购自Gibco；5-氮胞苷（5-azacytidine）购自Sigma；兔源HCN4一抗、小鼠来源NF-160一抗和TRITC标记山羊抗兔IgG购自Abcam；FITC标记山羊抗小鼠IgG和DAPI购自武汉博士德生物工程有限公司；RNA extraction kit购自Qiagen；PCR引物购自生工生物工程（上海）有限公司；SYBR Green Real Time-PCR Master Mix购自Invitrogen。免疫磁珠分选系统（Miltenyi Biotec），激光共聚焦显微镜（Nikon EZ-C1），PCR仪（Roche Light Cycler？R480）。
1.2 小鼠骨髓CD45-细胞纯化、扩增
随机取5只小鼠经2.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，70%乙醇浸泡30 min，超净台无菌条件下取出小鼠股骨和胫骨数根，用低糖DMEM反复冲洗髓腔，收集冲洗液，经400目尼龙筛网过滤，1000 r/min离心6 min，弃上清。采用添加了10%FBS的低糖DMEM培养基重新混悬细胞，37℃，5%CO2，饱和湿度培养，1 d后换液，弃去未贴壁细胞，以后每2天换液1次。细胞长至80%融合时，PBS洗涤2次，0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min离心5 min，弃上清，10%FBS的低糖DMEM培养基重新混悬，以1∶3传代。培养大约1个月后，采用免疫磁珠分选系统，选取CD45抗体，按照说明书操作，使细胞通过分选柱，收集CD45-细胞。采用添加了10%FBS的低糖DMEM培养基，37℃、5%CO2、饱和湿度培养。
1.3 小鼠窦房结组织分离、培养，收集培养基上清液
余下5只小鼠经2.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，70%乙醇浸泡30 min，超净台无菌条件下取出心脏，解剖显微镜下将心脏界嵴中部静脉窦侧、前腔静脉根部0.3 cm × 0.3 cm × 0.3 cm大小组织块，剪成1 mm左右大小的碎块，添加0.07%胰蛋白酶消化，经筛网过滤后，1000 r/min离心5 min，加入添加了20%FBS的DMEM-F12培养基，37℃、5%CO2、饱和湿度培养4 h，吸出未贴壁细胞重置于6孔板中，继续培养。每天半量换液。
1.4 条件培养基诱导分化骨髓CD45-细胞
收集窦房结细胞培养后的培养液，经1000 r/min离心10 min，取上清与10%FBS的低糖DMEM培养基1∶1混合，并添加10 mmol/L的5-氮胞苷，作为CD45-细胞的条件培养基。CD45-细胞经条件培养基培养后2～3周，选取生长稳定细胞，进行检测。
1.5 免疫荧光检测分化细胞起搏标志物表达
将生长良好的分化细胞接种至8孔Chamber中，培养过夜，常规免疫荧光染色，一抗兔HCN4（1∶200）、小鼠NF-160（1∶300），二抗TRITC标记山羊抗兔IgG（1∶500），FITC标记山羊抗小鼠（1∶500）。激光共聚焦显微镜下观察，拍照。
1.6 qRT-PCR检测诱导分化细胞起搏基因表达
选择生长良好的分化起搏样细胞和小鼠窦房结细胞作为对照，采用RNA extraction kit提取两种细胞的总RNA，稀释浓度为200 ng/μL，然后逆转录合成cDNA，再采用SYBR Green Real Time-PCR Master Mix方法检测小鼠NF-160、HCN4和HCN2基因表达，选取GAPDH作为内参，引物序列见表1。NF-160、HCN4和HCN2基因表达结果以倍数变化表示。设立对照以确定无DNA污染。反应体系为20 μL，其中cDNA模板1 μL，Nuclease-free water 8.2 μL，NF-160、HCN4、HCN2基因引物序列上游引物和下游引物各0.4 μL，2X SYBR Green Master Mix 10 μL。PCR反应条件：94℃预变性3 min，进行35个循环（94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s），然后72℃再延伸10 min，4℃保存。实验重复3次。
表1 SBYR Green法qRT-PCR引物
2 结果
2.1 小鼠骨髓CD45-细胞及诱导培养基诱导分化细胞
CD45-细胞贴壁后多为短梭形、三角形、多边形，排列无规律，细胞体积较小，分散生长（图1A）。生长良好的CD45-细胞更换为条件培养基后，细胞形态发生明显变化，体积变大，大小比较一致，多呈长梭形，向同一方向生长（图1B）。
2.2 分化细胞起搏标志物表达
经免疫荧光染色后，发现绝大多数分化细胞NF-160和起搏离子通道HCN4表达阳性，可见胞质内呈丝状表达的NF-160和HCN4，胞核未着色（图2，见封三）。
2.3 诱导分化起搏样细胞起搏基因qRT-PCR检测
与培养的窦房结细胞比较，分化起搏样细胞NF-160、HCN4、HCN2基因表达水平不同，以倍数形式表示，其中NF-160、HCN4表达水平较培养的窦房结细胞高（P < 0.01），而HCN2表达水平低于培养的窦房结细胞（P < 0.01）。见表2和图3。
表2 起搏基因NF-160、HCN4和HCN2表达水平
注：与小鼠窦房结细胞比较，*P < 0.01
与小鼠窦房结细胞比较，*P < 0.01；误差线表示实验结果为3次实验平均值
图3 起搏基因NF-160、HCN4和HCN2表达水平
3 讨论
20世纪末，Makino等[8]首次以5-氮胞苷诱导培养骨髓间充质干细胞，发现能够体外分化为心肌样细胞，部分细胞的动作电位与心脏起搏细胞相似。随后，大量研究围绕起搏样细胞的诱导分化展开。目前，常用方法有应用5-氮胞苷诱导分化方法[8-9]、起搏离子通道基因转移方法[10-11]和窦房结细胞裂解液诱导分化方法[12]。但是这些体外诱导分化条件仍不完善，单独应用成功率低，所以本实验联合应用5-氮胞苷和窦房结细胞培养上清液，提高诱导效率。
