作者：蔡怡 周前进 陈炯嗜水气单胞菌环介导等温扩增横向侧流试纸促旋酶b亚单位基因检测
摘要：以嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位（gyrase subunit B，gyrB）基因为检测靶标，设计6条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记探针，建立了嗜水气单胞菌的LAMP—LFD快速检测方法。该方法的流程可简单概括为将生物素标记的环介导等温扩增（loop—mediated isothermal amplification，LAMP）产物与FITC标记的探针进行特异性杂交，并使用横向流动试纸条（lateral flow dipstick，LFD）完成检测。经优化，LAMP最佳反应条件为63℃，反应30min，从LAMP扩增到LFD结果判读仅需40min，比常规PCR检测缩短近2h。试验结果表明，LAMP—LFD可特异性检出嗜水气单胞菌，对鳗弧菌等常见水产或食源性病原菌检测结果为阴性；其针对细菌纯培养物的检测灵敏度达2．03×10^1CFU／mL或0．81CFU／反应，是常规PCR（以F3／B3为引物）的100倍；可从人工污染1×10^2cFu／mL度的嗜水气单胞菌的鲫鱼肝组织匀浆样品中检测到细菌。嗜水气单胞菌（10^6CFU）人工感染鲫鱼24h，传统的细菌分离培养方法可获得肝、肾的载菌量分别为1．2×10^5CFU／g和6×10^3CFU／g；利用LAMP—LFD技术可成功从鲫鱼的肝、肾组织中检测出该病原；以F3／B3为引物的PCR方法仅能从感染鲫鱼的肝组织中检测到该病原菌，表明面对实际感染样品，LAMP—LFD的检测灵敏度优于PCR方法。因此，该方法可快速、灵敏、特异地检测出嗜水气单胞菌，而且操作简单，仪器设备依赖性低，有望成为嗜水气单胞菌现场检测的常规技术手段。
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