作者：熊艳军 宿玲恰 王蕾 吴敬 陈晟环糊精葡萄糖基转移酶酿酒酵母表面展示
摘要：【目的】将环状芽孢杆菌251（Bacillus circulans 251）来源的环糊精葡萄糖基转移酶（Cyclodextrin Glycosyltransferase,CGTase）展示在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞表面,构建全细胞催化剂生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸（2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid,AA-2G）,以提高AA-2G的产量。【方法】将CGTase编码基因cgt连接到载体质粒p YD1中的a凝集素（a-agglutinin）Aga2p亚基基因的下游构建表面展示重组质粒p YD1-cgt,转化酿酒酵母EBY100获得重组菌EBY100-p YD1-cgt,对发酵条件（培养基、诱导温度和诱导剂半乳糖浓度）进行优化;同时先后对重组菌的发酵产酶以及表面展示CGTase的酶促合成AA-2G的条件进行了优化;进一步又比较了表面展示的CGTase与E.coli BL21发酵所得的游离CGTase在酶促制备AA-2G过程中副产物的积累情况。【结果】展示CGTase的酿酒酵母重组菌株以YPG培养基作为发酵培养基,诱导剂半乳糖初始添加浓度为20 g/L,经25℃诱导48 h后,表面展示CGTase最大酶产量为0.5 U/m L;表面展示CGTase 40℃条件下的温度稳定性比游离酶有所提高,p H稳定范围变宽。对表面展示的CGTase制备AA-2G转化条件的优化发现,其最适温度最适p H分别为30℃和4.5,转化48 h达到平衡,表面展示的CGTase制备AA-2G的产量较游离酶提高了37%。【结论】对于CGTase,a凝集素系统是一个有效的展示系统,构建的酿酒酵母全细胞催化剂用于酶促制备AA-2G时,产生的副产物葡萄糖可能被酵母细胞利用,从而降低了葡萄糖与VC的竞争作用使AA-2G的产量增加,该全细胞催化剂具有良好的应用前景。
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