5-氮胞苷诱导分化机制是可引起细胞DNA中某些胞嘧啶的去甲基化，激活表达肌细胞的特异性启动或分化调控基因，从而使启动细胞向心肌分化，并表达心肌细胞特异性标志物，并有一部分细胞具有自律性[8，13]。由于窦房结是一个多态性的结构，心脏成纤维细胞能通过缝隙连接提高心肌细胞间的交通，因而稳定培养心肌的自发性收缩节律。因此，体外培养时不必将窦房结细胞完全分离纯化。窦房结细胞培养液对CD45-细胞的诱导分化作用依赖于窦房结细胞分泌的细胞因子，可以为干细胞向起搏样细胞分化提供一个接近于窦房结细胞生长的环境。
研究表明，窦房结起搏细胞的电生理特性为舒张期自动除极化，起主要作用的是起搏电流，其分子基础是HCN，包括HCN1～HCN4，小鼠心脏主要表达HCN4和HCN2，以窦房结细胞HCN表达水平最高，所以选择HCN4和HCN2作为检测指标[14-17]。
本实验采用全骨髓细胞直接接种，然后经免疫磁珠分选其中的CD45-细胞，换用条件培养基诱导分化的方法，从成年小鼠骨髓源干细胞得到窦房结起搏样细胞。该方法操作简便，得到细胞量大，细胞成活率高，传代后，细胞形态渐趋同一，排列趋同一个方向，光镜下可见胞体呈梭形，胞质淡染，胞核明显，位于胞体中央。笔者采用小鼠窦房结细胞培养基上清液，并添加5-氮胞苷作为条件培养基，得到的起搏样细胞能够表达起搏离子通道HCN4和神经丝蛋白NF-160，由qRT-PCR结果看出，分化细胞表达起搏离子通道，符合起搏细胞特点，说明得到的细胞大部分是起搏样细胞。形态学和免疫组织化学染色研究显示，得到的细胞具有较好的生物学活性，证明诱导分化方法有效，得到起搏样细胞在体外能够存活较长时间，并保持其生物学活性，为生物起搏器奠定实验基础。
目前仍有尚未解决的问题，比如得到的细胞并非全部是起搏样细胞，还包含有其他细胞成分，这些混杂的细胞会对进一步研究带来干扰，因此进一步完善诱导分化条件或增加分化后的筛选指标，利用流式细胞分离技术或免疫磁珠分选，对得到的细胞进行分离提纯，以提高细胞纯度。
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【关键词】 嗅鞘细胞； 神经干细胞； 急性脊髓损伤； 神经营养素-3
【Abstract】 Objective：To observe the impact of olfactory ensheathing cells combined neural stem cells in rats with acute spinal cord injury and neurotrophin-3 Expression.Method：80 SD rats were selected， after acute spinal cord injury modeling by Allen's method， the rats were randomly divided into the control group （sham group）， the experimental 1 group （NSCs transplantation group）， the experimental 2 group （OECs transplantation group） and the experimental 3 group （NSCs+OECs transplantation group）. Cells were used local injection method to transplant. In the preoperative and postoperative 1， 3， 5， 7， 14， 21， 28 days， adopt BBB score， improved Tralov score and inclined plane experiments were used to rate the status of rat’s hindlimb motor function， tested motor evoked potential（MEP N1 wave） preclinical. Finally， one rat in each group were selected， randomly， then perfused， drawn and fixed. Immunohistochemical staining were used to observe neurotrophin-3（NT-3） in the damaged spinal cord tissue localized expression in each group. Result：（1）After modeling and cell transplanting， the rats’ BBB rating and improved Tralov score was 0 points within 24 hours， inclined plane experiments’ angle decreased very significantly， from the previous experiment（82.00±3.45） ° reduced to（12.73±1.34） °（P
【Key words】 Olfactory ensheathing cells； Neural stem cells； Acute spinal cord injury； Neurotrophic-3
First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Baotou 014010，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.22.008
脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI）是中枢神经系统的一种严重创伤，近年来其发病呈逐年增多的趋势[1]。如何有效地治疗脊髓损伤已成为当今研究的热点难题[2]。在治疗脊髓损伤众多方法中，细胞移植的治疗方法越来越受到人们的重视。本实验采用局部注射法将神经干细胞（NSCs）及嗅鞘细胞（OECs）分别、共同移植于大鼠脊髓受损区，通过行为学评价（BBB评分、改良Tarlov评分和斜板实验）、电生理检测（运动诱发电位）及免疫组织化学的方法观测各种指标，从而考察两种细胞移植后在脊髓损伤区的存活、分化、表达及功能情况，以期为脊髓损伤的临床治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 SD雄性大鼠购买自内蒙古医科大学实验动物中心，共83只，其中3只（出生3 d内）用于神经干细胞及嗅鞘细胞的培养取材。余80只大鼠用于实验。
1.2 主要试剂与仪器 试剂：DMEM/F12细胞培养液、B27、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、兔抗鼠巢蛋白（Nestin）单抗、兔抗鼠P75单抗、兔抗鼠NT-3单抗、异硫氰酸荧光素（FITC）标记羊抗兔二抗、NT-3染色SP试剂盒等；仪器：5% CO2培养箱、倒置荧光显微镜、垂直流洁净工作台、电热恒温水浴锅、玻璃细胞培养瓶等。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞培养及鉴定 （1）神经干细胞（NSCs）的培养及鉴定：新生（出生3 d内）SD大鼠消毒后，引颈法处死。无菌条件下，充分暴露出嗅球、两侧大脑半球及小脑。外科显微镊剪断与海马有联系的大脑皮质或神经组织，仔细剥离海马。垂直流洁净工作台内，无菌条件下将海马表面的软脑膜剔除干净，4 ℃生理盐水内清洗3次后，将海马放入DMEM/F12细胞培养液中，显微镜下用显微外科剪将其剪碎，巴氏吸管先反复轻柔机械吹打分离，不锈钢细胞滤网过滤后离心沉淀，最后将沉淀加入含bFGF、EGF和B27的DMEM/F12细胞培养液内，细胞培养瓶中悬浮培养，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养。3～4 d换液1次，每次换50%培养液。传代一次约需5～7 d。第二代细胞用特异性Nestin抗原免疫荧光染色法鉴定NSCs。最后将细胞浓度调整为1×109/L，备用。（2）嗅鞘细胞（OECs）的培养及鉴定：同样方法，无菌条件下取大鼠两侧嗅球后培养OECs。3 d全部换液1次。传代1次约需16 d。第二代细胞用P75受体单抗免疫荧光染色法鉴定OECs。最后将细胞浓度调整为1×109个/L，备用。
1.3.2 实验动物分组 SD雄性大鼠（体重200～300 g）80只，按随机数字表法分为对照组（假手术组）15只、实验1组（NSCs移植组）20只、实验2组（OECs移植组）20只和实验3组（OECs+NSCs联合移植组）20只，剩余5只大鼠备用。分组完成后将大鼠做好标记。
1.3.3 大鼠急性脊髓损伤Allen’s模型的制备及术后一般情况和处理 （1）模型制备：腹腔注射麻醉大鼠起效后，手术区备皮，将大鼠俯卧固定于手术台上，消毒、铺巾，背部正中切口，钝性剥离椎旁肌，缝线牵拉开，显露T10～12棘突、横突及椎板。切除T10棘突及椎板下部、T12棘突及椎板上部和全部T11棘突及椎板，形成方形骨窗，充分暴露相应脊髓节段（T11）的硬脊膜及椎管，作为打击损伤区域。自制的改良Allen’s撞击器15 g自6 cm高度自由落下，对T11段脊髓造成损伤，制成急性脊髓损伤动物实验模型[3]。打击完成后，4 ℃生理盐水冲洗2次，依次逐层常规缝合切口。（2）术后一般情况和处理：术后大鼠禁食水数小时，以后逐渐增加进食水量至正常。7 d内先单独饲养，7 d后5只合笼饲养。术后7 d内青霉素2×105 U肌注2次，预防伤口、肺部感染，每日饲喂呋喃坦啶水以预防泌尿系感染。大鼠术后出现尿潴留，在其恢复之前，每日应给予按摩膀胱协助排尿3次。
1.3.4 局部注射法行细胞移植 进行细胞移植之前，先将部分NSCs与OECs混合，用于实验3组的联合细胞移植。各组细胞移植均在急性脊髓损伤动物实验模型制作完成24 h以内进行。操作方法：造模成功以后，4 ℃生理盐水冲洗后，外科显微镊轻柔提起T11处硬脊膜，1 mL无菌注射器针头在硬脊膜上刺一小洞，垂直进针，缓慢向该处硬脊膜下约3 mm、脊髓损伤方向插入，缓慢注入细胞悬液0.1 mL（细胞数约为1×105个）。关闭切口前，小块可吸收明胶海绵微加压填塞于硬脊膜进针点处，防止细胞移植液及大鼠脑脊液的渗漏。对照组生理盐水代替细胞移植液，作阴性对照，余操作步骤与实验组相同。
1.4 功能检测
1.4.1 行为学评价 术前和术后1、3、5、7、14、21 d和28 d，随机抽取实验组15只大鼠及全部对照组大鼠，采用BBB评分法、改良的Tralov评分法和斜板实验，对大鼠后肢运动功能状况进行双盲法评分，与手术之前相比较，以了解受损脊髓功能恢复情况。
1.4.2 神经电生理检测 运动诱发电位（MEP N1波）的检测，观察外周运动神经（坐骨神经）的功能状态。检测方法：大鼠麻醉起效后，环形切开头后部皮肤，剥离至骨膜，细纹螺钉钻孔，孔的大小以刚好将刺激电极放入为宜。根据MEP的产生原理，刺激电极置于皮层，记录电极置于后肢大腿后侧坐骨神经处，参考电极置于硬腭下。刺激类型是：单脉冲粗电压，强度3 V，波宽1 ms、频率10 Hz，滤波3000 Hz，增益20倍，时间常数0.01 s，次数100次。检测完毕后缝合切口。
1.5 大鼠灌注、取材、固定与免疫组织化学染色 各组随机抽取1只大鼠进行灌注、取材与固定，免疫组织化学染色的方法测定NT-3标记阳性细胞指数，检测NT-3在局部受损脊髓组织中的表达情况。操作方法：腹腔麻醉起效后，开胸后经左心室主动脉插管，剪开右心耳，先快速灌注冰盐水，清亮液体流出后，再用多聚甲醛经心灌注、固定动物，速度先快后慢。切取T10～T12脊髓节段上下各约1 mm脊髓节段，立即放入中尔马林溶液内后固定，再入蔗糖溶液内脱水，置4 ℃下至沉底，常规石蜡包埋，切片机连续切片，厚度为10 um。免疫组织化学染色按NT-3染色SP试剂盒操作说明进行（操作步骤详见说明书）。NT-3染色阳性的标志是细胞浆或细胞膜呈棕黄色。选取15张最优切片，每张切片在10倍光镜下分别计数4个视野内染色阳性细胞，测定各组染色阳性细胞在总计数细胞中所占比例（即阳性细胞指数），重复5次，求平均值。
1.6 统计学处理 采用SPSS 11.5统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，两两比较采用t检验，不同时间点比较采用单因素方差分析（ANOVA），以P
2 结果
2.1 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后BBB评分变化 对照组及各实验组大鼠术后24 h内BBB评分均为0分，随着实验的进行，各组均表现出不同程度的恢复情况。其中实验组恢复速度及程度大于对照组（P
2.2 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后改良的Tralov评分变化 所有大鼠模型制备完成后及术后任一检测时间点，Tralov评分均显著低于术前。随着实验的进行，各组大鼠均表现出不同程度的恢复情况。与BBB评分的统计分析结果相似，实验组Tralov评分均显著高于同一检测时间点的对照组（P
2.3 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后斜板实验角度变化 造模及细胞移植术后，大鼠斜板实验角度大幅下降，术后1 d由（82.00±3.45）°降为（12.73±1.34）°，差异有统计学意义（P0.05）；1周后，实验组与对照组比较差异均有统计学意义（P
2.4 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后MEP（N1波）潜伏期变化 造模及细胞移植术后，各组MEP（N1波）潜伏期明显延长，但各实验组N1波潜伏期短于对照组（P
2.5 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后NT-3染色表达阳性的细胞数变化 造模及细胞移植术后，各组大鼠受损脊髓组织中NT-3均有明显增高，其中术后第3天达到高峰，7 d内NT-3的表达维持在较高的水平，此后逐步减少。自术后第5天（包含5 d）开始，各实验组与对照组比较NT-3增高显著，差异有统计学意义（P
3 讨论
治疗急性脊髓损伤必须要明确其受损机制，从而针对其中的关键环节做出行之有效干预治疗措施。急性脊髓损伤的具体机制虽尚未被完全阐明，但医学工作者的认识逐渐趋于统一，认为脊髓损伤包括原发性损伤和继发性损伤[4]。基于这一认识，目前急性脊髓损伤动物实验模型基础研究中所实验的新方法新技术和临床上治疗脊髓损伤的各种常用措施，就是要及早正确的干预、减轻和预防可逆性的继发性损伤，但取得的治疗效果却不甚理想。上世纪90年代初，Reynold等[5]在鼠纹状体中发现了具有多向分化潜能、不断进行分裂的细胞群，后来Mckay将之命名为神经干细胞（NSCs）。他们的发现颠覆了人们以往认为成年中枢神经系统神经元不能够再生的认知，为治疗脊髓损伤提供了新的治疗思路―细胞移植。自此，各种细胞被尝试用来治疗神经系统损伤和脊髓损伤。在这些尝试中，最成功的例子就是神经干细胞移植治疗帕金森病、癫痫、中风等神经系统疾病[6-9]。但急性脊髓损伤的机制更加错综复杂，细胞移植虽然在基础实验研究及动物实验等方面取得了重大进展与突破，但国内外人体临床试验尚未大规模开展，这仍有待于研究者的进一步地探索研究。
神经干细胞（NSCs）是一类特定的干细胞，它可以通过非对称分裂的方式分化成为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等。此外，还可自分泌神经生长因子（NGF）、神经营养因子（NTF）等物质。自其被发现伊始，神经干细胞就被医学工作者用来自体移植治疗神经系统损伤，这样不仅可以避免免疫排斥反应的发生，同时又解决了移植细胞的来源问题，取得了满意的临床疗效，可作为急性脊髓损伤治疗的重要参照[10]。
嗅鞘细胞（OECs）是目前所发现的极少数中枢神经系统内可以再生的细胞之一，被认为是髓鞘化能力最强的胶质细胞，其特点是具备终生再生分裂的能力，它不仅能存活于中枢神经系统当中，而且又可以促进外周神经元细胞轴突的生长。Sasaki等[11]研究就发现，嗅鞘细胞移植后能够突出脊髓受损区达8 mm，除了仍可保持再生分裂的能力外，还可使已经脱髓鞘的神经元轴突重新髓鞘化。此外，与NSCs相似，嗅鞘细胞也能分泌多种神经营养因子，这些可能都对神经元轴突的生长起着重要的促进作用[12]。
本实验中，采用单种细胞或两种细胞联合移植治疗大鼠急性脊髓损伤，将能够分泌NT-3的神经干细胞及嗅鞘细胞分别、共同移植于脊髓受损区，以期可持续分泌NT-3，这样就可避免外源性神经营养因子半衰期短和持续性作用差的弊端，等同于NT-3、神经干细胞及嗅鞘细胞共同修复受损的脊髓，改善大鼠急性脊髓损伤后运动功能的恢复[13]。实验中笔者观察到，造模及细胞移植术后，24 h内各组大鼠BBB评分及改良的Tralov评分均为0分，斜板实验角度下降非常明显，由实验前的（82±3.45）°降为（12.73±1.34）°，各组MEP（N1波）潜伏期明显延长。随着实验的进行，各组均表现出不同程度的恢复情况，各实验组BBB评分及改良的Tralov评分与对照组相比增高显著（P
然而，并非所有的实验研究都获得了一致或相仿的研究结论。有学者认为，局部注射法进行细胞移植时，“细胞迁徙”可能是人为进行细胞移植时局部注射的压力所导致的局部扩散而已，而不是所谓的“主动迁徙”[14]。在各种急性脊髓损伤模型中，如脊髓半或全横断模型，脊髓压迫模型等，可见细胞移植无疗效或疗效甚微的案例，故而一部分学者对细胞移植治疗急性脊髓损伤的疗效抱有怀疑态度[15]。尽管如此，笔者认为急性脊髓损伤机制的复杂性决定了其治疗的全面性，不是单独应用一种治疗方法或多种治疗方法联合应用就可一蹴而就的。细胞移植的方法虽然不是涉及了急性脊髓损伤修复的所有方面，但取得了一定的疗效。
参考文献
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[关键词] 胚胎干细胞；绿色荧光蛋白；分化；角膜上皮细胞；诱导
[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）03（b）-0013-03
角膜上皮位于眼角膜表面，是维持眼表正常生理功能的重要条件。健全的角膜上皮细胞是角膜抵御外界各种有害因素损伤的重要条件。人的角膜自我更新由位于角膜缘区域的角膜缘干细胞来维持，结构与功能健全的角膜缘干细胞是角膜上皮再生的主要来源，当角膜受到化学及热烧伤，以及患有Stevens-Johnson syndrome等疾病时，角膜缘上皮细胞将会缺失，导致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危险[1]。因此，重建完整的角膜上皮就显得异常重要。
胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）是从早期胚胎内细胞团分离获得的，具有体外增殖和全能性两大特点。近年来随着ES细胞研究的不断深入，其逐渐应用于细胞、组织的修复和移植[2]。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因是一种新型的报告基因，用GFP作为标志物来标记ES细胞，可用来追踪ES细胞在体内的分化[3]。本研究利用质粒pEGFP-N1脂质体复合体转染鼠ES细胞，并在体外诱导鼠ES细胞向角膜上皮细胞分化，为治疗角膜损伤及重建角膜上皮提供细胞组织来源。
1 材料与方法
1.1 实验材料
鼠ES细胞由北京大学深圳研究生院分子生物学实验室提供。DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、B-巯基乙醇、非必需氨基酸，购自Sigma公司；丝裂霉素C，购自Kogyo公司；脂质体Lipofectamine 2000、G418，均购自Invitrogen公司；白血病抑制因子（1eukemia inhibitory factor，LIF）、L-谷氨酰胺，购自Sigma公司；质粒pEGFP-N1，购自Clontech公司；明胶、TaqDNA 聚合酶，购自博大泰克公司；CK14、CK12、CD44引物，委托宝生物工程公司合成；免疫组化二抗试剂盒、DAB显色试剂盒，购自武汉博士德公司；其余为国产分析纯试剂。
1.2 实验方法
1.2.1 ES细胞的培养 ES细胞复苏后，经丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）做饲养层培养，加入预先铺有明胶（Ⅳ型胶原）的培养皿中，37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养，每日更换ES细胞培养液为高糖DMEM（内含0.1 mol/L β-巯基乙醇、2 mmol/L谷氨酰胺、150 mL/L胎牛血清、1 000 U/mL LIF、15 g/L非必需氨基酸）。2～3 d传代1次。
1.2.2 转染及诱导ES细胞 将真核细胞表达载体pEGFP-N1转染ES细胞作为实验组，空载质粒转染ES细胞作为对照组。在转染前2 h改为无血清的DMEM培养液；含载体pEGFP-N1质粒的无血清DMEM 培养液与含脂质体Lipofectamine 2000的无血清DMEM培养液混合，加入ES细胞培养皿中，置37℃的CO2培养箱中培养，换液，培养基为不含LIF的ES细胞培养基。G418筛选GFP阳性细胞克隆，接种在丝裂霉素C处理的MEF饲养层上，继续扩增培养，获得稳定的转染细胞系。ES细胞诱导前去除饲养层细胞，接种于涂抹明胶（Ⅳ型胶原）的培养皿中，加入无LIF的ES细胞培养液，隔日换液，传3～4代，诱导ES细胞分化成角膜上皮细胞。
1.2.3 形态学和免疫组织化学鉴定 显微镜下观察ES细胞形态，诱导培养7 d后，细胞基本融合，将培养分化的ES细胞用PBS洗涤3次后，冷4%多聚甲醛固定30 min，正常山羊血清封闭30 min，滴加K14、K12及CD44单抗，4℃过夜，0.02% Triton-PBS洗涤，加人生物素标记的二抗，室温下孵育40 min，PBS洗涤数次后，加入链亲和素一过氧化物酶溶液，放置于室温下10 min，0.02% Triton-PBS洗涤，最后DAB显色，显微镜下观察。
1.2.4 RT-PCR检测 Trizol R试剂盒提取ES细胞总RNA，具体过程参照Trizol Reagent说明书。引物序列分别为：CD44 正义链5'-atcaacctgcctatgcaacc-3'，反义链5'-cttggacgggaactgacact-3'（248 bp）； K12正义链5'-cgagagtggtatgaaaca-3'， 反义链5'-tgggctctcatttcattg-3'（218 bp）； K14正义链5'-ggtcgatttgatggatttgg-3'，反义链5'-gttcagtgttggcctcttcc-3'（192 bp）；内参照β-actin 正义链5'-gatgacgatatcgctgcgctg-3'， 反义链5'-gtccgaccagaggcatacagg-3'（512 bp）。每个周期参数如下：94℃ 30 s， 60℃ 35 s， 72℃ 60 s，共30个循环周期。采用小鼠角膜上皮细胞做阳性对照，每组PCR反应均设一个阴性对照。取RT-PCR产物20 μL行琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪观察结果，凝胶成像系统拍照。
2 结果
2.1 ES细胞的形态
在饲养层上培养的ES细胞生长旺盛，边界光滑，呈现巢状生长，集落大多呈多角形或椭圆形，集落内细胞排列紧密，边界不清；细胞边界清，胞浆较丰富，细胞核大，核仁大。GFP阳性ES细胞在荧光显微镜下可观察到细胞内有微弱的绿色荧光（图1～2）。
2.2 诱导分化的角膜上皮细胞形态
GFP阳性ES细胞经Ⅳ型胶原诱导培养1周，可见在细胞集落中爬出上皮样细胞， 贴壁生长，增殖迅速，逐渐呈集落式生长，生长胞体多为扁平，呈多角型或不规则形态生长，表现出典型的上皮细胞形态，在荧光显微镜下可观察到细胞内有很强的绿色荧光（图3～4）。
2.3 K12、K14及CD44表达情况
RT-PCR检测发现：诱导分化的ES细胞中有K12及CD44表达，而K14则无表达，证实转染后ES细胞向角膜上皮细胞方向分化（图5）；免疫组化结果显示：角膜上皮样细胞K14的表达很少，而K12及CD44的免疫细胞化学染色阳性（图6）。
3 讨论
严重的角膜损伤一直是眼科治疗的难题。一些严重的化学或热烧伤，以及Stevens-Johnson syndrome等疾病，常导致角膜上皮的大量缺失。传统的移植方法虽有一定疗效，但由于供体缺乏、移植免疫及伦理等问题，在临床上的应用发展受到很大限制[4]。重建角膜的关键是获得足够的角膜上皮材料。本研究探索采用诱导有多向分化潜能的ES细胞向角膜上皮细胞分化，为角膜上皮移植提供无限的供体来源。
ES细胞是一种具有全能性、可无限增殖和多向分化潜能的未分化细胞，具有两个重要特性：①自我更新潜能。干细胞在未分化状态下可不断增殖，从而可自我更新。②多向分化潜能。在体内外ES细胞均有分化成许多特定细胞类型的能力。它能迁移到不同部位分化成相应的细胞类型，恢复受损细胞的功能，成为一种新型细胞替代治疗和基因治疗的途径。经丝裂霉素C处理的含LIF的MEF作为饲养层，能够抑制ES细胞的分化和促进其增殖，并使其保持未分化状态以及多向分化潜能[5]。本研究将Ⅳ型胶原作为诱导剂，加入不含LIF的培养板中，诱导体外培养的ES细胞向角膜上皮细胞分化。
GFP是一种由238个氨基酸组成的蛋白，作为荧光标记分子，在研究细胞的分化、细胞移植中具有重要作用[6]。本研究用脂质体方法将含有GFP的质粒转染至小鼠ES细胞中，选择G418筛选并纯化后的GFP阳性ES细胞。将这些能够持续表达GFP的ES细胞在诱导条件下分化成角膜上皮样细胞，并稳定表达GFP，证明GFP基因已完全整合到ES细胞基因组中，这对ES细胞在体内的分化、迁移及整合具有重要意义。
本研究对诱导分化后的ES细胞进行了形态学观察，发现分化后的细胞符合具有典型上皮细胞的形态学特征。细胞呈集落式生长，排列紧密，边界不清；细胞边界清，胞浆较丰富，细胞核大，核仁大。对于眼表上皮而言，区分角膜上皮细胞与结膜上皮细胞是非常重要的，因为它们在功能上有很大区别，影响角膜上皮组织的移植。细胞角蛋白（cytokeratin）是细胞骨架成分中间丝的重要组成部分，是一类在上皮细胞中表达丰富的蛋白质，也是某些上皮细胞重要的标志物，其中，K14主要在结膜上皮表达而不在角膜上皮表达，K12则是在角膜上皮细胞表达的角蛋白，是特异性角膜上皮细胞标志物。而CD44也存在于角膜上皮细胞中，功能与组织修复有关，它可以促进角膜上皮的愈合。本实验诱导分化的上皮细胞CD44和K12表达阳性，而表达K14阴性，说明诱导分化的细胞是角膜上皮细胞，而非结膜上皮细胞。提示ES细胞能在体外定向诱导分化为角膜上皮样细胞。本研究应用RT-PCR技术检测ES细胞及分化的角膜上皮样细胞中均有K12及CD44的表达，而结膜上皮标志物K14则无表达，证实转染GFP后的ES细胞向角膜上皮细胞方向分化。
总之，通过以上实验本研究成功建立了转染GFP基因的ES细胞系，并利用Ⅳ型胶原体外诱导ES细胞定向分化为角膜上皮样细胞，为临床治疗角膜损伤提供新的材料来源。
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如何培养适应社会需求的21世纪的新型人才，是现代高等教育所必须考虑的首要问题。因此，细胞工程作为现代生物技术学科的一个重要组成部分，在高等院校生物科学及相关专业的教学中被设定为主干课程。目前，细胞工程是生物技术等相关专业本科生培养计划的必修课程，在课程内容上要求系统全面地介绍细胞工程的基本原理、基本技术、最新研究方法和成果、实际生产应用以及未来发展趋势等。
细胞工程课程在生物科学专业的设置
本课程自从2007年在我校新办生物技术专业开设以来，根据学校对本科生物技术专业的培养计划，细胞工程是生物技术专业的主干课程，并于2009－2010学年第二学期开始开设。通过对该课程的教学，使学生掌握细胞工程所涉及的基本概念、原理、技术方法、应用基础等内容。通过近三年的教学实践，不断加强课程建设与发展，理论教学体系已经基本完善，实验教学平台基本建立。通过全面进行教学改革，已逐渐形成本校建设的特色课程。21世纪，生命科学全面快速发展。根据学科发展和社会需求趋势，在新办生物技术专业基础之上，2009年我校新办生物科学专业。然而，新办生物科学专业的困境是专业范围宽泛;如何在有限的时间内，全面、高效地培养适应社会需求的合格人才，是每位任课教师和教学管理者必须认清的首要问题。为了充分发挥我们医学院校的资源优势，在培养学生方向定位上，以健康教育为主要方向，兼顾生物制药等，但又与生物技术的培养方式不同。由于细胞工程是由细胞生物学、分子生物学、基因工程、工程学等学科理论技术有机结合的一门崭新学科，因而被设定为新办生物科学专业本科生培养计划的必修课程。
细胞工程课程在生物科学中的开设，是以普通生物学、生物化学、医学遗传学、细胞生物学、分子生物学、微生物学、免疫学等先修课程为基础。同时，将本课程的学习与基因工程、生物技术等课程的学习互相补充和相互促进，为将来从事生命科学基础理论研究、生物制品的开发和应用、疾病诊断技术的开发与应用等领域的工作打下必要的基础。在教材方面，以李志勇编著《细胞工程》(高等教育出版社)为基本教材，以杨吉成编著《细胞工程》(化学工业出版社)、安利国编著《细胞工程》(第二版，科学出版社)等为主要参考教材。在教师队伍配置方面，既有细胞生物学领域教学经验丰富的教授，也有年富力强的专业知识扎实的中青年骨干教师。细胞工程的理论教学和实验教学全部由既具有扎实生物工程学相关知识背景，又有基础细胞理论与实验技术背景的骨干教师承担。
细胞工程教学内容的设定与改革
细胞工程课程的特色，是以细胞工程技术方法的基本原理为课程教学切入点。在教学内容上，基本理论的讲授与技术方法过程的介绍并重;在本学科知识的系统性方面，既有本学科理论的系统性，又加强与其他相关学科的相互渗透交叉，尤其是以细胞生物学、生物工程的基础知识背景，为本学科的理论教学奠定基础;通过将现有技术的原理、应用归纳，与本学科相关技术的发展趋势讲解相结合;从内容上，客观系统地反映本学科相关领域应用前景、重点研究方向和尚待解决的科学问题;在理论上自成体系。根据教学计划，细胞工程在我校总学时设定为80学时，其中理论50学时，实验30学时。本课程的开设，一般在第三学年的第二学期，在普通生物学、生物化学、医学遗传学、细胞生物学、组织胚胎学等课程修完之后进行。细胞工程在教学内容、教学方法上又与以上学科大不相同，本课程教学是以技术方法的原理为基础理论的学科，因此实验与理论教学并重。细胞工程课程的理论课程内容，根据研究对象一般分为三大部分内容，分别为:细胞工程概论与基本技术、植物细胞工程、动物细胞工程。根据我校的教学实际情况和培养计划，我们对教学内容进行了适当的改革与调整。课程的内容重点在第一部分细胞工程概论与基本技术和第三部分动物细胞工程［1－4］。
细胞工程概论和细胞工程基本技术，这部分内容是细胞工程的理论方法基础，是教学重点之一。课程内容主要包括:细胞工程概论、细胞工程理论基础、实验室设置与无菌操作技术、细胞基本培养基本技术。重点让学生掌握细胞工程研究所涉及的基本理论、技术问题。由于细胞工程是在细胞生物学教学之后开设，学生已经基本具备细胞生物学的基本理论和技术方法;因此在理论教学内容安排上，只做概要性讲解。植物细胞、组织工程技术相对成熟，应用范围广泛。这部分内容包括:植物组织、器官培养技术;植物细胞培养技术;原生质体融合与培养技术;亚细胞水平的操作技术等。对这部分内容的教学，只做相关技术原理的理论性讲解，了解相关的技术原理和应用。细胞工程课程的教学重点内容设置在动物细胞工程部分。这部分内容主要有五个方面的相关主题:①动物细胞的规模化培养技术与生物反应器;②基因操作技术与外源基因的表达，包括转基因生物反应器(转基因细胞和转基因动物)、细胞培养与生物制药;③体外受精与核移植技术，包括体外受精技术、胚胎工程技术、核移植技术等;④细胞融合与单克隆抗体技术，包括杂交瘤技术、单克隆抗体技术、抗体工程技术等;⑤胚胎干细胞与组织工程技术。在这几个主题中，着重对细胞培养的细胞融合技术原理和基本方法，以及利用细胞融合产生杂交瘤和单克隆抗体的动物细胞工程发展的基础进行讲解;重点讲解动物细胞基因表达系统和基因打靶的技术、利用染色体载体转移基因和构建人工染色体的技术及其应用;并且对于干细胞生物学在医学上应用的重大意义，对胚胎干细胞和组织干细胞的研究方法、研究进展进行重点讲解［5－8］。
实验教学部分，将培养胚胎干细胞的整个实验体系与技术设定为细胞工程课程的实验教学部分。实验课程的教学改革，是我们对这门课程进行教学改革的重点部分，相关的研究进展将另文详细论述。细胞工程在无论是在理论教学还是实验教学上，都充分展现出细胞工程的最新前沿技术以及这些技术在生物制品研发、保障人类健康等方面所体现出来的越来越多的贡献和作用。通过课程改革，不断完善教学内容，不断丰富教学方法与手段，使理论教学与实践教学、甚至科研教学相互促进。通过本课程教学，使学生充分掌握细胞工程的基础知识、基本概念和实验技术的基本原理，完整的理论以及体外细胞培养技术和方法，以及细胞工程发展的新技术和新理论。从教学效果以及学生反馈来的信息，都证明了细胞工程教学取得了非常好的教学效果，达到了课程设定的预期目标。（本文作者：任立成、孙元田、苏振宇、林蓉、李冬娜单位：海南医学院生物学教研室）
关键词： 脂肪源性干细胞；异种松质骨；支架材料；骨代用品；生物医学工程；成骨诱导；种子细胞
0引言
如何获得充足的种子细胞是长期以来限制组织工程研究的瓶颈，骨髓基质干细胞尽管已被广泛应用于组织工程研究，但由于其干细胞含量过低、骨髓抽取量有限以及对患者造成的创伤等，使其广泛应用到受限. 2001年Zuk等［1］从脂肪组织中成功提取了干细胞，并成功诱导其向骨、软骨、脂肪、心肌等多个方向诱导分化. 我们将成骨诱导的脂肪源性干细胞（adiposederived stem cells，ADSCs）与异种松质骨支架复合，移植至兔颅骨缺损部位，以探讨成骨诱导脂肪源性干细胞修复骨缺损的应用前景.
1材料和方法
1.1材料新西兰大白兔12只，4 mo龄，体质量2.0～2.2 kg（第四军医大学实验动物中心）；Dolbecco改良的Eagle培养基（DMEM），胎牛血清（FBS），地塞米松，抗坏血酸，β甘油磷酸钠（美国Sigma公司）；碱性磷酸酶（ALP）活性测定试剂盒（南京建成生物技术有限公司），牛股骨，甲醇，氯仿，300 g/L H2O2等（市售）.
1.2方法
1.2.1ADSCs的分离培养［1］将新西兰大白兔按0.2 mL/kg速眠新麻醉，取颈部后正中3 cm切口，无菌切取肩胛上脂肪组织约2 mL. 清除切取组织中肉眼可见的小血管，去除外包膜和明显的结缔组织，DHanks冲洗3遍以洗去红细胞的污染. 切碎成糊状，加入2 g/LⅠ型胶原酶5 mL，在37℃水浴搅拌消化40 min，过滤，加入两倍体积DMEM培养液（含100 mL/L FBS, 1×105U/L青霉素, 1×105 U/L链霉素)，1000 r/min，离心10 min，倾去上层脂肪及上清，基础培养基重悬细胞, 接种至25 cm2培养瓶内, 种植密度1.5×104/cm2. 在37℃培养箱内培养,3 d后换液，观察原代细胞的生长. 细胞融合达90%时用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代.
1.2.2ADSCs的成骨诱导在第1次换液时将部分细胞改为成骨诱导培养液(基础培养液加10 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β甘油磷酸钠，50 mg/L抗坏血酸［1］)培养. 细胞融合达90%时用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代.
1.2.3ALP活性测定将第2代ADSCs以5×103/孔的密度接种于96孔板中,成骨诱导培养液诱导0，3，6，9，12，15 d后,PBS漂洗,加入50 μL细胞裂解液4℃过夜, ALP活性测定试剂盒检测ALP活性.
1.2.4茜素红染色取成骨诱导1 wk的细胞爬片培养1 wk,PBS冲洗3遍，950 mL/L乙醇固定10 min，蒸馏水冲洗3次，1 g/L茜素红于37℃染色30 min，蒸馏水冲洗，干燥，封片.
1.2.5松质骨支架的制备取市售牛股骨，将股骨头松质骨加工成直径10 mm，厚2 mm的骨片. 将骨片置入1∶1的甲醇∶氯仿100 mL中脱脂24 h，12 h换液1次，蒸馏水冲洗. 将脱脂后的骨片置入300 mL/L H2O2 100 mL中脱蛋白48 h，每12 h换液1次. 蒸馏水冲洗. 将脱脂、脱蛋白后的骨片置入0.6 mol/L的HCL中脱钙5 min，蒸馏水冲洗. 将脱脂、脱蛋白、脱钙后的松质骨片低温晾干，密封包装，Co60灭菌备用. 种植细胞前将成品松质骨无菌条件下PBS液中浸泡7 d，分别在基础培养液和诱导培养液中浸泡3 d.
1.2.6细胞的种植及检测将ADSCs和成骨诱导15 d的ADSCs用2.5 g/L胰蛋白酶消化，离心，分别用基础培养液和诱导培养液悬浮,调整细胞密度至1×1010/L. 将基础培养液和诱导培养液中浸泡的松质骨支架转移至24孔培养板中，分别种植上述细胞悬浮液100 μL，置37℃培养箱内6 h使细胞贴壁，然后分别加入基础培养液及诱导培养液培养. 将复合后培养5 d的细胞支架复合物固定，干燥，喷金，扫描电镜观察. 复合培养7 d后手术植入颅骨缺损部位.
1.2.7动物分组及处理将12只大白兔按0.2 mL/kg速眠新麻醉，取双侧颅骨直径10 mm钻孔，24孔分为4组，每组6孔. ① 支架+成骨诱导ADSCs（A组）；② 支架+ADSCs（B组）；③ 单纯支架（C组）；④ 对照组（D组）. A，B组植入上述成骨诱导和未诱导的脂肪源性干细胞复合异种松质骨支架，所用细胞均为自体细胞；C组植入单纯的松质骨支架，为前述松质骨成品PBS液中浸泡7 d，9 g/L NaCl溶液中浸泡3 d后植入；D组不做处理. 术前术后肌注庆大霉素，2万U/kg. 术后14 wk用过量戊巴比妥钠麻醉处死动物，取材，X线摄片，计算成骨面积，HE染色行组织学分析.
统计学处理：数据以x±s表示,应用SPSS医用统计软件包进行OneWay ANOVA检验. P<0.05为差异具有统计学意义.
2结果
2.1细胞培养原代脂肪源性干细胞呈梭形，在β甘油磷酸钠，地塞米松，抗坏血酸的诱导下，能向成骨方向分化（图 1A）. 诱导2 wk后茜素红染色阳性，提示有钙结节形成(图1B). ALP活性检测结果显示，成骨诱导6 d后，支架+成骨诱导ADSCs组与对照组间差异具有统计学意义（P<0.05，表1），支架+成骨诱导ADSCs组的ALP活性明显高于单纯支架组.表1不同时期对照组和成骨诱导组碱性磷酸酶含量
